專利名稱：制備流感病毒的多質(zhì)粒系統(tǒng)的制作方法
交叉參照相關(guān)申請本申請要求下列申請的優(yōu)先權(quán)和利益2002年4月26日提交的美國臨時申請60/375,675號；2002年7月9日提交的60/394,983號；200年9月12日提交的60/410,576號；2002年10月18日提交的60/419,802號；2002年10月23日提交的60/420,708號；2003年3月24日提交的60/457,699號(代理人備案號26-000250US)；以及2003年4月10日提交的題為“制備流感病毒的多質(zhì)粒系統(tǒng)”申請，其代理人備案號是26-000260US，每個申請的說明書都已完整納入本文作為參考。
背景技術(shù)：
流感病毒由含分節(jié)的單鏈RNA基因組的內(nèi)部核糖核蛋白核及外面的脂蛋白包膜組成，其中脂蛋白包膜由基質(zhì)蛋白連在一起。A型流感病毒和B型流感病毒都含有8節(jié)段的負極性單鏈RNA。A型流感病毒基因組至少編碼11個多肽。節(jié)段1-3編碼3個多肽，組成病毒RNA依賴的RNA聚合酶。節(jié)段1編碼聚合酶復合物蛋白PB2。另外的聚合酶蛋白PB1和PA分別由節(jié)段2和節(jié)段3編碼。另外，某些A型流感病毒株的節(jié)段1還編碼一個小蛋白PB1-F2，是由PB1編碼區(qū)內(nèi)的另一個閱讀框架產(chǎn)生的。節(jié)段4編碼血凝素(HA)表面糖蛋白，參與細胞粘附以及使病毒在感染期內(nèi)進入細胞。節(jié)段5編碼核殼體核蛋白(NP)多肽，這是一種與病毒RNA相連的主要結(jié)構(gòu)蛋白。節(jié)段6編碼神經(jīng)酰胺酶(NA)包膜糖蛋白。節(jié)段7編碼兩種基質(zhì)蛋白，被稱為M1和M2，是由經(jīng)不同方式剪接的mRNA翻譯的。節(jié)段8編碼NS1和NS2(NEP)，這是兩種非結(jié)構(gòu)蛋白，由經(jīng)其他方式剪接的mRNA翻譯的。
B型流感病毒的8個基因組節(jié)段編碼11種蛋白。三個最大的基因編碼RNA聚合酶的組分PB1、PB2和PA。節(jié)段4編碼HA蛋白。節(jié)段5編碼NP。節(jié)段6編碼NA蛋白和NB蛋白。NB和NA蛋白都是由雙順反子mRNA的重疊閱讀框架翻譯的。B型流感病毒的節(jié)段7也編碼兩種蛋白M1和BM2。最小的節(jié)段編碼兩種產(chǎn)物NS1是由全長RNA翻譯的，NS2是由剪接的mRNA變體翻譯的。
制備出能產(chǎn)生特異性抗流感病毒保護性免疫反應的疫苗已經(jīng)超過50年。這些疫苗包括全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、表面抗原疫苗和減毒活疫苗。這些類型的疫苗中任何一種的合適制劑都可以產(chǎn)生系統(tǒng)免疫反應，而減毒活疫苗還可以在呼吸道內(nèi)刺激局部粘膜免疫。
FluMist是一種減毒活疫苗，可保護兒童和成人不患流感(Belshe等，(1998)，“冷適應的三價鼻內(nèi)減毒活流感疫苗對兒童的效應”(The efficacy of liveattenuated，cold-adapted，trivalent，intranasal influenza virus vaccine inchildren)，N Engl J Med 3381405-12；Nichol等，(1999)，“鼻內(nèi)減毒活流感疫苗對健康的、工作的成年人的效應隨機對照臨床試驗”(Effectiveness of live，attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy，working adultsarandomized controlled trial)，JAMA 282137-44)。FLUMIST疫苗株含有來源于當前流行的野生型病毒株的HA和NA基因節(jié)段及來源于普通主供體病毒(common masterdonor virus)(MDV)的六個基因節(jié)段PB1、PB2、PA、NP、M和NS。FluMist的A型流感病毒株的MDV(MDV-A)是在連續(xù)降低溫度的條件下在原代雞腎組織培養(yǎng)物中通過野生型A/Ann Arbor/6/60病毒株(A/AA/6/60)的系列傳代而得到的(Maassab(1967)“流感病毒在25℃時的適應和生長特性”(Adaptation and growth characteristicsof influenza virus at 25 degrees C)Nature 213612-4)。MDV-A可在25℃時有效復制(ca，冷適應)，但是其生長在38℃和39℃時受到抑制(ts，溫敏)。另外，這種病毒在被感染的雪貂肺內(nèi)不能復制(att，減毒的)。這種溫敏表型相信是限制其在人呼吸道內(nèi)最冷區(qū)域之外的部位復制而導致其毒性減弱的原因。動物模型試驗和臨床試驗表明這種特性是相當穩(wěn)定的。與通過化學誘變制備的流感病毒株的這種ts表型不同，MDV-A的ts特性通過在感染的倉鼠內(nèi)傳代或從兒童中分離出的經(jīng)傳代的分離株的這種特性不會還原(最近的綜述，見Murphy & Coelingh(2002)“冷適應A型和B型流感減毒活疫苗的制備原理及其應用”(Principles underlying thedevelopment and use of live attenuated cold-adapted influenza A and B virusvaccines)Viral Immunol 15295-323)。
12株不同的6:2重排列病毒株給予超過20,000名成人和兒童進行臨床試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些疫苗是減毒的、安全而有效的(Belshe等，(1998)“冷適應三價鼻內(nèi)減毒活流感疫苗對兒童的效應”(The efficacy of live attenuated，cold-adapted，trivalent，intranasal influenza virus vaccine in children)N Engl J Med 3381405-12；Boyce等，(2000)“加佐劑的和未加佐劑的亞單位流感疫苗通過鼻內(nèi)給藥在健康成年人體內(nèi)的安全性和免疫原性“(Safety and immunogenicity ofadjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccines administeredintranasally to healthy adults)Vaccine 19217-26；Edwards等，(1994)“冷適應滅活疫苗預防A型流感的隨機對照臨床試驗”(A randomized controlled trialof cold adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza Adisease)J Infect Dis 16968-76；Nichol等，(1999)“鼻內(nèi)減毒活流感疫苗對健康的、工作的成年人的效應隨機對照臨床試驗”(Effectiveness of live，attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy，working adultsarandomized controlled trial)JAMA 282137-44)。攜帶MDV-A的6個內(nèi)部基因和野生型病毒的兩個HA和NA基因節(jié)段的重排列病毒株(6:2重排列株)能始終保持ca、ts和att表型(Maassab等，(1982)“利用雪貂評價冷重組流感病毒疫苗”(Evaluationof a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets)J Infect Dis 146780-900)。
到目前為止，美國所有商業(yè)化的流感疫苗都能在含胚胎的雞蛋內(nèi)繁殖。雖然流感病毒在雞蛋內(nèi)生長良好，但是疫苗的制備就要依賴雞蛋的供應。供應雞蛋必須是有組織的，制備疫苗的病毒株要在下一次流感季節(jié)到來前幾個月開始篩選，這就限制了這種方法的靈活性，常常會導致疫苗制備和分發(fā)的延遲或短缺。
最近幾年已經(jīng)開發(fā)出了在細胞培養(yǎng)物中制備流感病毒的系統(tǒng)(見，F(xiàn)urminger.“疫苗制備”(Vaccine Production)，Nicholson等(編)，《流感教科書》(Textbook ofInfluenza)，324-332頁；Merten等，(1996)“在細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)病毒以制備疫苗”(Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation)，Cohen & Shafferman(編)，《疫苗設(shè)計和制備的新策略》(Novel Strategies in Designand Production of Vaccines)，141-151頁)。一般來說，這些方法都是利用選定的病毒株感染適宜的永生化宿主細胞。根據(jù)已建立的組織培養(yǎng)方法制備疫苗雖然不會出現(xiàn)利用雞蛋制備疫苗時所遇到的許多困難，但是并不是所有的流感致病株都可以良好生長和制備。另外，許多具有期望特性的病毒株，如減毒性、溫度敏感性和冷適應性，利用已建立的方法在組織培養(yǎng)物中無法成功繁殖，而這些特性都是制備減毒活疫苗所需要的。
利用重組DNA制備流感病毒可顯著提高通過組織培養(yǎng)方法制備流感疫苗的靈活性和實用性。最近，有報道利用插入編碼病毒基因組的cDNA的重組質(zhì)粒制備病毒(見Neumann等，(1999)“完全利用克隆的cDNA制備A型流感病毒”(Generation ofinfluenza A virus entirely from cloned cDNAs).Proc Natl Acad Sci USA969345-9350；Fodo等，(1999)“從重組NDA中恢復A型流感病毒”(Rescue ofinfluenza A virus from recombinant DNA)，J.Virol 739679-9682；Hoffmann等，(2000)“利用8種質(zhì)粒制備A型流感病毒的DNA轉(zhuǎn)染系統(tǒng)”(A DNA transfectionsystem for generation of influenza A virus from eight plasmids)Proc Natl AcadSci USA 976108-6113；WO 01/83794)。通過這些系統(tǒng)可制備能表達任何選定病毒株的免疫原性HA和NA蛋白的重組病毒和重排列病毒。但是，與A型流感病毒不同的是，還沒有報道描述利用純質(zhì)粒系統(tǒng)來制備B型流感病毒。
另外，現(xiàn)在還沒有一個純質(zhì)粒系統(tǒng)可用于生產(chǎn)適于制備減毒活疫苗的減毒的、溫度敏感的、冷適應的病毒株。本發(fā)明提供了一種8質(zhì)粒系統(tǒng)用于從克隆的cDNA開始生產(chǎn)B型流感病毒；以及制備適用于疫苗制劑的A型和B型流感減毒活病毒的方法，如鼻內(nèi)使用活病毒疫苗制劑，閱讀本說明書后其他的許多優(yōu)點就變得很清楚了。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及在細胞培養(yǎng)物中制備流感病毒的多載體系統(tǒng)以及制備重組流感病毒和重排列病毒的方法，包括適宜作疫苗的減毒的(att)、冷適應的(ca)和/或溫度敏感的(ts)流感病毒，其中包括流感減毒活疫苗，如那些適于以鼻內(nèi)疫苗制劑的形式使用的疫苗。
本發(fā)明的第一個方面涉及在無輔助病毒的情況下在細胞培養(yǎng)物中制備重組B型流感病毒的載體和方法(即無輔助病毒細胞培養(yǎng)系統(tǒng))。本發(fā)明的方法包括導入一組載體，這些載體中的每一個都可以將一部分B型流感病毒插入到一群能支持病毒復制的宿主細胞內(nèi)。宿主細胞在適于病毒生長的條件下培養(yǎng)就可以獲得流感病毒。在某些實施方式中，流感病毒是減毒的病毒、冷適應病毒和/或溫度敏感性病毒。例如，在一個實施方式中，載體來源的重組B型流感病毒是減毒的、冷適應的、溫度敏感的病毒，適于制備成減毒活疫苗鼻內(nèi)制劑使用。在一個典型的實施方式中，病毒是通過導入一群插入B/Ann Arbor/1/66流感病毒基因組的全部或部分，即ca B/AnnArbor/1/66病毒基因組的載體而制備的。
例如，在某些實施方式中，B型流感病毒是經(jīng)過人工改造的流感病毒，其中插入了一個或多個氨基酸取代，從而改變了流感病毒株ca B/Ann ARBOR/1/66的生物學特性。這種流感病毒包含突變，突變導致在位置PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34上一個或多個氨基酸改變，如PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)。任何突變(在一個或多個這種位置上)不論單獨或者聯(lián)合在一起都會導致溫度敏感性、冷適應性或減毒性相對于野生型病毒增強，這些突變都是本發(fā)明的適宜突變。
在某些實施方式中，一組載體中插入了一種B型流感病毒株的至少6個內(nèi)部基因組節(jié)段以及另一種流感病毒株的編碼免疫原性流感病毒表面抗原的一個或多個基因組節(jié)段，這些載體被導入到一群宿主細胞內(nèi)。例如，一種選定的減毒的、冷適應和/或溫敏B型流感病毒株，即B/Ann Arbor/1/66的ca、att、ts株，或經(jīng)人工改造的含有上述位置上一個或多個氨基酸改變的B型流感病毒株的至少6個內(nèi)部基因組節(jié)段與另一種病毒株來源的編碼免疫原性抗原的一個或多個節(jié)段一起導入到一群宿主細胞內(nèi)。免疫原性表面抗原一般是指血凝素(HA)和/或神經(jīng)酰胺酶(NA)抗原中的一種或兩種。在某些實施方式中只導入一個編碼免疫原性表面抗原的節(jié)段，此時選定病毒的其他7個互補片段也導入到宿主細胞內(nèi)。
在某些實施方式中，插入B型流感病毒基因組節(jié)段的一群質(zhì)粒被導入到一群宿主細胞內(nèi)。例如，8個質(zhì)粒用于將完整的B型流感病毒基因組導入到宿主細胞內(nèi)，其中每個質(zhì)粒所包含的基因組節(jié)段都不相同。另外，也可以用插入較小基因組序列的更多個質(zhì)粒。
一般來說，本發(fā)明的質(zhì)粒載體都是雙向表達載體。本發(fā)明的雙向表達載體一般都包含第一啟動子和第二啟動子，其中第一和第二啟動子與同一雙鏈cDNA的其中一條鏈連接，cDNA編碼包含流感病毒基因組節(jié)段在內(nèi)的病毒核酸。另外，雙向表達載體還可以包含多聚腺苷酸信號和/或終止序列。例如，多聚腺苷酸信號和/或終止序列位于兩個啟動子之間的流感病毒基因組節(jié)段的兩側(cè)。本發(fā)明的一個優(yōu)選多聚腺苷酸信號是SV40多聚腺苷酸信號。本發(fā)明的典型質(zhì)粒載體是pAD3000，如圖1所示。
載體導入到宿主細胞內(nèi)，這種宿主細胞能支持流感病毒在載體啟動子控制下的復制。宿主細胞的優(yōu)選例子包括Vero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、PCK細胞、MDCK細胞、MDBK細胞、293細胞(如293T細胞)和COS細胞。在與本文所描述的pAD3000質(zhì)粒載體結(jié)合使用時，優(yōu)選Vero細胞、293和COS細胞。在某些實施方式中，至少兩種細胞系的混合物共培養(yǎng)組成了宿主細胞群，如COS和MDCK細胞的混合物或293T和MDCK細胞的混合物。
包含B型流感病毒載體的宿主細胞在適宜病毒復制和裝配的條件下在培養(yǎng)物中生長。一般來說，包含本發(fā)明的B型流感病毒質(zhì)粒的宿主細胞在37℃以下培養(yǎng)，優(yōu)選35℃或以下。細胞一般在32℃到35℃之間的溫度下培養(yǎng)。在某些實施方式中，細胞在約32℃到34℃之間的溫度下培養(yǎng)，如在約33℃培養(yǎng)。在培養(yǎng)一段適宜的時間使病毒復制到高滴度后收獲重組的和/或重排列的病毒。收獲的病毒還可以經(jīng)過滅活。
本發(fā)明還涉及具有很寬適用范圍的在細胞培養(yǎng)物中制備重組流感病毒的方法，所述方法包括將一組插入流感病毒基因組的載體導入到一群能支持流感病毒復制的宿主細胞內(nèi)，在低于或等于35℃的溫度下培養(yǎng)細胞，然后收獲流感病毒。
在某些實施方式中，插入流感病毒基因組節(jié)段的一群質(zhì)粒被導入到一群宿主細胞內(nèi)。在某些特定實施方式中，8個質(zhì)粒用于將完整的B型流感病毒基因組導入到宿主細胞內(nèi)，其中每個質(zhì)粒所包含的基因組節(jié)段都不相同。一般來說，本發(fā)明的質(zhì)粒載體都是雙向表達載體。本發(fā)明的典型質(zhì)粒載體是pAD3000，如圖1所示。
在某些實施方式中，流感病毒是指B型流感病毒。在另外一些實施方式中，流感病毒是指A型流感病毒。在某些特定實施方式中，方法包括收獲重組的和/或重排列的流感病毒，這些病毒給予受試者時，如通過鼻內(nèi)給藥給予受試者時可激發(fā)免疫反應。在某些實施方式中，病毒在給藥前被滅活，在另一些實施方式中，給予的是減毒活病毒。按照本發(fā)明的方法制備的重組的和重排列的A型流感病毒和B型流感病毒也是本發(fā)明的一個特征。
在某些實施方式中，病毒包括減毒流感病毒、冷適應流感病毒、溫敏流感病毒、或者具有這幾種特征的任意組合的流感病毒。在一個實施方式中，流感病毒是指B/Ann Arbor/1/66流感病毒株，即冷適應的、溫度敏感的減毒株B/Ann Arbor/1/66。在其他的實施方式中，流感病毒是指A/Ann Arbor/6/60流感病毒株，即冷適應、溫度敏感的減毒株A/Ann Arbor/6/60。在另一個實施方式中，病毒是經(jīng)人工改造的流感病毒，其中有一個或多個影響ca A/Ann Arbor/6/60或ca B/Ann Arbor/1/66病毒生物學特性的氨基酸改變，這種取代的氨基酸優(yōu)選ca A/Ann Arbor/6/60或caB/Ann Arbor/1/66的獨特氨基酸，對于A型流感病毒株來說有PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)；對于B型流感病毒株來說有PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。同樣，這些位置上能產(chǎn)生溫度敏感性、冷適應性和/或減毒特性的其他種類的氨基酸取代也包含在本發(fā)明的病毒和方法范圍內(nèi)。
另外，重排列病毒還可以通過導入含選定病毒株的6個內(nèi)部基因和編碼選定致病株的表面抗原(HA和NA)的基因組節(jié)段的載體來制備，其中所選定的病毒株具有適于疫苗制備的特性。例如，HA節(jié)段優(yōu)選自致病性的H1、H3或B株，這都可以通過疫苗制備的常規(guī)方法實現(xiàn)。同樣，HA節(jié)段可以選自顯性致病株如H2株(如H2N2)、H5株(如H5N1)或H7株(如H7N7)。另外，第一株的7個互補基因組節(jié)段可以和HA或NA編碼節(jié)段一起導入。在某些實施方式中，B/Ann Arbor/1/66或A/Ann Arbor/6/60流感病毒株。
另外，本發(fā)明還涉及制備具有期望特性的新型流感病毒，如溫度敏感性、減毒特性和/或冷適應性，這些特性與疫苗的制備有關(guān)，本發(fā)明還涉及制備含這些新型流感病毒的流感疫苗的方法。在某些實施方式中，新型流感病毒A株是通過引入突變制備的，這些突變導致在一個或多個特定位置上氨基酸的取代，本文已證實這些取代對于溫敏表型是十分重要的，如PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34。例如，在核苷酸位點PB11195、PB11766、PB12005、PB2821和NP146上的突變，或者其他能導致特定氨基酸位置上發(fā)生氨基酸取代的核苷酸突變。任何突變(在一個或多個這種位置上)不論單獨或者聯(lián)合在一起都會導致溫度敏感性、冷適應性或減毒性相對于野生型病毒增強，這些突變都是本發(fā)明的適宜突變。例如，優(yōu)選PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)這些突變引入野生型流感病毒A株的基因組中，即PR8，以制備適于作為減毒活疫苗使用的溫度敏感突變株。為了增加期望表型的穩(wěn)定性，一般要引入一組突變。將所選擇的突變引入到基因組后，突變的流感病毒基因組在適于病毒制備的條件下復制。例如，突變的流感病毒基因組可在雞蛋內(nèi)復制。另外，流感病毒基因組也可在細胞培養(yǎng)物中復制。在后一種情況下，病毒還可以在雞蛋內(nèi)進一步擴增以提高病毒的滴度。按照本發(fā)明的方法制備的溫度敏感的、減毒的和/或冷適應病毒也是本發(fā)明的特征，包含這種病毒的疫苗也是如此。同樣，含有在PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34位置上出現(xiàn)一個或多個突變的新型重組病毒核酸，即選自下列的突變PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)；以及具有這種氨基酸取代的多肽也是本發(fā)明的特征。
而且，本文所描述的方法適用于制備具有溫度敏感性、弱毒性和/或冷適應性的新型流感病毒B株，該方法是將一個或多個特異性突變引入到B型流感病毒基因組中。例如，將一個或多個導致在PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、M1159或M1183位置上發(fā)生氨基酸取代的突變引入到B型流感病毒株中以制備溫敏B型流感病毒基因組。氨基酸取代的例子包括PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。如上所示，包含這種病毒以及插入這些突變和氨基酸取代的核酸和多肽的疫苗都是本發(fā)明的特征。
相應的，不論其制備方法如何，插入本發(fā)明的突變的流感病毒都是本發(fā)明的特征。這就是說，本發(fā)明包含具有本發(fā)明的突變的流感病毒株，即在相對于野生型病毒株的下列一個或多個位置上發(fā)生氨基酸取代的任何A型流感病毒PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34，或在相對于野生型病毒株的下列一個或多個位置上發(fā)生氨基酸取代的任何B型流感病毒PB2630；PA431；PA497；NP55；NP114；NP410；NP510；M1159和M1183；但是病毒株ca A/Ann Arbor/6/60和B/Ann Arbor/1/66不是本發(fā)明的特征。在某些優(yōu)選的實施方式中，A型流感病毒含有一組突變，其中包括PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)；B型流感病毒含有一組突變，其中包括PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。
在一個實施方式中，一組含有流感病毒基因組的質(zhì)粒載體被導入到宿主細胞內(nèi)。例如，流感病毒基因組節(jié)段可以插入到至少8種質(zhì)粒內(nèi)。在一個優(yōu)選實施方式中，流感病毒基因組節(jié)段被插入到8種質(zhì)粒內(nèi)。例如，這8種質(zhì)粒的每個質(zhì)粒都插入有不同的流感病毒基因組節(jié)段。
本發(fā)明的載體可以是雙向表達載體。本發(fā)明的雙向表達載體一般都包含第一啟動子和第二啟動子，其中第一啟動子和第二啟動子可操作連接到含有流感病毒基因組節(jié)段的同一雙鏈病毒核酸的兩條鏈上。另外，雙向表達載體還可以包含多聚腺苷酸信號和/或終止序列。例如，多聚腺苷酸信號和/或終止序列位于兩個啟動子之間的流感病毒基因組節(jié)段的兩側(cè)。本發(fā)明的一個優(yōu)選多聚腺苷酸信號是SV40多聚腺苷酸信號。本發(fā)明的典型質(zhì)粒載體是pAD3000，如圖1所示。
任何能支持流感病毒在載體啟動子控制下復制的宿主細胞都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。宿主細胞的優(yōu)選例子包括Vero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、PCK細胞、MDCK細胞、MDBK細胞、293細胞(如293T細胞)和COS細胞。在與本文所描述的pAD3000質(zhì)粒載體結(jié)合使用時，優(yōu)選Vero細胞、293細胞和COS細胞。在某些實施方式中，至少兩種細胞系的混合物共培養(yǎng)組成了宿主細胞群，如COS和MDCK細胞的混合物或293T和MDCK細胞的混合物。
