一種粗榧生物堿產(chǎn)品的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物內(nèi)生菌分離與微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及一種粗榧生物堿產(chǎn)品的制備方法。通過選取多年生粗榧的根、莖、葉作為外植體，經(jīng)切條、滅菌后放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)使其長出粗榧共生菌，然后從粗榧共生菌中分離出可代謝粗榧生物堿的菌種并培養(yǎng)發(fā)酵，將發(fā)酵液濃縮后析出即制得產(chǎn)品。本發(fā)明在發(fā)酵液的制備過程中待菌種產(chǎn)生代謝生物后再接入第二批菌種，利用前批菌種產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物為第二批菌種提供營養(yǎng)物質(zhì)，大大促進了第二批菌種的生長，同時提高了其生物活性，從而產(chǎn)生大量發(fā)酵液，提高了粗榧生物堿的產(chǎn)量。
【專利說明】一種粗榧生物堿產(chǎn)品的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物內(nèi)生菌分離與微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及一種粗榧生物堿產(chǎn)品的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]粗榧是我國特有的一種植物，具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，粗榧生物堿是粗榧的重要有效成分之一，具有防癌等功效，常用于藥物中。目前粗榧資源稀少，且該樹種生長緩慢，粗榧生物堿產(chǎn)量低下，難以滿足人們的生活需求，同時也造成了涉及粗榧生物堿類藥物的價格昂貴，因此怎樣提高粗榧生物堿的產(chǎn)量成為人們的重要課題之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種粗榧生物堿產(chǎn)品的制備方法，能夠快速、高效的制備粗榧生物堿。
[0004]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是，一種粗榧生物堿產(chǎn)品的制備方法，選取多年生粗榧的根、莖、葉作為外植體，經(jīng)切條、滅菌后放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)使其長出粗榧共生菌，然后從粗榧共生菌中分離出可代謝粗榧生物堿的菌種并培養(yǎng)發(fā)酵，將發(fā)酵液濃縮后析出即制得產(chǎn)品，所述培養(yǎng)發(fā)酵的具體操作方法為將可代謝產(chǎn)生粗榧生物堿的菌種活化后放入溫度為2600的環(huán)境中培養(yǎng)48匕再把菌種接種到裝有？0八培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，待菌種產(chǎn)生代謝生物1-2天后接入第二批菌種，以促進第二批菌種的生長，第二批接種的菌種長出后接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶內(nèi)，然后把搖瓶放入轉(zhuǎn)速為20017111111、溫度為280(:的搖床上培養(yǎng)5山收集菌種的發(fā)酵液即可；
所述發(fā)酵液濃縮的具體操作方法為將發(fā)酵液放入轉(zhuǎn)速為10000170111的冷凍高速離心機中離心，收集上清液，把上清液放入轉(zhuǎn)速為1000017111111的冷凍高速離心機中再次離心，然后把再次離心后的上清液放入溫度為40-501、壓強為0.051即的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的十分之一，再將濃縮液放入溫度為41的冰箱內(nèi)即可；
所述析出的具體操作方法為向濃縮液中加入似0！1溶液直至13訴8?9，析出生物堿和混合物，將混合物加入到體積濃度為95%的乙醇中，且混合物和乙醇的體積比為1:10，加熱到301后冷卻至15-181，析出生物堿，重復(fù)上述加熱、冷卻析出過程2-3次，合并生物堿，即制得產(chǎn)品。
[0005]所述搖瓶內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基由土豆汁、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、1叻04、狃2？04和水制成，且各組分的質(zhì)量百分比為土豆汁2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.12%，可溶性淀粉1%，188040.05%，狃2？04 0.15%，余量為水，培養(yǎng)基的邱=7 ；
