一種測(cè)定龍葵中總生物堿含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥質(zhì)量控制領(lǐng)域，設(shè)及一種龍葵中總生物堿的含量測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 龍葵為茄科植物龍葵Solanumnigrum的干燥地上部分，性寒，味苦，微甘，有小毒， 歸肺、胃二經(jīng)，有清熱解毒、消腫散結(jié)、消炎利尿的功效。龍葵的藥理活性成分主要為生物堿 類(lèi)，包括龍葵堿、澳洲茄邊堿、澳洲茄堿、澳洲茄明堿、茄微堿等。少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道了龍葵藥材 及制劑的含量測(cè)定方法，均W澳洲茄堿、澳洲茄邊堿為對(duì)照品，采用高效液相色譜法或與質(zhì) 譜聯(lián)用進(jìn)行測(cè)定。該方法對(duì)單體化合物的含量測(cè)定靈敏準(zhǔn)確，但用于總生物堿含量測(cè)定時(shí) 操作技術(shù)要求高，較為繁瑣，儀器維持和使用費(fèi)用較高，試劑成本耗費(fèi)較大，同時(shí)HPLC測(cè)定 含量時(shí)流動(dòng)相的選擇、加入的憐酸溶液等對(duì)峰形、保留時(shí)間等仍有一定影響。不同地區(qū)不同 部位的龍葵藥材中澳洲茄堿、澳洲茄邊堿含量差異較大，現(xiàn)代藥理研究顯示龍葵多種醬體 生物堿在體內(nèi)外均具有較好的抗腫瘤活性，因此W龍葵總生物堿的含量作為藥材檢測(cè)指標(biāo) 更合理。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)酸性染料比色法W紫外分光光度計(jì)測(cè)定龍葵中總生物堿含量的方法， 操作簡(jiǎn)便，成本低廉，精密度好、回收率高，重現(xiàn)性好，可作為龍葵藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)，W 克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種龍葵總生物堿含量檢測(cè)方 法，操作簡(jiǎn)便，成本低廉，精密度好、回收率高，重現(xiàn)性好，可作為龍葵藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)。
[0004] 1、一種測(cè)定龍葵中總生物堿含量的方法，其特征在于包括W下步驟： 陽(yáng)0化](1)對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取干燥至恒重的龍葵堿對(duì)照品5.OOmg，用氯仿溶 解，超聲20min，轉(zhuǎn)移至50血容量瓶，加氯仿稀釋至刻度，搖勻即得0.Img/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備 液；
[0006] (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液于5ml量瓶中用氯仿稀釋配成梯度 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密吸取2ml標(biāo)準(zhǔn)溶液置于分液漏斗中，加入酸性緩沖溶液及漠甲酪綠染料 溶液進(jìn)行顯色，再加入氯仿萃取，分取氯仿層脫水處理，取上清液按照紫外分光光度法，于 243nm處測(cè)定吸光度；W氯仿W相同試劑及步驟處理做空白對(duì)照；W龍葵堿含量為橫坐標(biāo)， W其吸光度值為縱坐標(biāo)，得龍葵總生物堿含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0007] (3)供試品溶液的制備：精密稱(chēng)取已過(guò)14目篩的龍葵藥材粉末2.Og，置于錐形瓶， 加入體積比為1 : 4的2mol/L鹽酸和90%乙醇混合溶劑30血，于40°C下超聲提取35min， 提取液減壓回收乙醇至無(wú)醇味的浸膏，浸膏用10%鹽酸溶解，超聲20min助溶，抽濾去除沉 淀，用10%鹽酸定容至10血，用10%化0H調(diào)節(jié)抑至10-11，加氯仿萃取3次，收集氯仿液， 定容至25ml，即得供試品溶液；
[000引 （4)樣品溶液的含量測(cè)定：精密吸取供試品溶液2.OmL，按照步驟似中所述，加入 酸性緩沖溶液及漠甲酪綠染料溶液進(jìn)行顯色，再加入氯仿萃取，分取氯仿層脫水處理，取上 清液按照紫外分光光度法，于243nm處測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到龍葵總生物堿 的含量。
[0009] 進(jìn)一步地，步驟（2)和（4)中酸性緩沖溶液為抑=3. 6的醋酸-醋酸鋼緩沖溶液， 加入量為3. 5ml。