本發(fā)明的一個特征是含有本發(fā)明質(zhì)粒的宿主細胞在37℃以下培養(yǎng)，優(yōu)選35℃或以下。細胞一般在32℃到35℃之間的溫度下培養(yǎng)。在某些實施方式中，細胞在約32℃到34℃之間的溫度下培養(yǎng)，如在約33℃培養(yǎng)。
本發(fā)明的另一個方面涉及從培養(yǎng)的Vero細胞內(nèi)恢復重組的或重排列的A型流感病毒或B型流感病毒(即野生型A型流感病毒或流感病毒及其突變株)的新型方法。一組含流感病毒基因組的載體通過電穿孔導入到一群宿主細胞內(nèi)。細胞在適于病毒復制的條件下生長，即冷適應的、減毒的、溫度敏感的病毒株，Vero細胞在37℃以下培養(yǎng)，優(yōu)選35℃或以下。細胞一般在32℃到35℃之間的溫度下培養(yǎng)。在某些實施方式中，細胞在約32℃到34℃之間的溫度下培養(yǎng)，如在約33℃培養(yǎng)。另外(如對于疫苗的制備來說)，Vero細胞在無血清無任何動物來源的產(chǎn)物的培養(yǎng)基中生長。
在上面所描述的方法中，病毒通過培養(yǎng)含流感病毒基因組質(zhì)粒的宿主細胞而獲得。在某些實施方式中，收獲的病毒是重組病毒。在另外一些實施方式中，收獲的病毒是具有多個親本病毒株基因背景的重排列病毒。另外，收獲的重組病毒或重排列病毒還可以在培養(yǎng)的細胞內(nèi)或雞蛋內(nèi)進一步擴增。
另外，收獲的病毒可以被滅活。在某些實施方式中，收獲的病毒組成了流感疫苗。例如，收獲的流感疫苗可以是具有來源于選定的流感病毒A株或B株的HA和/或NA抗原的重排列流感病毒(即6:2或7:1重排列病毒)。在某些優(yōu)選的實施方式中，重排列流感病毒具有減毒的表型。另外，重排列病毒可以是冷適應和/或溫敏B型流感病毒，即具有表17中一個或多個氨基酸取代的減毒的、冷適應和/或溫敏B型流感病毒。這種流感病毒可用作減毒活疫苗以激發(fā)針對特定致病性流感病毒株的免疫反應。按照本發(fā)明的方法制備的流感病毒，如減毒的重排列病毒是本發(fā)明的一個特征。
在另一方面，本發(fā)明涉及制備重組流感病毒疫苗的方法，所述方法包括將一群含流感病毒基因組的載體導入到一群能支持流感病毒復制的宿主細胞內(nèi)，在低于或等于35℃的溫度下培養(yǎng)宿主細胞，以及收獲能在給予受試者后激發(fā)免疫反應的流感病毒。本發(fā)明的疫苗可以是A型流感病毒株，也可以是B型流感病毒株。在某些實施方式中，流感疫苗病毒包括減毒的流感病毒、冷適應流感病毒或溫敏流感病毒。在某些實施方式中，病毒具有這些特性的組合。在一個實施方式中，流感病毒包含A/AnnArbor/6/60流感病毒株。在另一個實施方式中，流感病毒包含B/Ann Arbor/1/66流感病毒株。另外，疫苗還包括人工改造的A型流感病毒或B型流感病毒，其中含有至少一個取代的氨基酸，這些取代的氨基酸能影響ca A/Ann Arbor/6/60或ca/B/AnnArbor/1/66的生物學特性，如這些病毒株的獨特氨基酸。例如，本發(fā)明所包含的疫苗包括人工改造的重組的和重排列的A型流感病毒，這些病毒至少有一個位置發(fā)生突變，導致下列位置上發(fā)生氨基酸取代PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34；以及人工改造的重組的和重排列的B型流感病毒，這些病毒至少有一個位置發(fā)生突變，導致下列位置上發(fā)生氨基酸取代PB2630；PA431；PA497；NP55；NP114；NP410；NP510；M1159和M1183。
在某些實施方式中，病毒包括重排列流感病毒(即6:2或7:1重排列株)，這些病毒含有來源于多個流感病毒株的基因組節(jié)段。例如，優(yōu)選的重排列流感病毒疫苗包含來源于選定的流感病毒A株或B株的HA和/或NA表面抗原以及來源于具有與疫苗制備有關(guān)的期望特性的病毒株的內(nèi)部基因組節(jié)段。通常情況下在預測致病株(如上面所描述的)在局部或世界范圍內(nèi)流行的基礎(chǔ)上優(yōu)選HA和/或NA編碼節(jié)段來源的流感病毒株。在某些情況下，含有內(nèi)部基因組節(jié)段的病毒株是減毒的、冷適應和/或溫敏流感病毒株，如A/Ann Arbor/6/60、B/Ann Arbor/1/66或具有一個或多個取代的氨基酸從而具有所期望的表型的人工改造的流感病毒株，如包含至少一個突變從而導致在下列位置上發(fā)生氨基酸取代的A型流感病毒PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34；以及包含至少一個突變從而導致在下列位置上發(fā)生氨基酸取代的B型流感病毒PB2630；PA431；PA497；NP55；NP114；NP410；NP510；M1159和M1183。例如，優(yōu)選的重排列病毒包含具有下列一個或多個氨基酸取代的人工改造的A型流感病毒PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N2655)和NP34(D34G)；以及包含具有下列一個或多個氨基酸取代的人工改造的B型流感病毒PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。
如果需要，流感病毒可以在收獲后被滅活。
通過本發(fā)明的方法制備的流感病毒疫苗，包括減毒活疫苗也是本發(fā)明的特征，在某些優(yōu)選的實施方式中，流感病毒疫苗是重排列病毒疫苗。
本發(fā)明的另一個方面涉及雙向表達質(zhì)粒載體。本發(fā)明的雙向表達載體含有位于第二啟動子和多聚腺苷酸位點即SV40多聚腺苷酸位點之間的第一啟動子。在一個實施方式中，第一啟動子和第二啟動子的方向相反，位于至少一個克隆位點的兩側(cè)。本發(fā)明的典型載體是質(zhì)粒pAD3000，如圖1所示。
在某些實施方式中，流感病毒基因組至少一個節(jié)段被插入到克隆位點上，形成雙鏈核酸。例如，本發(fā)明的載體包括一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒中的第一啟動子位于第二啟動子和SV40多聚腺苷酸位點之間，其中第一啟動子和第二啟動子方向相反，位于至少一個流感病毒基因組節(jié)段的兩側(cè)。
包含本發(fā)明的一個或多個表達載體的試劑盒也是本發(fā)明的一個特征。一般來說，試劑盒還包含一個或多個能支持流感病毒復制的細胞系，緩沖液、細胞培養(yǎng)基、說明書、包裝材料和容器。在某些實施方式中，試劑盒含有一組表達載體，每種表達載體至少含有流感病毒基因組的一個節(jié)段。例如，試劑盒包含一組表達載體，每種表達載體含有一種選定病毒株的一個內(nèi)部基因組節(jié)段，所選擇的病毒株具有與疫苗制備或使用有關(guān)的特性，這也是本發(fā)明的特征。例如，選定的病毒株可以是減毒的、冷適應的和/或溫度敏感的病毒株，如A/Ann Arbor/6/60、B/Ann Arbor/1/66或具有期望特征的其他病毒株，如具有本文表17中所描述的一個或多個氨基酸取代的人工改造的病毒株。在一個實施方式中，試劑盒包含的表達載體含有編碼突變的HA和/或NA抗原的核酸文庫的成員。
能在低于或等于35℃的溫度下增殖性生長的細胞培養(yǎng)物也是本發(fā)明的特征，這些細胞培養(yǎng)物至少包括一種細胞，該細胞包含一組含有流感病毒基因組的載體。組合物還可以包括細胞培養(yǎng)基。在某些實施方式中，一組載體包括雙向表達載體，即含有插入到第二啟動子和SV40多聚腺苷酸位點之間的第一啟動子。例如，第一啟動子和第二啟動子方向相反，位于流感病毒至少一個節(jié)段的兩側(cè)。本發(fā)明的細胞培養(yǎng)物可在低于或等于35℃的溫度下培養(yǎng)，如約32℃到35℃之間，一般來說是在約32℃到34℃之間，如約33℃。
本發(fā)明還涉及細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括上述能增殖性生長的至少包含一種細胞的細胞培養(yǎng)物，其中細胞包含一組含有流感病毒基因組的載體；以及維持細胞培養(yǎng)物在低于或等于35℃下生長的調(diào)節(jié)劑。例如，調(diào)節(jié)劑優(yōu)選能維持細胞在約32℃到35℃之間生長，一般來說是在約32℃到34℃之間，如約33℃。
本發(fā)明的另一個特征是人工改造的的重組流感病毒或重排列病毒，該病毒含有一個或多個能影響溫敏流感病毒、冷適應性和/或減毒特性的取代的氨基酸。例如，在如下位置上出現(xiàn)氨基酸取代的人工改造的A型流感病毒PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34；以及在下列位置上發(fā)生氨基酸取代的人工改造的B型流感病毒PB2630；PA431；PA497；NP55；NP114；NP410；NP510；M1159和M1183都是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。典型的實施方式包括具有下列一個或多個如下取代的氨基酸的A型流感病毒PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)；以及具有下列一個或多個氨基酸取代的B型流感病毒PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。在某些實施方式中，病毒包含一組突變，如在上述位置上的1、2、3、4、5、6、7、8或9個取代的氨基酸。相應的，在上述所有5個位置上，即PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)發(fā)生氨基酸取代的人工改造的A型流感病毒；以及在上述8個或所有9個位置上，即PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)發(fā)生氨基酸取代的人工改造的B型流感病毒也都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。另外，病毒也可以含有上面未提到的一個或多個其他類型的取代的氨基酸。
在某些實施方式中，人工改造的流感病毒是溫敏流感病毒、冷適應的和/或減毒的流感病毒。例如，與野生型的流感病毒相比，本發(fā)明的溫敏流感病毒在39℃生長時一般會降低約2.0到5.0log10。例如，與野生型的流感病毒相比，在39℃時，溫敏流感病毒病毒的生長至少約降低2.0log10、約3.0log10、4.0log10或4.5log10。一般來說，但也不一定，溫敏流感病毒在33℃時保持最旺盛的生長特性。通過雪貂減毒試驗發(fā)現(xiàn)，與野生型的流感病毒相比，本發(fā)明的減毒流感病毒一般會降低約2.0到5.0log10。例如，通過雪貂減毒試驗證明，與野生型的流感病毒相比，本發(fā)明的減毒流感病毒的生長至少約降低2.0log10、通常降低約3.0log10，優(yōu)選降低約4.0log10。
附圖簡述圖1pAD3000質(zhì)粒的說明圖2感染細胞的顯微圖片圖3通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染所得到的rMDV-A和6:2 H1N1重排列病毒的基因型分析圖4制備B型流感病毒的8質(zhì)粒系統(tǒng)的說明圖5A和B.RT-PCR分析重組MDV-B病毒的特征；C和D.RT-PCR分析重組B/Yamanashi/166/98的特征圖6GeneBank形式的pAD3000序列圖7MDV-B和8種質(zhì)粒的序列比對圖8同時擴增B型流感病毒的HA和NA節(jié)段所得到的RT-PCR產(chǎn)物圖9柱形圖說明重組病毒和重排列病毒的相對滴度圖10柱形圖說明重排列病毒在允許溫度和限制溫度下的相對滴度(溫敏流感病毒)圖11圖表說明插入與溫敏流感病毒有關(guān)的特異性突變(敲入)的重排列病毒(左圖)以及在允許溫度和限制溫度下的相對滴度(溫敏流感病毒)(右圖)。
圖12利用微基因組分析確定ts突變。A.HEp-2細胞轉(zhuǎn)染PB1、PB2、PA、NP以及pFlu-CAT，在33℃或39℃孵育18小時，細胞提取物用于分析CAT報告基因的表達。B.利用引物延伸試驗分析CAT mRNA的表達圖1

PA、NP和M1蛋白上具有野生型殘基的三基因重組病毒圖14表格說明單基因和雙基因重組病毒的生長情況
圖15表格說明非ts表型相應的核蛋白的氨基酸殘基圖16重組PR8突變株的簡圖。黑點表示PB1和/或PB2基因上引入的突變圖17柱形圖說明在33℃和39℃時的相對滴度圖18PR8突變株在各種溫度下噬菌斑形態(tài)的顯微照片。MDCK細胞如所示的那樣轉(zhuǎn)染病毒并分別在33℃、37℃和39℃孵育3天。通過免疫染色觀察噬菌斑并拍照。
圖19允許溫度及非允許溫度下的蛋白合成。MDCK細胞如所示的那樣轉(zhuǎn)染病毒并分別在33℃或39℃孵育過夜。SDS-PAGE電泳分離放射性同位素標記的多肽并進行放射自顯影。圖中指示的是病毒蛋白HA、NP、M1和NS。
圖20A.線圖說明MDA-V和MDV-B在Per.C6細胞內(nèi)與在MDCK細胞內(nèi)復制的區(qū)別。B.線圖說明MDV-A單基因重排列病毒在Per.C6細胞內(nèi)的不同復制情況。
詳細描述許多致病性流感病毒在組織培養(yǎng)物中的生長狀態(tài)很差，適于制備減毒活疫苗(即溫敏流感病毒、冷適應的和/或減毒的流感病毒)的病毒株還無法在培養(yǎng)的細胞內(nèi)成功生長以制備商業(yè)用途的產(chǎn)品。本發(fā)明提供了一種多質(zhì)粒系統(tǒng)，該系統(tǒng)可使那些在標準細胞培養(yǎng)條件下不能生長的流感病毒株生長和恢復。
在第一個方面，本發(fā)明的方法涉及在細胞培養(yǎng)物中完全由克隆的病毒DNA來制備重組B型流感病毒的載體和方法。在另一個方面，本發(fā)明的方法部分基于組織培養(yǎng)條件的改善，這種條件能夠支持具有疫苗制備相關(guān)特性(即減弱的致病性、冷適應性、溫敏流感病毒等)的病毒株(流感病毒A株和B株)在體外培養(yǎng)的細胞內(nèi)生長。流感病毒可通過將一組攜帶克隆的病毒基因組節(jié)段的載體導入到宿主細胞內(nèi)并在不超過35℃的溫度下培養(yǎng)而制備。當轉(zhuǎn)染含流感病毒基因組的載體時，適于作為疫苗的重組病毒可通過標準的純化方法制備。利用本發(fā)明的載體系統(tǒng)和方法，可快速高效地在組織培養(yǎng)物中制備插入有6個具有期望特性的病毒株的內(nèi)部基因節(jié)段和選定致病株的免疫原性HA和NA節(jié)段的重排列病毒。因此，本文所描述的系統(tǒng)和方法可用于在細胞培養(yǎng)物中快速制備重組的和重排列的A型流感病毒和B型流感病毒，包括適于作為疫苗的病毒，包括減毒活疫苗，如適于鼻內(nèi)使用的疫苗。
一般來說，每個A亞型和B亞型選擇一個主供體病毒(MDV)株。對于減毒活疫苗來說，主供體病毒一般根據(jù)其優(yōu)良的特性來選擇，如與疫苗制備有關(guān)的溫敏流感病毒、冷適應性和/或減毒特性。例如，典型的主供體病毒分別包括A/Ann Arbor/6/60和B/Ann Arbor/1/66的這種溫度敏感株、減毒株和冷適應株。本發(fā)明在下面說明了導致這些病毒株產(chǎn)生ca、ts和att表型的突變，并且提供了制備適于作為供體株制備重組疫苗和重排列疫苗的新型流感病毒株的方法。
例如，一個選定的主供體A型病毒(MDV-A)或主供體B型病毒(MDV-B)可從一組含病毒基因組的克隆的病毒cDNA開始制備。在一個典型的實施方式中，重組病毒是從8個克隆的病毒cDNA開始制備的。8個病毒cDNA代表選定的MDV-A的或MDV-B的PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M和NS序列，這些cDNA被克隆到雙向表達載體如質(zhì)粒(如pAD3000)內(nèi)，這樣病毒基因組RNA就可以在RNA聚合酶I(pol I)啟動子的控制下從一條鏈上轉(zhuǎn)錄出來，病毒mRNA在RNA聚合酶II(pol II)啟動子的控制下從另一條鏈上合成出來。另外，任何基因節(jié)段都可以經(jīng)過修飾，其中包括HA節(jié)段(如去除多堿基裂解位點)。
然后將攜帶8個病毒cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到合適的宿主細胞，如Vero細胞、共培養(yǎng)的MDCK/293T或MDCK/COS7細胞內(nèi)，隨后就可以收獲感染性重組MDV-A或MDV-B病毒。利用本文所描述的質(zhì)粒和方法，本發(fā)明可通過共轉(zhuǎn)染選定病毒(如MDV-A、MDV-B)的6個內(nèi)部基因(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)和不同的相應類型流感病毒(A或B)來源的HA和NA用于制備6:2重排列流感病毒疫苗。例如，HA節(jié)段最好是選自致病性的H1、H3或B病毒株，這些在疫苗制備中都是常規(guī)的。同樣，HA節(jié)段也可以選自與致病株有關(guān)聯(lián)的病毒株，如H2株(H2N2)、H5株(H5N1)或H7株(H7N7)。含有MDV的7個基因組節(jié)段和選定病毒株的HA或NA基因的重排列病毒株(7:1重排列病毒)也可以制備。另外，該系統(tǒng)還可以用于確定表型特征的分子基礎(chǔ)，如與疫苗制備相關(guān)的減毒特性(att)、冷適應性(ca)以及溫敏(ts)流感病毒。
定義除非另外給出定義，所有的科學和技術(shù)術(shù)語都被理解為與其所用領(lǐng)域內(nèi)的常用含義相同。為了本發(fā)明的目的特地對下列術(shù)語作出定義。
術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”以及“核酸序列”是指單鏈或雙鏈脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，或其嵌合體或類似物。如本文所描述，該術(shù)語還可以包括具有天然核苷酸基本屬性的天然核苷酸類似物的多聚物，該多聚物可以天然核苷酸相同的方式與單鏈核酸雜交。除非特別說明，本發(fā)明的特定核酸序列除了包含明確指出的序列外還包含互補序列。
術(shù)語“基因”是一個被廣泛使用的概念，是指有生物功能的任何核酸序列。因此，基因包括編碼序列和/或其表達所需要的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“基因”適用于特殊的基因組序列，也適用于基因組序列所編碼的cDNA或mRNA。
基因也包括非表達的核酸節(jié)段，如形成其他蛋白的識別序列。非表達調(diào)節(jié)序列包括“啟動子”和“增強子”，調(diào)節(jié)蛋白如轉(zhuǎn)錄因子可與之結(jié)合，導致臨近或附近序列的轉(zhuǎn)錄。“組織特異性”的啟動子或增強子是指可在特定類型的組織或細胞內(nèi)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的啟動子或增強子。
術(shù)語“載體”是指可用于在微生物、細胞或細胞組分之間繁殖和/或轉(zhuǎn)移核酸的工具。載體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、原病毒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子和人工染色體等，載體可自主復制或整合到宿主細胞的染色體內(nèi)復制。載體還可以是裸RNA、裸DNA、位于同一條鏈內(nèi)的由DNA和RNA組成的多核苷酸、多聚賴氨酸結(jié)合的DNA或RNA、肽連接的DNA或RNA、脂質(zhì)體連接的DNA等，這些載體不能自主復制。本發(fā)明最常用的載體是質(zhì)粒。
“表達載體”是能啟動表達以及能使其攜帶的核酸復制的載體，如質(zhì)粒。一般來說，被表達的核酸連接有啟動子和/或增強子，核酸的轉(zhuǎn)錄被啟動子和/或增強子控制。
“雙向表達載體”一般具有方向相反的兩個啟動子，核酸位于兩個啟動子之間，表達可在任一方向起始轉(zhuǎn)錄出RNA的正義鏈(+)或反義鏈(-)。另外，雙向表達載體還可以是雙義載體，病毒mRNA和病毒基因組RNA(作為cRNA)從同一條鏈上表達。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“游離的”是指不含在天然環(huán)境中與其伴隨或相互作用的組分的生物材料，如核酸或蛋白質(zhì)。游離的材料還可以包含天然環(huán)境中不存在的材料，如細胞。例如，如果材料存在于天然環(huán)境中，如細胞，但是該材料在細胞內(nèi)所存在的位置(如基因組或基因元件)與天然環(huán)境中所處的位置是不同的。例如，天然核酸(如編碼序列、啟動子、增強子等)如果以非天然的方式被引入到基因組(即載體，如質(zhì)?；虿《据d體，或者復制子)內(nèi)該核酸所處的天然位點不同的位點上，則該核酸就成為游離的核酸。這種核酸也被稱為“異源核酸”。
術(shù)語“重組子”是指經(jīng)人工改造或人工合成的材料(如核酸或蛋白)。這種改變可在其天然環(huán)境或狀態(tài)中進行，也可從其天然環(huán)境或狀態(tài)中去除。當這個術(shù)語指病毒，如流感病毒時，病毒是重組病毒是指該病毒是通過重組核酸的表達而制備的。
術(shù)語“重排列的”指病毒時說明病毒包含來源于多個親本病毒株或資源的基因元件和/或多肽元件。例如，7:1重排列病毒包括第一親本病毒來源的7個基因組節(jié)段(或基因節(jié)段)和第二親本病毒來源的一個互補病毒基因組節(jié)段，如編碼血凝素或神經(jīng)酰胺酶的基因組節(jié)段。6:2重排列病毒包括第一親本病毒來源的6個基因組節(jié)段，最常用的是6個內(nèi)部基因；以及另一個親本病毒來源的兩個互補片段，即血凝素和神經(jīng)酰胺酶。
術(shù)語“導入的”用于異源或游離核酸時是指核酸摻入到真核細胞或原核細胞內(nèi)，其中核酸插入到細胞的基因組(如染色體、座機里、質(zhì)體或線粒體DNA)內(nèi)，轉(zhuǎn)化形成自主復制子或瞬時表達(如轉(zhuǎn)染的mRAN)。該術(shù)語包括方法如“感染”、“轉(zhuǎn)染”、“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)導”。在本發(fā)明中，各種方法都可以用于將核酸導入到原核細胞內(nèi)，如電穿孔、鈣磷酸鹽沉淀、脂質(zhì)介導的轉(zhuǎn)染(脂轉(zhuǎn)染)等。
術(shù)語“宿主細胞”是指含有異源核酸，如載體，并支持核酸復制和/或表達的細胞，該細胞還可以產(chǎn)生一種或多種編碼查努，包括多肽和/或病毒。宿主細胞可以是原核細胞如大腸桿菌，也可以是真核細胞如酵母、昆蟲細胞、兩棲類動物細胞、鳥類細胞或哺乳動物細胞，其中包括人源細胞。本發(fā)明所用的典型宿主細胞包括Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)、Per.C6細胞(人胚胎視黃醛細胞)、BHK細胞(幼倉鼠腎細胞)、原代雞腎細胞(PCK)、Madin-Darby狗腎(MDCK)細胞、Madin-Darby牛腎(MDBK)細胞、293細胞(如293T細胞)和COS細胞(如COS1、COS7細胞)。術(shù)語宿主細胞包含細胞的混合物，如不同類型的細胞或細胞系的混合培養(yǎng)物。
術(shù)語“溫度敏感的”、“冷適應”和“減毒的”是本領(lǐng)域所熟知的。例如，術(shù)語“溫度敏感的”(“ts”)用于A型流感病毒株說明該病毒在39℃時的滴度相對于33℃來說下降100倍或更多，用于B型流感病毒株說明該病毒在37℃時的滴度相對于33℃來說下降100倍或更多。例如，術(shù)語“冷適應”(“ca”)是指病毒在25℃時的生長在其33℃時的生長的100倍以內(nèi)。例如，術(shù)語“減毒的”(“att”)是指病毒可在雪貂的上呼吸道內(nèi)復制但是在肺組織內(nèi)檢測不到，也不能引起動物出現(xiàn)感冒樣的疾病。也可以理解為病毒具有中間表型，即病毒在39℃(對于A株病毒來說)或37℃(對于B株病毒來說)時滴度降低小于100倍，在25℃時的生長比其在33℃的生長高100倍以上(如200倍、500倍、1000倍、10000倍以內(nèi))，和/或其在雪貂肺內(nèi)的生長弱于其在上呼吸道內(nèi)的生長(即毒性部分降低)和/或在動物體內(nèi)引起的感冒樣疾病較輕，具有本文所描述的一個或多個氨基酸取代的病毒也是本發(fā)明所包括的有用病毒。生長是指病毒量的增加，通過測定滴度、噬菌斑大小或形態(tài)、顆粒密度或本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他方法。
術(shù)語“人工改造的的”用于本文是指病毒、病毒核酸或病毒編碼產(chǎn)物如多肽、疫苗含有至少一個通過重組方法引入的突變，如定向誘變、PCR突變等。術(shù)語“人工改造的的”用于含有一個或多個核苷酸突變和/或氨基酸取代的病毒(或病毒成分或產(chǎn)物)時是指編碼病毒(或病毒成分或產(chǎn)物)的病毒基因組或基因組節(jié)段不是來源于天然資源，如天然產(chǎn)生的或通過非重組方法(如在25℃下累進傳代)制備的以前已經(jīng)存在的實驗室病毒株，即野生型的或冷適應A/Ann Arbor/6/60或B/Ann Arbor/1/66S流感病毒株。