所述土豆汁由組分八和組分8按照10:1的重量比混合后放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的三分之一后制得，所述組分八是將土豆切碎后放入溫度為95-1001的鍋中蒸煮20-30-1取出后過100-200篩，收集濾液制得；所述組分8是將土豆切碎后放入榨汁機中壓榨，再把榨汁過80-100目篩，收集濾液制得。
[0006]有益效果
一、本發(fā)明在發(fā)酵液的制備過程中待菌種產(chǎn)生代謝生物后再接入第二批菌種，利用前批菌種產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物為第二批菌種提供營養(yǎng)物質(zhì)，大大促進了第二批菌種的生長，同時提高了其生物活性，從而產(chǎn)生大量發(fā)酵液，提高了粗榧生物堿的產(chǎn)量。
[0007]二、本發(fā)明通過將發(fā)酵液離心，取出上清液后再次離心，然后進行濃縮，除去了發(fā)酵液中的大部分雜質(zhì)，之后向濃縮液中加入他0！1溶液，并通過反復(fù)加熱、冷卻析出過程，大大提高了生物堿的純度。
[0008]三、通過將第二批菌種接種到本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，使得菌種生長迅速，代謝旺盛，大大提高了發(fā)酵液的產(chǎn)量，從而提高了粗榧生物堿的產(chǎn)量。

【具體實施方式】
[0009]一種粗榧生物堿產(chǎn)品的制備方法，選取多年生粗榧的根、莖、葉作為外植體，經(jīng)切條、滅菌后放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)使其長出粗榧共生菌，然后從粗榧共生菌中分離出可代謝粗榧生物堿的菌種并培養(yǎng)發(fā)酵，將發(fā)酵液濃縮后析出即制得產(chǎn)品，所述培養(yǎng)發(fā)酵的具體操作方法為將可代謝產(chǎn)生粗榧生物堿的菌種活化后放入溫度為261的環(huán)境中培養(yǎng)48匕再把菌種接種到裝有？0八培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，待菌種產(chǎn)生代謝生物1-2天后接入第二批菌種，以促進第二批菌種的生長，第二批接種的菌種長出后接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶內(nèi)，然后把搖瓶放入轉(zhuǎn)速為20017111111、溫度為280(:的搖床上培養(yǎng)5山收集菌種的發(fā)酵液即可；
所述發(fā)酵液濃縮的具體操作方法為將發(fā)酵液放入轉(zhuǎn)速為10000170111的冷凍高速離心機中離心，收集上清液，把上清液放入轉(zhuǎn)速為1000017111111的冷凍高速離心機中再次離心，然后把再次離心后的上清液放入溫度為40-501、壓強為0.051%的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的十分之一，再將濃縮液放入溫度為41的冰箱內(nèi)即可；
所述析出的具體操作方法為向濃縮液中加入似0！1溶液直至邱=8?9，析出生物堿和混合物，將混合物加入到體積濃度為95%的乙醇中，且混合物和乙醇的體積比為1:10，加熱到301后冷卻至15-181，析出生物堿，重復(fù)上述加熱、冷卻析出過程2-3次，合并生物堿，即制得產(chǎn)品。
[0010]所述搖瓶內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基由土豆汁、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、1叻04、1^2？04和水制成，且各組分的質(zhì)量百分比為土豆汁2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.12%，可溶性淀粉1%，188040.05%，狃2？04 0.15%，余量為水，培養(yǎng)基的邱=7 ；
所述土豆汁由組分八和組分8按照10:1的重量比混合后放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的三分之一后制得，所述組分八是將土豆切碎后放入溫度為95-1001的鍋中蒸煮20-30-1取出后過100-200篩，收集濾液制得；所述組分8是將土豆切碎后放入榨汁機中壓榨，再把榨汁過80-100目篩，收集濾液制得。
[0011]實施例1
一種粗榧生物堿產(chǎn)品的制備方法，包括以下步驟:
步驟一、外植體的選擇和處理
選取多年生粗榧的根、莖、葉作為外植體，用流水將外植體清洗干凈，再將根切成長為5-6(3111的長塊，除去莖上的老皮和枝葉，備用；
步驟二、外植體的滅菌將處理好的外植體放入超凈工作臺內(nèi)，先用體積濃度為75%的酒精滅菌5111111，再用質(zhì)量濃度為0.1%的升汞滅菌12111111，無菌水洗4遍后，把處理好的外植體放入無菌水中，備用；
步驟三、粗榧菌種的純化分離
