專利名稱：刺激胃腸運動性的食品和飲料的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及作用于毒蠅堿M3受體的物質(zhì)，更具體而言，涉及能夠刺激胃腸運動性、胃酸分泌、泌尿或者食欲，或者能夠提高可飲用性的物質(zhì)。
本發(fā)明還涉及使用了該物質(zhì)，或者含有該物質(zhì)的天然產(chǎn)物、經(jīng)加工的天然產(chǎn)品或組合物的食品和飲料，特別涉及這樣的食品和飲料，其利用了所述物質(zhì)刺激胃腸運動性或提高可飲用性的能力。
背景技術：
人類攝取的食物在胃腸系統(tǒng)的不同區(qū)域內(nèi)經(jīng)歷各種消化過程，大部分營養(yǎng)物質(zhì)在被攝取食物排泄前在小腸中得到吸收。為了使這些消化和吸收過程有序地進行，需要根據(jù)其消化的階段將食物經(jīng)由胃腸道連續(xù)地推進。因而，胃腸運動性是一種控制胃腸道各種消化過程的重要生理功能，包括內(nèi)容物的輸送、貯存、攪拌/混合和排泄。
胃腸運動性輸送、貯存和攪拌/混合胃腸道的內(nèi)容物，這是形成胃腸道壁的平滑肌的協(xié)同收縮(蠕動)。胃腸運動性受神經(jīng)調(diào)節(jié)和體液調(diào)節(jié)。神經(jīng)調(diào)節(jié)由自主神經(jīng)系統(tǒng)的雙重控制和胃腸壁壁內(nèi)神經(jīng)的控制組成。參與神經(jīng)調(diào)節(jié)的主要神經(jīng)是膽堿能副交感神經(jīng)節(jié)后纖維。與之對比，體液調(diào)節(jié)通過胃腸激素來實現(xiàn)。
如果這些調(diào)節(jié)機制的平衡被打破，胃腸運動性受到干擾，那么消化過程的各個階段會受到擾亂，導致吞咽困難，胃灼熱、惡心、嘔吐、腹痛、腹脹、腹瀉、便秘和其它胃腸病癥。特別地，在我們現(xiàn)代充滿壓力的社會里，患有這些癥狀，但實際并無任何器質(zhì)性疾病，如潰瘍和癌癥的病人數(shù)量越來越多。在日本，這樣的病人被診斷為患有慢性胃炎，并沒有得到實際的治療。然而，胃腸疾病診斷學的發(fā)展表明，許多這種情況是由有缺陷的胃腸運動性造成的，如表現(xiàn)為胃排空延遲，術語“機能性消化不良”和“非潰瘍性消化不良(NUD)”被用來指這些病癥并將它們與胃炎區(qū)別開來。此類疾病還包括胃張力缺乏-一種常見于老年人的胃壁肌緊張性下降引起的病癥，以及由心理生理因素引起的病癥，如神經(jīng)性消化不良和胃神經(jīng)病?；熞鸬男g后胃腸運動性減弱和食欲喪失也成為社會關注的問題。
與胃腸運動性有關的受體研究的最新進展揭示了胃腸運動性神經(jīng)調(diào)節(jié)的詳細機理。胃腸運動性主要由壁內(nèi)膽堿能神經(jīng)調(diào)節(jié)，該神經(jīng)是副交感神經(jīng)節(jié)后纖維。這些神經(jīng)的突觸末端釋放的乙酰膽堿與平滑肌的毒蠅堿M3受體結(jié)合引起肌肉收縮。隨著膽堿脂酶使乙酰膽堿降解，平滑肌恢復到原始長度。這種收縮和松弛頻率的提高促進了胃腸運動性。
因而，可以用作毒蠅堿M3受體的激動劑的物質(zhì)可以引起胃腸道內(nèi)平滑肌的收縮并由此刺激胃腸運動性。該物質(zhì)可用來改善胃腸運動性減弱引起的胃腸病癥的癥狀并因而可以用作高效的胃腸運動性刺激劑。
其中，已知酒精飲料可以影響上胃腸道運動性。例如，已經(jīng)證實啤酒可促進胃排空并縮短胃容物到達闌尾所經(jīng)歷的時間，然而，具有與啤酒相近的乙醇濃度(7.5％)的乙醇溶液抑制胃排空(Pfeiffer等人的Clin.Investig，.Vol.70，pp.487-491，1992)。曾報導過一個有趣的發(fā)現(xiàn)，某種比其它種類的啤酒從胃中排空更快的特殊種類的啤酒顯示出更高的可飲用性(Biosci.Biotechnol.Biochem，Vol.62，pp.846-851，1998)。
如本文中所用的，術語“啤酒的可飲用性”指在大量飲用后，啤酒保持鮮爽(refreshing)的能力。在歐洲，該術語稱作“Weitertrinken”或“可飲用性”并被認為是一種評估啤酒的重要因素。上述研究的結(jié)果表明啤酒在其酒精成分以外含有某些能夠刺激胃腸運動性和提高其可飲用性的物質(zhì)。這些活性成分從未被充分研究過，也未被確定。
本發(fā)明人采用小鼠進一步證實了啤酒的干燥產(chǎn)物具有促進胃排空的能力。本發(fā)明人還通過采用小鼠回腸(ilea)縱肌進行的受體結(jié)合試驗和收縮性試驗驗證了干燥啤酒產(chǎn)物的作用機理。結(jié)果，證實干燥的啤酒產(chǎn)物能夠刺激毒蠅堿M3受體并由此刺激胃腸運動性(AlcoholismClinical & Experimental Research，Vol.26，No.5，pp677-681，2002)。