流感病毒流感病毒的基因組由線性(-)核糖核酸(RNA)鏈的8個節(jié)段組成，分別編碼免疫原性的血凝素(HA)和神經(jīng)酰胺酶(NA)蛋白；以及6個內(nèi)部核心多肽核外殼核蛋白(NP)、基質(zhì)蛋白(M)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)、以及3個RNA多聚酶(PA、PB1、PB2)蛋白。在復制期間，基因組病毒RNA在宿主細胞的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄成(+)鏈信使RNA和(-)鏈基因組cRNA。8個基因組節(jié)段都包裝到核糖核蛋白復合體內(nèi)，該復合體內(nèi)除了RNA外還含有NP和多聚酶復合體(PB1、PB2和PA)。
在本發(fā)明中，8個節(jié)段中的每一個相應的病毒基因組RNA被插入到重組載體中進行操作和制備流感病毒。各種載體，包括病毒載體、質(zhì)粒、粘粒、噬菌體以及人工染色體都可以用于本發(fā)明中。為了便于操作，病毒基因組節(jié)段一般插入到質(zhì)粒載體內(nèi)，載體中含有一個或多個能在細菌和真核細胞內(nèi)發(fā)揮功能的復制起點，還可以含有篩選標記基因以便于篩選轉(zhuǎn)染質(zhì)粒序列的細胞。典型的載體是圖1所示的pAD3000。
本發(fā)明最常用的質(zhì)粒載體是雙向表達載體，該載體可使插入的病毒基因組節(jié)段在任何一個方向上起始轉(zhuǎn)錄，合成出(+)鏈RNA和(-)鏈RNA。為了提高雙向轉(zhuǎn)錄的效率，每個病毒基因組節(jié)段都插入到含有至少兩個獨立啟動子的載體內(nèi)，這樣病毒基因組RNA的拷貝可被第一RNA聚合酶啟動子(即Pol I)從一條鏈上轉(zhuǎn)錄出來，而病毒mRNA被第二RNA聚合酶啟動子(即Pol II)合成。相應的，兩個啟動子以相反方向排列，位于至少一個克隆位點(即限制性內(nèi)切酶識別序列)的兩側(cè)，優(yōu)選獨特的克隆位點來插入病毒基因組RNA片段。另外，“雙義”載體也可以使用，其中(+)鏈mRNA和(-)病毒RNA(作為cRNA)從同一條鏈上表達。
表達載體需要表達的流感病毒基因組節(jié)段被連接到控制mRNA合成的適當轉(zhuǎn)錄控制序列(啟動子)上。各種啟動子都適用于流感病毒基因組節(jié)段在表達載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。在某些實施方式中，載體是質(zhì)粒pAD3000，，所用的啟動子為巨細胞病毒(CMV)DNA依賴的RNA聚合酶II(Pol II)啟動子。如果需要，例如為了調(diào)節(jié)條件表達的需要，也可以用其他的啟動子替換以誘導RNA在特定的條件下轉(zhuǎn)錄，或者在特定的組織或細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄。許多病毒的啟動子或哺乳動物如人的啟動子都可以使用，可根據(jù)特定的用途來分離。例如，動物和人病毒基因組來源的啟動子包括腺病毒(如腺病毒2)、乳頭狀瘤病毒、乙型肝炎賓度故、多瘤病毒和猿病毒40(SV40)來源的啟動子以及各種逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子。哺乳動物啟動子包括肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、熱休克啟動子等。另外，噬菌體啟動子也可以和同源的RNA聚合酶聯(lián)合使用，如T7啟動子。
轉(zhuǎn)錄還可以通過加入增強子序列來增強。增強子一般較短，約10-500bp，是一種順式作用DNA元件，可與啟動子一起增強轉(zhuǎn)錄。許多增強子序列已被從哺乳動物基因(血紅蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)和真核細胞病毒中分離出來。增強子可被連接到載體內(nèi)的異源編碼序列的5’或3’位置，但是一般都插入到啟動子的5’端。一般來說，所選擇的啟動子以及附加的轉(zhuǎn)錄增強序列能優(yōu)化異源DNA在其所導入的宿主細胞內(nèi)的表達(Scharf等，(1994)“熱應激啟動子和轉(zhuǎn)錄因子”(Heat stress promoters and transcription factors)Results Probl Cell Differ20125-62；Kriegler等，(1990)“增強子、啟動子和剪接位點的裝配以控制轉(zhuǎn)移基因的表達”(Assembly of enhancers，promoters，and splice signals to controlexpression of transferred genes)Methods in Enzymol 185512-27)。另外，擴增子還可以含有核糖體結(jié)合位點或內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)以便于翻譯的起始。
本發(fā)明的載體還優(yōu)選包含轉(zhuǎn)錄終止以及穩(wěn)定mRNA所需要的序列，如多聚腺苷酸位點或終止子序列。這種序列通常置于真核或病毒DNA或cDNA的5’非翻譯區(qū)，有時也置于3’非翻譯區(qū)。在一個實施方式中，即包含質(zhì)粒pAD3000的實施方式中，多聚腺苷酸信號是由SV40多聚腺苷酸序列提供的。
另外，如上面所描述，表達載體還可以包含一個或多個篩選標記基因以提供篩選轉(zhuǎn)化細胞所需要的表型性狀，處理前面所列的基因外，標記物如二氫葉酸還原酶或新霉素耐藥性都適于篩選真核細胞培養(yǎng)物。
含上述合適DNA序列以及合適啟動子或控制序列的載體可用于轉(zhuǎn)化允許蛋白表達的宿主細胞。雖然本發(fā)明的載體可在細菌中復制，但是大多數(shù)情況下這些載體是需要導入到哺乳動物細胞，如Vero細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞、COS細胞內(nèi)以獲得表達。
其他的表達元件在大對數(shù)情況下，編碼流感病毒蛋白的基因組節(jié)段包括其表達，包括翻譯成功能性病毒蛋白所需的任何附加序列，在其他情況下，編碼病毒蛋白如HA或NA蛋白的小基因或其他人工構(gòu)建體也可以使用。在這種情況下，通常需要包含特異性的起始信號以幫助異源編碼序列有效翻譯。這些信號包括ATG起始密碼子及其臨近的序列。為了確保整個插入片段的翻譯，起始密碼子應插入到與病毒蛋白有關(guān)的正確閱讀框架內(nèi)。外援轉(zhuǎn)錄元件和起始密碼子可以是各種來源的，可以是天然的，也可以是合成的。表達效率可以通過添加適于細胞系統(tǒng)的增強子來增強。
如果需要，編碼附加表達元件如信號序列、分泌或局域化序列等的多核苷酸序列可以插入到載體內(nèi)，通常與目的多核苷酸序列處于同一框架內(nèi)以使表達的多肽靶向性地定位到期望的細胞腔隙、膜或細胞器內(nèi)，或者分泌到細胞培養(yǎng)基中。這些序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，包括分泌前導肽、細胞器靶向性序列(如細胞核定位序列、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號、線粒體轉(zhuǎn)運虛禮)、膜定位/錨定序列(如停止運送序列、GPI錨定序列)等。
流感病毒疫苗流感病毒疫苗以前都是根據(jù)經(jīng)驗預測將要流行的病毒株，然后選擇病毒株在含胚胎的雞蛋內(nèi)制備。最近，重排列病毒株已經(jīng)被制備出來，這些病毒含有選定的血凝素和神經(jīng)酰胺酶抗原，是已經(jīng)被認可的減毒的、溫敏流感病毒主病毒株。經(jīng)過在雞蛋內(nèi)多次傳代培養(yǎng)以后收獲流感病毒，還可以選擇利用甲醛和/或β-丙內(nèi)酯滅活。但是，以這種方式制備流感疫苗有幾個明顯的缺點。從雞蛋內(nèi)剩余的污染物是具有高抗原活性的，是由于高熱所產(chǎn)生的，常常會在使用后產(chǎn)生明顯的副作用。更重要的是，設(shè)計需要制備的病毒株必需在下一個流行季節(jié)到來前幾個月開始篩選和分配以便于有足夠的時間來制備和滅活流感疫苗。在細胞培養(yǎng)物中制備重組和重排列疫苗的企圖也受到了被批準可以制備疫苗的病毒株都不能在標準細胞培養(yǎng)條件下生長這一問題的阻礙。
本發(fā)明提供了在細胞培養(yǎng)物中制備重組和重排列病毒的載體系統(tǒng)和方法，這使根據(jù)一個或多個選定的抗原性病毒株來快速制備疫苗成為可能。特別是本發(fā)明提供的條件和病毒株可使病毒在細胞培養(yǎng)物中從多質(zhì)粒系統(tǒng)中有效制備出來。另外，如果需要，病毒還可以在雞蛋內(nèi)進一步擴增。
例如，利用標準的細胞培養(yǎng)條件如在37℃使流感病毒B主病毒株B/AnnArbor/1/66生長是不可能的。在本發(fā)明的方法中，多質(zhì)粒系統(tǒng)中的每一個質(zhì)粒都含有一個流感病毒基因組的節(jié)段，這個系統(tǒng)被導入到適宜的細胞內(nèi)，然后在低于或等于35℃的溫度下培養(yǎng)細胞。一般來說，細胞培養(yǎng)物可在約32℃到35℃之間的溫度下培養(yǎng)，優(yōu)選約32℃到34℃之間，如約33℃。
通常細胞培養(yǎng)物都是在一個系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)，如細胞培養(yǎng)箱，控制濕度和CO2含量，利用溫度調(diào)節(jié)裝置是溫度保持在一個恒定的范圍內(nèi)，如恒溫器以確保溫度不超過35℃。
重排列病毒可以通過導入一組載體很容易地獲得，這些載體含有主流感病毒的基因組節(jié)段和來源于目的病毒株(即感興趣的抗原性病毒株)的互補節(jié)段。一般來說，主病毒株的選擇是基于其是否具有與疫苗使用有關(guān)的特性。例如，對于疫苗制備，即減毒活疫苗的制備來說，選擇的主供體病毒要有減毒表型、冷適應性和/或溫敏流感病毒。因此，流感病毒A株ca A/Ann Arbor/6/60；流感病毒B株ca B/AnnArbor/1/66；或其他具有期望表型特性即減毒特性、冷適應性和/或溫敏流感病毒病毒株，如實施例4所描述的人工改造的流感病毒A株；或者表17所列的一個或多個取代的氨基酸的人工改造的流感病毒B株都優(yōu)選為主供體病毒株。
在一個實施方式中，含有主流感病毒株6個內(nèi)部基因(即PB1、PB2、PA、NP、M1、NS1和NS2)和抗原性病毒株，即經(jīng)預測可能引起明顯的局部或全球流感的病毒株來源的血凝素和神經(jīng)酰胺酶片段的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到合適的宿主細胞內(nèi)。重排列病毒在適于有效生長的溫度，即低于或等于35℃，如在約32℃到35℃之間，例如在約32℃到34℃之間，或約33℃下在細胞培養(yǎng)物中復制，然后收獲重排列病毒。另外，收獲的病毒還可以用變性劑如甲醛或β-丙內(nèi)酯滅活。
減毒的、溫度敏感的和冷適應的流感病毒疫苗在一個方面，本發(fā)明是基于確定導致優(yōu)選的主供體病毒株產(chǎn)生ts表型的突變。為了確定單個核苷酸改變對于MDV病毒株基因組的功能重要性，分析了A/AA/6/60病毒系內(nèi)高度相關(guān)的病毒株來源的重排列病毒的溫敏流感病毒。兩個親本病毒的同基因特性可以使單核苷酸改變對ts表型的影響得以評價。相應的，MDV-A的ts表型在核苷酸水平上的基因基礎(chǔ)被映射到PB1、PB2和NP內(nèi)的特異性氨基酸上。
以前有研究人員試圖利用共感染/重排列技術(shù)繪制ca A/AA/6/60的ts表型的基因基礎(chǔ)以制備出A/AA/6/60和不相關(guān)的野生型病毒株之間的單基因和多基因重排列病毒。這些研究表明PB2和PB1與ts表型都有關(guān)系(Kendal等，(1978)“重組病毒在亞理想溫度下的生化特性有跡象表明ts損傷存在于RNA節(jié)段1和3，RNA1編碼病毒原轉(zhuǎn)錄酶”(Biochemical characteristics of recombinant viruses derivedat sub-optimal temperaturesevidence that ts lesions are present in RNAsegments 1 and 3，and that RNA 1 codes for the virion transcriptase enzyme)，734-743頁，B.W.J.Mahy和R.D.Barry(編)，Negative Strand Viruses，AcademicPress；Kendal等，(1977)“野生型和冷突變(溫敏流感病毒)流感病毒的比較研究重組的冷適應病毒H3N2的基質(zhì)蛋白(M)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)的系譜學”(Comparativestudies of wild-type and cold mutant(temperature sensitive)influenzavirusesgenealogy of the matrix(M)and the non-structural(NS)proteins inrecombinant cold-adapted H3N2 viruses)，J Gen Virol37145-159；Kendal等，(1979)“野生型和冷突變(溫敏流感病毒)流感病毒的比較研究在突變型A/AnnArbor/6/60與野生型H3N2病毒株重組的過程中病毒復制的溫敏流感病毒與病毒原轉(zhuǎn)錄酶活性的溫敏流感病毒是相互獨立的”(Comparative studies of wild-type andcold-mutant(temperature sensitive)influenza virusesindependentsegregation of temperature-sensitivity of virus replication fromtemperature-sensitivity of virion transcriptase activity duringrecombination of mutant A/Ann Arbor/6/60 with wild-tyoe H3N2 strains)，J GenVirol，44443-4560；Snyder等，(1988)“4個病毒基因?qū)盍鞲蠥/AnnArbor/6/60(H2N2)冷適應重排列病毒疫苗的減毒活性的貢獻是獨立的”(Four viralgenes independently contribute to attenuation of live influenza A/AnnArbor/6/60(H2N2)cold-adapted reassortant virus vaccines)，J Virol62488-95)。但是這些研究的結(jié)果被兩株不同流感病毒A株來源的混合基因節(jié)段所導致的相互影響效應所混淆。通過A/AA/6/60和野生型基因節(jié)段而不是具有A/AA/6/60基因背景的表達ts表型的其他病毒株之間的改變可使相互作用減弱。相互影響效應也顯示出可混淆M基因組節(jié)段與att表型之間相互關(guān)系的解釋(Subbarao等，(1992)“流感病毒A/Ann Arbor/6/60冷適應病毒(H2N2)M基因所賦予的A/Korea/82(H3N3)重排列病毒的減毒表型來自于基因相互影響效應”(Theattenuation phenotype conferred by M gene of the influenza A/Ann Arbor/6/60cold-adapted virus(H2N2)on the A/Korea/82(H3N2)reassortant virus resultsfrom a gen constellation effect)，Virus Res，2537-50)。
在本發(fā)明中，導致氨基酸在PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34位置上發(fā)生取代的突變已被確定對于MDV-A株病毒的溫敏表型是具有功能意義的。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，在PB11195、PB11766、PB12005、PB2821和NP146位置上發(fā)生的核苷酸突變可分別導致在PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34位置上發(fā)生氨基酸取代。因此，任何能導致在這些位置上發(fā)生氨基酸取代的核苷酸改變都是本發(fā)明的特征。典型的突變包括單個突變PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)，優(yōu)選的是聯(lián)合突變，結(jié)果導致病毒產(chǎn)生溫敏表型。同樣這些突變恢復到野生型ts表型就會消失，而將這些突變引入具有野生型基因背景的病毒中就可以使其具有ts表型。和病毒傳代期間這些表型的穩(wěn)定性一致的是，單個變化不能使病毒的溫敏流感病毒回復到野生型病毒的水平。而且這些改變是在一起協(xié)調(diào)作用來完全表達ts表型的。這個發(fā)現(xiàn)可以使我們將其他溫敏流感病毒A株改造成適于制備減毒活流感疫苗的主供體病毒。
同樣，主供體病毒B株上每個氨基酸的改變都是與表17中所列的ts表型相關(guān)的。因此，本文所描述的方法適于通過在流感病毒B株基因組內(nèi)引入一個或多個特異性突變來制備具有溫敏表型、還可以具有減毒表型和/或冷適應表型的新型流感病毒B株。例如，將一個或多個能導致在下列位置上發(fā)生氨基酸取代的突變引入到流感病毒B株基因組中制備溫敏B型流感病毒PB2630；PA431；PA497；NP55；NP114；NP410；NP510；M1159和M1183。典型的氨基酸取代包括PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。
無論其制備方法如何，含有本發(fā)明的突變的流感病毒都是本發(fā)明的特征。也就是說本發(fā)明包括含有本發(fā)明的突變的流感病毒株，即在一個或多個下列位置上出現(xiàn)相對于野生型的氨基酸取代的任何A型流感病毒PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34，或者在一個或多個下列位置上出現(xiàn)相對于野生型的氨基酸取代的任何B型流感病毒PB2630；PA431；PA497；NP55；NP114；NP410；NP510；M1159和M1183，但是病毒株ca A/AnnArbor/6/60和B/Ann Arbor/1/66不是本發(fā)明的特征。在某些優(yōu)選的實施方式中，A型流感病毒含有一組(即2個、3個、4個、5個或更多個)如下突變PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)；B型流感病毒含有如下一組突變PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。例如，除了提供具有與疫苗制備有關(guān)的表型的病毒以外，含有一組突變，如1、2、3、4或5個選擇的突變，的病毒還可用于研究其他突變對病毒表型的影響。在某些實施方式中，流感病毒含有至少一個其他的非野生型核苷酸(可能導致其他的氨基酸改變)，這個核苷酸還可能賦予病毒期望的表型或?qū)σ延械钠谕硇瓦M一步作出貢獻。
細胞培養(yǎng)病毒的增殖一般都是在培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基中。適于流感病毒復制的宿主細胞包括Vero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、MDCK cells細胞和COS細胞，比如293T細胞、COS7細胞。通常用上述兩種細胞系的共培養(yǎng)物，如MDCK細胞與293T細胞或COS細胞以1∶1的比例共培養(yǎng)以提高復制的效率。細胞一般在標準的商用培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如添加血清(如10％胎牛血清)的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基，或無血清培養(yǎng)基，控制濕度和CO2的濃度以維持適宜的中性緩沖pH(即pH在7.0到7.2之間)。另外，培養(yǎng)基中還可以加入抗生素以防止細菌生長，如青霉素、鏈霉素等，還可以加入營養(yǎng)物質(zhì)如L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必須氨基酸、以及使細胞達到最佳生長狀態(tài)的添加劑，如胰蛋白酶、β-巰基乙醇等。
培養(yǎng)哺乳動物細胞的方法已有很多報道，都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。通用的培養(yǎng)過程見下列文獻的描述Freshney(1983)動物細胞的培養(yǎng)基本技術(shù)方法“(Culture of Animal CellsManual of Basic Technique)，Alan R.Liss，New York；Paul(1975)《細胞與組織培養(yǎng)》(Cell and Tissue Culture)，第五版，Livingston，Edinburgh；Adams(1980)《生物化學與分子生物學實驗室技術(shù)—生物化學家適用的細胞培養(yǎng)》(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-CellCulture for Biochemists)，Work和Burdon(編)，Elsevier，Amsterdam。有關(guān)在體外制備流感病毒的特殊組織培養(yǎng)方法的其他細節(jié)描述見Merten等，(1996)“在細胞培養(yǎng)物中制備流感病毒用于疫苗的制備”(Production of influenza virus in cellcultures for vaccine preparation)，Cohen和Shafferman(編)，《設(shè)計和制備疫苗的新策略》(Novel Strategies in Design and Production of Vaccines)，本文都已完整納入作為參考。另外，對這些方法進行改動以適用于本發(fā)明也是很容易通過常規(guī)試驗達到的。
用于制備流感病毒的細胞可在含血清的或無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在某些情況下，如在制備純化的病毒時，希望宿主細胞在無血清培養(yǎng)基中生長。細胞可以小規(guī)模培養(yǎng)，如在含25ml以下培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，也可以在大培養(yǎng)瓶中，如在回旋瓶中振蕩培養(yǎng)，或者在微載體微球(如DEAE-Dextran微載體微球，如Dormacell、Pfeifer & Langen；Superbead，F(xiàn)low Laboratories；苯乙烯共聚物-三-甲胺微球，如Hillex，Solohill，Ann Arbor)表面利用培養(yǎng)瓶或反應器培養(yǎng)。微載體微球是一種微小的球(直徑在100-200微米范圍內(nèi))，為單位體積細胞培養(yǎng)物中的粘附細胞的生長提供了一個較大的表面積。例如，1升培養(yǎng)基可包含2千萬以上的微載體微球，提供的生長表面超過8000mm2。對于商業(yè)用途的病毒制備，如疫苗制備來說，通常在生物反應器或發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)細胞。生物反應器的體積小到1升以下，大到100升以上，如Cyto3生物反應器(Osmonics，Minnetonka，MN)；NBS生物反應器(New Brunswick Scientific，Edison，N.J.)；來自B.Braun BiotechInternational(B.Braun Biotech，Melsungen，Germany)的實驗室和商用規(guī)模的生物反應器。
在本發(fā)明中不論培養(yǎng)體積的大小，培養(yǎng)溫度維持在35℃或以下是十分重要的，這樣可以確保利用本文所描述的多質(zhì)粒系統(tǒng)有效收獲重組病毒和/或重排列病毒。例如，細胞在約32℃到35℃之間的溫度下培養(yǎng)，一般在約32℃到34℃之間，最常用的是約33℃。