把滅菌后的外植體分別接入裝有？0八培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，把接有外植體的培養(yǎng)瓶放置到溫度為251的培養(yǎng)架上進行培養(yǎng)，待培養(yǎng)瓶中長出菌種后，根據(jù)不同菌種的菌落特征從中分離出可代謝產(chǎn)生粗榧生物堿的菌株，備用；
步驟四、培養(yǎng)發(fā)酵
將可代謝產(chǎn)生粗榧生物堿的菌種活化后放入溫度為261的環(huán)境中培養(yǎng)48匕再把菌種接種到裝有？0八培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，待菌種產(chǎn)生代謝生物后接入第二批菌種，以促進第二批菌種的生長，第二批接種的菌種長出1天后接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶內(nèi)，然后把搖瓶放入轉(zhuǎn)速為20017111111、溫度為28?的搖床上培養(yǎng)5山收集菌種的發(fā)酵液，備用；步驟五、發(fā)酵液濃縮
將發(fā)酵液放入轉(zhuǎn)速為1000017^111的冷凍高速離心機中離心，收集上清液，把上清液放入轉(zhuǎn)速為10000170111的冷凍高速離心機中再次離心，把再次離心后的上清液放入溫度為401、壓強為0.051即的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的十分之一，將濃縮液放入溫度為41的冰箱內(nèi)，備用；
步驟六、析出
向濃縮液中加入版10?溶液直至邱=8,析出生物堿和混合物，將混合物加入到體積濃度為95%的乙醇中，且混合物和乙醇的體積比為1: 10，加熱到301后冷卻至151，析出生物堿，重復(fù)上述加熱、冷卻析出過程2次，合并生物堿，即制得粗榧生物堿；
步驟七、保存
將粗榧生物堿加入到體積濃度為95%的乙醇中，且粗榧生物堿和乙醇的體積比為1:10，密封溶解后置于溫度為41的冰箱內(nèi)即可。
[0012]步驟四所述搖瓶內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基由土豆汁、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、1叻04、狃2？04和水制成，且各組分的質(zhì)量百分比為土豆汁2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.12%，可溶性淀粉1%，%804 0.05%？狃2？04 0.15%，余量為水，培養(yǎng)基的邱二7。
[0013]所述土豆汁由組分八和組分8按照10:1的重量比混合后放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的三分之一后制得，所述組分八是將土豆切碎后放入溫度為951的鍋中蒸煮20-1取出后過100目篩，收集濾液制得；所述組分8是將土豆切碎后放入榨汁機中壓榨，再把榨汁過80目篩，收集濾液制得。
[0014]實施例2
一種粗榧生物堿產(chǎn)品的制備方法，包括以下步驟:
步驟一、外植體的選擇和處理
選取多年生粗榧的根、莖、葉作為外植體，用流水將外植體清洗干凈，再將根切成長為5-6(3111的長塊，除去莖上的老皮和枝葉，備用；
步驟二、外植體的滅菌
將處理好的外植體放入超凈工作臺內(nèi)，先用體積濃度為75%的酒精滅菌5111111，再用質(zhì)量濃度為0.1%的升汞滅菌12111111，無菌水洗5遍后，把處理好的外植體放入無菌水中，備用；
步驟三、粗榧菌種的純化分離
把滅菌后的外植體分別接入裝有？0八培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，把接有外植體的培養(yǎng)瓶放置到溫度為251的培養(yǎng)架上進行培養(yǎng)，待培養(yǎng)瓶中長出菌種后，根據(jù)不同菌種的菌落特征從中分離出可代謝產(chǎn)生粗榧生物堿的菌株，備用；
步驟四、培養(yǎng)發(fā)酵
將可代謝產(chǎn)生粗榧生物堿的菌種活化后放入溫度為261的環(huán)境中培養(yǎng)48匕再把菌種接種到裝有？0八培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，待菌種產(chǎn)生代謝生物2天后接入第二批菌種，以促進第二批菌種的生長，第二批接種的菌種長出后接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶內(nèi)，然后把搖瓶放入轉(zhuǎn)速為20017111111、溫度為28?的搖床上培養(yǎng)5山收集菌種的發(fā)酵液，備用；
步驟五、發(fā)酵液的濃縮
將發(fā)酵液放入轉(zhuǎn)速為1000017^111的冷凍高速離心機中離心，收集上清液，把上清液放入轉(zhuǎn)速為10000170111的冷凍高速離心機中再次離心，把再次離心后的上清液放入溫度為501、壓強為0.051即的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的十分之一，將濃縮液放入溫度為41的冰箱內(nèi)，備用；