如果在啤酒中鑒別出能作用于毒蠅堿M3受體的胃腸運動性刺激劑或可飲用性增強劑，那么該刺激劑或增強劑能夠用來提高可飲用性和刺激胃腸運動性、胃酸分泌、泌尿或食欲。因而，可以預見該刺激劑或增強劑非常有用。
為了測定存在于啤酒材料，如大麥中的痕量成分進行了各種研究美國專利No.3,475,459描述了大麥亭A，一種從大麥獲得的殺真菌劑。然而，在該專利中，沒有根據(jù)相關數(shù)據(jù)接近地研究其三維結(jié)構(gòu)，也沒有確定其任何的立體異構(gòu)體。而且，在其抗真菌活性以外，沒有提及大麥亭A的其它活性，特別是對毒蠅堿M3受體的活性。
因此，本發(fā)明的目標是分離并鑒別出啤酒中能夠作用于毒蠅堿M3受體和刺激胃腸運動性的活性成分。本發(fā)明的另一個目標是在多種功能性食品和飲料中應用該物質(zhì)以提供可飲用性增強劑和胃腸運動性、胃酸分泌、泌尿或食欲的刺激劑。
在我們研究過程中，本發(fā)明人試圖根據(jù)其對毒蠅堿M3受體的結(jié)合活性從啤酒中提純胃腸運動性刺激劑，最終成功地用四步液相色譜法分離出了該物質(zhì)。本發(fā)明人還確定了該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)并完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
在一個方面中，本發(fā)明涉及以下化學式(I)表征的化合物 在本發(fā)明的這個方面中，確定了該化合物的三維結(jié)構(gòu)并實際地提供了該化合物。
具體而言，本發(fā)明人通過以下方法確定了化學式(I)化合物的三維結(jié)構(gòu)首先分離我們稱為活性物質(zhì)α和β的兩種異構(gòu)體，然后分別使活性物質(zhì)α和β經(jīng)過紫外吸收光譜、質(zhì)譜分析法、核磁共振光譜和其它分析技術分析。
具體而言，化學式(I)化合物的每一種異構(gòu)體--活性物質(zhì)α和β，分別表征為以下化學式(II)和(III) 本發(fā)明的化學式(I)化合物分子中含有兩個手性碳原子。因此，該化學式(I)化合物具有不同的立體異構(gòu)體，它們都包含于化學式(I)中?；瘜W式(I)所表征的物質(zhì)還包含化學式(I)化合物立體異構(gòu)體的混合物。
化學式(I)化合物的每一種立體異構(gòu)體--化學式(II)(順式)表征的化合物和化學式(III)(反式)表征的化合物具有各自的對映體。本發(fā)明的活性物質(zhì)α和β分別具有產(chǎn)生

圖13和14所示圓二色性譜的絕對構(gòu)型。這些對映體包括在化學式(II)和(III)表征的化合物內(nèi)。
本發(fā)明的化學式(I)-(III)表征的化合物可以采取鹽的形式。在本發(fā)明的整篇說明書和權利要求書中，這些鹽也包含于化學式(I)-(III)表征的化合物內(nèi)。
化學式(I)-(III)表征的化合物是對-香豆芳酰胍基丁胺的二聚物。對-香豆芳酰胍基丁胺在其酚基和酰胺基之間含有雙鍵。如果形成二聚物的兩個對-香豆芳酰胍基丁胺均為順式，那么得到的二聚物具有關于五元環(huán)的順式構(gòu)型，如化學式(III)所示。
對比而言，化學式(II)化合物具有關于五元環(huán)的順式構(gòu)型和關于雙鍵的反式構(gòu)型。這是一種罕見的結(jié)構(gòu)，幾乎不能從兩個順式分子的二聚作用或兩個反式分子的二聚作用預見到。換言之，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)化學式(II)化合物具有對于天然存在化合物而言極為罕見的結(jié)構(gòu)。
在另一個方面中，本發(fā)明提供了分離/提純活性物質(zhì)α和β的方法。具體而言，該方法包括冷凍干燥作為原料的啤酒以除去揮發(fā)性成分并收集非揮發(fā)性成分；使非揮發(fā)性組分經(jīng)過應用了合成吸收劑的色譜以除去未被吸附的成分并在含有濃縮活性物質(zhì)的粗級分中收集被吸附的成分；使所述粗級分經(jīng)過弱酸性陽離子交換色譜以除去未被吸附的成分；用酸性甲醇(甲醇/鹽酸)將活性物質(zhì)洗提出來；使洗脫液經(jīng)過采用了0.01N鹽酸的凝膠過濾色譜以獲得提純的級分；將提純的級分經(jīng)過C18高效液相色譜(ODS-HPLC)進一步提純以分離出兩種活性物質(zhì)。所獲得的活性物質(zhì)是水溶性的。
在HPLC中，分別測定了兩種活性物質(zhì)α和β，各得到一個單峰。在毒蠅堿M3受體結(jié)合試驗中，測定了每一種所具有的對毒蠅堿M3受體的親合性。具體而言，在小鼠中測試了活性物質(zhì)α和β促進胃排空的能力以提供一個它們對胃腸運動性作用的量度。結(jié)果，證實它們中的每一種均具有促進胃腸運動性的強大能力。
毒蠅堿M3受體不僅存在于小腸中，也存在于各種胃細胞的表面上并在引起胃的生理活性中起重要作用。具體而言，壁細胞、主細胞和G細胞通過毒蠅堿M3受體受到乙酰膽堿的刺激，分別分泌出胃酸、胃蛋白酶原和促胃液素。這引起胃平滑肌收縮。
