專利名稱：一種用于質(zhì)粒分析的整體床的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于質(zhì)粒分析的整體床的合成方法，屬于生物分子分析和色譜分析技術(shù) 領(lǐng)域。
技術(shù)背景基因治療和DNA疫苗在癌癥、單基因遺傳病、艾滋病、心血管疾病、關(guān)節(jié)炎等重大疾病 的診斷和治療方面的應(yīng)用研究正日益引起越來(lái)越廣泛的關(guān)注。目前質(zhì)粒逐漸成為基因治療的 最重要的基因傳遞系統(tǒng)，因此應(yīng)用于基因治療的藥用質(zhì)粒的大規(guī)模制備成為其基礎(chǔ)。而藥用 質(zhì)粒的大規(guī)模制備過(guò)程的關(guān)鍵之一在于如何監(jiān)測(cè)質(zhì)粒純度、監(jiān)測(cè)質(zhì)粒制備過(guò)程的性能，評(píng)價(jià) 最終產(chǎn)品質(zhì)量以及產(chǎn)品的規(guī)格等，這對(duì)于過(guò)程開(kāi)發(fā)、認(rèn)證、產(chǎn)品批準(zhǔn)非常重要。質(zhì)粒分析方法主要包括紫外吸收光譜法、熒光光譜法、電泳法、色譜法等。近年來(lái)，色 譜法除了作為藥用質(zhì)粒大規(guī)模制備過(guò)程中重要的分離純化技術(shù)之外，也逐漸成為制備過(guò)程中 不可缺少的高效分析方法。在質(zhì)粒分析過(guò)程中存在反相色譜、疏水相互作用色譜、體積排阻 和離子交換色譜等多種模式。離子交換色譜既可以用于質(zhì)粒和雜質(zhì)的定量，也可用于質(zhì)粒不 同拓?fù)湫螒B(tài)的分析，在藥用質(zhì)粒分析中應(yīng)用最為廣泛。目前專門(mén)針對(duì)質(zhì)粒分離分析開(kāi)發(fā)的商業(yè)化離子交換色譜介質(zhì)產(chǎn)品非常有限，而應(yīng)用于質(zhì) 粒分析過(guò)程的陰離子交換型色譜介質(zhì)均為商業(yè)化產(chǎn)品，其中大多數(shù)是為蛋白質(zhì)分離分析而開(kāi) 發(fā)。目前藥用質(zhì)粒分離過(guò)程中過(guò)程流分析中所采用的離子交換色譜介質(zhì)主要有多孔微球、灌 注色譜填料、非多孔色譜填料和薄殼色譜填料等，為提高傳質(zhì)性能而開(kāi)發(fā)的各種新型色譜介 質(zhì)是其中的主體。多孔微球包括瓊脂糖基質(zhì)的QSepharoseHP、聚(苯乙烯一二乙烯基苯)基 質(zhì)的PL—SAX和MonoQ;灌注色譜填料包括聚(苯乙烯一二乙烯基苯)基質(zhì)的Poros 20 PI和 Poros20QE;非多孔微球包括聚(苯乙烯一二乙烯基苯)基質(zhì)的MiniQ和聚甲基丙烯酸酯基質(zhì) 的TSKDNA—NPR;薄殼型介質(zhì)為DNAPac PA—100。應(yīng)用于質(zhì)粒分析的市售色譜柱骨架結(jié)構(gòu)包括聚(苯乙烯一二乙烯基苯)、聚(甲基丙烯酸 縮水甘油酯一雙甲基丙烯酸乙二醇酯)和瓊脂糖。聚(苯乙烯一二乙烯基苯)為基質(zhì)的微球 是目前應(yīng)用于質(zhì)粒分析的主要骨架材料，但是該類基質(zhì)在質(zhì)粒分析中存在易污染的問(wèn)題，文 獻(xiàn)"Kepka C, Rhodin J, Lemmens R， et al. Extraction of plasmid DNA from Escherichia coli cell lysate in a thermoseparating aqueous two-phase system. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A. 2004, 1024(1-2): 95-104."中指出即使是無(wú)孔的MiniQ也存在色譜柱污染后無(wú)法分析樣品的問(wèn) 題。