通常情況下用調(diào)節(jié)器如恒溫器或其他能探測及維持細胞培養(yǎng)系統(tǒng)溫度裝置來確保在病毒復制期間溫度不超過35℃。
載體導入宿主細胞攜帶流感病毒基因組節(jié)段的載體按照本領(lǐng)域熟知的方法被導入(如轉(zhuǎn)染)到宿主細胞內(nèi)從而將異源核酸引入真核細胞內(nèi)，這些方法包括鈣磷酸鹽共沉淀法、電穿孔、微注射、脂質(zhì)體介導以及利用多胺轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染。例如，載體如質(zhì)?？梢岳枚喟忿D(zhuǎn)染試劑TransIT-LT1(Mirus)按照廠家的說明書導入到宿主細胞內(nèi)，如COS細胞、293T細胞或者COS或293T細胞與MDCK細胞的混合物。約1μg載體導入到宿主細胞群內(nèi)需要約2μl TransIT-LT1，稀釋到160μl培養(yǎng)基中，優(yōu)選無血清培養(yǎng)基，總體積為200μl。DNA轉(zhuǎn)染試劑混合物在室溫下孵育45分鐘，然后加入800μl培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染混合物加入宿主細胞，然后按照上述方法培養(yǎng)。照此來計算，在細胞培養(yǎng)物中制備重組病毒或重排列病毒時，含有8個基因組節(jié)段(PB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA和NA)的載體與約20μl TransIT-LT1混合并轉(zhuǎn)染宿主細胞。另外，在轉(zhuǎn)染前可用無血清培養(yǎng)基，如Opti-MEM I替換含血清的培養(yǎng)基，然后孵育4-6小時。
另外，也可以用電穿孔方法將含流感病毒基因組節(jié)段的載體導入到宿主細胞內(nèi)。例如，含A型流感病毒或B型流感病毒的質(zhì)粒載體優(yōu)選利用電穿孔方法導入到Vero細胞內(nèi)，過程如下收獲5×106在添加10％胎牛血清(FBS)的改進的Eagle培養(yǎng)基(MEM)中生長的Vero細胞，重懸于0.4ml OptiMEM中，然后將細胞加入到電穿孔杯內(nèi)。20μgDNA混合到25μl，然后加到含細胞的杯內(nèi)，通過輕叩溫和混勻。按照廠家的說明書(BioRad Gene Pulser II with Capacitance Extender Plus connected)進行電穿孔，參數(shù)為300伏、950微法，持續(xù)時間28-33秒。通過溫和敲打再混合細胞，電穿孔后約1-2分鐘將0.7ml含10％FBS的MEM直接加入到小杯內(nèi)。然后將細胞轉(zhuǎn)移到標準6孔組織培養(yǎng)板的2個孔內(nèi)，孔內(nèi)含2ml MEM+10％FBS或無血清的OPTI-MEM。洗滌小杯以回收剩余的細胞，洗滌懸液分成兩孔。終體積約為3.5。然后再適合病毒生長的條件下孵育細胞，即冷適應株在約33℃培養(yǎng)。
病毒一般從培養(yǎng)基中回收，感染(或轉(zhuǎn)染)的細胞在培養(yǎng)基中生長。在濃縮流感病毒前一般要將粗分離的培養(yǎng)基澄清。常用的方法包括過濾、超濾、硫酸鋇吸附和洗脫以及離心。例如，感染培養(yǎng)物中粗分離的培養(yǎng)基首先在1000-2000×g離心足夠時間進行澄清以去掉細胞碎片和其他的大顆粒物質(zhì)，如離心10到30分鐘。另外，培養(yǎng)基還可以用0.8μm的醋酸纖維素濾器過濾以去除完整的細胞和其他大顆粒物質(zhì)。另外，經(jīng)澄清的培養(yǎng)基上清液還可以再離心以沉淀流感病毒，如15,000×g離心約3-5小時。將病毒團重懸浮到合適的緩沖液，如STE(0.01M Tris-HCl；0.15M NACI；0.0001M EDTA)或pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中后，利用蔗糖(60％-12％)或酒石酸鉀(50％-10％)密度梯度離心濃縮病毒。持續(xù)離心或分步驟離心都可以，如12％到60％之間的蔗糖梯度用4個12％步驟。梯度離心時要有足夠的轉(zhuǎn)速和時間以使病毒濃縮成可見的條帶以便于回收病毒。另外，對于最大規(guī)模的商業(yè)用途來說，不用密度梯度離心而用持續(xù)模式的帶狀離心轉(zhuǎn)子。下面文獻中所描述的其他細節(jié)足以指導本領(lǐng)域的技術(shù)人員在組織培養(yǎng)物中制備流感病毒Furminger，“疫苗制備”(VaccineProduction)，Nicholson等(編)，《流感病毒教科書》(Textbook ofInfluenza)324-332頁；Merten等，(1996)“在細胞培養(yǎng)物中制備流感病毒用于疫苗的制備”(Production of influenza virus in cell cultures for vaccinepreparation)，Cohen和Shafferman(編)，《設(shè)計和制備疫苗的新策略》(NovelStrategies in Design and Production of Vaccines)，141-151頁；以及美國專利5,690,937號。如果需要，回收的病毒還可以用蔗糖-磷酸鹽-谷氨酸鹽(SPG)作為穩(wěn)定劑置于-80℃保存。
預防用疫苗的使用方法和組合物本發(fā)明的重組和重排列病毒可以混合在合適的載體或賦形劑內(nèi)預防使用以刺激一個或多個流感病毒株特異性的免疫反應。載體或賦形劑通常都是藥用載體或賦形劑，如無菌水、鹽溶液、緩沖鹽溶液、葡萄糖溶液、甘油水溶液、乙醇、未感染的雞蛋的尿囊液(即正常的尿囊液″NAF″)或溶液的混合物。這種溶液要按照本領(lǐng)域已知的方法制備以確保無菌、合適的pH、等滲性及穩(wěn)定性。載體或賦形劑一般選擇能使變態(tài)反應或其他不良反應最小的，并且適合特定的給藥途徑，如皮下注射、肌肉注射、鼻內(nèi)給藥等。
本發(fā)明的流感病毒一般都要給予足夠的量以刺激一個或多個流感病毒株特異性的免疫反應。流感病毒的使用最好能激發(fā)保護性的免疫反應。激發(fā)抗一種或多種流感病毒株保護性免疫反應的劑量和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。例如，滅活的流感病毒的給藥劑量約為1-1000HID50(人感染劑量)，即每個劑量內(nèi)約含105-108pfu(噬菌斑形成單位)。另外，約10-50μg，如約15μg HA不添加佐劑給藥，或者以更小的劑量添加佐劑給藥。一般來說劑量在這個范圍內(nèi)可以根據(jù)年齡、身體狀況、體重、性別、飲食、給藥時間以及其他臨床因素作出調(diào)整。預防性疫苗制劑可以用針頭和注射器，或者無針注射裝置皮下注射或肌肉注射系統(tǒng)給藥。另外，疫苗制劑還可以利用滴劑、大顆粒氣溶膠(大于10微米)鼻內(nèi)給藥，或者通過噴霧噴入上呼吸道。雖然上述給藥途徑都可以激發(fā)保護性的全身免疫反應，但是鼻內(nèi)給藥還有另外的優(yōu)點，即可以在流感病毒進入部位激發(fā)粘膜免疫。對于鼻內(nèi)給藥來說，減毒活病毒疫苗通常是優(yōu)選的，即減毒的、冷適應的和/或溫敏流感病毒重組或重排列流感病毒。雖然利用單次劑量來刺激保護性免疫反應是優(yōu)選的，但是通過相同的或不同的給藥途徑給予附加的劑量也可以達到預期的保護效果。
另外，通過體外或體內(nèi)樹突狀細胞靶向性地與流感病毒相互作用也可以激發(fā)免疫反應。例如，增殖性的樹突狀細胞以足夠的劑量和足夠的時間與病毒接觸可以使樹突狀細胞捕獲流感病毒抗原。然后將細胞通過標準的靜脈移植方法轉(zhuǎn)移到被免疫的受試者內(nèi)。
另外，保護性流感病毒或其亞單位的制劑還可以包含一種或多種佐劑以增強抗流感病毒抗原的免疫反應。適宜的佐劑包括皂甙、礦物膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、普盧蘭尼克多元醇、聚陰離子、肽、油或烴乳劑、桿菌卡介苗(BCG)、小棒狀桿菌以及合成的佐劑QS-21和MF59。
如果需要，預防性流感病毒疫苗還可以和一種或多種免疫刺激分子一同使用。免疫刺激分子包括各種細胞因子、淋巴因子和趨化因子，這些因子具有免疫刺激活性、免疫增強活性和原炎癥因子活性，如白細胞機介素(如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-12，IL-13)；生長因子(如粒細胞-巨噬細胞(GM)-集落刺激因子(CSF))；以及其他免疫刺激分子，如巨噬細胞炎癥因子、Flt3配基、B7.1、B7.2等。免疫刺激分子可以和流感病毒在同一種制劑內(nèi)，也可以和流感病毒分別給藥。蛋白質(zhì)或編碼蛋白質(zhì)的表達載體可以使用以產(chǎn)出免疫刺激效應。
在另一個實施方式種，本發(fā)明的含流感病毒基因組節(jié)段的載體可用于將異源核酸導入到宿主菌或宿主細胞內(nèi)，如哺乳動物細胞，其中包括來源于人的細胞，并且與上述合適的藥用載體或賦形劑聯(lián)合使用。異源核酸通常被插入到基因或基因節(jié)段，如節(jié)段7的M基因的非必需區(qū)。異源多核苷酸序列編碼多肽或肽，或者RNA，如反義RNA或核酶。然后通過制備攜帶異源核酸的重組病毒將異源核酸引入宿主或宿主細胞內(nèi)，病毒按照上面所描述的方法使用。
另外，本發(fā)明的含異源核酸的載體可通過共轉(zhuǎn)染的方式導入到感染流感病毒的細胞內(nèi)并在宿主細胞內(nèi)表達。然后還可以將細胞回輸?shù)绞荏w內(nèi)，一般是回輸?shù)郊毎膩碓床课弧Ｔ谀承梅矫?，細胞可通過已有的細胞轉(zhuǎn)移或移植方法移植到感興趣的組織、器官或系統(tǒng)位點(如上所述)上。例如，造血細胞系的干細胞，如骨髓、臍帶血或外周血來源的造血干細胞可通過標準轉(zhuǎn)移或輸注技術(shù)轉(zhuǎn)移到受體內(nèi)。
另外，含異源核酸的病毒也可以轉(zhuǎn)移到受體體內(nèi)的細胞內(nèi)。這種方法一般包括將載體顆粒注射給靶細胞群(血細胞、皮膚細胞、肝細胞、神經(jīng)(包括腦)細胞、腎細胞、子宮細胞、肌肉細胞、腸細胞、頸細胞、陰道細胞、前列腺細胞等；以及各種細胞、組織、器官來源的腫瘤細胞)。可通過靜脈注射病毒顆粒系統(tǒng)給藥，也可以通過各種方法，如注射(利用針頭或注射器)、無針疫苗轉(zhuǎn)移、局部給藥或推入組織、器官或皮膚部位將病毒顆粒直接轉(zhuǎn)移到目的部位。例如，病毒載體顆粒可通過吸入、口服、靜脈注射、皮下注射、真皮下注射、真皮內(nèi)注射、肌肉注射、腹腔注射、氣管內(nèi)注射、陰道或直腸注射，或者通過在手術(shù)過程中將病毒顆粒置于身體的腔隙或其他部位轉(zhuǎn)移。
上述方法可通過將本發(fā)明的含異源多核苷酸的載體引入體外或體內(nèi)的靶細胞群用于治療性和/或預防性治療疾病或失調(diào)，其中異源多核苷酸編碼治療性或預防性多肽(或肽)或RNA(入反義RNA或核酶)。編碼目的多肽(或肽)或RNA的多核苷酸一般都連接有上面“表達載體”部分和“其他表達元件”部分所描述的適當調(diào)節(jié)序列。另外，一個載體或病毒可以插入多個異源編碼序列。例如，除了編碼治療性或預防性活性多肽或RNA外，載體還可以含有其他治療性或預防性多肽，如抗原、共刺激分子、細胞因子、抗生素等，和/或篩選標記等。
本發(fā)明的方法和載體可用于預防或治療多種疾病，包括遺傳疾病和獲得性疾病，如以疫苗的形式預防或治療由病毒、細菌等引起的疾病。
試劑盒為了便于使用本發(fā)明的載體和載體系統(tǒng)，任何載體，如含有流感病毒共有序列的質(zhì)粒、含有突變的流感病毒多肽的質(zhì)粒、流感病毒多肽文庫質(zhì)粒等，和用于包裝和感染實驗性或治療性流感病毒的其他組分，如緩沖液、細胞、培養(yǎng)基都可以包裝成試劑盒的形式。一般來說，除了上述組分外，試劑盒還包含其他材料，如使用本發(fā)明方法的說明書、包裝材料以及容器。
病毒核酸和蛋白質(zhì)的操作在本發(fā)明的范圍內(nèi)，流感病毒核酸和/或蛋白質(zhì)可按照已知的分子生物學技術(shù)操作。許多這種方法，包括擴增、克隆、突變、轉(zhuǎn)化等的詳細過程見下列文獻的描述Ausubel等，《當前的分子生物學操作技術(shù)》(2000年增補)(Current Protocolsin Molecular Biology(supplemented through 2000))John Wiley & Sons，NewYork(″Ausubel″)；Sambrook等，《分子克隆-實驗室手冊》(Molecular Cloning-ALaboratory Manual)(第二版)，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，1989(″Sambrook″)；以及Berger和Kimmel《分子克隆技術(shù)指導，酶學方法》，152卷，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(″Berger″)。
除了上述文獻外，其他可用于擴增本發(fā)明的cDNA探針的體外擴增技術(shù)操作方法，如多聚酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應(LCR)、Q-復制酶擴增以及其他RNA聚合酶介導的技術(shù)(如NASBA)可見于下列文獻的描述Mullis等，(1987)美國專利4,683,202號；《PCR技術(shù)一方法和應用指導》(PCR Protocols A Guide to Methods andApplications)(Innis等編)，Academic Press Inc.San Diego，CA(1990)(″Innis″)；Arnheim和Levinson(1990)C&EN 36；The Journal Of NIH Research(1991)381；Kwoh等，(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86，1173；Guatelli等，(1990)Proc NatlAcad Sci USA 871874；Lomell等，(1989)J Clin Chem 351826；Landegren等，(1988)Science 2411077；Van Brunt(1990)Biotechnology 8291；Wu和Wallace(1989)Gene 4560；Barringer等，(1990)Gene 89117以及Sooknanan和Malek，(1995)Biotechnology 13563。其他可用于克隆本發(fā)明的核酸的方法見于Wallace等，5,426,039號。通過PCR擴增大片段核酸的改進方法見綜述Cheng等，(1994)Nature 369684及其參考文獻。
本發(fā)明的某些多核苷酸，如寡核苷酸可利用各種固相技術(shù)合成，其中包括單核苷酸一和/或三核苷酸亞磷酰胺耦合化學。例如，核酸序列可通過將活化的單體或三體順序添加到延伸的多核苷酸鏈上來合成，見Caruthers，M.H.等，(1992)Meth Enzymol2113。
除了合成所需要的序列以外，還可以從各個商家訂購基本的核酸序列，如MidlandCertified Reagent Company(mcrc@oligos.com)，The Great American Gene Company(www.genco.com)，ExpressGen，Inc.(www.expressgen.com)，Operon Technologies，Inc.(www.operon.com)等。
另外，取代病毒多肽上的指定氨基酸可通過位點特異性突變來實現(xiàn)。例如，含有在功能上與表型特征，如減毒表型、冷適應性、溫敏流感病毒相關(guān)的取代的氨基酸的病毒多肽可通過將特異性的突變引入編碼多肽的病毒核酸片段上來制備。位點特異性突變的方法是本領(lǐng)域熟知的，見上述Ausubel、Sambrook和Berger的描述。許多位點特異性突變試劑盒都可以買到，如Chameleon定點誘變試劑盒(Stratagene，La Jolla)，可按照廠家的操作說明書進行操作，將表6或表17中所描述的一個或多個氨基酸取代引入到編碼流感病毒A或B多肽的基因組節(jié)段中。
實施例實施例1pAD3000的構(gòu)建質(zhì)粒pHW2000(Hoffmann等，(2000)“用于從8個質(zhì)粒開始制備流感病毒A的DNA轉(zhuǎn)染系統(tǒng)”(A DNA transfection system for generation of influenza A virus fromeight plasmids)Proc Natl Acad Sci USA 976108-6113)經(jīng)過改造，用猿病毒40(SV40)來源的多聚腺苷酸信號序列代替牛生長激素(BGH)多聚腺苷酸信號。
SV40來源的序列用下列寡核苷酸通過Taq MasterMix(Qiagen)擴增，方向為5’到3’polyA.1AACAATTGAGATCTCGGTCACCTCAGACATGATAAGATACATTGATGAGT(SEQ ID NO1)polyA.2TATAACTGCAGACTAGTGATATCCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA(SEQ ID NO2)用質(zhì)粒pSV2His作為模板。按照廠家的說明書用Topo TA cloningvector(Invitrogen)擴增出一個與預測一致的175bp產(chǎn)物，然后克隆到pcDNA3.1中。用EcoRV和BstEII將所需要的含SV40多聚腺苷酸信號的138bp的片段從所得到的質(zhì)粒上切下，瓊脂糖凝膠電泳分離，然后利用常規(guī)方法(見Ausubel，Berger，Sambrook)克隆到pHW2000的獨特PvuII和BstEII位點上。所得到的質(zhì)粒pAD3000(圖1)經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)含有SV40多聚腺苷酸位點并且方向正確。pAD3000上的核苷酸295-423相對于SV40株777(AF332562)上的核苷酸2466-2594。
實施例2制備MDV-A的8質(zhì)粒系統(tǒng)通常用冷適應性的A型流感病毒突變株A/AA/6/60作為主供體病毒制備鼻內(nèi)給藥的A型流感疫苗。這個病毒株在本發(fā)明中是典型的主供體病毒(MDV)。為了簡化，本文將這個A/AA/6/60突變株命名為MDV-A。MDV-A病毒RNA用RNeasy迷你試劑盒(Qiagen)提取，8個相應的cDNA片段用表1所列引物通過RT-PCR擴增。
表1.用于克隆MDV-A8個節(jié)段的引物序列
除了編碼HA和PB2的流感病毒基因組節(jié)段用含Aar I限制性內(nèi)切酶識別位點的引物擴增以外，其余的6個基因都用含BsmB I限制性內(nèi)切酶識別位點的引物擴增。Aar I和BsmB I cDNA片段都可以克隆到pAD3000載體的兩個BsmB I位點之間。
序列分析表明所有克隆的cDNA片段都含有與MDV-A共有序列有關(guān)的突變，這些突變可能是在克隆的過程中引入的。每個基因節(jié)段中發(fā)現(xiàn)的突變總結(jié)在表2中。
表2.被引入到pAD3000的MDV-A克隆中的突變
所有的突變都可以用QuikChange定點誘變試劑盒(Stratagene)和表3中所列的合成寡核苷酸引物矯正回MDV-A共有序列。
表3.用于矯正MDV-A克隆中突變的引物
實施例3感染性重組MDV-A和重排列流感病毒的制備Madin-Darby狗腎(MDCK)細胞和人COS7細胞用含10％胎牛血清(FBS)的改進的Eagle培養(yǎng)基(MEM)培養(yǎng)。人胚胎腎細胞(293T)用含5％FBS的Opti-MEM I(LifeTechnologies)培養(yǎng)。MDCK或者和COS7或者和293T細胞以1∶1的比例在6孔培養(yǎng)板內(nèi)共培養(yǎng)，在細胞生長到約80％匯合時用于轉(zhuǎn)染。293T和COS7細胞具有很高的轉(zhuǎn)染效率，但是不允許流感病毒復制。與MDCK細胞共培養(yǎng)可確保重組病毒有效復制。在轉(zhuǎn)染前用無血清培養(yǎng)基(Opti-MEM I)替換含血清的培養(yǎng)基，然后孵育4-6小時。質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染用TransIT-LT1(Mirus)，8種質(zhì)粒DNA(PB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA和NA)的每一種取1μg與20μl TransIT-LT1混合，然后稀釋到160μl Opti-MEM I培養(yǎng)基中，總體積為200μl。DNA轉(zhuǎn)染試劑混合物在室溫下孵育45分鐘，加入800μlOpti-MEM I培養(yǎng)基。然后將轉(zhuǎn)染混合物加入到共培養(yǎng)的MDCK/293T或MDCK/COS7細胞細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染的細胞在35℃或33℃孵育6到24小時，如過夜，然后在每孔中加入1ml Opti-MEMI替換轉(zhuǎn)染混合物。在35℃或33℃孵育24小時后，每孔中加入1ml含1μg/ml TPCK-胰蛋白酶的Opti-MEM I，在孵育12小時。然后在匯合的MDCK細胞內(nèi)擴增收獲的病毒，或者直接在含胚胎的雞蛋內(nèi)擴增。在12孔培養(yǎng)板中分MDCK細胞用0.2ml轉(zhuǎn)染混合物在室溫下轉(zhuǎn)染1小時，然后去掉轉(zhuǎn)染混合物并用2ml含1μg/mlTPCK-胰蛋白酶的Opti-MEM I替換。細胞在35℃或33℃孵育3-4天。擴增出的病毒加入SPG穩(wěn)定劑在-80℃保存，或者在MDCK細胞或含胚胎的雞蛋內(nèi)進行噬菌斑純化和擴增。
MDA-A聚合物蛋白的功能性表達4種MDV-A聚合酶蛋白PB2、PB1、PA和NP的功能活性通過檢測其復制編碼EGFP報告基因的流感病毒微小基因組的能力來分析。一套含8個表達質(zhì)粒的載體(見表4)(Hoffmann等，(2001)“用于回收A型流感病毒的8質(zhì)?；厥障到y(tǒng)；控制流感病毒的選擇”(Eight plasmid rescue system for influenza A virus；Options for thecontrol of influenza)International Congress Series 12191007-1013)含有A/PR/8/34病毒株(H1N1)的cDNA以及攜帶編碼增強型綠色熒光蛋白(EGFP，pHW72-EGFP)的報告基因的流感病毒小基因組。
將MDV-A PB1、PB2、PA和NP，或PB1、PA、NP(PB2作為陰性對照)與表達流感A病毒EGFP小基因組的質(zhì)粒(pHW72-EGFP)一起轉(zhuǎn)染到共培養(yǎng)的MDCK/293T細胞內(nèi)(Hoffmann等，(2000)“‘雙義’方法制備A型流感病毒從一個模板內(nèi)合成vRNA和mRNA”(″Ambisense″approach of the generation of influenza A virusvRNA andmRNA synthesis from one template)Virology 15267(2)310-7)。轉(zhuǎn)染后48小時在相差顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染的細胞。另外，還可以用流式細胞儀檢測EGFP的表達。
如圖2所示，在轉(zhuǎn)染MDV-A的PB2、PB1、PA和NP的細胞內(nèi)可觀察到綠色熒光，說明EGFP小基因組是表達的，而在只轉(zhuǎn)染3個聚合物蛋白的細胞內(nèi)觀察不到熒光。這說明pAD3000內(nèi)的MDV-A聚合酶蛋白是有功能的。
在其他的試驗中，被命名為pFlu-CAT的含氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因的小基因組用于檢測聚合酶的活性。在這個試驗中CAT在蛋白水平(如通過ELISA)或RNA水平的表達作為小基因組復制的指標。
通過單基因重排列試驗分析MDV-A質(zhì)粒通過MDV-A的單個基因節(jié)段與對照病毒株A/PR/8/34的其他7個互補節(jié)段共轉(zhuǎn)染進行重排列試驗，結(jié)果表明克隆到pAD3000內(nèi)的8個MDV-A基因組節(jié)段都是有功能的。所有8個含單個基因組節(jié)段的質(zhì)粒與對照病毒株的互補節(jié)段共轉(zhuǎn)染都可以產(chǎn)生出具有感染性的重排列病毒，這些病毒可以在感染的MDCK細胞內(nèi)引起細胞病理效應，說明所有這8個質(zhì)粒都能編碼具有功能的MDV-A蛋白。
表4.7+1重排列病毒通過質(zhì)?；謴?