毒蠅堿M3受體也存在于膀胱平滑肌(逼尿肌)中，受到乙酰膽堿作用時引起平滑肌收縮，促進泌尿。
由于能作用于毒蠅堿M3受體，本發(fā)明的活性物質(zhì)α和β在刺激胃腸運動性之外還能刺激依賴毒蠅堿M3受體的泌尿、胃酸分泌和食欲。因此，這些物質(zhì)可以用于止吐劑或味覺排斥癥患者所用的零食中。
在另一個方面中，本發(fā)明提供了化學式(I)-(III)表征的活性物質(zhì)，其能夠提高可飲用性并能夠促進胃腸運動性、胃酸分泌、泌尿和食欲。
在為發(fā)現(xiàn)活性物質(zhì)α和β的來源的努力中，本發(fā)明人篩選了各種材料以尋找存在這些物質(zhì)的材料，發(fā)現(xiàn)所述活性物質(zhì)富含于酵母發(fā)酵產(chǎn)物、大麥、發(fā)芽的大麥、和發(fā)芽大麥的分級分離產(chǎn)物中。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)所述活性物質(zhì)特別富含于大麥芽，一種發(fā)芽大麥的分級分離產(chǎn)物中。
基于這一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人通過采用Magnus法分析了活性物質(zhì)的豐富來源-大麥芽提取物對豚鼠回腸縱肌收縮的作用。試驗表明，該提取物引起了回腸縱肌的強烈收縮，由此刺激了胃腸運動性。
在另一個方面中，本發(fā)明提供了各種食品和飲料、用于食品和飲料中的添加劑、藥品和動物飼料，其使用了化學式(I)-(III)表征的活性物質(zhì)，或者含有所述活性物質(zhì)的天然存在材料、天然存在材料的加工產(chǎn)品或組合物。這些產(chǎn)品能夠刺激胃腸運動性并提高可飲用性。
本發(fā)明的食品和飲料、食品和飲料添加劑、藥品和動物飼料優(yōu)選含有大麥芽。
更優(yōu)選地，本發(fā)明的食品和飲料以酒精飲料、非酒精飲料、保健食品和特殊設計食品的形式提供。
附圖簡述圖1是顯示參考實施例1中獲得的抑制作用曲線的圖，表明干燥的啤酒產(chǎn)物得到的分級分離產(chǎn)物對[3H]4-DAMP結(jié)合的抑制作用。
圖2是顯示實施例1分離/提純方法的流程圖，通過該方法從啤酒中分離/提純出能夠刺激胃腸運動性的物質(zhì)。
圖3是實施例1中得到的本發(fā)明活性物質(zhì)α的HPLC色譜圖。
圖4是顯示實施例1中獲得的抑制作用曲線的圖，表明本發(fā)明活性物質(zhì)α對[3H]4-DAMP結(jié)合的抑制作用。
圖5是顯示實施例1中獲得的抑制作用曲線的圖，表明本發(fā)明活性物質(zhì)β對[3H]4-DAMP結(jié)合的抑制作用。
圖6顯示了說明實施例2的活性物質(zhì)α和β的紫外吸收度的紫外分光光度法結(jié)果。
圖7顯示了采用實施例2的活性物質(zhì)α的質(zhì)譜分析法結(jié)果。
圖8顯示了采用實施例2的活性物質(zhì)β的質(zhì)譜分析法結(jié)果。
圖9顯示了采用實施例2的活性物質(zhì)α的核磁共振(1H-NMR)光譜的結(jié)果。
圖10顯示了采用實施例2的活性物質(zhì)β的核磁共振(1H-NMR)光譜的結(jié)果。
圖11顯示了采用實施例2的活性物質(zhì)α的核磁共振(13C-NMR)光譜的結(jié)果。
圖12顯示了采用實施例2的活性物質(zhì)β的核磁共振(13C-NMR)光譜的結(jié)果。
圖13顯示了采用實施例2的活性物質(zhì)α的圓二色性譜的結(jié)果。
圖14顯示了采用實施例2的活性物質(zhì)β的圓二色性譜的結(jié)果。
圖15是顯示實施例3中進行的實驗結(jié)果的圖，其中檢測了活性物質(zhì)α和β促進小鼠胃排空的能力。
圖16是實施例4中從大麥芽提取并部分提純的組合物的HPLC色譜圖。
圖17是顯示實施例5結(jié)果的圖，其中檢測了含有活性物質(zhì)的大麥芽提取物引起豚鼠回腸縱肌收縮的能力。
圖18是顯示實施例6結(jié)果的圖，其中檢測了人類含有能夠刺激胃腸運動性的物質(zhì)的食品和飲料(酒精飲料)刺激泌尿的能力。
圖19是顯示實施例7結(jié)果的圖，其中在大鼠中檢測了含有能夠刺激胃腸運動性的物質(zhì)的食品和飲料(非酒精飲料)提高可飲用性的能力。
圖20是顯示實施例8結(jié)果的圖，其中在人類中檢測了含有能夠刺激胃腸運動性的食品和飲料(啤酒)提高可飲用性的能力。
本發(fā)明的最佳實施方式現(xiàn)在將要就本發(fā)明活性物質(zhì)的分離、提純和性能詳細描述本發(fā)明，所述活性物質(zhì)能夠作用于毒蠅堿M3受體并表征為化學式(I)-(III)。
具體而言，能夠作用于毒蠅堿M3受體并表征為化學式(I)-(III)的本發(fā)明活性物質(zhì)可以通過采用正確組合的四步液相色譜從啤酒來分離和提純。更具體而言，冷凍干燥啤酒以除去揮發(fā)性成分，使余下的非揮發(fā)性成分經(jīng)過采用合成吸附劑如AMBERLITE XAD-2和DIAIONHP-20的色譜以除去未被吸附的成分。然后用醇，如甲醇洗提被吸附的成分以獲得含有濃縮活性物質(zhì)的粗級分。
