專利名稱：一種用于DNA Marker制備的質粒及其構建方法與用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學與基因工程領域，涉及一種基因工程中得以廣泛使用的 DNA分子量標準(DNA Marker)的生產方法。具體地，本發(fā)明涉及一種用于低成本快速生產高質量DNA Marker的質粒及其構建方法，同時涉及利用該質粒生產DNA Marker的方法與應用。
背景技術：
基因工程又稱重組DNA技術，是指在體外在分子水平上對DNA進行切割、連接、修飾等一系列操作的過程，是在分子生物學和分子遺傳學的基礎上綜合發(fā)展起來，誕生于20 世紀70年代的一門嶄新的生物科學技術。盡管該技術是一門年輕的技術，但其在生命科學、生物醫(yī)學領域甚至是物理學、高分子科學等領域的研究和應用中起到了非常巨大的作用。在對DNA的體外操作中，涉及到DNA分子的分離、純化、切割、修飾、連接、擴增、序列測定等許多過程，其中，最基礎而且應用非常廣泛的一項操作是DNA的電泳。DNA電泳是指利用DNA在中性緩沖液中帶負電的性質，在一定的電場作用下，在特定的支持介質中(比如瓊脂糖凝膠)，不同大小的DNA片段由于帶有的電荷量以及空間位阻等的不同而在支持介質中具有不同的泳動速度從而得以分離的過程。DNA電泳是基因工程中最基本的技術， DNA制備、檢測、濃度測定、目的DNA片段的純化，重組子的酶切鑒定等均需要電泳完成。在凝膠電泳中，在一定的范圍內，具有相同構型的DNA在相同的凝膠濃度和電場強度下，其遷移率與DNA分子的大小(通常也就是DNA片段的長度)呈線性關系。因此，可以用一組分子量(長度)已知的DNA片段混合物來指示未知DNA分子的大小。這種由一組分子量已知的，電泳后按其分子量大小和遷移率的不同可以在凝膠上形成一個DNA片段分布梯度，從而可以指示電泳過程中未知DNA樣品的分子量的DNA片段混合物就稱為DNA分子量標準，簡稱DNA Marker。DNA Marker的應用非常廣泛，是分子生物學實驗室的常用試劑。盡管實現 DNAMarker的原理非常簡單，但要制作低成本高質量的DNA Marker還是有相當的難度。目前各實驗室中DNA Marker的使用大部分是從商業(yè)公司購買，而且由于DNA Marker是消耗品，每個實驗室中的使用量非常大，具有廣闊而良好的市場前景。目前，許多生物公司也為此開發(fā)了多種針對不同應用的，具有不同分子量范圍的DNAMarker產品。DNA Marker的制備上，目前主要有兩種方法PCR法和酶切法。PCR法實現簡單，通過PCR(聚合酶鏈式反應)技術強大的擴增能力，在DNA聚合酶的作用下，根據特定的模板設計特定的引物擴增出一系列不同大小的DNA片段，通過純化、 定量和組合即形成了 DNA Marker。該方法的優(yōu)點是操作簡單、制作方便，各條帶的大小控制方便，不同大小的條帶可以靈活的組合成不同的DNAMarker。為了改善重復性和降低成本， 目前的主流方法已經由獲得單一的DNA片度PCR向多重PCR(多對引物針對同一模板或一對引物針對多個面板的情況)技術發(fā)展。但其仍然存在成本較高，長片段擴增困難或效率不高，條帶不夠銳利，條帶之間的亮度難以完全一致，重復性差等缺點。酶切法又分為以天然來源的基因組DNA的限制性酶切和基于人工構建載體的限制性酶切。天然來源的基因組DNA酶切是指分離某種來源固定、背景信息清晰的基因組DNA 分子，用一種或幾種限制性內切酶進行消化，從而產生一系列DNA片段組合。用該方法生產的最經典的DNA Marker是Lambda DNA/Hind III Marker，Lambda噬菌體基因組DNA經過內切酶Hind III消化后，產生125bp至23130bp大小的8條條帶。用這種方法生產DNA Marker 制作方便，在DNA來源方便的情況下，成本也比較低。但其缺點也是顯然易見的1、條帶距離不均勻，由于來自天然的基因組，DNA分子上的酶切位點的位置也是天然的，是不可控的， 因此DNAMarker中有的兩個條帶之間相聚很遠，不能清晰地指示該區(qū)域內的未知DNA分子量情況，有的兩個條帶之間距離很近，難以清晰地分開；2、基于同樣的原因，條帶的分子量未能是整數；3、條帶亮度嚴重不均一，這也是最嚴重的問題，由于對應片段在基因組中的拷貝數不可控，分子量大的條帶的亮度與分子量較小的條帶的亮度相差很遠，以Lambda DNA/ Hind III Marker為例，最大的條帶23130bp與最小的條帶125bp在亮度上要相差上百倍， 電泳過程中往往導致大條帶未實現良好分離而小條帶已經嚴重擴散導致亮度很低甚至不可見。為此，隨著基因工程技術的發(fā)展，人們想到用人工構建的DNA分子(比如質粒)進行限制性酶切來制備DNA Marker0通過一次性將所需要的片段以設計好的酶切方式連接到載體中，通過發(fā)酵培養(yǎng)和質粒DNA提取，適當酶切后既可獲得大量目標DNA片段。這種方法的優(yōu)勢在于可以通過大腸桿菌的培養(yǎng)獲得大量廉價的質粒DNA，通過酶切方法獲得的片段電泳時條帶銳利，生產重復性高，一旦質粒構建好，后續(xù)生產成本極低。