為了進一步確定A型流感病毒的包裝限制，將NS節(jié)段分為兩個基因節(jié)段一個編碼NS1基因組節(jié)段，另一個編碼NS2基因組節(jié)段。將含有A型流感病毒9個基因組節(jié)段的9個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到上述MDCK/COS細胞內(nèi)，在用MDCK細胞測定滴度前先用含胚胎的雞蛋擴增收獲的病毒。結(jié)果看到9質(zhì)粒系統(tǒng)所產(chǎn)生的噬菌斑比上述的8質(zhì)粒系統(tǒng)小。RT-PCR分析表明只有NS2節(jié)段存在于病毒顆粒內(nèi)，而NS1基因沒有被包裝進去。
MDV-A和6:2重排列病毒的收獲根據(jù)上面描述的方法，用8個MDV-A質(zhì)粒(重組病毒)或用含6個MDV-A內(nèi)部基因以及A/PR/8/34來源的HA和NA基因的質(zhì)粒(6:2重排列病毒)轉(zhuǎn)染后3天，收集培養(yǎng)物上清用于轉(zhuǎn)染新的MDCK細胞，轉(zhuǎn)染的細胞在1μg/ml TPCK-胰蛋白酶存在的條件下在33℃孵育3天。利用顯微鏡觀察重組病毒的胞漿效應。病毒血凝素的表達用標準的血細胞凝集試驗(HA)進行分析。HA分析是通過50μl系列倍比稀釋的培養(yǎng)上清與50μl 1％雞紅細胞在96孔板內(nèi)混合而進行的。轉(zhuǎn)染的8 MDV-A質(zhì)粒來源的擴增病毒以及6:2重排列病毒所檢測到的HA滴度約為1:254-1:1024。利用E.Hoffman博士惠贈的8A/PR/8/34質(zhì)粒進行的轉(zhuǎn)染反應作為陽性對照。這3個轉(zhuǎn)染反應所制備的感染性流感病毒列在表5中。
表5.用于恢復A/PR/8/34、MDV-A和6:2重排列病毒的質(zhì)粒
利用RT-PCR測定回收的病毒的基因型。用RNeasy迷你試劑盒(Qiagen)從感染細胞培養(yǎng)上清中分離病毒RNA，用每個MDV-A基因節(jié)段的特異性引物以及H1和N1特異性引物通過RT-PCR擴增8個流感病毒的節(jié)段。如圖3所示，rMDV-A所含有的PB2、PB1、NP、PA、M和NS是MDV-A特異性的，HA和NA是H2和N2亞型特異性的。6:2重排列病毒含有MDV-A來源的6個內(nèi)部基因和A/PR/8/34(H1N1)來源的HA和NA。這說明用轉(zhuǎn)染質(zhì)粒制備的病毒具有正確的基因型。
用MDCK細胞做噬菌斑形成試驗分析回收病毒的滴度，噬菌斑是否是流感病毒所形成的通過抗MDV-A的雞血清進行免疫染色來確定。在12孔板內(nèi)MDCK細胞生長到100％匯合時用100μl 10倍系列稀釋的病毒感染，在室溫下溫和搖動1小時。去掉接種物，細胞用含0.8％瓊脂糖和1μg/ml TPCK-胰蛋白酶的1×L15覆蓋。培養(yǎng)板放到35℃或33℃孵育3天，然后用100％甲醇固定，用含5％牛奶的PBS封閉，與1∶2000稀釋的雞抗MDV-A抗血清孵育1小時，然后再與HRP連接的兔抗雞IgG孵育1小時。加入HRP底物溶液(DAKO)就可以看到噬菌斑。所有回收的病毒免疫染色都呈陽性。
實施例4繪制MDV-A的ca、ts、att表型的基因基礎(chǔ)MDV-A流感病毒疫苗株具有幾種與疫苗制備有關(guān)的表型，即減毒活疫苗冷適應性(ca)、溫敏流感病毒(ts)和減毒特性(att)。MDV-A株與非ts毒性野生型A/AA/6/60株的序列比較表明兩個病毒株之間有17nt的差異(表6)。通過與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的所有A型流感病毒相比發(fā)現(xiàn)MDV-A序列內(nèi)的幾個變化都是這個病毒株所獨有的，說明這些取代的氨基酸中的一個或多個是與att、ca及ts表型相關(guān)的。在PB2821位置上發(fā)生的單個氨基酸改變是唯一一個以前已報道的決定MDV-A ts表型的核苷酸位置(Subbarao等，(1995)“在A型流感轉(zhuǎn)染體病毒的PB2基因上引入溫敏流感病毒錯義突變可影響溫敏流感病毒和減毒活性的升高并使人工改造的A型流感病毒活疫苗的設(shè)計更合理”(Addition of Temperature-Sensitive Missense Mutations into thePB2 Gene of Influenza A Transfectant Viruses Can Effect an Increase inTemperature Sensitivity and Attenuation and Permits the Rational Design ofa Genetically Engineered Live Influenza A Virus Vaccine)J.Virol.695969-5977)。
為了精確定位涉及MDV-A表型的最小取代，將MDV-A上與野生型A/AA/6/60不同核苷酸逐個改變成野生型A/AA/6/60的核苷酸(即″反轉(zhuǎn)″)。然后將每個反轉(zhuǎn)的基因節(jié)段與MDV-A的其他片段一起導入到宿主細胞以恢復單基因重排列病毒。另外，反轉(zhuǎn)基因節(jié)段和相應的MDV-A片段還可以和其他野生型病毒株，如A/PR/8/34一起轉(zhuǎn)染以評價每個基因節(jié)段對病毒表型的貢獻。利用上述重組MDV-A質(zhì)粒系統(tǒng)進行位點特異性突變以進一步改變6個內(nèi)部基因制備出非ts重排列病毒。共有15核苷酸取代突變倍引入到6個MDV-A質(zhì)粒中，代表表6中所列的重組野生型A/AA/6/60基因組(rWt，F(xiàn)lu064)。Madin-Darby狗腎(MDCK)細胞和COS-7細胞按上述方法培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染?；厥盏牟《驹贛DCK細胞內(nèi)傳代一次，然后在含胚胎的雞蛋尿囊腔內(nèi)擴增。在MDCK和雞蛋內(nèi)的轉(zhuǎn)染和病毒擴增在33℃進行，這個溫度對于ca和wt病毒來說都可以將溫度篩選壓力降到最低。通過測定從病毒RNA中擴增出的cDNA片段的序列來確定病毒的基因型。
表6.“野生型”A/AA/6/60和MDV-A的序列比較
加粗的數(shù)字代表rMDV-A和rWt之間的區(qū)別。
加粗的單詞(15)代表rmdv-a和rwt之間的變化。
表型特征用本領(lǐng)域熟知的方法確定，如Parkin的美國專利6,322,967號所描述的，該專利的名稱為“流感病毒的重組色氨酸突變株”(″Recombinant tryptophan浮液提供了作為首次劑量的極少的接種物。盡管如此，當通過飼喂的第二個劑量來加強時，這些雞產(chǎn)生反應，說明通過IN路徑小劑量足以使雞接受LT抗原。
表3
表3A顯示血清學反應。無論該劑量是在0，7或14日齡提供，檢測血清學反應的最早時間為21日齡。在第3、7和11組中，第三個劑量是在28日齡時提供，但不是產(chǎn)生可檢測的滴度所需要的。在21日齡檢測的反應持續(xù)到42日齡，與肉用仔雞的上市日齡(35-65天)相吻合。
當僅給予雞兩個劑量時，觀察到最佳的血清學反應，在兩種情況下，首次接種在1日齡，而第二次接種在7日齡。由于通常在入孵前的第三天或者在孵化第1天通過雞蛋進行接種，在1日齡時使雞接觸到抗原可以應用于肉用仔雞工業(yè)生產(chǎn)的免疫接種實踐中。
為了系統(tǒng)地詳細地分析MDV-A ts表型的基因基礎(chǔ)，將幾個比較相近的非ts、非att野生型A/AA/6/60株的序列與具有17-48nt差異的ca A/AA/6/60，包括高度相關(guān)的分離株wt A/AA/6/60 E10SE2的序列進行比較。E10SE2和MDV-A之間共有19nt的差異(表6)。E10SE2在雪貂中是非ts(表7)和非att的。為了制備重組非ts病毒，通過位點特異性突變在MDV-A質(zhì)粒中引入15-19個突變，代表10個氨基酸的改變。MDV-A和E10SE2之間不同的4個核苷酸位置PB2-1182、1212、PB1-123和NP-1550不在MDV-A序列上改變，因為這些核苷酸也存在于A/AA/6/60的其他非ts分離株，因此這些位置上的核苷酸對于ts的表達可能不產(chǎn)生影響(Herlocher等，(1996)“A/AA/6/60流感病毒的序列比較影響減毒表型的突變“(Sequence comparisons ofA/AA/6/60 influenza virusmutations which may contribute toattenuation).Virus Research 4211-25)。編碼15個核苷酸改變的重組病毒(rWt，F(xiàn)lu064)得自轉(zhuǎn)染8種質(zhì)粒，pWt-PB2、pWT-PB1、pWt-PA、pWt-NP、pWt-M、pWt-NS、pMDV-HA和pMDV-NA的共培養(yǎng)的COS-7/MDCK細胞。序列分析表明rWt含有預先設(shè)計的基因改變，在39℃時是非ts表型的，與生物學方法制備的野生型A/AA/6/60一致。這些結(jié)果證明ts表型是由于這15nt核苷酸的改變。
6個內(nèi)部基因節(jié)段對病毒ts表型的貢獻每個野生型基因節(jié)段對MDV-A ts表型的影響通過制備重組的單基因重排列病毒來評價(表7)。野生型PB2引入rMDV-A導致病毒只在38℃時呈非溫敏表型，但是，在39℃時依然保持溫敏表型。通過在MDCK細胞內(nèi)進行噬菌斑形成試驗發(fā)現(xiàn)病毒滴度在38℃和39℃時分別降低0.6log10和2.7log10(與33℃相比)。含野生型PB1基因節(jié)段的重排列病毒是非溫敏流感病毒，其在38℃和39℃時都可以形成噬菌斑。但是這個重組病毒形成的噬菌斑的大小受增加的溫度的影響，與rWt相比在39℃時明顯縮小。野生型NP基因引入rMDV-A也可導致病毒在38℃時呈非溫敏表型，但是與野生型PB2重組病毒相比，這個含野生型NP基因節(jié)段的病毒在39℃時不能形成噬菌斑。將野生型PA、M或NS基因節(jié)段單獨引入rMDV-A不能改變其溫敏表型，說明這3個基因節(jié)段對于維持這個表型的作用很小。
由于在MDV-A背景上單獨表達野生型PB1、PB2或NP都不能產(chǎn)生明顯的噬菌斑，噬菌斑的大小無法達到非野生型rWt的程度，因此將這些基因節(jié)段以各種組合的方式導入到MDV-A中。野生型PB1和野生型PB2聯(lián)合導入可導致病毒在38℃和39℃時呈非溫敏表型(表7)。盡管噬菌斑的大小比任何一種單基因重排列病毒形成的噬菌斑要大，但是卻比rWt形成的噬菌斑明顯要小。因此，當野生型PB2、PB1或NP基因節(jié)段單獨導入時只能部分反轉(zhuǎn)溫敏表型，而將這3個野生型基因節(jié)段聯(lián)合在一起導入時卻能將其溫敏表型完全反轉(zhuǎn)成與rWt一樣的非溫敏表型。
為了確定這3個基組節(jié)段是否能將MDV-A的溫敏表型傳遞給rWt，將MDV-A來源的6個內(nèi)部基因分別或聯(lián)合導入到rWt中。將PB1、PB2或NP單獨引入rWt可導致病毒滴度在38℃時降低，在39℃時降低更多，但是這些單基因重排列病毒都不是和rMDV-A一樣限制在高溫度(圖10)。MDV-A來源的PA、M和NS基因節(jié)段不能影響rWt的非溫敏表型。與前面的結(jié)果相一致，將MDV-A PB1和PB2兩個基因?qū)氲絩Wt背景中可大大增加病毒在38℃的溫敏表型，但是完全反轉(zhuǎn)病毒的溫敏表型需要再加上NP基因。因此，MDV-A來源的PB1、PB2和NP基因節(jié)段在賦予完全的溫敏表型中是同樣重要的。
繪制決定MDV-A溫敏表型的基因位點rWt的PB1、PB2和NP和rMDV-A的PB1、PB2和NP之間的特殊差異全部列出以確定哪些改變在溫敏表型中發(fā)揮顯著作用。rMDV-A的NP基因與rWt的NP基因之間的差別只在146位上(G34D，表6)。rMDV-A的PB2基因與rWt的PB2基因之間的差別在3個位點上，但是只有nt821的改變可導致氨基酸的變化(N265S，表6)，因此推斷這個位點代表PB2基因節(jié)段上的溫度敏感位點。rMDV-A的PB1基因與rWt的PB1基因之間的差別在6個位置上，其中有4個編碼氨基酸的改變(表6)。每個野生型氨基酸殘基分別替換到rMDV-A的PB1基因節(jié)段上以評價其對ts表型的影響。1395G(Glu-457)和2005G(Ala)不影響DV-A的溫敏表型。1195A(Lys-391)和1766A(Glu-581)可導致在38℃時穩(wěn)定敏感表型輕微下降，但是在39℃時沒有作用(表8)。這些數(shù)據(jù)說明1195A和1766A可能是PB1基因節(jié)段上的溫度敏感位點。但是，1195A和1766A聯(lián)合起來卻不能產(chǎn)生出與野生型PB1一致的溫敏表型(表6)。將2005G而不是1395A加到PB1-1195A/1766A上還可以進一步降低病毒在39℃時的溫敏表型，說明2005A對于MDV-A PB1片段的溫敏表型的表達也有影響。
表8繪圖描述PB1中決定ts表型的殘基具有野生型序列的病毒 33℃38℃ 33℃/38℃39℃ 33℃/39℃log10PFU/mLrMDV-A8.676.00 2.67 ＜4.0＞4.67rWt 9.049.01 0.03 9.03 0.01PB1-1195A 8.066.68 1.38 ＜4.0＞4.06PB1-1395G 8.725.88 2.85 ＜4.0＞4.72PB1-1766A 8.076.70 1.37 ＜4.0＞4.07PB1-2005G 8.766.31 2.45 ＜4.0＞4.76PB1-1195A1766A8.657.60 1.05 5.98*2.68PB1-1195A1395G1766A 8.848.13 0.71 6.38*2.46PB1-1195A1766A2005G 8.798.12 0.66 7.14*1.64PB1/PB2/NP8.268.63 0.12 8.59 0.16PB2/NP8.818.21 0.59 7.56*1.25PB1-1195A/PB2/NP 8.868.81 0.05 7.60*1.26PB1-1766A/PB2/NP 9.338.84 0.50 8.71*0.62PB1-1766A2005G/PB2/NP 8.308.22 0.08 8.11*0.18PB1-1766A1395G/PB2/NP 8.888.85 0.03 8.39*0.49PB1-1195A1766A/PB2/NP 8.458.48 0.06 8.10 0.35*表示與rWt相比噬菌斑減小下劃線表示在10-4倍稀釋時沒有檢測到噬菌斑將單位點突變的PB1和野生型PB2和NP一起導入到rMDV-A中。野生型PB2/NP和rMDV-A重排列病毒在38℃時是非溫敏流感病毒，在39℃時滴度下降1.25log10，但是其形成的噬菌斑與rWt相比明顯減小。加上PB1-1195A或1766A不能顯著改變野生型PB2/NP重排列病毒的表型。只有PB1-1195A和1766A聯(lián)合與野生型PB2和NP一起才能導致病毒具有與野生型PB1/PB2/NP和rMDV-A重排列病毒相同的非溫敏表型(表8)。將PB1-1395G或2005G引入野生型PB1-1766/PB2/NP也不能使病毒轉(zhuǎn)變成rWt的非溫敏表型。因此，這些數(shù)據(jù)說明分布在PB1、PB2和NP基因上的4個氨基酸能完全反轉(zhuǎn)MDV-A的穩(wěn)定敏感表型。
MDV-A和重排列病毒的宿主細胞限制性MDV-A病毒和具有一個或多個MDV-A來源節(jié)段的重排列病毒除了具有溫敏流感病毒和減毒表型以外，MDV-A病毒還具有宿主細胞限制性，因為該病毒在Per.C6細胞內(nèi)的生長水平要低于在MDCK細胞內(nèi)的生長水平。與在MDCK細胞內(nèi)相比，MDV-A和具有MDV-A來源的PB1和PB2節(jié)段的重排列病毒在Per.C6細胞內(nèi)的生長水平顯著降低，如圖20A和20B所示。
溫度敏感的減毒病毒株的改造為了確定MDV-A的PB1、PB2和NP基因節(jié)段上的5個氨基酸是否能修復MDV-A的溫敏表型和減毒表型，將PB1-391E、581G、661T、PB2-265S、NP-34G引入到野生型病毒株(A/PR/8/34；″PR8″)中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒的滴度在38℃時下降1.9log10，在39℃時下降4.6log10，與rMDV-A的結(jié)果非常相似(圖11)。
ca A/AA/6/60(MDV-A)和A/PR/8/34的PB1、PB2和NP基因的序列比較發(fā)現(xiàn)MDV-A的PB1和PB2基因上的4個取代的氨基酸是獨有的。NP34在MDV-A和PR8之間是保守，因此，通過位點特異性突變將MDV-A的PB1基因上的3個溫度敏感位點PB1391(K391E)、PB1581(E581G)和PB1661(A661T)引入到A/PR/8/34上，將PB2265(N265S)引入到A/PR/8/34的PB2上。引入到PB1和PB2上的突變通過序列分析確證。用于突變反應的引物對列在表9中。這些病毒在圖16中用示意圖標出。。
表9.用于將ts突變引入PR8 PB1基因和PB2基因中的引物HJ240 PR8-PB1A1195G 5’GAAAGAAGATTGAAGAAATCCGACCGCTC(SEQ ID NO79)HJ241 PR8-PB1A1195G.as5’GAGCGGTCGGATTTCTTCAATCTTCTTTC(SEQ ID NO80)HJ242 PR8-PB1A1766G 5’GAAATAAAGAAACTGTGGGGGCAAACCCGTTCC(SEQ ID NO81)HJ243 PR8-PB1A1766G.as5’GGAACGGGTTTGCCCCCACAGTTTCTTTATTTC(SEQ ID NO82)HJ244 PR8-PB1G2005A 5’GTATGATGCTGTTACAACAACACACTCC(SEQ ID NO83)HJ245 PR8-PB1G2005.as 5’GGAGTGTGTTGTTGTAACAGCATCATAC(SEQ ID NO84)HJ246 PR8-PB2A821G5’ATTTGCTGCTAGGAGCATAGTGAGAAGAGC(SEQ ID NO85)HJ247 PR8-PB2A821G.as 5’GCTCTTCTCACTATGCTCCTAGCAGCAAT(SEQ ID NO86)為了檢測引入到PR8的PB1和PB2上的溫度敏感突變是否能在體外導致溫敏表型，進行小基因組分析。流感病毒小基因組報告子被稱為pFlu-CAT，含有反義CAT基因，該基因位于pol I啟動子的控制之下。CAT蛋白的表達依賴于流感病毒PB1、PB2、PA和NP蛋白的表達。
簡言之，HEp-2細胞用1μg PB1、PB2、PA、NP和pFlu-CAT小基因組通過lipofectamine 2000(Invitrogen)分別轉(zhuǎn)染。在33℃或39℃孵育過夜(大約18小時)后，用CAT ELISA試劑盒(Roche Bioscience)分析細胞提取物中CAT蛋白的表達。CAT mRNA的表達通過因為延伸分析檢測。轉(zhuǎn)染后48小時，用TRIzolreagent(Invitrogen)提取細胞總RNA，1/3 RNA與過量的DNA引物(5’-ATGTTCTTTACGATGCGATTGGG)和T4多核苷酸激酶在6μl水內(nèi)混合，其中引物在5’末端用[r-32P]-ATP標記。在95℃變性3分鐘后，在反應緩沖液中加入50U反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)進行引物延伸，其中緩沖液中含0.5mM dNTP反應在42℃進行1小時。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在含8M尿素的6％聚丙稀酰胺凝膠上進行電泳分析，緩沖液為TBE，然后進行放射自顯影。
如圖12A和12B所示，攜帶3個取代的氨基酸(PR8-3s)PB1391(K391E)、PB1581(E581G)和PB1661(A661T)的PB1基因其活性在33℃時比PR8對照降低。這個突變株在39℃時的CAT蛋白表達下降更明顯(圖12A)，說明具有3個引入的MDV-A溫度敏感位點的PB1基因在體外試驗中的復制是溫敏流感病毒。將PB2265(N265S)引入PR8卻對其在允許溫度(33℃)和非允許溫度(39℃)下的活性影響很小。PB1-3s和PB2-1s結(jié)合卻可以使蛋白活性顯著降低(PR8-4s)，甚至比MDV-A的溫敏流感病毒更強。正如所預期的，在轉(zhuǎn)染MDV-A來源的PB1、PB2、PA和NP基因的細胞內(nèi)，其在39℃時的活性比野生型A/AA/6/60(wt A/AA)低很多(15％)。
PR8突變病毒按照上面描述的方法制備和回收。簡言之，共培養(yǎng)的COS7和MDCK細胞用編碼PR8來源的PR8 HA、NA、PB1、PB2、PA、NP、M和NS基因的8個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。為了制備含4個溫度敏感位點的病毒(PR8-4s)，使用含在PB1的nt1195(K391E)、nt1766(E581G)和nt2005(A661T)位置上出現(xiàn)3個改變的PB1-3s和在PB2的821(N265S)位置上含有一個改變的PB1-1s。另外，在PB1上有3個突變的PR8(PR8-3s)或在PB2上有1個突變的PR(PR8-1s)也分別回收。這些病毒用示意圖在圖16中標出。所有4個重組突變PR8病毒在雞蛋內(nèi)都以很高的滴度生長，達到9.0log10pfu/ml或更高，如表10所示。
為了檢測感染細胞內(nèi)病毒蛋白的合成情況，MDCK細胞用m.o.i為5的病毒感染，在轉(zhuǎn)染后7小時用35S-Trans標記1小時。標記的細胞裂解物用含SDS的1.5％的聚丙稀酰胺凝膠進行電泳并進行放射自顯影。用蛋白印跡試驗分析蛋白的合成。在轉(zhuǎn)染后8小時收獲病毒感染細胞，在4-15％的梯度凝膠中電泳。用抗M1抗體或抗MDV-A的雞多克隆抗體標記，然后用HRP標記的二抗孵育。用化學發(fā)光檢測系統(tǒng)(Invitrogen)檢測抗體結(jié)合的蛋白帶，然后暴露于X射線膠片。
如圖19所示，在33℃時所有的細胞都具有相似的蛋白合成水平，但是在39℃時PR8-1s感染細胞內(nèi)的蛋白合成水平輕微降低，而PR8-3s和PR8-4s感染細胞內(nèi)的蛋白合成水平明顯下降。蛋白印跡試驗也說明蛋白合成水平下降的次序為PR8-4s＞PR8-3s＞PR8-1s。因此，溫度敏感突變株復制水平的降低可能是其在非允許穩(wěn)定下復制減弱的結(jié)果。