隨后，使得到的醇洗脫液經(jīng)過弱酸性陽離子交換色譜，例如CM-Sephadex C-25柱色譜以除去未被吸附的成分，并用酸性甲醇(甲醇/鹽酸)洗提被吸附的活性物質(zhì)。
然后使得到的洗脫液經(jīng)過采用0.01N鹽酸的凝膠過濾色譜獲得提純的級分，接下來使其經(jīng)過C18高效液相色譜(ODS-HPLC)進一步提純以分離出所需的兩種活性物質(zhì)(活性物質(zhì)α和β)。
根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)分離和提純的活性物質(zhì)可以直接用作刺激胃腸運動性的刺激劑，或者，可以采用含有所述活性物質(zhì)的天然產(chǎn)物或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物。如本文中所用的，術語“天然產(chǎn)物”指未經(jīng)加工的谷物(例如，大麥)或近似的材料，術語“經(jīng)加工的天然產(chǎn)物”指的是酵母發(fā)酵產(chǎn)物、發(fā)芽的大麥、其分級分離產(chǎn)物和以各種其它方式加工過的天然產(chǎn)物。術語“分級分離產(chǎn)物”在本文中用來指經(jīng)物理分離的產(chǎn)物(即組織級分)。術語“經(jīng)加工的天然產(chǎn)物”還包含通過加工天然產(chǎn)物、酵母發(fā)酵產(chǎn)物或發(fā)芽的大麥，例如通過將它們變成精細粉末而獲得的，可以直接吸收的組合物。
根據(jù)對本發(fā)明食品和飲料、食品和飲料的添加劑、藥品、動物飼料、胃腸運動性刺激劑的性能要求，天然產(chǎn)物或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物可以以任何合適組合物的形式提供，所述組合物是在從各種天然產(chǎn)物或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物中提取、分離或提純過程中的所需階段中獲得的。在本發(fā)明中，這些含有活性物質(zhì)的組合物也包含在術語“經(jīng)加工的天然產(chǎn)物”內(nèi)。
用作本發(fā)明中原料的酵母發(fā)酵產(chǎn)物的實例包括釀酒酵母類酵母菌株的發(fā)酵產(chǎn)物。酵母發(fā)酵產(chǎn)物的具體實例是威士忌和其它燒酒蒸餾后剩余的非揮發(fā)性餾分和含有酵母發(fā)酵產(chǎn)物的酵母發(fā)酵液，如啤酒、葡萄酒和米酒。
例如，可以按以下步驟從酵母發(fā)酵產(chǎn)物中獲得具有經(jīng)由毒蠅堿M3受體來刺激胃腸運動性性能的所需級分將酵母發(fā)酵產(chǎn)物與合成吸附劑(例如DIAION HP-20，MICHBISHI CHEMICAL)接觸，使特定成分吸附到吸附劑上，將吸附的成分用醇，如甲醇和乙醇來洗提，得到能夠刺激胃腸運動性的所需級分。
如果需要，可以將得到的級分在酸性pH下向陽離子交換樹脂(例如，CM-Sephadex C-25，PHARMACIA)暴露以獲得能夠刺激胃腸運動性的酵母發(fā)酵產(chǎn)物級分的陽離子形式成分，然后通過HPLC對其進行提純或在有機溶劑如乙醚中結(jié)晶以獲得所需的高純度活性物質(zhì)。
或者，可以從大麥、發(fā)芽的大麥或發(fā)芽的大麥的分級分離產(chǎn)物中分離出所述活性物質(zhì)。術語“大麥”在本文中指任何大麥屬植物，包括大麥(Hordeum vulgare L.)和栽培二棱大麥(Hordeum distichonL.)。從農(nóng)業(yè)經(jīng)濟上講，可以根據(jù)播種季節(jié)分類為春大麥和冬大麥。根據(jù)麥粒行數(shù)，還可以將大麥分為雙行大麥和六行大麥。具體品種包括Haruna nijo、Amagi nijo、Mikamo golden和Takaho golden，均種植于日本，和Alexis、Schooner、Harrington、orbit、Corniche和Triumph，均種植在日本國以外。
如本文中所用，術語“發(fā)芽的大麥”指經(jīng)生長或發(fā)育的大麥粒。在麥芽生產(chǎn)過程中，該術語指綠麥芽(生麥芽)和干麥芽。就所涉及到的生長的大麥粒而言，該術語指芽和幼苗。在麥芽生產(chǎn)過程中，可以通過控制如生長溫度、供水量、表層氧氣與二氧化碳的比率和發(fā)芽時間長度的諸因素來決定大麥的發(fā)芽程度。優(yōu)選地，綠麥芽(生麥芽)的含水量為約40-45％，干麥芽的含水量為約3-15％。
根據(jù)本發(fā)明，發(fā)芽的大麥的分級分離產(chǎn)物可以是任何組織級分，包括麥麩、淀粉層(胚乳)、谷殼和外種皮、葉芽、嫩葉、嫩枝、幼根、糊粉層、大麥芽、細根及其混合物。發(fā)芽的大麥的分級分離產(chǎn)物可以通過采用任何已知技術來制備，包括粉碎、過篩、脫殼、吹氣、比重選擇和表面去除。