[0010] 步驟似和（4)中漠甲酪綠染料溶液，加入量為2ml。
[0011] 步驟（2)和（4)中氯仿萃取及脫水處理要求為，用10ml氯仿分=次萃取，分別是 4血、3血、3血，密塞劇烈振搖5min后，靜置30min，取氯仿層用干燥定量濾紙過(guò)濾，加入干燥 具塞并已加入0. 25g無(wú)水硫酸鋼的=角燒瓶中靜置30min后，分取上清液。
[0012] 本發(fā)明W龍葵堿制備對(duì)照品溶液，將龍葵藥材制備成供試品溶液，在酸性緩沖溶 液中利用漠甲酪綠染料與生物堿結(jié)合成有色絡(luò)合物并W氯仿萃取，采用紫外分光光度計(jì)在 一定波長(zhǎng)處測(cè)定該有色溶液的吸收度，用W計(jì)算生物堿的含量。
[0013] 為使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明，本申請(qǐng)人進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)研究，W證 明本發(fā)明的效果：
[0014] 1 試藥
[0015] 龍葵飲片，購(gòu)自浙江嘉信醫(yī)藥有限公司，經(jīng)鑒別符合2010年版中國(guó)藥典（一部）。 龍葵堿對(duì)照品，購(gòu)自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20131223。漠甲酪綠、氯仿、乙醇、醋 酸、醋酸鋼、無(wú)水硫酸鋼等，購(gòu)自嘉興市甫宏化工有限公司，均為分析純。
[0016] 2儀器
[0017]UV2201型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津），BS224S型電子分析天平（北京賽多 利斯），BGZ246型數(shù)顯電熱恒溫干燥箱（上海博訊），L冊(cè)8A型連續(xù)投料粉碎機(jī)（新昌彰誠(chéng)機(jī) 械），RE5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮）、HH4型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋（常州國(guó)華）、GM0. 5B 型隔膜式真空累（天津津騰）、LX920S1型電動(dòng)吸引器（上海斯曼峰）、KQ300DE型數(shù)顯溫控 超聲清洗儀（昆山舒美）。 陽(yáng)〇1引 3溶液的配制
[0019] 3. 1緩沖溶液先配制0.2mol/L的醋酸溶液和醋酸鋼溶液。A液：量取醋酸 11. 55111以加蒸饋水稀釋至lOOOmU冷藏保存。B液：稱(chēng)取16. 4g醋酸鋼或27. 22g含水醋酸 鋼，加蒸饋水溶解，稀釋定容至lOOOmU冷藏保存。再依下表分別配制不同抑值的緩沖液： A液X血+B液y血，加水稀釋至100血，最后經(jīng)抑計(jì)校正。
[0021] 3. 2染料溶液0.05%漠甲酪綠溶液：精密稱(chēng)取0.Ig，溶于0.05mol/L氨氧化鋼溶 液2. 8血，用水稀釋至200血，搖勻即得。
[0022] 3. 3對(duì)照品溶液精密稱(chēng)取干燥至恒重的龍葵堿對(duì)照品5.OOmg，用氯仿溶解，超聲 20min，轉(zhuǎn)移至50血容量瓶，加氯仿稀釋至刻度，搖勻即得0.Img/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。
[0023] 3.4供試品溶液龍葵飲片60°C干燥，粉碎過(guò)14目篩。精密稱(chēng)取龍葵藥材粉末 2.Og，置于錐形瓶，加入2mol/L鹽酸：90 %乙醇（體積比1 : 4)的混合溶劑30血，于 40°C下超聲提取35min，提取液減壓回收乙醇至無(wú)醇味的浸膏，浸膏用10%鹽酸溶解，超聲 20min助溶，抽濾去除沉淀，用10%鹽酸定容至10血，用10%化0H調(diào)節(jié)抑至10-11，加氯仿 萃取3次，收集氯仿液，定容至25ml，即得供試品溶液。
[0024] 4測(cè)定波長(zhǎng)的選擇
[0025] 精密吸取龍葵堿對(duì)照品溶液與龍葵供試品溶液各分別置于分液漏斗中，分別 精密加入抑3. 6的醋酸-醋酸鋼緩沖溶液3. 5mU及漠甲酪綠染料再加入氯仿lOmL 分3次萃?。?, 3, 3mL)，密塞劇烈振搖5min后，靜置30min，分取氯仿層，用干燥定量濾紙過(guò) 濾，加入干燥具塞=角燒瓶中（已加入0. 25g無(wú)水硫酸鋼）靜置30min后，取上清液在紫外 分光光度計(jì)于200-700nm范圍內(nèi)分別掃描。另精密吸取氯仿置于分液漏斗同上操作， 所得氯仿液為空白對(duì)照液。結(jié)果表明，龍葵堿對(duì)照品溶液和龍葵供試品溶液均在243nm處 有最大吸收峰，而空白對(duì)照液在該處無(wú)吸收峰，故選擇243nm為測(cè)定波長(zhǎng)。 陽(yáng)0%] 5酸性染料比色法的建立