酶切的方法又分為部分酶切和完全酶切。部分酶切是將具有某種單位長度而且?guī)в性O計好的酶切位點的片段順序連接到載體中，通過控制酶的活性、溫度和反應時間等酶切條件，實現載體的部分酶切，酶切產物將是質粒上該單位長度的倍數的片段。該方法適用于以單位長度遞增的DNA Marker (比如IOObp DNA Ladder，條帶為lOObp，200bp，300bp等依次遞增)的制備，其優(yōu)點是制備方便，條帶分布均勻，但其缺點是部分酶切的程度難以掌握，條帶亮度與酶切的完全程度相關。完全酶切是將設計好的一組不同大小的DNA片段克隆到特定的載體中，經過大腸桿菌擴增后，將純化得到的質粒DNA通過完全酶切，獲得相應大小的DNA片段。該方法制備的DNA Marker質量較好，但其缺點是前期載體構建復雜，而且目前所報道的利用完全酶切的方法產生的DNA Marker均未完美地解決不同大小的DNA片段在質粒中的拷貝數的問題， 從而未能解決酶切后所得到的各條DNA分子之間亮度的均一性問題。綜上所述，在目前DNA Marker的生產過程中，主要采用的PCR擴增的方式雖然簡單，但是一種勞動密集型的，難以保證批次之間重復性，從而難以實現大規(guī)模生產，總體成本較高的方法。酶切法中的人工構建DNA分子的酶切是將來技術發(fā)展的主流，但目前仍然存在前期載體分子構建復雜，制備不同種類的Marker靈活性欠佳，后期制備過程中條帶亮度不能完全均一的瓶頸。本發(fā)明通過在載體構建過程中合理搭配不同大小的DNA片段及其拷貝數，使得質粒DNA通過完全酶切后，各條帶的量完全一致，從而實現DNA Marker在凝膠上的均一性，尤其是小條帶的亮度問題。同時，本發(fā)明利用同尾酶的特點和巧妙的設計思路極大地簡化此類DNA分子的構建過程，大大提高了 DNA Marker制備的效率。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種低成本DNA Marker生產和制備的方法。利用這種方法制備DNA Marker具有成本低、速度快，產物條帶均一、銳利，條帶間亮度均一性極佳的特點，可以廣泛應用于DNA電泳過程中的分子量指示。本發(fā)明同時也提供了用于制備該DNA Marker的質粒及其構建方法。本發(fā)明根據準備生產的DNA Marker的條帶組成設計載體，使得可以用單一的酶釋放組成DNA Marker中的各片段，對載體中各片段拷貝數的設計使得酶切后得到的各條帶的量一致或可根據設計變化，從而實現所生產的DNA Marker的條帶間亮度的一致性或可根據設計變化。然后，將構建好的質粒擴增后，用完全酶切的方法制備DNA Marker0由于該載體片段較多，按常規(guī)方法構建復雜，工作量大，本發(fā)明利用同尾酶的特點對組成片段進行拼裝，大大簡化了載體構建的流程。本發(fā)明首先提供了一種用于DNA Marker制備的質粒，所述質粒符合下列要求含有組成目標DNAMarker的各大小不同的DNAMarker片段(為DNA片段)，各大小不同的DNA Marker片段在所述質粒中的拷貝數為一個以上(包括一個)，且各DNA Marker 片段之間含有同樣的單酶切位點。目標DNA Marker的片段大小可以根據需求設計，可以是任意數量任意長度片段的組合。所述單酶切位點可以是II型限制性內切酶酶切位點。較佳的，所述單酶切位點是任意片段內不存在多余的識別位點而且不與載體構建過程中的酶相沖突的II型限制性內切酶酶切位點。更佳地，應該選擇酶切效果好而且成本較低的酶切位點如Hind III，EcoR I，BamH I,Pst I等的酶切位點。進一步的，所述單酶切位點僅存在于各DNA Marker片段之間，不存在于各DNA Marker片段內部。由于單一的酶釋放即能得到組成目標DNA Marker的各片段，因此，質粒中每兩個相鄰的所述單酶切位點之間的距離都應等于目標DNA Marker中某一 DNA片段的大小，即每兩個相鄰的所述單酶切位點之間的堿基數均與目標DNAMarker中某一 DNA片段的堿基數相等。滿足上述設計要求的質粒能用單一的酶釋放得到組成目標DNA Marker的各片段。進一步的，組成DNA Marker的各片段在該質粒中的拷貝數與該片段的長度有關， 要達到同樣信號強度，長度越小的片段在質粒中的拷貝數越高。進一步的，某DNA Marker片段在所述質粒中的拷貝數與該DNA Marker片段長度的乘積，比上另一 DNAMarker片段在所述質粒中的拷貝數與該另一 DNAMarker片段長度的乘積獲得的比值，等于DNA Marker中，所述某DNA Marker片段與所述另一 DNA Marker片段的信號強度比值。艮P: (Na X Ca) (NbXCb) = Sa Sb其中，Na表示DNA Marker片段a的堿基數，Nb表示DNA Marker片段b的堿基數， Na Φ Nb ；Ca表示DNA Marker片段a在質粒中的拷貝數，Cb表示DNA Marker片段b在質粒中的拷貝數；Sa表示DNA Marker片段a的信號強度；Sb表示DNAMarker片段b的信號強