在不同分級分離產(chǎn)物中，在本發(fā)明中優(yōu)選將大麥芽-在大麥發(fā)芽過程中生長或發(fā)出的細根或根(可稱作“細根”)用作含有所需活性物質(zhì)α和β的天然產(chǎn)物或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物。
為了從大麥、發(fā)芽的大麥或發(fā)芽的大麥分級分離產(chǎn)物中得到能夠經(jīng)由毒蠅堿M3受體刺激胃腸運動性的所需組合物，可以采用任何已知的提取或分離技術。具體實例包括基于分配平衡的分離，如固體-液體提取(例如水提取體系和有機提取體系)，超臨界氣體提取和吸附(例如活性炭)；基于速度差的分離，如過濾、透析和膜分離(例如超濾、RO和功能膜)，和液相色譜(例如離子交換)；基于優(yōu)先沉淀的分離，如結(jié)晶和利用有機溶劑沉淀。可以適當?shù)亟M合使用這些技術。
如果需要，可以進行濃縮、過濾、干燥和其它必要工藝，以濃縮的提取物、粉末、干燥產(chǎn)物、結(jié)晶產(chǎn)物或各種其它形式獲得用來刺激胃腸運動性的所需組合物。組合物的純度可以根據(jù)所需的食品和飲料、食品和飲料的添加劑、藥品、動物飼料和胃腸運動性刺激劑的性能來確定可以以粗產(chǎn)物或高純度產(chǎn)物的形式提供所述組合物。
可以從大麥芽和/或細根，以如下方式獲得所需能夠經(jīng)由毒蠅堿M3受體刺激胃腸運動性的組合物如果有麥麩和其它雜質(zhì)的話，在預處理如過篩時將其從大麥芽和/或細根中除去。當需要將大麥芽和/或細根加工成可以直接吸收的組合物時，可以將它們采用通常已知的粉碎技術粉碎成細粉，或可以使它們形成膏體或丸粒。當需要從大麥芽和/或細根提取或分離出刺激胃腸運動性的組合物時，用水或合適溶劑來提取或分離該組合物。如果需要，可以通過將提取物向各種吸附劑如合成吸附劑、活性炭和離子交換樹脂暴露，或使其經(jīng)過分離和/或提純技術，如分離膜來進一步提高組合物純度。可以濃縮、過濾或干燥提取物，使組合物形成濃縮提取物、粉末、干燥產(chǎn)物、結(jié)晶產(chǎn)物或各種其它形式?；蛘?，可以使提取物與糖混合，形成糖漿狀組合物。可以使組合物形成任何所需的鹽，如鹽酸鹽。
根據(jù)本發(fā)明，可以將大麥芽和/或細根直接與其它材料混合，并可以使混合物經(jīng)過提取/分離工藝以制備含有所需胃腸運動性刺激劑的飲料。對于可直接吸收的飲料而言，混入原料中的大麥芽和/或細根的量優(yōu)選為每升終產(chǎn)物中20mg-200g?；钚晕镔|(zhì)的量優(yōu)選為每升終產(chǎn)物中0.01mg-100mg。
可以將上述方式獲得的作用于毒蠅堿M3受體的胃腸運動性刺激劑直接作為添加劑加入食品和飲料以刺激胃腸運動性，或者如果需要，可以將其與適當可食用的載體結(jié)合，形成干燥產(chǎn)物、液體產(chǎn)物或粉末產(chǎn)物以用作添加劑。還可以使所述刺激劑形成易溶制劑，其可以在使用前或使用時溶解在酒精飲料或礦泉水中。
根據(jù)本發(fā)明，可以以上述定義的含有所述刺激劑的天然產(chǎn)物或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物的形式向食品或飲料中加入作用于毒蠅堿M3受體的胃腸運動性刺激劑，或者如果需要，可以將所述天然產(chǎn)物或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物與適當?shù)目墒秤幂d體相結(jié)合，形成干燥產(chǎn)物、液體產(chǎn)物或粉末產(chǎn)物以用作添加劑。所述含有刺激劑的天然產(chǎn)物或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物也可以形成易溶制劑，其可以在使用前或使用時將其溶解在酒精飲料或礦泉水中。
用于本發(fā)明食品和飲料中的添加劑是用于不同目的的添加劑，包括調(diào)料、香料、furikake(灑在米飯上的調(diào)味用干燥食品粉末)、烹調(diào)油、湯料和補充物，每一種都含有作為其一種成分的胃腸運動性刺激劑。
通過采用通常已知的技術，可以將刺激胃腸運動性的刺激劑和組合物及其混合物-每一種都可以用作本發(fā)明的活性成分-與食物材料一起，加工成食品和飲料、保健食品或?qū)ｉT設計的食品。
本發(fā)明的食品和食料可以是任何種類和形式，包括固體和液體產(chǎn)品和高檔食品。實例包括農(nóng)產(chǎn)品，如面包、面條、米飯、甜食(例如餅干、蛋糕、糖果、巧克力、日式甜品、膠質(zhì)糖和口香糖)，以及豆腐和豆腐制品；調(diào)味品，如mirin(調(diào)味用日本甜米酒)、醋、醬、發(fā)酵豆醬和調(diào)味料；畜產(chǎn)品，如酸奶、火腿、咸肉、香腸和蛋黃醬；魚醬產(chǎn)品，如Kamaboko(水煮魚餅)和hanpen(膨化魚餅)；飲料，如果汁飲品、無酒精飲料、運動飲料、咖啡飲料、茶飲料和碳酸飲料；和牛奶與奶粉制品，如嬰兒奶粉和用于咖啡中的牛奶。