文獻(xiàn)"Prazeres D M, Schluep T, Cooney C. Preparative purification of supercoiled plasmid DNA using anion-exchange chromatography. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A. 1998,806(1): 31-45"指出與聚(苯乙烯一二乙烯基苯)骨架基質(zhì)相比，瓊脂糖親水性提高，由疏水 相互作用引起的非特異性吸附會(huì)明顯降低。因此，從骨架結(jié)構(gòu)的角度來(lái)看，骨架為親水性瓊 脂糖或聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯一雙甲基丙烯酸乙二醇酯)的色譜介質(zhì)更適合質(zhì)粒的分析。應(yīng)用于質(zhì)粒分析的市售色譜柱按基質(zhì)孔結(jié)構(gòu)可以分為多孔和非多孔兩類。目前采用的多 孔色譜分析材料均是針對(duì)蛋白質(zhì)分離分析開(kāi)發(fā)，因通常所需分離的蛋白的分子量為8千到20 萬(wàn)，而且通常為球形， 一般尺寸為幾納米到十幾納米。而因質(zhì)粒的分子量高達(dá)數(shù)百到數(shù)千萬(wàn)， 而且通常為超螺旋結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度可達(dá)幾百納米，窄的部分可達(dá)十幾納米。文獻(xiàn)"PrazeresDM, Schluep T, Cooney C. Preparative purification of supercoiled plasmid DNA using anion陽(yáng)exchange chromatography. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A. 1998， 806(1): 31-45"指出其與多孔材 料鍵合時(shí)主要發(fā)生在微球的外表面。因?yàn)閮H是采用色譜材料的外表面，MiniQ和TSK雖然無(wú)孔， 但因粒徑小，所以有效的外比表面積最高，而且它們屬于非多孔材料，傳質(zhì)速度非常快，因 此，目前采用的多孔色譜分析材料非多孔材料MiniQ和TSKDNA—NPR從微觀結(jié)構(gòu)的角度看 具有比較突出的優(yōu)勢(shì)?？紤]到色譜介質(zhì)的骨架結(jié)構(gòu)，MiniQ為聚(苯乙烯一二乙烯基苯)，而 TSKDNA—NPR為聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯一雙甲基丙烯酸乙二醇酯)，因此，TSKDNA 一NPR色譜柱無(wú)論從骨架結(jié)構(gòu)還是孔結(jié)構(gòu)均比較適合于質(zhì)粒分析。但該介質(zhì)由于是無(wú)孔微球， 色譜柱的制備和裝填要求均非常高，而且色譜柱在使用過(guò)程中背壓也非常高。因此開(kāi)發(fā)針對(duì) 質(zhì)粒分析的多孔介質(zhì)或結(jié)構(gòu)性介質(zhì)，充分提高介質(zhì)比表面積的利用率，是提高色譜介質(zhì)對(duì)質(zhì) 粒分析性能的關(guān)鍵。發(fā)明人在"Zhang M L, Sun Y. Poly(glycidyl methacrylate ~divinylbenzene -triallylisocyanurate) continuous-bed protein chromatography. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHYA. 2001, 912(1): 31-38"和"張敏蓮，白姝，孫彥.聚(GMA-DVB-TAIC) 型連續(xù)床的制備及其對(duì)蛋白質(zhì)的色譜分離性能.離子交換與吸附，2003， 16(3) : 199 206" 中曾針對(duì)蛋白質(zhì)分離分析開(kāi)發(fā)了聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯一二乙烯基苯一三聚異氰尿酸三 烯丙酯)型整體床，該類型的色譜介質(zhì)具有良好的親水性能。