例如，質粒中，IOObp大小的DNA Marker片段在所述質粒中的拷貝數是200bp大小的DNA Marker片段在所述質粒中的拷貝數的2倍，那么最終獲得的DNAMarker中，IOObp 大小的DNA Marker片段與200bp大小的DNA Marker片段的信號強弱比例即為1 1 ；再比如，質粒中，IOObp大小的DNA Marker片段在所述質粒中的拷貝數與200bp大小的DNA Marker片段在所述質粒中的拷貝數相等，那么最終獲得的DNA Marker中，IOObp大小的DNA Marker片段與200bp大小的DNA Marker片段的信號強弱比例即為1 2，其余以此類推?？梢酝ㄟ^調整各大小不同的DNA Marker片段的拷貝數來使得DNA Marker中，各大小不同的DNA Marker片段的信號強弱比例符合預期。較佳的，拷貝數與片段長度的關系為各條帶拷貝數與片段長度的乘積一致(為了便于觀察在DNA Marker中需要特意加強亮度的條帶除外)，保持這種關系使得組成DNA Marker的各條帶在質粒酶切后，各片段的量相等，從而在凝膠上亮度一致。以目前廣泛使用的含有 6 條帶(lOObp, 250bp, 500bp, 750bp, IOOObp, 2000bp)的 DNA Marker 為例，如圖 1 所示，則該質粒中，2000bp片段的拷貝數為1個，IOOObp片段的拷貝數為2個，500bp片段的拷貝數為4個，250bp片段拷貝數為8個，IOObp片段拷貝數為20個，750bp的片段為了加強顯示，拷貝數為4個，該條帶的亮度將是其他條帶的1. 5倍。則整個質粒分子的結構如圖2 所示，完整質粒大小為13000bp，當然，在構建質粒載體時，條帶之間的順序并不重要。所述質粒應當與其他常用質粒載體一樣，包括一些必須的元件，如復制子、抗性基因和篩選標記。為便于設計，所述元件可以位于質粒中堿基數最多的DNA Marker片段中。如實施例具體列舉的，所述制備DNA Marker的質粒的DNA序列為SEQ ID NO 1。本發(fā)明還進一步公開了符合上述設計要求的用于DNA Marker制備的質粒的制備方法。從圖2可以看出，以該質粒為例，質粒共有39個條帶，如果按照常規(guī)的克隆，需要做38次克隆，工作量非常大，這也是為什么目前該方法未能在商業(yè)上廣泛使用的原因之一。本發(fā)明利用同尾酶的特點完成質粒的構建，極大地簡化了構建過程。同尾酶是一類來源各異，識別序列不同，但切割DNA產生相同的，可以相互連接的粘性末端的限制性內切酶， 常見的同尾酶對有 BamH I/Bgl II/Bcl I，Spe I/Xba I/Nhe I，Nco I/Pci I, Sal I/Xho I等。同尾酶的特點如圖3所示，以BamH I和Bal II為例，這兩個酶分別識別“GGATCC”和 “AGATCT”的DNA序列，酶切后留下相同的5，突出“GATC”的粘性末端，這兩個粘性末端匹配連接后，形成“GGATCT”的序列，該序列將不被BamH I或Bgl II中的任意一個切割。利用這個特點進行載體構建，使得完成整個載體僅需要用到BamH I或Bgl II這兩個酶，極大地簡化了內切酶的選擇和使用。具體構建流程如圖4所示，首先在受體質粒上引入一個BamH I和一個后期DNA Marker制備過程中用到的酶切位點(此處以Hind III為例)，在提供片段的供體載體上，片段的兩端分別引入BamH I和Bgl II位點，在其內部引入一個Hind III 位點，所有片段中BamH I位點與Hind III之間的距離一致，從而保證每兩個Hind III位點之間的距離等于預設好的片段大小。構建時，用BamH I單酶切受體質粒并進行去磷酸化處理以減少自連率，用BamH I和Bgl II雙酶切供體質粒釋放片段，該片段與供體質粒相連后，將形成一個帶有該片段的質粒，由于BamH I與Bgl II相連后兩個酶切位點消失，所以該質粒仍然只帶有一個BamH I位點。以同樣的方式，可以接受另一個片段，直到所有片段按照預定的方式進入載體。由于本載體中涉及到的片段眾多，如果逐個添加，僅以20個IOObp的片段為例則需要19個克隆步驟才能完成整個載體。同樣地，本發(fā)明采用同尾酶的方法，如圖5所示，將這些片段按幾何級數的方式連接，則僅需要5個克隆步驟即可完成20個片段的連接。采用同樣的方式，構建8個串聯(lián)的250bp片段，4個串聯(lián)的500bp片段，4個串聯(lián)的750bp片段和 2個串聯(lián)的IOOObp片段。本發(fā)明質粒的制備方法具體包括如下的步驟(1)根據目標DNA Marker的片段組成設計目標質粒，設計的目標質粒滿足下列要求含有組成目標DNA Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNAMarker片段在所述質粒中的拷貝數為一個以上(包括一個)，且各DNA Marker片段之間含有同樣的單酶切位點；(2)確定用于質粒構建的同尾酶對，確定用于完全酶切法制備DNA Marker的所述單酶切位點對應的酶；(3)選擇高拷貝數質粒作為骨架載體并在其中引入一個所述同尾酶對中任意一個同尾酶的酶切位點和一個所述單酶切位點，構建完成的骨架載體中，所述同尾酶的酶切位點及所述單酶切位點均為唯一。