本發(fā)明的保健食品也可以是任何種類和形式，包括片劑、膠囊以及固體或液體產(chǎn)品。
本發(fā)明的專門設計食品包括為病弱人群設計的食品、孕婦和哺乳期母親用的奶粉、嬰兒人工奶粉、老年食品和具有保健功能的食品(例如，具有營養(yǎng)功能的食品和特定保健用途的食品)。
可以將本發(fā)明的活性成分加入發(fā)酵麥芽飲料中，如啤酒、低麥芽度啤酒或低醇發(fā)酵麥芽飲料，或發(fā)酵酒，如葡萄酒、米酒或藥酒中，以制成具有提高的胃腸運動性刺激作用和可飲用性的酒精飲料。也可以向燒酒如威士忌、白蘭地或shochu(日本蒸餾酒)中加入所述活性成分，以制成具有胃腸運動性刺激能力和增強可飲用性能力的開胃酒/開胃食品。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明活性物質(zhì)的刺激劑以刺激胃腸運動性?？梢酝ㄟ^采用常規(guī)配制技術將所述刺激劑成形為膠囊、片劑、粉末、顆粒、可飲用制劑、糖漿、注射劑、點滴注射制劑和其它制劑。可以在進餐前或進餐中服用這些制劑以刺激胃腸運動性，或者它們可以作為高檔食品來攝取。所述刺激劑不僅可以為健康的人刺激胃腸運動性，還可以用來恢復由于外科手術、衰老、疲勞、疾病和損傷造成的胃腸運動性降低并可以解決化療引起的食欲降低。
本發(fā)明的胃腸運動性刺激劑作用于毒蠅堿M3受體。毒蠅堿M3受體在各種生理活動中所起的顯著作用清楚地表明本發(fā)明的物質(zhì)不僅能夠刺激胃腸運動性，還能夠刺激泌尿、胃酸分泌和食欲。
還證實本發(fā)明的胃腸運動性刺激劑具有提高可飲用性的能力。
不直接采用從啤酒中分離出的化學式(I)-(III)的物質(zhì)，可以將含有所述物質(zhì)的天然產(chǎn)物(例如大麥)或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物(例如酵母發(fā)酵產(chǎn)物、發(fā)芽的大麥和發(fā)芽的大麥的分級分離產(chǎn)物)用作胃腸運動性、泌尿、胃酸分泌和食欲的刺激劑以及可飲用性增強劑。特別地，大麥芽和大麥芽的加工產(chǎn)品含有大量化學式(I)-(III)的物質(zhì)，且適合應用。
可以使所述天然產(chǎn)物和經(jīng)加工天然產(chǎn)物經(jīng)過提取/分離工藝以獲得特定的組合物。根據(jù)所需食品和飲料、食品和飲料添加劑、藥品、動物飼料和胃腸運動性刺激劑的性能，得到的組合物可以適合應用。
當將本發(fā)明的作用于毒蠅堿M3受體的胃腸運動性刺激劑加入到食品和飲料中供人類或其它動物攝入時，應將其以能夠有效地刺激胃腸運動性的充分量加入。例如，加入的刺激劑的量可以是這樣使每餐消費幾毫克活性物質(zhì)。調(diào)節(jié)刺激劑的量，優(yōu)選使每天攝入0.01mg-100mg溶性物質(zhì)，更優(yōu)選為0.05mg-50mg活性物質(zhì)，甚至更優(yōu)選為0.1mg-10mg活性物質(zhì)，盡管該量可以根據(jù)食品和飲料、食品和飲料添加劑、胃腸運動性刺激劑和動物飼料的形式而變化。
在急性毒性試驗中，當向小鼠經(jīng)口給服多達50mg/kg時，在一般情況或體重條件下，證實本發(fā)明的胃腸運動性刺激劑不會造成死亡或帶來任何的反常。因而，證實該刺激劑幾乎或完全沒有毒性。
如上所述，本發(fā)明在刺激胃腸運動性和提高可飲用性上是有效的并因而可以用于厭食、消化不良、餐后飽脹感、胃重感、惡心、嘔吐、上腹部痛和其它胃腸運動性下降引起的胃腸癥狀患者。
實施例現(xiàn)在，參考實驗和實施例進一步詳細描述本發(fā)明，所用實驗和實施例只是以示例的方式提供，決非以任何方式限制本發(fā)明范圍。
研究表明，經(jīng)干燥的啤酒產(chǎn)物通過作用于毒蠅堿M3受體刺激胃腸運動性。因而，基于其對毒蠅堿M3受體的結(jié)合活性，對啤酒中存在的胃腸運動性刺激劑進行了探究。
參考實施例1對毒蠅堿M3受體結(jié)合活性的試驗按以下方式進行了對毒蠅堿M3受體結(jié)合活性的試驗。
向細胞膜制劑懸浮液中加入樣品(干燥啤酒產(chǎn)物和干燥啤酒產(chǎn)物的分級分離產(chǎn)物)和0.2nM用作配體的[3H]4-二苯基乙酰氧基-N-甲基哌啶甲碘化物([3H]4-DAMP)，上述細胞膜制劑懸浮液是從表達人類毒蠅堿M3受體的經(jīng)感染中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系獲得的。然后，在22℃將混合物溫育60分鐘。隨后，使反應混合物經(jīng)由玻璃纖維過濾器(GF/B，PACKARD)過濾，同時進行抽氣。反應一結(jié)束，用冰冷的緩沖液洗滌混合物數(shù)次。向該過濾器加入閃爍混合物(MicroscintO，PACKARD)，通過液體閃爍計數(shù)器(Topcount，PACKARD)測量殘留放射性。從結(jié)合[3H]4-DAMP的總量減去1μM阿托品存在下非特異性結(jié)合的量，測定了[3H]4-DAMP的特異性結(jié)合量。