但由于該類色譜介質(zhì)針對(duì)蛋白 分離分析開(kāi)發(fā)，整體床中的孔徑為l 2pm，雖然在蛋白分離中可以具有良好的傳質(zhì)性能，但 因質(zhì)粒的長(zhǎng)度可達(dá)幾百納米，窄的部分可達(dá)十幾納米，因此類型整體床在質(zhì)粒分析中傳質(zhì)性 能差，易出現(xiàn)色譜柱堵塞，而無(wú)法應(yīng)用于質(zhì)粒的分析。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)目前質(zhì)粒分析中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種不易被污染、具有大 量質(zhì)?？梢赃M(jìn)入的孔道、傳質(zhì)速度快，背壓低的用于質(zhì)粒分析的整體床的合成方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種用于質(zhì)粒分析的整體床的合成方法，其特征在于該方法按如下步驟進(jìn)行1)將含有環(huán)氧端基的甲基丙烯酸酯類或含有環(huán)氧端基的丙烯酸酯類單體與交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑混合，得到反應(yīng)混合物，其中a. 所述交聯(lián)劑與單體的物質(zhì)的量的比為0.05 0.2;b. 所述致孔劑用量占反應(yīng)混合物體積含量的40 80%;c. 所述引發(fā)劑與單體的物質(zhì)的量的比為0.005 0.03;2) 將上述反應(yīng)混合物超聲混和均勻，加入到色譜柱管中，原位聚合形成整體床，聚合 溫度控制在50 6(TC之間，反應(yīng)時(shí)間為12 72小時(shí)；3) 聚合反應(yīng)結(jié)束后，利用有機(jī)溶劑沖洗整體床；4) 利用溶于有機(jī)溶劑的胺類修飾劑對(duì)整體床進(jìn)行改性，其中胺類修飾劑的體積含量為 25 75%，修飾溫度控制在70 80。C之間，反應(yīng)時(shí)間為12 24小時(shí)；5) 修飾反應(yīng)結(jié)束后，利用有機(jī)溶劑沖洗整體床。 所述交聯(lián)劑采用含有兩個(gè)雙鍵的化合物和三個(gè)雙鍵的化合物的混合物，兩類交聯(lián)劑的物質(zhì)的量的比為0.25 4;所述的致孔劑采用飽和垸烴和芳烴中的至少一種；所述的引發(fā)劑采 用偶氮類物質(zhì)；所述的有機(jī)溶劑為醇類和環(huán)醚類中的任一種。所述含有兩個(gè)雙鍵的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷和雙甲基丙烯酸乙二醇 酯中的任一種；所述含有三個(gè)雙鍵的化合物采用三聚異腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯和三甲 基丙烯酸丙三醇酯中的任一種。所述偶氮類物質(zhì)采用偶氮二異丁腈和偶氮二異庚腈中的任一 種。所述飽和烴采用正庚烷、正辛烷和正壬垸中的任一種；所述芳烴采用甲苯、乙苯和二甲 苯中的任一種。所述醇類采用乙醇或甲醇；所述環(huán)醚類采用四氫呋喃或二噁烷。所述胺類修 飾劑采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一種。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)中質(zhì)粒色譜分析方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)及突出性效果采用本方法所合成的整體床在質(zhì)粒分析中具有良好的耐污染能力，可以對(duì)于含有大量雜質(zhì)的酶解的裂解 液進(jìn)行多個(gè)批次的分析而分析柱性能無(wú)明顯改變；整體床中具有的孔道直徑可達(dá)十微米以上， 可以確保質(zhì)粒的可接近性，傳質(zhì)速度快，背壓低。