(4)制備組成目標DNA Marker的各個條帶的DNA Marker前體片段，并分別連接到中間載體中獲得各DNA Marker前體片段的中間載體，這些前體片段兩端為所述同尾酶對的酶切位點，中間包含一個所述單酶切位點，各DNA Marker前體片段中所述單酶切位點離片段某一端的距離一致，且各DNA Marker前體片段中該端的同尾酶酶切位點相同，在構建完成的中間載體中，所述同尾酶對中任一同尾酶的酶切位點及所述單酶切位點均為唯一。(5)將中間載體中的各DNA Marker前體片段依次連接起來，構建到步驟3制備的骨架載體中，形成可以用于DNA Marker制備的質粒。步驟1中目標質粒的設計還可進一步滿足之前所述的各種要求。步驟2中，所述同尾酶對應的酶切位點應不同于所述單酶切位點。進一步的，步驟3構建的骨架載體中，引入的同尾酶酶切位點應當至少包括步驟4 制備的所有DNA Marker前體片段中，與所述單酶切位點距離一致的一端所含的同尾酶酶切位點，且在骨架載體與步驟4制備的所有DNA Marker前體片段中，該同尾酶酶切位點與所述單酶切位點的距離一致。步驟4中，所述DNA Marker前體片段中，所述同尾酶對的酶切位點之間的堿基數與其對應的DNA Marker片段相同，兩者的不同在于如圖6所示，若以前體片段中與所述單酶切位點距離一致的一端所在的同尾酶酶切位點到所述單酶切位點的序列為A，所述單酶切位點到前體片段中另一同尾酶酶切位點的序列為B，那么所述DNA Marker前體片段中， 所述同尾酶對的酶切位點之間的序列就為A-B，而與其對應的DNA Marker片段的序列就為 B-A。步驟4中，制備組成DNA Marker的各個條帶的DNA Marker前體片段的方法可采用各種現有的制備DNA片段的方法，包括但不限于用PCR或酶切的方法、化學合成等。進一步的，步驟5可分別以步驟4獲得的各DNA Marker前體片段的中間載體為起點，反復利用同尾酶酶切及拼接的方式獲得含有各DNA Marker前體片段串聯(lián)重復片段的中間載體，直至各DNA Marker前體片段的中間載體中，DNA Marker前體片段的拷貝數達到設計要求；而后再次利用同尾酶酶切及拼接的方式，將含有符合設計DNA Marker前體片段拷貝數要求的各中間載體中的DNA Marker前體片段拼接入步驟3制備的骨架載體中，形成可以用于DNA Marker制備的質粒。所述同尾酶對是指，兩個識別不同DNA序列但酶切后產生相同DNA末端的限制性內切酶。適用于本發(fā)明中的同尾酶對可以是，但不局限于BamH I/Bgl II/BclI中的任意兩個，Spe I/Xba I/Nhe I 中的任意兩個，Nco I/Pci I，Sal I/Xho I 等。所述高拷貝數質粒是指，可以存在于細菌體內的，其復制與細菌基因組DNA的復制不關聯(lián)的，在單個細菌體內可以達到300個拷貝數以上的質粒。適用于本發(fā)明的質?？梢允?，但不局限于PUC系列，pBluescript系列，pGEM系列，pTZ系列等。所述中間載體可選自pUC18，pUC19,pUC57, pBR322, pUCm-T，pSG-TS，pMD18_T， PMD19-T等多種克隆載體。本發(fā)明還提供了一種DNA Marker的制備方法，包括下列步驟A.構建前述用于制備DNA Marker的質?；蛘咧苯硬捎脴嫿ê玫挠糜谥苽?DNAMarker 的質粒；B.將步驟A所述質粒轉入合適的宿主菌后擴增質粒；C.分離質粒并采用所述單酶切位點對應的限制性內切酶完全酶切質粒獲得DNA Marker。所述的宿主菌可以是大腸桿菌。所述完全酶切法制備DNA Marker是指，用一個或多個限制性內切酶對質粒DNA過量消化，使得質粒上的每一個該酶的識別位點均被切開，釋放相應大小的片段。所述用于完全酶切法制備DNA Marker的所述單酶切位點對應的酶是指，用于切割質粒后產生如設計所示的各DNA條帶的酶。適用于本發(fā)明中的該酶可以是質粒中除了片段相連處之外的序列中不含有的任意II型限制性內切酶，更佳地，宜選用成本較低的酶，如 Hind III，BamH I, EcoR I，Pst I 等。當采用實施例列舉的序列為SEQ ID NO 1的質粒制備DNA Marker時，可將其轉入大腸桿菌復制，并采用Hind III完全酶切質粒獲得DNA Marker.采用本發(fā)明的方法用制備DNA Marker具有如下優(yōu)點1、所制備的Marker條帶銳利，尤其是條帶間亮度均一性極佳。2、前期載體構建好后，后期Marker生產成本很低，生產量可大可小，縮放非常方便。3、穩(wěn)定性高，生產過程簡單，批次間重復性極好。4、解決了前期載體構建流程復雜的問題，本發(fā)明的方法可以方便地拓展用于不同種類DNA Marker的制備。


圖1是DNA Marker組成片段大小與拷貝數的關系示意2是用于制備DNA Marker的質粒DNA及其中的片段大小與拷貝數關系示意3是同尾酶酶切位點的特點示意圖