圖1中顯示了干燥啤酒產(chǎn)物的[3H]4-DAMP結(jié)合抑制曲線。從圖1的結(jié)果可以看出，在高于0.1mg/ml的濃度下，干燥啤酒產(chǎn)物抑制了[3H]4-DAMP的結(jié)合，其IC50值(50％[3H]4-DAMP結(jié)合被抑制時的抑制劑濃度)為約2mg/ml。
實施例1為從啤酒中分離出胃腸運動性刺激劑，通過采用參考實施例1中獲得的配體與毒蠅堿M3受體的結(jié)合活性作為標準，分離/提純了對配體結(jié)合具有抑制活性的級分。圖2中顯示了分離/提純方法的流程。
具體而言，對10L啤酒(100％麥芽，5％酒精，干重＝3.5％w/v)進行冷凍干燥。向該干燥產(chǎn)物中加入純水并使溶液經(jīng)過采用合成吸附劑(XAD-2)的色譜。用甲醇洗提被吸附的物質(zhì)，得到對毒蠅堿M3受體具有結(jié)合活性的洗脫液。從該洗脫液中蒸發(fā)掉甲醇并向干燥產(chǎn)物中加入純水。然后使溶液經(jīng)過弱酸性陽離子交換色譜(樹脂CM-Sephadex C-25)。用甲醇/鹽酸洗提被吸附的物質(zhì)得到具有結(jié)合活性的洗脫液。從該洗脫液中蒸發(fā)掉甲醇和鹽酸并向干燥產(chǎn)物中加入純水。然后使溶液經(jīng)過凝膠過濾色譜(樹脂Sephadex G-15)。隨后，使每一個具有結(jié)合活性的級分(活性級分No.1kd＝3-5；活性級分No.2kd＝7-9)經(jīng)過制備ODS-HPLC。結(jié)果，從活性級分No.1得到4.2mg活性物質(zhì)α，從活性級分No.2得到12.6mg活性物質(zhì)β。
使以上得到的兩種活性物質(zhì)(α和β)經(jīng)過HPLC分析。圖3中顯示了活性物質(zhì)α的HPLC分析圖。
圖中所示的單峰表明，在約33-34分鐘的保留時間洗脫出活性物質(zhì)α。
相近地，在與活性物質(zhì)α基本相同的保留時間洗脫出活性物質(zhì)β，且活性物質(zhì)β由HPLC的單峰得到證實。
同樣，在不同的條件下經(jīng)過HPLC分析時，活性物質(zhì)α和β分別顯示出單峰。
采用每一個均在HPLC上洗脫出單峰的活性物質(zhì)α和β的各自劑量，通過按照參考實施例1進行對毒蠅堿M3受體的結(jié)合活性試驗，建立了每種物質(zhì)的劑量-反應曲線。
結(jié)果分別示于圖4(活性物質(zhì)α)和圖5(活性物質(zhì)β)中。從這些圖中的結(jié)果可以看出，活性物質(zhì)α和β分別顯示出劑量-依賴性并分別具有0.65×10-6g/ml和2.30×10-6g/ml的IC50值。
4-DAMP的IC50值為0.62×10-9g/ml。
總之，從啤酒中分離出了兩種活性物質(zhì)(即活性物質(zhì)α和β)，而且每一種都顯示出HPLC單峰并以劑量-依賴的方式作用于毒蠅堿M3受體。
實施例2將以上分離/提純的兩種活性物質(zhì)(α和β)經(jīng)過UV分光光度測定、質(zhì)譜分析法和NMR光譜分析。
1、UV分光光度測定法圖6中顯示了對物質(zhì)α和β進行的UV光譜測定的結(jié)果。
這兩種物質(zhì)顯示出非常相近的UV光譜在230nm附近的單吸收峰和300nm附近的相對較寬的吸收峰，是這些物質(zhì)的獨特模式。
2、質(zhì)譜分析法(FAB-MASS)對活性物質(zhì)α和β還進行了質(zhì)譜分析法(FAB-MASS)分析。
將活性物質(zhì)α和β單獨地溶解在3-硝基芐醇中并經(jīng)過質(zhì)譜分析法測定。結(jié)果示于圖7(活性物質(zhì)α)和圖8(活性物質(zhì)β)中。如圖所示，每種活性物質(zhì)在551的質(zhì)荷比(m/z)下產(chǎn)生出分子離子(M+H)+，且每一種均顯示具有550分子量。
3、NMR(1H-NMR，13C-NMR)光譜測定。
對活性物質(zhì)α和β進行了NMR(1H-NMR，13C-NMR)光譜分析。具體來說，采用DMSO-D6溶劑在DMX-750(1H-NMR)和DMX-500(13C-NMR)(BRUKER BIOSPIN)上進行了NMR分析。
1H-NMR光譜測定的結(jié)果示于圖9(活性物質(zhì)α)和圖10(活性物質(zhì)β)中，13C-NMR光譜測定的結(jié)果示于圖11(活性物質(zhì)α)和圖12(活性物質(zhì)β)中。
活性物質(zhì)α和β的1H-NMR和13C-NMR光譜的信號數(shù)相近并顯示出極為相近的化學位移和信號分裂方式，表明兩種化合物間高度的結(jié)構(gòu)相似性。
4、結(jié)構(gòu)確定如上所述，分離出的活性物質(zhì)α和β的UV分光光度測定、質(zhì)譜分析法和NMR光譜分析結(jié)果表明這兩種化合物是以下化學式所示化合物的立體異構(gòu)體 已顯示活性物質(zhì)α和β的結(jié)構(gòu)式分別表示為以下化學式(II)和(III)