步驟六、析出
向濃縮液中加入版10?溶液直至邱=9,析出生物堿和混合物，將混合物加入到體積濃度為95%的乙醇中，且混合物和乙醇的體積比為1: 10，加熱到301后冷卻至181，析出生物堿，重復(fù)上述加熱、冷卻析出過程3次，合并生物堿，即制得粗榧生物堿；
步驟七、保存
將粗榧生物堿加入到體積濃度為95%的乙醇中，且粗榧生物堿和乙醇的體積比為1: 10，密封溶解后置于溫度為41的冰箱內(nèi)即可。
[0015]步驟四所述搖瓶內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基由土豆汁、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、1叻04、狃2？04和水制成，且各組分的質(zhì)量百分比為土豆汁2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.12%，可溶性淀粉1%，%804 0.05%？狃2？04 0.15%，余量為水，培養(yǎng)基的邱二7。
[0016]所述土豆汁由組分八和組分8按照10:1的重量比混合后放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的三分之一后制得，所述組分八是將土豆切碎后放入溫度為1001的鍋中蒸煮
目篩，收集濾液制得；所述組分8是將土豆切碎后放入榨汁機中壓榨，再把榨汁過100目篩，收集濾液制得。
【權(quán)利要求】
1.一種粗榧生物堿產(chǎn)品的制備方法，選取多年生粗榧的根、莖、葉作為外植體，經(jīng)切條、滅菌后放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)使其長出粗榧共生菌，然后從粗榧共生菌中分離出可代謝粗榧生物堿的菌種并培養(yǎng)發(fā)酵，將發(fā)酵液濃縮后析出即制得產(chǎn)品，其特征在于:所述培養(yǎng)發(fā)酵的具體操作方法為將可代謝產(chǎn)生粗榧生物堿的菌種活化后放入溫度為26°c的環(huán)境中培養(yǎng)48h，再把菌種接種到裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，待菌種產(chǎn)生代謝生物1-2天后接入第二批菌種，以促進第二批菌種的生長，第二批接種的菌種長出后接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶內(nèi)，然后把搖瓶放入轉(zhuǎn)速為200r/min、溫度為280C的搖床上培養(yǎng)5d，收集菌種的發(fā)酵液即可； 所述發(fā)酵液濃縮的具體操作方法為將發(fā)酵液放入轉(zhuǎn)速為10000r/min的冷凍高速離心機中離心，收集上清液，把上清液放入轉(zhuǎn)速為10000r/min的冷凍高速離心機中再次離心，然后把再次離心后的上清液放入溫度為40-50°C、壓強為0.05Mpa的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的十分之一，再將濃縮液放入溫度為4°C的冰箱內(nèi)即可； 所述析出的具體操作方法為向濃縮液中加入NaOH溶液直至pH=8?9，析出生物堿和混合物，將混合物加入到體積濃度為95%的乙醇中，且混合物和乙醇的體積比為1:10，加熱到30°C后冷卻至15-18°C，析出生物堿，重復(fù)上述加熱、冷卻析出過程2-3次，合并生物堿，即制得產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從粗榧共生菌中分離出可代謝粗榧生物堿菌種的方法，其特征在于:所述搖瓶內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基由土豆汁、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、MgSO4, KH2PO4和水制成，且各組分的質(zhì)量百分比為土豆汁2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.12%，可溶性淀粉1%，MgSO4 0.05%, KH2PO4 0.15%，余量為水，培養(yǎng)基的 pH=7 ； 所述土豆汁由組分A和組分B按照10:1的重量比混合后放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的三分之一后制得，所述組分A是將土豆切碎后放入溫度為95-100°C的鍋中蒸煮20-30min，取出后過100-200篩，收集濾液制得；所述組分B是將土豆切碎后放入榨汁機中壓榨，再把榨汁過80-100目篩，收集濾液制得。
【文檔編號】C12P17/18GK104293854SQ201410543253
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】王祖華, 王安亭, 李永程, 姚戰(zhàn)軍, 楊瑞先, 王佳偉 申請人:洛陽理工學院