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圖4是同尾酶在本發(fā)明中的應用原理示意5是相同長度的片段幾何倍數克隆原理示意6DNA Marker前體片段及其對應的DNA Marker片段示意圖a :DNA Marker前體片段示意圖b 對應的DNA Marker片段示意7是不同長度的片段幾何倍數克隆原理示意8是實施例中所述DNA Marker瓊脂糖凝膠電泳效果圖
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，旨在進一步舉例說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明所要保護的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1一種通用小分子量DNA Marker的制備本實施例講述一種通用的小分子量DNA Marker的制備，該Marker含有6個DNA 條帶，分別為2000bp，IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp,是目前在各實驗室中應用最為廣泛的DNA Marker，為了易于識別，我們對750bp的條帶亮度進行了加強。如未特別注明，本實施例中所用的生化試劑以及PCR或核酸提取與純化試劑盒等均來自生工生物工程(上海)有限公司；所有引物合成均由生工生物工程(上海)有限公司采用固相亞磷酰胺三酯法合成，用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法純化；所有DNA序列測定均由生工生物工程(上海)有限公司采用雙脫氧鏈終止法結合Applied Biosystems 3730/3730x1 DNA Analyzers儀器分析；所有限制性內切酶均采購自富酶泰斯生物技術 (深圳)有限公司(Fermentas China Co.，Ltd.)。如未特別注明，本實施例中所用的PCR反應體系為
10 X PCR buffer5 μ L
25 mM MgSO43 μ L
2. 5 mM dNTP mix2 μ L
Primer F (10 μ mol/L)2 μ L
Primer R (10 μ mol/L)2 yLPlasmid DNA (50 ng/μ )0. 1 μ L
細2035 μ L
tag DNA polymerase_1 μ L
Total volume50 μ L反應程序94V for 2min, (94 V for 15sec，65 V ramp to 58 V for 15sec，72 "C for 80sec) XlOcycles, (94 "C for 15sec，58 "C for 15sec，72 "C for 80sec) X20cycles,72°C for 2min。如未特別注明，本實施例中所用PCR產物或酶切產物均用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用EB染色后于紫外線下觀察，DNA定量均用Bio-Tek公司微孔板微量分光光度計測定。如未特別注明，本實施例中所用的限制性內切酶酶切反應體系為
10 χ Buffer 5 μ L BSA (10 mg/ml) 0.5 μ L Target DNA (50 ng/μ ) 10 μ L Restriction Enzyme (5 U/μ 1) 2 μ L ddH20_32. 5 μ L
Total volume50 μ L反應條件為37°Cfor 3hour0如未特別注明，本實施例中所用的DNA連接反應體系為
10 χ Buffer 2 μ L DNA fragment A 0.5 μ L DNA fragment B 0. 5 μ L T4 DNA ligase (5 U/μ 1) 2 μ L ddH20_15 μ L
Total volume20 μ L反應條件為16°Cfor 3hour。如未特別注明，本實施例中所用的轉化菌株為大腸桿菌DH5 α。如未特別注明，本實施例中所用的DNA去磷酸化酶為小牛堿性磷酸酶(CIP)反應體系為10 X Buffer 2 μ L DNA fragment 0.5 μ L CIP (5 U/μ 1) 2 μ L ddH20_15 μ L