該類整體床的質(zhì)粒分析過(guò)程方便快捷，成 本低。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供的一種用于質(zhì)粒分析的整體床的合成方法，該方法按如下步驟進(jìn)行1) 將含有環(huán)氧端基的甲基丙烯酸酯類或含有環(huán)氧端基的丙烯酸酯類單體與交聯(lián)劑、致 孔劑和引發(fā)劑混合，得到反應(yīng)混合物，其中a. 所述交聯(lián)劑與單體的物質(zhì)的量的比為0.05 0.2;b. 所述致孔劑用量占反應(yīng)混合物體積含量的40 80%;c. 所述引發(fā)劑與單體的物質(zhì)的量的比為0.005 0.03;2) 將上述反應(yīng)混合物超聲混和均勻，加入到色譜柱管中，原位聚合形成整體床，聚合 溫度控制在50 6(TC之間，反應(yīng)時(shí)間為12 72小時(shí)；3) 聚合反應(yīng)結(jié)束后，利用有機(jī)溶劑沖洗整體床；4) 利用溶于有機(jī)溶劑的胺類修飾劑對(duì)整體床進(jìn)行改性，其中胺類修飾劑的體積含量為 25 75%，修飾溫度控制在70 8(TC之間，反應(yīng)時(shí)間為12 24小時(shí)；5) 修飾反應(yīng)結(jié)束后，利用有機(jī)溶劑沖洗整體床。 所述交聯(lián)劑釆用含有兩個(gè)雙鍵的化合物和三個(gè)雙鍵的化合物的混合物，兩類交聯(lián)劑的物質(zhì)的量的比為0.25 4;所述的致孔劑采用飽和烷烴和芳烴中的至少一種；所述的引發(fā)劑采 用偶氮類物質(zhì)；所述的有機(jī)溶劑為醇類和環(huán)醚類中的任一種。所述含有兩個(gè)雙鍵的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷和雙甲基丙烯酸乙二醇 酯中的任一種；所述含有三個(gè)雙鍵的化合物采用三聚異腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯和三甲 基丙烯酸丙三醇酯中的任一種。所述偶氮類物質(zhì)采用偶氮二異丁腈和偶氮二異庚腈中的任一 種。所述飽和烴采用正庚烷、正辛烷和正壬烷中的任一種；所述芳烴采用甲苯、乙苯和二甲 苯中的任一種。所述醇類采用乙醇或甲醇；所述環(huán)醚類采用四氫呋喃或二噁烷。所述胺類修 飾劑采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一種。利用合成的整體床進(jìn)行質(zhì)粒分析的過(guò)程如下采用水和緩沖液A (10mMTris-HCl， lmMEDTA， pH8.0)沖洗整體床。在質(zhì)粒制備過(guò)程分析中，雜質(zhì)含量最高的是裂解液，純度 最高的是最終的質(zhì)粒純品，可以利用整體床對(duì)質(zhì)粒純品和裂解液進(jìn)行分析，如果色譜柱可以 對(duì)兩者有較好的分析性能，則其可以應(yīng)用于質(zhì)粒制備過(guò)程分析。分析質(zhì)粒標(biāo)樣和酶解裂解液 時(shí)，所采用的溶液為緩沖液A，緩沖液B(緩沖液A+2MNaCl)。鹽梯度為0-5min30-50%緩 沖液B;5-5.01min 50-30%緩沖液B; 5.01-15min 30%緩沖液B。裂解液采用RNase—DNase Free酶液處理，處理溫度為35。C 40。C，恒溫0.5~2h。將上述溶液加入到整體床中，在0.2 0.8 mol/L鹽濃度下將RNA和蛋白等雜質(zhì)從整體床中洗脫下來(lái)，然后在0.9 1.5 mol/L鹽濃度 下將質(zhì)粒組分洗脫下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的純度和含量分析。