通過噬菌斑形成試驗分別在33℃、37℃、38℃和39℃時利用MDCK細胞測定PR8突變病毒的溫敏流感病毒。收獲的兵卒在含胚胎的雞蛋內(nèi)擴增，然后按上述方法導入到細胞內(nèi)。病毒感染細胞在設(shè)定的溫度下培養(yǎng)3天后，用抗MDV的雞多克隆抗體對單層細胞進行免疫染色，計數(shù)噬菌斑形成的數(shù)目。比較每個溫度下所得到的噬菌斑數(shù)目以評價每種病毒的溫敏表型。關(guān)閉溫度定為最低溫度，與33℃相比其滴度降低100倍或更多。
如圖10和圖17所示，雖然病毒的滴度有稍許減少，但是所有的突變株在33℃時都能高效復制。在38℃時，所有突變株的滴度都顯著下降。在39℃時，PB1基因上具有3個溫度敏感位點的病毒(PR8-3s和PR8-4s)滴度下降超過4.0log10。PR8-1s在39℃時也是溫敏流感病毒。PR8-4s的溫敏表型與MDV-A非常相似，與在33℃時相比在39℃時滴度下降4.6log10。雖然所有3個PR8突變株在37℃時的滴度降低都不超過2.0log10，但是其噬菌斑形態(tài)與其在33℃時明顯不同。如圖18所示，每個突變株在33℃的噬菌斑大小只比PR8縮小一點。PR8-3s在37℃時形成的噬菌斑明顯縮小，PR8-4s形成的噬菌斑更小。PR8-1s在37℃時形成的噬菌斑看不出明顯縮小。在39℃時，PR8-3s和PR8-4s只能形成幾個針尖大小的噬菌斑。PR8-1s所形成的噬菌斑大小大約為野生型PR8的30％。
表10.具有引入的ts位點的PR8的溫敏流感病毒病毒滴度(log10pfu/ml)病毒 33℃37℃38℃39℃MDV-A 8.6 7.0 6.4 4*Wt A/AA8.7 8.7 8.9 8.3PR89.6 9.5 9.5 9PB8-1s 9.4 8.9 7.7 7.4PB8-3s 9.2 8.8 7.8 5.2PB8-4s 9.5 7.8 7.1 4.4在稀釋10,000倍時檢測不到病毒認為病毒滴度為4.0在雪貂中測定突變的PR8病毒的減毒活性。簡言之，9-10周齡的雄性雪貂用于評價病毒在動物宿主呼吸道內(nèi)的復制情況。雪貂分別飼養(yǎng)，鼻內(nèi)接種8.5log10pfu的病毒。感染3天后用鹽酸氯胺酮麻醉動物，取其肺和鼻甲(NT)。肺組織勻漿物系列稀釋后在含10天胚胎的雞蛋內(nèi)測定病毒的滴度。肺內(nèi)的病毒滴度(log10pfu/ml)用Karber方法計算。NT內(nèi)的病毒復制情況通過噬菌斑形成試驗進行分析，表示為log10pfu/ml。
病毒在肺和鼻甲內(nèi)的復制水平通過EID50或噬菌斑形成試驗進行檢測(表11)。感染3天后，PR8在肺組織內(nèi)復制到5.9log10pfu/ml的水平。但是PR8-1s在雪貂肺內(nèi)的復制水平降低3.0log10pfu/ml，而PR8-3s的復制很少。在兩個感染PR8-4s的組內(nèi)都沒有檢測到PR8-4s的復制。通過EID50試驗所能檢測到的下限是1.5log10，因此PR8-4s的滴度被指定為log10EID50。作為對照，MDV-A在雪貂肺內(nèi)不能復制，野生型A/AA/6/60的滴度為4.4log10。病毒在鼻甲(NT)內(nèi)的復制通過在MDCK細胞內(nèi)進行噬菌斑形成試驗進行分析。PR8在鼻內(nèi)的復制滴度達到6.6log10pfu/g。PR8-1s和PR8-3s的滴度只有輕微的降低。PR8-4s(A)的滴度降低2.2log10，而PR8-4s(B)的滴度降低4.3log10，該病毒在PB1基因上有改變(E390G)。PR8-4s(B)的復制水平顯著降低是與其在37℃時的溫敏流感病毒一致的。本文用8.5log10pfu的感染劑量代替7.0log10的劑量，而后者在評價MDV-A來源的流感病毒疫苗的減毒表型時是常用的。這個結(jié)果說明含4個MDV-A來源的溫度敏感位點的PR8在雪貂的下呼吸道內(nèi)的復制活性是降低的。
表11.PR8突變株在雪貂中的復制
a)未檢測到病毒認為滴度是1.5log10EID50/gb)病毒還含有另外的改變PB1-1193(E390G)在溫度敏感和減毒試驗中，PR8突變病毒具有與MDV-A十分相似的溫敏表型和減毒表型。這些數(shù)據(jù)說明漿MDV-A的獨特的取代的氨基酸引入不同的流感病毒株中可使病毒具有預期的溫敏流感病毒和減毒表型以便于制備減毒活疫苗。另外，溫度敏感的減毒的PR-8病毒以高滴度生長，因此適于作為主供體病毒制備減毒活流感疫苗或滅活的流感疫苗。這些結(jié)果說明5個MDV-A突變PB1-391E、PB1-581G、PB1-661T、PB2-265S和NP-34G可賦予任何流感病毒株以溫敏表型和減毒表型。同樣，適于制備疫苗的新型溫度敏感的減毒的B株也可以通過將MDV-B的突變引入到流感病毒B株內(nèi)來制備。除了制備減毒活疫苗以外，將這些突變引入到供體病毒株內(nèi)還可以用于制備安全的滅活疫苗。
實施例5制備MDV-B的8質(zhì)粒系統(tǒng)冷適應流感病毒突變株B/Ann Arbor/1/66(ca/Master Ann Arbor/1/66 P1 Aviron10/2/97)是一種典型的B型流感病毒主供體株(MDV-B)，利用RNeasy試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)從100μl感染該病毒的含胚胎的雞蛋尿囊液中提取病毒RNA，提取的RNA溶解到40μl水中。利用一步RT-PCR試劑盒(One Step RT-PCR kit)(Qiagen，Valencia，CA)按照說明書RT-PCR擴增基因組節(jié)段，每個反應用1μl提取的RNA。RT反應在50℃進行50分鐘，然后在94℃進行15分鐘。PCR反應進行25個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃1分鐘、54℃1分鐘、72℃3分鐘。利用含BsmB I位點的節(jié)段特異性引物擴增P基因，結(jié)果可得到兩個片段(表12)。
表12.擴增流感病毒ca B/Ann Arbor/1/66的8個病毒RNA所用的RT-PCR引物
與流感病毒序列互補的序列用黑體字標出。5’-末端具有限制性內(nèi)切酶BsmB I(Bm)或Bsa I(Ba)的識別序列。
質(zhì)粒的克隆分離PCR片段，用BsmBI(NP用BsaI)消化，然后插入到上述pAD3000(pHW2000的衍生物，可轉(zhuǎn)錄反義vRNA和正義mRNA)的BsmBI位點內(nèi)。每種質(zhì)粒取2到4個克隆測序，根據(jù)直接測序的RT-PCR片段與MDV-B的共有序列比較。具有核苷酸改變從而導致與共有序列不一致的氨基酸改變的質(zhì)粒通過質(zhì)粒的克隆或利用Quikchange試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)進行修復。所得到的B/Ann Arbor/1/66質(zhì)粒命名為pAB121-PB1、pAB122-PB2、pAB123-PA、pAB124-HA、pAB125NP、pAB126-NA、pAB127-M和、pAB128-NS。利用這個雙向轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，所有的病毒RNA和蛋白都可以在細胞內(nèi)制備，結(jié)果節(jié)得到了感染性的B型流感病毒(圖4)。
值得注意的是，與共有序列相比較，pAB121-PB1和pAB124-HA含有2個沉默的核苷酸取代，pAB128-NS有1個沉默的核苷酸取代(表13)。這些核苷酸變化不產(chǎn)生氨基酸的改變，也不參與影響病毒的生長和回收。這些沉默的取代被保留有利于重組病毒的基因型分型。
表13.代表B/Ann Arbor/1/66(MDV-B)8個片段的質(zhì)粒組
為了構(gòu)建在PA、NP和M1基因上有核苷酸取代的質(zhì)粒，以質(zhì)粒pAB123-PA、pAB125-NP、pAB127-M為模板，利用Quikchange試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)突變核苷酸。另外，用含有期望的突變的引物通過PCR方法擴增兩個片段，然后用BsmBI消化，然后通過3片段連接反應插入到pAD3000-BsmBI內(nèi)。得到的質(zhì)粒測序以確保cDNA不含不需要的突變。
利用含有AmpliTaq DNA聚合酶FS的Rhodamine或dRhodamine染色-終止子循環(huán)測序預備反應試劑盒(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Inc，F(xiàn)oster City，CA)測定模板DNA的序列。樣品通過電泳分開，在PE/ABI 373型、373 Stretch型或377型DNA測序儀上分析。
在另一個試驗中，擴增流感病毒株B/Yamanshi/166/98來源的病毒RNA，克隆到pAD3000中，方法與上面描述的相似，只是反應過程為25個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃30秒、54℃30秒、72℃3分鐘。用同樣的引物擴增B/Yamanashi/166/98病毒株的節(jié)段，只是擴增NP和NA節(jié)段的引物如下MDV-B 5′BsmBI-NPTATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCACAGCATTTTCTTGTG(SEQ ID NO75)；MDV-B3’BsmBI-NPATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAACAGCATTTTTTAC(SEQ ID NO76)；Bm-NAb-1TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGCA(SEQ IDNO77)；Bm-NAb-1557RATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGCATTTT(SEQID NO78)。B/Yamanashi/166/98質(zhì)粒被命名為pAB251-PB1、pAB252-PB2、pAB253-PA、pAB254-HA、pAB255-NP、pAB256-NA、pAB257-M和pAB258-NS。在PA中所鑒定出的3個沉默核苷酸差異有利于重組的和重排列的B/Yamanashi/166/98病毒的基因型分型。
實施例6感染性重組流感病毒B和重排列流感病毒的制備為了克服流感病毒在無輔助病毒的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)難以生長的困難，本發(fā)明提供了制備重組的和重排列的B株流感病毒的新型載體和方法。用于回收B型流感病毒的載體系統(tǒng)是以制備A型流感病毒的方法為基礎(chǔ)開發(fā)分(Hoffmann等，(2000)“從8個質(zhì)粒開始制備A型流感病毒的DNA轉(zhuǎn)染系統(tǒng)”(A DNA transfection system forgeneration of influenza A virus from eight plasmids)Proc Natl Acad Sci USA976108-6113；Hoffmann & Webster(2000)“從8個質(zhì)粒開始制備A型流感病毒的單方向RNA聚合酶I-聚合酶II轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)”(unidirectional RNA polymeraseI-polymerase II transcription system for the generation of influenza A virusfrom eight plasmids)J Gen Virol 812843-7)。293T或COS-7細胞(具有高轉(zhuǎn)染效率和pol I活性的靈長類細胞)與MDCK(允許流感病毒復制)細胞共培養(yǎng)，293T細胞用含5％FBS的OptiMEM I-AB培養(yǎng)基培養(yǎng)，COS-7細胞用含10％FBS的DMEM I-AB培養(yǎng)基培養(yǎng)。MDCK細胞用添加10％FBS、抗生素和antimycotic試劑的1×MEM培養(yǎng)。在用病毒基因組載體轉(zhuǎn)染前，細胞用5ml PBS或不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基洗滌一次。10ml胰蛋白酶-EDTA加到75cm2培養(yǎng)瓶的匯合細胞上(MDCK細胞孵育20-45分鐘，293T細胞孵育1分鐘)。將細胞離心，然后重懸到10ml OptiMEM I-AB內(nèi)。然后每種細胞懸液取1ml稀釋到18ml OptiMEM I-AB中，混勻。細胞分別加到6孔板內(nèi)，每孔3ml。6-24小時后，每種質(zhì)粒取1μg加到含OptiMEM I-AB的1.5ml Eppendorf管內(nèi)(xμl質(zhì)粒+xμl OptiMEM I-AB+xμl TransIT-LT1＝200μl)；每μg質(zhì)粒DNA用2 1 TransIT-LT1?；旌衔镌谑覝叵路跤?5分鐘。然后加入800μl OptiMEM I-AB。去掉培養(yǎng)基后將轉(zhuǎn)染混合物加到細胞上(t＝0)，33℃孵育6-15小時。然后從細胞上緩慢去掉轉(zhuǎn)染混合物，加入1ml OptiMEM I-AB，細胞在33℃孵育24小時。轉(zhuǎn)染后48小時，將1ml含1μg/mlTPCK-胰蛋白酶的OptiMEM I-AB加到細胞上。轉(zhuǎn)染后96小時，將1ml含1μg/ml TPCK-胰蛋白酶的OptiMEM I-AB加到細胞上。
轉(zhuǎn)染后4天到7天之間吸取1ml細胞培養(yǎng)物上清，通過HA試驗或噬菌斑形成試驗監(jiān)測。簡言之，將1ml上清加到離心管內(nèi)，5000rpm離心5分鐘。將900μl上清轉(zhuǎn)移到新管中，進行系列稀釋，加到MDCK細胞上，每孔500μl(如在12孔板內(nèi))。上清與細胞孵育1小時后去掉，用含1μg/ml TPCK-胰蛋白酶的感染培養(yǎng)基(1×MEM)替換。然后進行HA分析或噬菌斑形成試驗。例如，對于噬菌斑形成試驗來說，上清在MDCK細胞上進行滴度測定，細胞在33℃用0.8％的瓊脂糖覆蓋3天。對于感染雞蛋來說，感染細胞的上清在轉(zhuǎn)染后6天或7天收獲，將100μl用Opti-MEM I稀釋的上清注射到含11天胚胎的雞蛋內(nèi)，33℃培養(yǎng)。接種后3天通過MDCK細胞的TCID50試驗來確定病毒的滴度。
為了制備MDV-B，共培養(yǎng)的293T-MDCK或COS-7-MDCK細胞用1μg質(zhì)粒感染。在感染后5-7天檢測時，共培養(yǎng)的MDCK細胞出現(xiàn)細胞病變效應(CPE)，說明感染性的MDV-B病毒從克隆的cDNA中產(chǎn)生出來。轉(zhuǎn)染7個質(zhì)粒的細胞沒有觀察到CPE(表14)。為了確定DNA轉(zhuǎn)染系統(tǒng)用于病毒制備的效率，轉(zhuǎn)染7天后細胞上清用MDCK細胞測定滴度，病毒的滴度通過噬菌斑形成試驗測定。共培養(yǎng)的293T-MDCK上清的滴度為5.0×106pfu/ml，COS7-MDCK細胞上清的滴度為7.6×106pfu/ml。
表14.利用8個質(zhì)粒制備感染性B型流感病毒
瞬時共培養(yǎng)的293T-MDCK(1，2)或COS7-MDCK細胞(3，4)用7種或8種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后7天監(jiān)測共培養(yǎng)的MDCK細胞上的細胞病變效應(CPE)。在轉(zhuǎn)染后7天將轉(zhuǎn)染細胞的上清滴到MDCK細胞上。pfu/ml數(shù)據(jù)代表多次(如3次或4次)轉(zhuǎn)染試驗的平均值。
用B/Yamanashi/166/98質(zhì)粒載體進行的轉(zhuǎn)染試驗得到了相似的結(jié)果。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)染系統(tǒng)能夠從8個質(zhì)粒開始擴增制備B型流感病毒。
重組B型流感病毒的基因分型在MDCK細胞內(nèi)經(jīng)過連續(xù)傳代以后，感染細胞的上清通過RT-PCR擴增以確定是否制備出了病毒。利用節(jié)段特異性引物RT-PCR擴增所有的8個節(jié)段(表12)。如圖5A所示，所有節(jié)段都擴增出了PCR產(chǎn)物。直接測序PB1、HA和NS的PCR產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)所分析的4個核苷酸與質(zhì)粒pAB121-PB1、pAB124-HA和pAB128-NS上所見到的一致。這些結(jié)果證實了所得到的病毒是從所設(shè)計的質(zhì)粒中制備的，排出了任何可能的親本病毒的實驗室污染(除了陰性對照之外)9圖5B)。
同樣，用B/Yamanashi/166/98質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染后回收病毒，擴增包含PA節(jié)段核苷酸1280-1290在內(nèi)的區(qū)域。序列測定表明回收的病毒與質(zhì)粒來源的重組病毒B/Yamanashi/166/98一致(圖5C和5D)。
rMDV-B的表型分型MDV-B病毒具有兩個特征性的表型溫敏流感病毒(ts)和冷適應性(ca)。病毒在37℃時與33℃時相比差2log(或更高)被定義為具有溫敏表型，病毒在25℃時與33℃時相比生長水平差異小于2log被定義為具有冷適應表型。原代雞腎(PCK)細胞用親本MDV-B病毒或質(zhì)粒來源的病毒轉(zhuǎn)染以確定病毒在3種溫度下的生長情況。
用6孔板內(nèi)匯合的MDCK細胞(ECACC)進行噬菌斑形成試驗。病毒稀釋液在33℃孵育30-60分鐘。細胞用0.8％瓊脂糖覆蓋。感染的細胞在33℃或37℃孵育。感染后3天，細胞用0.1％結(jié)晶紫溶液染色，計數(shù)噬菌斑形成的數(shù)目。
通過病毒樣品在25℃、33℃和37℃下進行TCID50滴定來分析溫度敏感-冷適應表型。TCID50滴度的測定是通過檢測流感病毒在不同的溫度(25℃、33℃、37℃)下在96孔板內(nèi)的原代雞腎單層細胞內(nèi)的細胞病變效應(CPE)來進行的。該分析結(jié)果不依賴噬菌斑的形態(tài)，噬菌斑的形態(tài)隨溫度和病毒株的不同而不同，該結(jié)果只依賴流感病毒復制的穩(wěn)定性和和所引起的CPE效應。用胰酶消化原代組織，將原代雞腎(PCK)細胞懸浮到含5％FCS的MEM(Earl’s)培養(yǎng)基中制成細胞懸液。將PCK細胞接種到96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)48小時以制備匯合率＞90％的單層細胞。48小時后，單層PCK細胞用無血清的含5Mm L-谷氨酰胺、抗生素、非必需氨基酸的MEM培養(yǎng)基(被稱為表型分析培養(yǎng)基(PAM))洗滌1小時。然后將10倍系列稀釋的病毒樣品加到含PAM的96孔板內(nèi)。每個稀釋度的病毒樣品設(shè)6個復孔用稀釋的病毒感染。作為對照的未感染細胞每個樣品也設(shè)6個復孔。每個樣品取2-4個孔測定病毒的滴度。每個試驗中都包括在25℃、33℃和37℃下具有預定滴度的表型對照病毒。為了確定病毒樣品的溫敏表型，培養(yǎng)板在5％CO2培養(yǎng)箱中分別在33℃和37度培養(yǎng)6天。為了確定冷適應表型特征，培養(yǎng)板在25℃孵育10天。用Karber方法計算病毒的滴度，用log10TCID50滴度平均值(n＝4)/ml+標準差表示。在圖1-3中出現(xiàn)的病毒滴度的標準差在0.1到0.3之間。病毒在33℃和37℃時的滴度差異用于確定溫敏表型，病毒在25℃和33℃時的滴度差異用于確定冷適應表型。
質(zhì)粒來源的重組MDV-B(recMDV-B)病毒如預期的那樣在細胞培養(yǎng)物中表達兩個特征性表型—冷適應性和溫敏流感病毒。病毒能在25℃時有效復制，也就是說用PCK細胞分析時病毒在25℃和在33℃的滴度差異低于或等于2log10即認為該病毒具有冷適應表型。親本MDV-B和recMDV-B都具有冷適應表型；在25℃和33℃時的滴度差異分別為0.3和0.4log10(表15)。溫敏表型也是通過測定不同溫度下在PCK細胞內(nèi)的滴度而確定的；但是，對于溫敏表型來說，在37℃的滴度應該比33℃的滴度的2log10或更多。親本MDV-B和recMDV-B在33℃和37℃時的滴度差異分別為3.4和3.7log10(表15)。因此，質(zhì)粒來源的重組MDV-B表達冷適應表型和溫敏表型。
表15.用質(zhì)粒制備的MDV-B和rMDV-B的表型分析
原代雞腎細胞用親本MDV-B病毒和質(zhì)粒來源的重組病毒(recMDV-B)感染。在3種不同的溫度下測定病毒的滴度。
實施例7重排列病毒B/Yamanashi/166/98的制備擴增能代表主要B型流感病毒譜系的幾個不同病毒株的HA和NA節(jié)段，然后按照上述方法克隆到pAD3000中。優(yōu)化引物的組合以同時RT-PCR擴增HA和NA節(jié)段。通過比較代表節(jié)段4(HA)和節(jié)段6(NB/NA)非編碼區(qū)的病毒RNA末端序列發(fā)現(xiàn)B型流感病毒的HA和NA基因之間5’末端的20核苷酸和3’末端的15個核苷酸是一致的。RT-PCR所用的引物對為(下劃線部分是B型流感病毒特異性的)Bm-NAb-1TAT TCGTCT CAG GGA GCA GAA GCA GAG CA(SEQ ID NO79)；Bm-NAb-1557RATA TCG TCT CGTATTAGT AGT AAC AAG AGC ATT TT(SEQ ID NO80)，這對引物用于同時擴增各種流感病毒B株的HA和NA基因(圖8)。分離B/Victoria/504/2000、B/Hawaii/10/2001和B/Hong Kong/330/2001的HA和NA PCR節(jié)段，用BsmBI消化后插入到pAD3000內(nèi)。結(jié)果表明利用這些引物可有效擴增含幾種不同野生型病毒來源的流感病毒B HA和NA基因的質(zhì)粒，這幾種野生型病毒代表了B型流感病毒的主要譜系。RT-PCR產(chǎn)物用于測序和/或克隆到表達質(zhì)粒內(nèi)。