Total volume20 μ L反應條件為37°C for 30min,75°C for IOmin0反應結束后，用DNA膠回收或PCR Cleanup試劑盒的方法回收目標片段。1. 1載體分子的設計根據本發(fā)明的方法，本實施例中選擇克隆載體pUC18為骨架載體，帶有氨芐青霉素抗性基因；選用Hind III作為完全酶切法制備DNA Marker的酶；選則BamH I/Bgl II作為同尾酶對；每個片段中的Hind III位點位于BamH I端，相隔Obp。根據本發(fā)明的方法， 用于制備該DNA Marker的質粒總大小為13000bp，以Hind III為間隔，其中包含2000bp片段1個拷貝，IOOObp片段2個拷貝，750bp片段4個拷貝，500bp片段4個拷貝，250bp片段 8個拷貝，IOObp片段20個拷貝。該質粒的完整序列如SEQ ID NO. 1所示。1. 2各目標DNA前體片段的獲得1. 2. 12000bp 前體片段合成弓丨物 p2000F(5，-cgcggatccaagcttgctcactgactcgctgcg-3‘)禾口 p2000R( 5，-cgcggatccgacgaaagggcctcgtgata-3‘)，以載體 pUC18 質粒 DNA 為模板，用 taq DNA polymerase進行擴增，獲得的2000bp片段用BamH I酶切后進行自身環(huán)化。轉化大腸桿菌篩選正確的克隆，該質粒命名為P2000-1。該質粒的完整序列如SEQ ID N0. 2所示。1. 2. 2 IOOObp 前體片段合成弓I物 pl000F(5，-ggatccaagcttggcaagcataagcacacaga-3‘)禾口 pl000R(5，-a gatctcaccgcttcagaagttcaca-3‘)，VX Lambda ΒΜ Ι ' Φ DNA 1 , M taqDNA polymerase 3 行擴增，獲得的IOOObp片端，將該片段用TA克隆的方法克隆至生工生物工程(上海)有限公司提供的載體PSG-TS中，選用該載體的原因是，該載體多克隆位點被移除，后續(xù)酶切釋放片段時不會產生干擾。轉化大腸桿菌并篩選正確克隆，該質粒命名為plOOO-1。該片段的序列如SEQ ID N0. 3所示。1. 2. 3750bp前體片段合成弓I物 p750F(5，-ggatccaagcttcgccaccatggtgagc-3‘)和 p750R(5，-agatct tcgcggccgctttac-3’)，以載體 pEGFP-Nl 為模板，用 taq DNApolymerase 進行擴增，獲得的 750bp片端，將該片段用TA克隆的方法克隆至生工生物工程(上海)有限公司提供的載體 pSG-TS中。轉化大腸桿菌并篩選正確克隆，該質粒命名為P750-1。該片段的序列如SEQ ID N0. 4所示。1. 2. 4500bp 前體片段合成弓I物 p500F(5，-ggatccaagcttatttccccgaaaagtgcc-3‘)禾口 p500R(5，-agat ctgcgaatgggacgcg-3')，以載體 pET30a 為模板，用 taq DNA polymerase 進行擴增，獲得的 500bp片端，將該片段用TA克隆的方法克隆至生工生物工程(上海)有限公司提供的載體 pSG-TS中。轉化大腸桿菌并篩選正確克隆，該質粒命名為P500-1。該片段的序列如SEQ ID N0. 5所示。
1. 2. 5250bp 前體片段合成弓丨物 P250F (5，-ggatccaagctttcgcgcgtttcggt-3，)和 p250R(5，-agatctcgcc tgatgcggtatttt-3，)，以載體pUC18 為模板，用 taq DNApolymerase 進行擴增，獲得的 250bp 片端，將該片段用TA克隆的方法克隆至生工生物工程(上海)有限公司提供的載體pSG-TS 中。轉化大腸桿菌并篩選正確克隆，該質粒命名為P250-1。該片段的序列如SEQ ID NO. 6 所示。1. 2. 6100bp 前體片段合成弓丨物 pl00F(5，-ggatccaagcttcaactcaaccctgtccgatt-3，)禾口 pl00R(5，~aga tctggacaggaccagcatacgat-3‘)，Lambda ΒΜ Ι ' Φ DNA 1 , M taqDNA polymerase 3 ^ff 擴增，獲得的IOObp片端，將該片段用TA克隆的方法克隆至生工生物工程(上海)有限公司提供的載體PSG-TS中。轉化大腸桿菌并篩選正確克隆，該質粒命名為plOO-1。該片段的序列如SEQ ID NO. 7所示。以上載體均進行DNA序列測定確定插入片段的長度。1. 3前體片段的幾何級數拼裝用BamH I單酶切質粒ρ100_1，回收大片段，并將該片段進行去磷酸化處理；用 BamH I和Bgl II雙酶切同樣的質粒pl00_l，回收IOObp大小的小片段；將該片段與上述載體連接，轉化后挑選正確克隆，則得到一個還有2個拷貝IOObp片段的載體，這兩個片段上分別帶有Hind III酶切位點且這兩個位點之間的距離為lOObp，該質粒命名為plOO-2。以載體plOO-2為起始載體，用同樣的方法獲得帶有4個拷貝IOObp片段的載體plOO-4。以載體plOO-4為起始載體，用同樣的方法獲得帶有4個拷貝IOObp片段的載體plOO-8。以載體 plOO-8為起始載體，用同樣的方法獲得帶有4個拷貝IOObp片段的載體plOO-16。用BamH I單酶切質粒plOO-16，回收大片段，將其與用BamH I和Bgl II雙酶切從pl00_4上獲得的片段連接，形成帶有20個拷貝IOObp片段的載體P100-20。