[0027] 5. 1緩沖液抑的考察精密吸取龍葵堿對(duì)照品溶液2. 0血共5份于分液漏斗中， 分別加入抑值為3. 6、4. 0、4. 4、4. 8、5. 2的醋酸-醋酸鋼緩沖液，其余操作同上，所得測(cè)定 液分別于243nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果表明緩沖液抑值為3. 6時(shí)，測(cè)定液有最大吸光度。精 密吸取供試品溶液2.OmL同法操作，結(jié)果與對(duì)照品所測(cè)一致。
[0028] 5.2緩沖液用量的考察精密吸取龍葵堿對(duì)照品溶液2.0血共5份于分液漏斗中， 分別加入抑值3. 6的緩沖液1. 0,1. 5, 2. 0, 2. 5, 3.OmU其余操作同上，所得測(cè)定液分別于 243nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果表明緩沖液用量為3. 5mL時(shí)吸光度最大。精密吸取供試品溶液 2. OmL同法操作，結(jié)果與對(duì)照品所測(cè)一致。
[0029] 5. 3酸性染料用量的考察精密吸取龍葵堿對(duì)照品溶液2.OmL共5份于分液漏 斗中，分別加入抑3. 6的緩沖液3. 5mU分別加入漠甲酪綠染料溶液1. 0,1. 5,2. 0,2. 5， 3. OmU其余操作同上，所得測(cè)定液分別于243nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果表明酸性染料用量為 2mL時(shí)吸光度最大。精密吸取供試品溶液2.OmL同法操作，結(jié)果與對(duì)照品所測(cè)一致。
[0030] 5. 4顯色穩(wěn)定性的考察精密吸取龍葵對(duì)照品溶液2. 0血共10份于分液漏斗中， 按照實(shí)施例2第1項(xiàng)方法操作，分別在顯色后的10, 20, 30,40, 50,60, 70,80,90,lOOmin時(shí)， 測(cè)定吸收度。結(jié)果表明在顯色后30min后吸收度無(wú)明顯變化。
[0031] 6酸性染料比色法測(cè)定龍葵中總生物堿含量的方法學(xué)考察
[0032] 6. 1精密度的考察精密吸取龍葵堿對(duì)照品溶液2.OmU按4項(xiàng)下方法操作測(cè)定， 連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果測(cè)得吸收值的RSD= 0. 49%，表明儀器精密度良好。
[0033] 6. 2穩(wěn)定性的考察精密吸取龍葵堿對(duì)照品溶液2.OmU按4項(xiàng)下方法操作測(cè)定， 每隔30min測(cè)1次吸收值，共測(cè)5次，結(jié)果顯示化內(nèi)吸收值RSD=0. 8%，說(shuō)明樣品液在化 內(nèi)穩(wěn)定性好。
[0034] 6. 3線性關(guān)系的考察精密吸取對(duì)照品溶液0. 5,1. 0,1. 5, 2. 0, 2. 5, 3. 0血于5ml 量瓶中用氯仿稀釋配成梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取2ml置于分液漏斗中，按4項(xiàng)下方法 操作，測(cè)定液在243nm測(cè)定吸光度。W龍葵堿含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線，計(jì)算回歸方程為Y= 0. 0129X-0. 0087，r2= 0. 9960,線性范圍為5-30yg/mL。見(jiàn)圖1。
[0035] 6. 4重復(fù)性試驗(yàn)精密稱(chēng)取同批號(hào)的龍葵干燥粉末5.Og，按4項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，各精密取2.OmU按照實(shí)施例2第1項(xiàng)方法操作測(cè)定吸光度，結(jié)果顯示RSD= 1. 53%。
[0036] 6. 5加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密吸取已測(cè)定含量的龍葵堿供試品溶液2.OmL各6份，加 入已知濃度的龍葵堿對(duì)照品溶液2.OmU按4項(xiàng)下方法操作測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程，計(jì) 算龍葵堿含量，并按下式計(jì)算回收率。結(jié)果顯示平均回收率為99.7%，RSD= 1.4%。
[0037] 加樣回收率（％ )=(測(cè)得量一供試品含量）/對(duì)照品含量X100%
[0038] 表1回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6)
[0041] 本發(fā)明的酸性染料比色法測(cè)定龍葵中總生物堿含量，是根據(jù)在適當(dāng)介質(zhì)中，堿性 藥物度）可