為了證明利用B/Yamanashi/166/98(一種B/Yamagata/16/88樣病毒)能有效表達各種B型流感病毒譜系來源的抗原，制備含B/Yamanashi/166/98的PB1、PB2、PA、NP、M、NS和代表Victoria及Yamagata譜系的HA和NA的重排列病毒(6+2重排列病毒)。按照上述方法，用代表B/Yamanashi/166/98的6個質(zhì)粒和含B/Victoria/2/87譜系的兩個病毒株B/Hong Kong/330/2001和B/Hawaii/10/2001，以及B/Yamagata/16/88譜系的一個病毒株B/Victoria/504/2000的HA和NA節(jié)段cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染瞬時共培養(yǎng)的COS7-MDCK細胞。轉(zhuǎn)染后6到7天在新鮮的MDCK細胞上滴定上清液。所有6+2重排列病毒的滴度都在4-9×106pfu/ml之間(表16)。這些數(shù)據(jù)說明B/Yamanashi/166/98的6個內(nèi)部基因與兩種B型流感病毒株的HA和NA基因能有效形成感染性病毒。
轉(zhuǎn)染后6或7天滴定COS7-MDCK細胞的上清液，利用MDCK細胞進行噬菌斑形成試驗來確定病毒的滴度。
表16用于制備B/Yamanashi/166/98和6+2重排列病毒的質(zhì)粒
野生型B/Yamanashi/166/98在雞蛋內(nèi)復制可得到相對較高的滴度。利用試驗來確定這種特性是否是該病毒6個“內(nèi)部”基因的固有表型。為了評價這種特性，將在雞蛋內(nèi)只能中等程度復制的野生型B/Victoria/504/2000的產(chǎn)量與表達B/Victoria/504/2000HA和NA的6+2重排列病毒的產(chǎn)量做了比較。除了野生型和重組的B/Yamanashi/166/98以外，所有這些病毒都接種到含3天或4天胚胎的雞蛋內(nèi)，接種量為100或1000pfu。感染后3天，從雞蛋內(nèi)收獲尿囊液，用MDCK細胞測定TCID50滴度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6+2重排列病毒在尿囊液中的量與野生型的或重組的B/Yamanashi/166/98病毒株相似(圖9)。B/Victoria/504/2000和6+2重組病毒的滴度差異約為1.6log10TCID50(0.7-2.5log10TCID50/ml，95％CI)。通過3個不同的試驗證明B/Victoria/504/2000和6+2重組病毒之間存在顯著性差異(P＜0.001)。這些結(jié)果證明在雞蛋內(nèi)很難復制的病毒株正常表達的HA和NA可以使B/Yamanashi/166/98在雞蛋內(nèi)生長。
實施例8ca B/Ann Arbor//1/66的冷適應表型的分子基礎(chǔ)MDV-B病毒(ca B/Ann Arbor/1/66)在人體內(nèi)的毒性是減弱的，在雪貂內(nèi)也具有減毒表型，在細胞培養(yǎng)物內(nèi)具有冷適應表型和溫敏表型。利用BLAST搜索算法比較MDV-B內(nèi)部基因所推算出的氨基酸序列與Los Alamos流感病毒數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址flu.lanl.gov)的序列。鑒定出8個MDV-B所獨有的不存在于任何其他病毒株中的氨基酸(表17)。編碼PB1、BM2、NS1和NS2的基因組節(jié)段沒有獨特的取代殘基。PA和M1蛋白有2個、NP蛋白有4個獨特的取代的氨基酸(表17)。在PB2 630位置上發(fā)現(xiàn)有一個取代的氨基酸(另一個病毒株B/Harbin/7/94(AF170572)在630位置上也有一個精氨酸殘基)。
這些結(jié)果說明基因節(jié)段PB2、PA、NP和M1可能參與MDV-B減毒表型的形成。在一個與上述MDV-A相似的方式中，8質(zhì)粒系統(tǒng)用于制備重組和重組分類病毒(單基因和/或雙基因重排列病毒，即7:1或6:2重排列病毒)，制備方法是以不依賴輔助病毒的方式將相關(guān)的質(zhì)粒按照上述MDV-A相似的方式共轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的細胞內(nèi)。例如，B/Lee/40來源的6個內(nèi)部基因與MDV-B來源的HA和NA片段一起轉(zhuǎn)染以制備6+2重排列病毒。
表17.B/Ann Arbor/1/66的獨特取代的氨基酸
8個ca B/Ann Arbor蛋白的推算出的氨基酸序列用于BLAST搜索。MDV-B和排列序列之間不相同的氨基酸在表中列出。密碼子上有下劃線的核苷酸代表被取代的位置。
為了確定這8個獨特的氨基酸差異對MDV-B的表型特征是否存在影響，構(gòu)建出了一個重組病毒，其中所有8個核苷酸位置編碼反應野生型流感病毒基因背景互補的氨基酸。一組質(zhì)粒被構(gòu)建出來，其中PA、NP和M1基因上的8個殘基通過位點特異性突變加以改變使其編碼野生型的氨基酸(如表17所示)。具有所有8個核苷酸改變的重組病毒被命名為rec53-MDV-B，是通過構(gòu)建的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS7-MDCK細胞共培養(yǎng)物而獲得的，細胞在33℃培養(yǎng)以確保在轉(zhuǎn)染后7天能在上清液中得到高滴度的病毒。轉(zhuǎn)染細胞的上清液利用噬菌斑形成試驗在MDCK細胞和PCK細胞內(nèi)滴定，測定其在33℃和37℃時的滴度。
如圖13所示，在兩個不同的獨立試驗中，recMDV-B在MDCK細胞和PCK細胞內(nèi)都能表達溫敏表型。三基因重排列病毒rec53-MDV-B含有決定非溫敏表型的所有8個氨基酸改變，其在PCK細胞內(nèi)33℃和37℃的滴度差異只有0.7log10。這個滴度低于定義溫敏表型所需要的2log10的差異，也比recMDV-B所觀察到的3log10的差異要小的多。這些結(jié)果說明PA、NP和M1內(nèi)的8個氨基酸改變足以產(chǎn)生攜帶同源和異源糖蛋白的非溫敏流感病毒野生型樣病毒。
隨后研究了每個基因節(jié)段對溫敏表型的貢獻。利用DNA共轉(zhuǎn)染技術(shù)制備在野生型氨基酸補體中具有PA、NP或M基因節(jié)段的質(zhì)粒來源的重組病毒。在MDCK細胞和PCK細胞內(nèi)37℃時所有單基因重組病毒的生長都受到限制(圖14)，說明單個基因節(jié)段的改變不能反轉(zhuǎn)溫敏表型。另外，攜帶NP和M或PA和M基因節(jié)段的重組病毒也保留著溫敏表型。而含有PA和NP基因節(jié)段的重組病毒在37℃和33℃時的滴度差異低于或等于2.0log10，與rec53-MDV-B相似。這些結(jié)果說明NP和PA基因是影響溫敏表型的主要基因。
為了確定NP蛋白上的4個氨基酸和PA蛋白上的2個氨基酸是否都對非溫敏表型產(chǎn)生影響，制備出了具有NP和PA基因突變的三基因和雙基因重組病毒(圖15)。兩種氨基酸取代，A114→V114和H410→P410產(chǎn)生非溫敏表型。在核蛋白中具有單氨基酸取代H410→P410的病毒在MDCK細胞和PCK細胞內(nèi)具有非溫敏表型。另一方面，單氨基酸取代A55→T55的病毒具有溫敏表型。這些結(jié)果說明NP上的P410參與病毒在37℃時的有效生長。這些結(jié)果表明PA和NP的6個氨基酸中有4個殘基對非溫敏表型起作用。
根據(jù)以前的試驗結(jié)果，溫敏表型和減毒表型是高度相關(guān)的。以前的研究證實在感染ca B/Ann Arbor/1/66的雪貂的肺組織內(nèi)檢測不到病毒，而鼻內(nèi)感染后在肺組織內(nèi)可檢測到非減毒的B型流感病毒。為了確定完全相同的突變是否是溫敏表型和減毒表型的基礎(chǔ)，進行了下面的試驗。
轉(zhuǎn)染后獲得的重組病毒在含胚胎的雞蛋內(nèi)傳代以制備病毒原種。9周齡的雪貂鼻內(nèi)接種病毒，每個鼻孔0.5ml，滴度為5.5、6.0或7.0log10pfu/ml。感染3天后處死雪貂，如上所述檢測非組織和鼻甲。
雪貂(每組4只動物)鼻內(nèi)感染recMDV-B或rec53-MDV-B。感染病毒后3天取其鼻甲和肺組織，檢測是否存在病毒。在感染7.0log10pfu rec MDV-B的雪貂肺組織內(nèi)檢測不到病毒。感染7.0log10pfu rec53-MDV-B的4只動物中有3只動物可在肺組織內(nèi)檢測到病毒(該組中的一只動物檢測不到的原因不清楚)。感染低劑量(5.5log10pfu)rec53-MDV-B的4只雪貂中有2只在肺組織內(nèi)分離出了病毒。因此，PA、NP和M1蛋白上8個獨特氨基酸的改變足以使減毒表型轉(zhuǎn)變成非減毒表型。
由于細胞培養(yǎng)試驗的結(jié)果表明對溫敏表型起主要作用，因此在第二個試驗中雪貂用6log pfu的rec53-MDV-B(PA、NP、M)、rec62-MDV-B(PA)、NP rec71-MDV-B(NP)感染。感染rec53-MDV-B的4只動物中有2只在肺內(nèi)檢測到病毒。感染單基因和雙基因重排列病毒的雪貂在肺組織內(nèi)都沒有檢測到病毒。因此，除了PA和NP蛋白上的氨基酸以外，M1蛋白對于減毒表型也很重要。具有野生型PA和NP的病毒在雪貂肺內(nèi)不能復制，說明參與減毒表型的一組突變對溫敏表型也有影響。
因此，B/Ann Arbor/1/66的溫敏表型最多是由3個基因決定的。將PA、NP和M1蛋白上的8個氨基酸改變成野生型殘基可使重組病毒在37℃時具有復制能力。同樣，含有MDV-B的6個內(nèi)部基因和B/Hong Kong/330/01的HA和NA節(jié)段的6+2重組病毒具有溫敏表型，而三基因重組病毒是非溫敏流感病毒。
與上面有關(guān)A型流感病毒株的描述一樣，上述殘基的替換，如PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)賦予病毒以溫敏表型和減毒表型。相應的，具有一個或多個這種取代的氨基酸的人工改造的B型流感病毒株具有溫敏表型和減毒表型，適于作為主供體病毒制備流感病毒減毒活疫苗。
實施例9通過電穿孔轉(zhuǎn)導Vero細胞從8質(zhì)粒系統(tǒng)制備流感病毒以前已有報道證明可從Vero細胞內(nèi)恢復重組的A型流感病毒(Fodor等，(1999)“利用重組DNA恢復A型流感病毒”(Rescue of influenza A virus from recombinantDNA).J.Virol.739679-82；Hoffmann等，(2002)“快速制備流感病毒疫苗的8質(zhì)粒系統(tǒng)”(Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virusvaccine)Vaccine 203165-3170)。報道的方法需要脂質(zhì)體試劑，并且只報道了一株具有高效復制能力的A型流感病毒實驗室株(A/WSN/33和A/PR/8/34)，因此其在制備適于疫苗制備的減毒活病毒的應用中受到限制。本發(fā)明提供了利用電穿孔技術(shù)從Vero細胞恢復重組流感病毒的新型方法。這些方法適于制備A型和B型流感病毒株，可用于從Vero細胞內(nèi)恢復冷適應、溫度敏感的減毒病毒，其中Vero細胞在無血清培養(yǎng)基中生長以便于制備出適于鼻內(nèi)使用的減毒活疫苗，即鼻內(nèi)疫苗制劑。除了能用于不同的病毒株以外，電穿孔技術(shù)除了需要用于細胞生長的培養(yǎng)基外不需要添加其他的試劑，因此降低了污染的風險。該方法在用無血清培養(yǎng)的Vero細胞制備重組和重排列病毒時特別有效，如無病原體適于疫苗制備的Vero細胞。這個特點使電穿孔技術(shù)成為將DNA導入細胞底物內(nèi)的適宜商業(yè)方法。
電穿孔技術(shù)與其他各種將DNA導入Vero細胞的方法作了比較，其中包括利用脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染、鈣磷酸鹽沉淀法以及細胞微注射法。盡管利用脂質(zhì)體試劑恢復A型流感病毒有時可獲得成功，但是只有電穿孔技術(shù)可以從Vero細胞內(nèi)恢復B型流感病毒和A型流感病毒。
在電穿孔前1天，分散達到90-100％匯合的Vero細胞，以每個T225培養(yǎng)瓶9×106細胞的密度接種，培養(yǎng)基為添加青霉素/鏈霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和10％FBS的MEM(MEM，10％FBS)。在第二天，細胞用胰酶消化，重懸到含50ml磷酸鹽緩沖液(PBS)的T225培養(yǎng)瓶中。然后將細胞離心并重新懸浮到含0.5ml OptiMEM I的T225培養(yǎng)瓶中。另外，訂購的含非人或動物來源組分的OptiMEM培養(yǎng)基也可以使用。細胞進行1∶40稀釋，在血細胞計數(shù)器上計數(shù)，確定細胞的密度，5×106細胞加入到0.4cm的電穿孔杯內(nèi)，終體積為0.4ml OptiMEM I。由8種含MDV-A或MDV-B基因組的質(zhì)粒等摩爾混合的20μg DNA體積不超過25μl，然后加到含細胞的杯內(nèi)。通過輕叩溫和混勻，在BioRad Gene Pulser II with Capacitance Extender Plusconnected(BioRad，Hercules，CA)上進行電穿孔，參數(shù)為300伏、950微法，持續(xù)時間28-33秒。
通過溫和敲打再混合細胞，電穿孔后約1-2分鐘將0.7ml含10％FBS的MEM用1ml移液管加入到小杯內(nèi)。細胞用移液管上下吹打數(shù)次溫和混合，然后將細胞轉(zhuǎn)移到標準6孔組織培養(yǎng)板的2個孔內(nèi)，孔內(nèi)含2ml MEM+10％FBS。用1ml MEM+10％FBS洗滌小杯，洗滌懸液分到兩孔內(nèi)，終體積約為每孔3.5ml。
在另一個試驗中，能在無血清培養(yǎng)基，即OptiPro(SFM)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中生長的Vero細胞按照上述方法進行電穿孔，區(qū)別在于上述方法是在OptiMEM I中進行，細胞用OptiPro(SFM)稀釋，該培養(yǎng)基就是培養(yǎng)細胞用于恢復病毒的培養(yǎng)基。
電穿孔的細胞在適于作為冷適應主供體病毒株被導入的病毒復制和恢復的條件下培養(yǎng)，如33℃。在第二天(即電穿孔后約19小時)，去掉培養(yǎng)基，細胞用OptiMEM或OptiPro(SFM)洗滌，每孔3ml。然后每孔中加入1ml含青霉素/鏈霉素的OptiMEM I或OptiPro(SFM)，通過每天替換培養(yǎng)基來收集上清液。上清液儲存在-80℃的SPG中。病毒的制備一般在電穿孔后2到3天達到最高峰。
表18通過不同的轉(zhuǎn)染方法在不同類型的細胞內(nèi)用8個質(zhì)?；謴蚆DV病毒株的結(jié)果
實施例10用于基因轉(zhuǎn)移的流感病毒載體系統(tǒng)本發(fā)明的載體也可作為基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)用于基因治療。在這種用途中，需要制備表達外援蛋白的重組流感病毒，如A型重組流感病毒或B型重組流感病毒。例如，由于B型流感病毒的7個節(jié)段不是彼此連接的，因此很容易插入插入異源核酸序列。mRNA含有兩個順反子，具有編碼M1和BM2蛋白的兩個開放閱讀框架。BM2或M1的開放閱讀框架可被異源目的序列所替換，如編碼增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的基因。利用本發(fā)明的質(zhì)粒載體系統(tǒng)，將編碼M1-EGFP和BM2開發(fā)閱讀框架的cDNA克隆到兩個不同的質(zhì)粒中。開放閱讀框架兩側(cè)為節(jié)段7的非編碼區(qū)，該區(qū)含有復制和轉(zhuǎn)錄所需要的信號。另外，還可以構(gòu)建如下兩個質(zhì)粒一個含M1的ORF，另一個含EGFP-BM2。將得到的9個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染可制備出含異源基因序列的B型重組流感病毒。同樣，EGFP可從流感病毒A的NS1節(jié)段表達。
典型的“綠色”流感病毒B可用于標準化的病毒分析，如微中和試驗。質(zhì)粒技術(shù)和蛋白表達的簡單檢測相結(jié)合(EGFP發(fā)出的熒光可用顯微鏡觀察，如圖2所示)可優(yōu)化蛋白的表達。
為了能清楚地理解本發(fā)明，在前面對本發(fā)明的某些細節(jié)進行了描述，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過閱讀本說明書，可以在不偏離本發(fā)明的真實范圍的情況下對本發(fā)明的形式和細節(jié)作出各種修改。例如，上面所描述的所有技術(shù)和裝置都可以以各種組合的方式應用。本申請所引用的所有出版物、專利、專利申請或其他文獻都已完整納入本文作為參考，其目的與出版物、專利、專利申請或其他文獻被單個納入作為參考的目的是一樣的。
權(quán)利要求
1.一種在細胞培養(yǎng)物中制備流感病毒的方法，所述方法包括i)將一組含流感病毒基因組的載體導入到一群宿主細胞內(nèi)，該宿主細胞群能夠支持流感病毒的復制；ii)在低于或等于35℃的溫度下培養(yǎng)該群宿主細胞；以及iii)回收一組流感病毒。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述流感病毒含有至少一種減毒的流感病毒，冷適應流感病毒和溫敏流感病毒。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述流感病毒具有下列一種或多種表型特征減毒特性，溫度敏感性及冷適應性。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述流感病毒適于以鼻內(nèi)疫苗制劑的形式使用。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括導入至少含下列之一的一群載體a)含有至少一個取代的氨基酸的流感病毒A/Ann Arbor/6/60或人工改造的A型流感病毒，該取代的氨基酸可影響A/Ann Arbor/6/60的生物學特性；以及b)含有至少一個取代的氨基酸的流感病毒B/Ann Arbor/1/66或人工改造的B型流感病毒，該取代的氨基酸可影響B(tài)/Ann Arbor/1/66的生物學特性。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，所述方法包括導入至少含下列之一的一群載體a)含有至少一個取代的氨基酸的人工改造的A型流感病毒，所述取代的氨基酸與流感病毒A/Ann Arbor/6/60的獨特氨基酸一致；以及b)含有至少一個取代的氨基酸的人工改造的B型流感病毒，其中的取代的氨基酸與流感病毒B/Ann Arbor/1/66的獨特氨基酸一致。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述流感病毒含有至少一個a)至少含有下列取代的氨基酸之一的A型流感病毒株P(guān)B1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34；以及b)至少含有下列取代的氨基酸之一的B型流感病毒株P(guān)B2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、M1159和M1183。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述流感病毒含有至少一個a)至少含有下列取代的氨基酸之一的A型流感病毒株P(guān)B1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)；以及b)至少含有下列取代的氨基酸之一的B型流感病毒株P(guān)B2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述流感病毒含有一組取代的氨基酸。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述一組取代的氨基酸包含2、3、4、5、6、7、8或9個取代的氨基酸。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括導入一組含B型流感病毒的載體。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括導入一組含A型流感病毒的載體。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括導入一組含下列基因組節(jié)段的載體(a)第一流感病毒株的至少6個內(nèi)部基因組節(jié)段；以及(b)至少一個編碼第二流感病毒株免疫原性流感表面抗原的基因組節(jié)段。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括導入一組含下列基因組節(jié)段的載體(a)第一流感病毒株的至少6個內(nèi)部基因組節(jié)段，該病毒株是減毒的、冷適應的和/或溫度敏感的；以及(b)至少一個編碼第二流感病毒株免疫原性流感表面抗原的基因組節(jié)段。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括導入一組含下列基因組節(jié)段的載體(a)第一流感病毒株的至少6個內(nèi)部基因組節(jié)段，該病毒株是減毒的、冷適應的和溫度敏感的；以及(b)至少一個編碼第二流感病毒株免疫原性流感表面抗原的基因組節(jié)段。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括導入一組含下列基因組節(jié)段的載體(a)流感病毒株B/Ann Arbor/1/66、A/Ann Arbor/6/60或包含至少一個取代的氨基酸的人工改造的流感病毒的至少6個內(nèi)部基因組節(jié)段，該取代的氨基酸與流感病毒B/Ann Arbor/1/66或A/Ann Arbor/6/60的獨特氨基酸一致；以及(b)至少一個編碼不同流感病毒株免疫原性流感表面抗原的基因組節(jié)段。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，所述方法包括導入一組含下列基因組節(jié)段的載體(a)流感病毒株B/Ann Arbor/1/66、A/Ann Arbor/6/60或包含至少一個取代的氨基酸的人工改造的流感病毒的6個內(nèi)部基因組節(jié)段，該取代的氨基酸與流感病毒B/Ann Arbor/1/66或A/Ann Arbor/6/60的獨特氨基酸一致；以及(b)編碼B/AnnArbor/1/66或A/Ann Arbor/6/60之外的流感病毒株HA和NA抗原的兩個基因組節(jié)段。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，所述方法包括導入一組含下列基因組節(jié)段的載體(a)流感病毒株B/Ann Arbor/1/66、A/Ann Arbor/6/60或包含至少一個取代的氨基酸的人工改造的流感病毒的7個內(nèi)部基因組節(jié)段，該取代的氨基酸與流感病毒B/Ann Arbor/1/66或A/Ann Arbor/6/60的獨特氨基酸一致；或(b)編碼B/AnnArbor/1/66或A/Ann Arbor/6/60之外的流感病毒株HA抗原或NA抗原的基因組節(jié)段。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括導入一組質(zhì)粒載體。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述宿主細胞群包含Vero細胞、Per.C6細胞、MDCK細胞、293T細胞或COS細胞中的一種或多種。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述細胞群包含由MDCK細胞、293T細胞和COS細胞中至少兩種所組成的混合物。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括在約32℃到35℃之間的溫度下培養(yǎng)宿主細胞群。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括在約32℃到34℃之間的溫度下培養(yǎng)宿主細胞群。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括在約33℃培養(yǎng)宿主細胞群。