以同樣的方法獲得帶有8個拷貝250bp片段的載體P250-8 ；帶有4個拷貝750bp 片段的載體P750-4 ；帶有4個拷貝500bp片段的載體p500-4 ；帶有2個拷貝IOOObp片段的載體 ρ 1000-2。1.4終載體的組裝用BamH I單酶切質粒p2000_l，回收大片段，并將該片段進行去磷酸化處理；用 BamH I和Bgl II雙酶切質粒pl00_20，回收大小為2000bp的片段；將該片段連接到上述載體中，轉化后挑選陽性克隆。重復同樣的步驟，直至上述各種大小的重復片段均進入骨架載體中，終載體命名為PSDM2000。經測序，載體的序列為SEQ ID NO :1。1. 5DNA Marker 的制備將pSDM2000質粒以常規(guī)方法轉化大腸桿菌，將帶有pSDM2000質粒的大腸桿菌大量繁殖，用堿裂解法結合柱式DNA純化法抽提質粒。用Hind III對質粒進行單酶切，反應
體系如下10 X Buffer 50 μ L BSA (10 mg/ml) 5 μ L PSDM2000 DNA (100 ng/μ ) 250 μ L Η η III (5 U/μ 1) 25 μ L ddH20_170 μ L
Total volume500 μ L反應條件為37°Cfor IOhours。反應結束后，按照1 5的比例加入6x DNA Loading Buffer，所制備的Marker即可應用于瓊脂糖凝膠電泳。如圖8所示，三個泳道上樣量分別為3ul，5ul和8ul，可以看到該DNA Marker條帶分布均勻，亮度均一(750bp條帶如設計所示有亮度增強的效果)，符合本發(fā)明的設計要求。
權利要求
1.一種用于DNA Marker制備的質粒，所述質粒含有組成目標DNA Marker的各大小不同的DNA Marker片段，各大小不同的DNA Marker片段在所述質粒中的拷貝數為一個以上， 且各DNA Marker片段之間含有同樣的單酶切位點。
2.如權利要求1所述用于DNAMarker制備的質粒，其特征在于，所述單酶切位點為II 型限制性內切酶酶切位點。
3.如權利要求1所述用于DNAMarker制備的質粒，其特征在于，所述單酶切位點選自 Hind III, EcoR I.BamH I 或 I3St I 的酶切位點。
4.如權利要求1-3任一所述用于DNAMarker制備的質粒，其特征在于，所述單酶切位點僅存在于各DNA Marker片段之間，不存在于各DNA Marker片段內部，且質粒中每兩個相鄰的所述單酶切位點之間的距離均對應等于目標DNA Marker中某一 DNA片段的大小。
5.如權利要求4所述用于DNAMarker制備的質粒，其特征在于，組成目標DNAMarker 的各大小不同的片段在該質粒中的拷貝數與該片段的長度有關，要達到同樣信號強度，長度越小的片段在質粒中的拷貝數越高。
6.如權利要求5所述用于DNAMarker制備的質粒，其特征在于，某DNA Marker片段在所述質粒中的拷貝數與該DNA Marker片段長度的乘積，比上另一 DNAMarker片段在所述質粒中的拷貝數與該另一DNA Marker片段長度的乘積獲得的比值，等于DNA Marker中，所述某DNA Marker片段與所述另一 DNAMarker片段的信號強度比值。
7.如權利要求5所述用于DNAMarker制備的質粒，其特征在于，各DNA Marker片段拷貝數與片段長度的關系為各DNA Marker片段拷貝數與片段長度的乘積一致。
8.如權利要求1所述用于DNAMarker制備的質粒，其特征在于，所述質粒的DNA序列為 SEQ ID NO :1ο
9.一種用于DNA Marker制備的質粒的制備方法，包括下列步驟(1)根據目標DNAMarker的片段組成設計目標質粒，設計的目標質粒滿足下列要求 含有組成目標DNA Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNAMarker片段在所述質粒中的拷貝數為一個以上，且各DNA Marker片段之間含有同樣的單酶切位點；(2)確定用于質粒構建的同尾酶對，確定用于完全酶切法制備DNAMarker的所述單酶切位點對應的酶；(3)選擇高拷貝數質粒作為骨架載體并在其中引入所述同尾酶對中任意一個同尾酶的酶切位點和一個所述單酶切位點，構建完成的骨架載體中，所述同尾酶的酶切位點及所述單酶切位點均為唯一；(4)制備組成DNAMarker的各個條帶的DNA Marker前體片段，并分別連接到中間載體中獲得各DNA Marker前體片段的中間載體，這些片段兩端為所述同尾酶對的酶切位點，中間包含一個所述單酶切位點，各DNA Marker前體片段中所述單酶切位點離片段某一端的距離一致，且各DNA Marker前體片段中該端的同尾酶酶切位點相同，在構建完成的中間載體中，所述同尾酶對中任一同尾酶的酶切位點及所述單酶切位點均為唯一；(5)將中間載體中的各DNAMarker前體片段依次連接起來，構建到步驟(3)制備的骨架載體中，形成可以用于DNA Marker制備的質粒。
10.如權利要求9所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述同尾酶對應的酶切位點應不同于所述單酶切位點。