下面通過(guò)幾個(gè)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例l:稱取單體甲基丙烯酸縮水甘油酯、交聯(lián)劑二乙烯基苯和三聚異腈尿酸三烯丙酯(1: 0.04:0.01 mol/mol/mol);致孔劑甲苯和正庚烷(致孔劑/反應(yīng)混合物80 vol%，甲苯/正庚烷3: 2vol/vol);引發(fā)劑偶氮二異丁腈(引發(fā)齊U/單體0.005:1 mol/mo1)，混合均勻，裝入一端密封 的50x4.6mm不銹鋼管中，將另一端密封，于5(TC反應(yīng)72小時(shí)。將整體床連接到泵上，乙醇 沖洗。然后利用二乙胺為修飾劑，溶劑采用乙醇，二乙胺的體積含量為25%，修飾反應(yīng)控制 在8(TC，反應(yīng)時(shí)間為12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，采用乙醇沖洗整體床。本發(fā)明所合成的整體床 中75%以上的孔其孔徑在十微米以上，整體床的修飾密度約為2.0mmol/g整體床。實(shí)施例2:稱取單體甲基丙烯酸環(huán)氧乙酯、交聯(lián)劑雙甲基丙烯酸乙二醇酯和三乙烯基苯(1: 0.03:0.06 mol/mol/mol);致孔劑乙苯和正辛烷(致孔齊U/反應(yīng)混合物75 vol%，乙苯/正辛烷1: 1 vol/vol); 引發(fā)劑偶氮二異丁腈(引發(fā)劑/單體0.01:1 mol/mo1)，混合均勻，裝入一端密封的50><4.6mm 不銹鋼管中，將另一端密封，于55'C反應(yīng)36小時(shí)。將整體床連接到泵上，四氫呋喃沖洗。 然后利用二甲胺為修飾劑，溶劑采用四氫呋喃，二甲胺的體積含量為75%，修飾反應(yīng)控制在 7(TC，反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，采用四氫呋喃沖洗整體床。本發(fā)明所合成的整體床 中75%以上的孔其孔徑在十微米以上，整體床的修飾密度約為2.3mmol/g整體床。實(shí)施例3:稱取單體丙烯酸縮水甘油酯、交聯(lián)劑二乙烯基苯和三聚異腈尿酸三烯丙酯(1: 0.06:0.03 mol/mol/mol);致孔劑二甲苯(致孔劑/反應(yīng)混合物60 vol%);引發(fā)劑偶氮二異庚腈(引發(fā)劑/ 單體0.02:1 mol/mo1)，混合均勻，裝入一端密封的50x4.6mm不銹鋼管中，將另一端密封， 于6(TC反應(yīng)12小時(shí)。將整體床連接到泵上，甲醇沖洗。然后利用乙胺為修飾劑，溶劑采用 甲醇，乙胺的體積含量為30%，修飾反應(yīng)控制在75C反應(yīng)時(shí)間為18小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后， 采用甲醇沖洗整體床。本發(fā)明所合成的整體床中75%以上的孔其孔徑在十微米以上，整體床 的修飾密度約為2.1mmol/g整體床。實(shí)施例4:稱取單體丙烯酸環(huán)氧乙酯、交聯(lián)劑二乙烯基苯基甲烷和三甲基丙烯酸丙三醇酯(1: 0.04:0.16 mol/mol/mol);致孔劑正壬烷(致孔劑/反應(yīng)混合物40 vol%);引發(fā)劑偶氮二異庚腈 (引發(fā)劑/單體0.03:1 mol/mo1)，混合均勻，裝入一端密封的50x4.6mm不銹鋼管中，將另一 端密封，于6(TC反應(yīng)12小時(shí)。將整體床連接到泵上，二噁烷沖洗。然后利用乙二胺為修飾 劑，溶劑采用二噁烷，乙二胺的體積含量為50%，修飾反應(yīng)控制在75t:，反應(yīng)時(shí)間為12小 時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，采用二噁烷沖洗整體床。本發(fā)明所合成的整體床中75%以上的孔其孔徑在 十微米以上，整體床的修飾密度約為2.6mmol/g整體床。
權(quán)利要求