25.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括回收重組流感病毒。
26.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括回收重排列流感病毒。
27.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括滅活流感病毒。
28.用權(quán)利要求1所述方法制備的流感病毒。
29.一種在細胞培養(yǎng)物中制備B型流感病毒的方法，所述方法包括i)將一組含B型流感病毒基因組的載體導入到一群宿主細胞內(nèi)，該宿主細胞群能夠支持流感病毒的復制；ii)在允許病毒復制的條件下培養(yǎng)該群宿主細胞；以及iii)回收一組B型流感病毒。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，所述方法包括在細胞培養(yǎng)物中制備B型流感病毒的無輔助病毒方法，該方法為在無輔助病毒存在的條件下將一組含B型流感病毒基因組的載體導入到一群宿主細胞內(nèi)。
31.如權(quán)利要求29所述的方法，所述方法包括在低于或等于35℃的溫度下培養(yǎng)宿主細胞群。
32.如權(quán)利要求29所述的方法，所述方法包括在32℃到35℃之間的溫度下培養(yǎng)宿主細胞群。
33.如權(quán)利要求29所述的方法，所述方法包括在32℃到34℃之間的溫度下培養(yǎng)宿主細胞群。
34.如權(quán)利要求29所述的方法，所述方法包括在約33℃培養(yǎng)宿主細胞群。
35.如權(quán)利要求29所述的方法，所述方法包括回收重組流感病毒。
36.如權(quán)利要求29所述的方法，所述方法包括回收重排列流感病毒。
37.用權(quán)利要求29所述方法制備的流感病毒。
38.在細胞培養(yǎng)物內(nèi)制備流感病毒的方法，所述方法包括i)通過電穿孔將一組含流感病毒基因組的載體導入一群Vero細胞；ii)在允許病毒復制的條件下培養(yǎng)Vero細胞群；以及iii)回收流感病毒群。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中，所述流感病毒具有下列一種或多種表型特征減毒特性，溫度敏感性及冷適應性。
40.如權(quán)利要求38所述的方法，其中，所述流感病毒包括減毒的、冷適應的、溫度敏感的流感病毒。
41.如權(quán)利要求38所述的方法，其中，所述流感病毒適于以鼻內(nèi)疫苗制劑的形式使用。
42.如權(quán)利要求38所述的方法，所述方法包括導入一組含B型流感病毒的載體。
43.如權(quán)利要求38所述的方法，所述方法包括導入一組含A型流感病毒的載體。
44.如權(quán)利要求38所述的方法，所述方法包括在低于或等于35℃的溫度下培養(yǎng)宿主細胞群。
45.如權(quán)利要求38所述的方法，所述方法包括在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)Vero細胞。
46.一種制備重組流感病毒疫苗的方法，所述方法包括i)將一組含流感病毒基因組的載體導入到一群宿主細胞內(nèi)，該宿主細胞群能夠支持流感病毒的復制；ii)在低于或等于35℃的溫度下培養(yǎng)宿主細胞；以及iii)回收在給予受試者后能激發(fā)免疫反應的流感病毒。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述流感病毒至少具有下列一種表型特征溫度敏感性、冷適應性及減毒特性。
48.如權(quán)利要求46所述的方法，所述方法包括導入一組含B型流感病毒的載體。
49.如權(quán)利要求46所述的方法，所述方法包括導入一組含A型流感病毒的載體。
50.如權(quán)利要求46所述的方法，所述重組流感病毒疫苗含有重排列流感病毒。
51.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述流感病毒疫苗包含流感病毒減毒活疫苗。
52.如權(quán)利要求46所述的方法，所述方法還包括滅活流感病毒。
53.用權(quán)利要求46所述方法制備的流感病毒疫苗。
54.一種雙向表達載體，該載體含有攜帶第一啟動子的質(zhì)粒，其中第一啟動子位于第二啟動子和雙向多聚腺苷酸位點之間。
55.如權(quán)利要求54所述的載體，其中，所述第一和第二啟動子方向相反，位于至少一個克隆位點兩側(cè)。
56.如權(quán)利要求54所述的載體，其中，所述雙向多聚腺苷酸位點包括SV40多聚腺苷酸位點。
57.如權(quán)利要求54所述的載體，包括pAD3000。
58.如權(quán)利要求54所述的載體，該載體還含有一個雙鏈核酸，該核酸包含至少一個插入到克隆位點內(nèi)的流感病毒基因組節(jié)段。
59.如權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述第一啟動子和第二啟動子可操作連接到同一雙鏈病毒核酸的兩條鏈上，該病毒核酸含有流感病毒基因組節(jié)段。
60.如權(quán)利要求54所述的雙向表達載體，該載體包含攜帶位于第二啟動子和SV40多聚腺苷酸位點之間的第一啟動子的質(zhì)粒，其中，所述第一和第二啟動子方向相反，位于至少一個流感病毒基因組節(jié)段兩側(cè)。
61.一種試劑盒，所述試劑盒含有權(quán)利要求54所述的一種或多種表達載體，以及一種或多種下列組分細胞、緩沖液、細胞培養(yǎng)基、說明書、包裝材料和容器。
62.如權(quán)利要求61所述的試劑盒，所述試劑盒包含一組表達載體，其中每個表達載體含有至少一個流感病毒基因組節(jié)段。
63.如權(quán)利要求62所述的試劑盒，所述試劑盒包含攜帶第一流感病毒株至少6個內(nèi)部基因組節(jié)段的一組表達載體，所述流感病毒株至少具有下列一種表型特征溫度敏感性、冷適應性及減毒特性。
64.如權(quán)利要求62所述的試劑盒，其中，所述表達載體含有編碼突變的HA和/或NA抗原的核酸文庫。
65.一種組合物，所述組合物包括含有至少一種細胞的能在低于或等于35℃的溫度下增殖性生長的細胞培養(yǎng)物，其中至少有一種細胞含有一組載體，該組載體含有流感病毒基因組。
66.如權(quán)利要求65所述的組合物，該組合物還含有細胞培養(yǎng)基。
67.如權(quán)利要求65所述的組合物，其中，該組載體包括雙向表達載體。
68.如權(quán)利要求67所述的組合物，所述雙向表達載體攜帶位于第二啟動子和SV40多聚腺苷酸位點之間的第一啟動子的質(zhì)粒；其中，所述第一和第二啟動子方向相反，位于至少一個流感病毒節(jié)段兩側(cè)。
69.一種細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括含有至少一種細胞的增殖性生長的細胞培養(yǎng)物，其中至少有一種細胞含有一組載體，該組載體含有流感病毒基因組；以及能在低于或等于35℃的溫度下培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物的調(diào)節(jié)劑。
70.如權(quán)利要求69所述的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)還包括細胞培養(yǎng)基。
71.如權(quán)利要求69所述的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中，這組載體包括雙向表達載體。
72.如權(quán)利要求69所述的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，所述雙向表達載體攜帶位于第二啟動子和SV40多聚腺苷酸位點之間的第一啟動子的質(zhì)粒；其中第一和第二啟動子方向相反，位于至少一個流感病毒基因組節(jié)段兩側(cè)。
73.人工改造的重組或重排列流感病毒，該病毒包含在選自PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34的位置上有一個或多個氨基酸取代的A型流感病毒株；或在選自PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、M1159和M1183的位置上有一個或多個氨基酸取代的B型流感病毒株。
74.如權(quán)利要求73所述的流感病毒，其中，所述A型流感病毒含有一個或多個選自PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)的氨基酸取代；或其中所述B型流感病毒含有一個或多個選自PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)的氨基酸取代。
75.如權(quán)利要求73所述的A型流感病毒，該病毒包含一組選自PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)的氨基酸取代。
76.如權(quán)利要求73所述的A型流感病毒，該病毒包含一組由PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)構(gòu)成的氨基酸取代。
77.如權(quán)利要求73所述的B型流感病毒，該病毒包含一組選自PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)的氨基酸取代。
78.如權(quán)利要求73所述的B型流感病毒，該病毒包含一組由PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)構(gòu)成的氨基酸取代。
79.如權(quán)利要求73所述的A型流感病毒，該病毒包含A型流感病毒株P(guān)R8。
80.如權(quán)利要求73所述的流感病毒，其中，所述流感病毒具有下列一種或多種表型特征溫度敏感性、冷適應性及減毒特性。
81.如權(quán)利要求73所述的流感病毒，該病毒還含有至少一種其他非野生型氨基酸。
82.如權(quán)利要求73所述的流感病毒，其中，所述流感病毒在雪貂減毒試驗中復制至少下降3.0個log50。
83.如權(quán)利要求73所述的流感病毒，其中，所述流感病毒在雪貂減毒試驗中無法檢測到其復制。
84.一種制備溫敏(ts)流感病毒的方法，所述方法包括(a)在A型流感病毒基因組中引入至少一個能在選自PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34的位置上導致氨基酸取代的突變，或在B型流感病毒基因組中引入至少一個能在選自PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、M1159和M1183的位置上導致氨基酸取代的突變；以及(b)在能制造病毒的條件下復制突變的流感病毒基因組。
85.如權(quán)利要求84所述的方法，其中，所述A型流感病毒基因組包含PR8基因組。
86.如權(quán)利要求84所述的方法，所述方法包括引入至少一個編碼下列取代的氨基酸的突變到A型流感病毒基因組中PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)；或者引入至少一個編碼下列取代的氨基酸的突變到B型流感病毒基因組中PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。
87.如權(quán)利要求84所述的方法，所述方法包括引入一組編碼下列取代的氨基酸的突變到A型流感病毒基因組中PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)；或者引入一組編碼下列取代的氨基酸的突變到B型流感病毒基因組中PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。
88.如權(quán)利要求84所述的方法，所述方法包括引入能導致下列一組氨基酸取代的突變到A型流感病毒基因組中PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)；或者引入能導致下列一組氨基酸取代的突變到B型流感病毒基因組中PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。
89.如權(quán)利要求84所述的方法，所述方法包括在雞蛋內(nèi)復制突變的流感病毒基因組。
90.如權(quán)利要求84所述的方法，所述方法包括在細胞培養(yǎng)物內(nèi)復制突變的A型流感病毒基因組。
91.如權(quán)利要求90所述的方法，該方法還包括在雞蛋內(nèi)擴增病毒。
92.如權(quán)利要求90所述的方法，所述方法包括在低于或等于35℃的溫度下培養(yǎng)細胞。
93.如權(quán)利要求90所述的方法，其中，所述細胞培養(yǎng)物含有Vero細胞、MDCK細胞、293T細胞和COS細胞中的一種或多種。
94.一種制備流感病毒減毒活疫苗的方法，所述方法包括(a)引入至少一個能導致下列氨基酸取代的突變到A型流感病毒基因組中PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34；或者引入至少一個能導致下列氨基酸取代的突變到B型流感病毒基因組中PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、M1159和M1183；(b)在能制造病毒的條件下復制突變的流感病毒基因組；以及(c)回收流感病毒。
95.如權(quán)利要求94所述的方法，其中，所述流感病毒含有編碼至少來源于第二病毒株的HA和NA抗原的基因組節(jié)段。
96.如權(quán)利要求95所述的方法，其中，所述HA和NA抗原能激發(fā)抗至少一種流感病毒株的保護性免疫反應。
97.一種人工改造的重組或重排列的溫敏(ts)A型流感病毒，該病毒含有至少一個選自PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34的引入的氨基酸取代。
98.如權(quán)利要求97所述的溫敏A型流感病毒，該病毒含有至少一個選自PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)的引入的氨基酸取代。
99.如權(quán)利要求97所述的溫敏A型流感病毒，該病毒含有一組選自PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D34G)的引入的氨基酸取代。
100.如權(quán)利要求97所述的溫敏A型流感病毒，該病毒含有一組由PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661(A661T)、PB2265(N265S)和NP34(D346)構(gòu)成的引入的氨基酸取代。
101.如權(quán)利要求97所述的溫敏A型流感病毒，其中，所述溫敏A型流感病毒與野生型A型流感病毒相比在39℃時其生長下降約在2.0到5.0log10之間。
102.如權(quán)利要求101所述的溫敏A型流感病毒，其中，所述溫敏A型流感病毒與野生型A型流感病毒相比在39℃時其生長分別下降至少約2.0log10，至少約3.0log10，至少約4.0log10以及至少約4.5log10。
103.如權(quán)利要求97所述的溫敏A型流感病毒，其中，所述A型流感病毒與野生型A型流感病毒相比在雪貂減毒試驗中其生長下降約在2.0到5.0log10之間。
104.如權(quán)利要求103所述的溫敏A型流感病毒，其中，所述A型流感病毒在雪貂減毒試驗中其生長分別下降至少約2.0log10，至少約3.0log10以及至少約4.0log10。
105.如權(quán)利要求97所述的重排列的溫敏A型流感病毒，該病毒含有一個或多個編碼至少一個來源于第二A型流感病毒株的HA或NA抗原的基因組節(jié)段。
106.一種重組或重排列的A型流感病毒疫苗，該疫苗含有包含一組選自PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34的引入的氨基酸取代的A型流感病毒或A型流感病毒蛋白。
107.一種重組或分離的核酸，其含有編碼A型流感病毒多肽的多核苷酸序列，所述A型流感病毒多肽在選自PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34的位置上有一個或多個引入的氨基酸取代。
108.一種重組或分離的A型流感病毒多肽，其在選自PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34的位置上包含一個或多個氨基酸取代。
109.一種人工改造的重組或重排列的溫敏(ts)B型流感病毒，該病毒含有至少一個選自PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)的引入的氨基酸取代。
110.如權(quán)利要求109所述的溫敏B型流感病毒，該病毒含有至少一個選自PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)的引入的氨基酸取代。
111.如權(quán)利要求109所述的溫敏B型流感病毒，該病毒含有一組選自PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)的引入的氨基酸取代。
112.如權(quán)利要求109所述的溫敏B型流感病毒，該病毒含有一組由PB2630(S630R)、PA431(V431M)、PA497(Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP410(P410H)、NP510(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)構(gòu)成的引入的氨基酸取代。
113.如權(quán)利要求109所述的溫敏B型流感病毒，其中，所述溫敏A型流感病毒與野生型B型流感病毒相比在39℃時其生長下降約在2.0到5.0log10之間。
114.如權(quán)利要求113所述的溫敏B型流感病毒，其中，所述溫敏B型流感病毒在39℃時其生長分別下降至少約2.0log10，至少約3.0log10，至少約4.0log10以及至少約4.5log10。
115.如權(quán)利要求109所述的溫敏B型流感病毒，其中，所述B型流感病毒與野生型B型流感病毒相比在雪貂減毒試驗中其生長下降約在2.0到5.0log10之間。
116.如權(quán)利要求117所述的溫敏B型流感病毒，其中，所述B型流感病毒在雪貂減毒試驗中其生長分別下降至少約2.0log10，至少約3.0log10以及至少約4.0log10。
117.如權(quán)利要求109所述的重排列的溫敏B型流感病毒，該病毒含有一個或多個編碼至少一個來源于第二B型流感病毒株的HA或NA抗原的基因組節(jié)段。
118.一種重組或重排列的B型流感病毒疫苗，該疫苗含有包含一組選自PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、M1159和M1183的引入的氨基酸取代的B型流感病毒或B型流感病毒蛋白。
119.一種重組或分離的核酸，其含有編碼B型流感病毒多肽的多核苷酸序列，所述B型流感病毒多肽在選自PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、M1159和M1183的位置上含有一個或多個引入的氨基酸取代。
120.一種重組或分離的B型流感病毒多肽，其含有一個或多個選自PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、M1159和M1183的引入的氨基酸取代。
全文摘要
本發(fā)明涉及在細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)適于重組流感病毒疫苗制備的流感病毒的載體和方法。本發(fā)明還涉及用在多質(zhì)粒流感病毒表達系統(tǒng)中的雙向表達載體。
文檔編號A61K39/145GK1678345SQ03815195
公開日2005年10月5日 申請日期2003年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月26日
發(fā)明者E·霍夫曼, H·金, B·盧, G·杜克, G·W·坎寶 申請人:米迪繆尼疫苗股份有限公司