11.如權利要求9所述的制備方法，其特征在于，步驟(5)為分別以步驟(4)獲得的各DNA Marker前體片段的中間載體為起點，反復利用同尾酶酶切及拼接的方式獲得含有各 DNA Marker前體片段串聯(lián)重復片段的中間載體，直至各DNA Marker前體片段的中間載體中，DNA Marker前體片段的拷貝數達到設計要求；而后再次利用同尾酶酶切及拼接的方式， 將含有符合設計DNA Marker前體片段拷貝數要求的各中間載體中的DNA Marker前體片段拼接入步驟3制備的骨架載體中，形成可以用于DNA Marker制備的質粒。
12.如權利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述同尾酶對選自BamHI/Bgl II/Bcl I中的任意兩個，Spe I/Xba I/Nhe I中的任意兩個，Nco I/Pci I或Ml I/Xho I。
13.如權利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述中間載體選自pUC18，pUC19， pUC57, pBR322, pUCm-T，pSG-TS，pMD18_T 或 pMD19_T。
14.如權利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述單酶切位點為II型限制性內切酶酶切位點。
15.如權利要求14所述的制備方法，其特征在于，所述單酶切位點選自HindIII.EcoR I、BamH I或I3St I的酶切位點。
16.如權利要求9-15任一權利要求所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)設計的目標質粒中，所述單酶切位點僅存在于各DNA Marker片段之間，不存在于各DNA Marker片段內部，且質粒中每兩個相鄰的所述單酶切位點之間的距離均對應等于目標DNA Marker中某一 DNA片段的大小。
17.如權利要求16所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)設計的目標質粒中，組成目標DNA Marker的各大小不同的片段在該質粒中的拷貝數與該片段的長度有關，要達到同樣信號強度，長度越小的片段在質粒中的拷貝數越高。
18.如權利要求17所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)設計的目標質粒中，某 DNA Marker片段在所述質粒中的拷貝數與該DNA Marker片段長度的乘積，比上另一 DNA Marker片段在所述質粒中的拷貝數與該另一 DNAMarker片段長度的乘積獲得的比值，等于 DNA Marker中，所述某DNA Marker片段與所述另一 DNA Marker片段的信號強度比值。
19.如權利要求16所述的制備方法，其特征在于，步驟⑴設計的目標質粒中，各DNA Marker片段拷貝數與片段長度的關系為各DNA Marker片段拷貝數與片段長度的乘積一致。
20.如權利要求1所述用于DNAMarker制備的質粒，其特征在于，步驟(1)設計的目標質粒的DNA序列為SEQ ID NO :1。
21.—種DNA Marker的制備方法，包括下列步驟A.采用權利要求9-20任一權利要求所述制備方法構建用于制備DNAMarker的質粒； 或者直接采用權利要求1-8任一權利要求所述用于DNAMarker制備的質粒；B.將步驟A所述質粒轉入合適的宿主菌后擴增質粒；C.分離質粒并采用所述單酶切位點對應的限制性內切酶完全酶切質粒獲得DNA Marker0
22.如權利要求21所述一種DNAMarker的制備方法，其特征在于，所述的宿主菌為大腸桿菌。
23.如權利要求21所述一種DNAMarker的制備方法，其特征在于，步驟A所述質粒為序列為SEQ ID NO :1的質粒，步驟B所述宿主菌為大腸桿菌，步驟C所述限制性內切酶為 Hind III。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于DNA Marker制備的質粒及其構建方法與用途。本發(fā)明所述質粒含有組成目標DNA Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNA Marker片段在所述質粒中的拷貝數為一個以上，且各DNA Marker片段之間含有同樣的單酶切位點。本發(fā)明還提供了低成本快速制備DNA分子量標準的方法，用該方法生產的DNA Marker具有條帶銳利，亮度均一或可隨意控制，批次間重復性好等特點。
文檔編號C12N15/70GK102337284SQ20111029762
公開日2012年2月1日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權日2011年9月30日
發(fā)明者萬軍飛, 李威 申請人:生工生物工程(上海)有限公司