1.一種用于質(zhì)粒分析的整體床的合成方法，其特征在于該方法按如下步驟進(jìn)行1)將含有環(huán)氧端基的甲基丙烯酸酯類或含有環(huán)氧端基的丙烯酸酯類單體與交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑混合，得到反應(yīng)混合物，其中a.所述交聯(lián)劑與單體的物質(zhì)的量的比為0.05～0.2；b.所述致孔劑用量占反應(yīng)混合物體積含量的40～80％；c.所述引發(fā)劑與單體的物質(zhì)的量的比為0.005～0.03；2)將上述反應(yīng)混合物超聲混和均勻，加入到色譜柱管中，原位聚合形成整體床，聚合溫度控制在50～60℃之間，反應(yīng)時(shí)間為12～72小時(shí)；3)聚合反應(yīng)結(jié)束后，利用有機(jī)溶劑沖洗整體床；4)利用溶于有機(jī)溶劑的胺類修飾劑對(duì)整體床進(jìn)行改性，其中胺類修飾劑的體積含量為25～75％，修飾溫度控制在70～80℃之間，反應(yīng)時(shí)間為12～24小時(shí)；5)修飾反應(yīng)結(jié)束后，利用有機(jī)溶劑沖洗整體床。
2. 按照權(quán)利要求1所述的一種用于質(zhì)粒分析的整體床的合成方法，其特征在于所述 交聯(lián)劑采用含有兩個(gè)雙鍵的化合物和三個(gè)雙鍵的化合物的混合物，兩類交聯(lián)劑的物質(zhì)的量的比為0,25 4;所述的致孔劑采用飽和垸烴和芳烴中的至少一種；所述的引發(fā)劑采用偶氮類物質(zhì)；所述的有機(jī)溶劑為醇類或環(huán)醚類。
3. 按照權(quán)利要求2所述的一種用于質(zhì)粒分析的整體床的合成方法，其特征在于所述 含有兩個(gè)雙鍵的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷或雙甲基丙烯酸乙二醇酯；所述 含有三個(gè)雙鍵的化合物采用三聚異腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯或三甲基丙烯酸丙三醇酯。
4. 按照權(quán)利要求2所述的一種用于質(zhì)粒分析的整體床的合成方法，其特征在于所述 偶氮類物質(zhì)采用偶氮二異丁腈或偶氮二異庚腈。
5. 按照權(quán)利要求2所述的一種用于質(zhì)粒分析的整體床的合成方法，其特征在于所述飽和烴采用正庚垸、正辛烷或正壬垸；所述芳烴采用甲苯、乙苯或二甲苯。
6. 按照權(quán)利要求2所述的一種用于質(zhì)粒分析的整體床的合成方法，其特征在于所述 醇類采用乙醇或甲醇；所述環(huán)醚類采用四氫呋喃或二噁烷。
7. 按照權(quán)利要求2所述的一種用于質(zhì)粒分析的整體床的合成方法，其特征在于所述 胺類修飾劑采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一種。
全文摘要
一種用于質(zhì)粒分析的整體床的合成方法，屬于生物分子分析和色譜分析技術(shù)領(lǐng)域。該方法將含有環(huán)氧端基的甲基丙烯酸酯類或含有環(huán)氧端基的丙烯酸酯類單體與交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑混合，得到反應(yīng)混合物；然后將上述反應(yīng)混合物超聲混和均勻，加入到色譜柱管中，原位聚合形成整體床；聚合反應(yīng)結(jié)束后，利用有機(jī)溶劑沖洗整體床；利用溶于有機(jī)溶劑的胺類修飾劑對(duì)整體床進(jìn)行改性；修飾反應(yīng)結(jié)束后，利用有機(jī)溶劑沖洗整體床。采用本方法所合成的整體床在質(zhì)粒分析中具有良好的耐污染能力、傳質(zhì)速度快、背壓低、分析過(guò)程方便快捷、成本低。
文檔編號(hào)G01N30/00GK101625347SQ20091009037
公開(kāi)日2010年1月13日 申請(qǐng)日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日
發(fā)明者劉孟儒, 憲 孔, 張敏蓮 申請(qǐng)人:清華大學(xué)