通過圓二色性曲線分析確定了每一種立體異構(gòu)體的絕對構(gòu)型。在JASCOJ-725分光偏振計上采用甲醇溶劑獲得了活性物質(zhì)α和β的圓二色性譜。
表明本發(fā)明的活性物質(zhì)α和β分別具有圖13和14所示圓二色性譜的絕對構(gòu)型。
實施例3基于其對小鼠胃排空的刺激活性，對分離/鑒別出的活性物質(zhì)α和β對胃腸運動性的刺激能力進行了評估。
1、方法采用胃管，在18小時禁食期后對ddy系小鼠(每組中10頭動物)分別經(jīng)口給服蒸餾水，活性物質(zhì)α和β。在服用60分鐘后，采用相同的技術對每只動物經(jīng)口給服試驗飼料(0.2ml/動物；含有0.05％酚紅的1.5％甲基纖維素溶液)。15分鐘后，通過頸部脫位殺死動物并取出胃。然后在10ml的0.1N NaOH中將胃及其內(nèi)容物一起勻漿并在室溫下使勻漿物靜置1小時。向1ml得到的上清液中，加入0.1ml 20％的三氯乙酸并離心該上清液以沉淀蛋白質(zhì)。隨后，收集了0.5ml得到的上清液并加入0.5ml 0.5N的NaOH以使溶液顯色。測量溶液在560nm的吸收度以確定保留在胃中的酚紅的量。通過以下方程確定胃排空率
胃排空率(％)＝(A-B)/A×100其中‘A’是剛剛服用試驗飼料后胃中的酚紅量；‘B’是服用試驗飼料15分鐘后保留在胃中的酚紅量。
2、結(jié)果如圖15所示，用平均值和標準誤差表征每一組的結(jié)果，采用斯氏t檢驗對其進行顯著性差異測試。
從圖中所示的結(jié)果可以看出，活性物質(zhì)α(0.1和0.3mg/kg)和活性物質(zhì)β(0.3和1.0mg/kg)中的每一種均顯著地以劑量-依賴方式刺激了胃排空(P＜0.05)，表明每種物質(zhì)都具有對胃腸運動性的強刺激能力。
在各種生理活動中毒蠅堿M3受體所起的顯著作用清楚地表明每一種本發(fā)明的物質(zhì)不僅能刺激胃腸運動性，還能刺激泌尿、胃酸分泌和食欲。
實施例4使富含活性物質(zhì)α和β源的多種天然存在物質(zhì)按照實施例1的方式經(jīng)過相同的提純過程和HPLC分析以獲得含有天然活性物質(zhì)的組合物。
對每種物質(zhì)的甲醇提取物進行冷凍干燥，然后溶解在純水中。使每種溶液經(jīng)過弱酸性陽離子交換色譜和凝膠過濾色譜，以與實施例1相同的方式通過HPLC分析得到的級分(kd＝3-5和kd＝7-9)。從保留時間和峰面積測定了活性物質(zhì)的存在和濃度。
結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大麥芽-發(fā)芽的大麥的一種分級分離產(chǎn)物含有活性物質(zhì)。
圖16顯示了從大麥芽提取物獲得的級分(kd＝7-9)的HPLC分析圖。
如圖中箭標所示，在33-34分鐘的保留時間以單峰形式檢測到活性物質(zhì)。
通過向該級分(kd＝7-9)中加入實施例1中分離出的活性物質(zhì)β并使溶液通過HPLC分析，證實得到的峰相互重疊且大麥芽中存在活性物質(zhì)β。近似地，對kd為3-5的級分進行分析證實了大麥芽中存在活性物質(zhì)α。同樣，使大麥芽提取物經(jīng)過HPLC提純工藝以分離出活性物質(zhì)α和β，然后使它們經(jīng)過UV分光光度測定法、質(zhì)譜分析法和NMR光譜測定，證實這些光譜與實施例2中得到的光譜一致。
從各自峰的面積還測定了大麥芽中活性物質(zhì)各自的濃度，發(fā)現(xiàn)大麥芽含有高濃度(分別為約0.05mg和0.5mg/1g大麥芽)的活性物質(zhì)α和β。
大麥芽-發(fā)芽的大麥的一種分級分離產(chǎn)物含有本發(fā)明的活性物質(zhì)，該事實暗示著活性物質(zhì)在發(fā)芽的大麥分級分離產(chǎn)物的其它成分中的存在，該成分包括麥麩、淀粉層(胚乳)、谷殼和外種皮、葉芽、幼根、糊粉層和細根以及大麥和發(fā)芽的大麥。
上述討論證實含有天然活性物質(zhì)(即活性物質(zhì)α和β)的多種組合物/添加劑可以通過使大麥芽和相關材料(例如發(fā)芽的大麥的分級分離產(chǎn)物、大麥和發(fā)芽的大麥)經(jīng)過上述的提取/分離工藝來獲得。
實施例5為了測定含有活性物質(zhì)的大麥芽提取物是否具有刺激胃腸運動性的能力，按照Magnus法檢測了提取物對豚鼠回腸縱肌收縮的作用。
具體而言，將從Hartley系雄性豚鼠回腸收集的一定長度的縱肌懸掛在傳感器上，同時浸沒在Krebs-Ringer溶液中。將溶液保持在35℃并用95％O2/5％CO2氣飽和來進行穩(wěn)定。該裝置是為每一種以下材料準備的用作試驗產(chǎn)品的大麥芽提聚物干燥產(chǎn)物(IC50＝0.20×10-3g/ml，其中IC50定義為50％標準配體與M3受體的結(jié)合被抑制時的抑制劑濃度(參見參考實施例1))；用作對照的啤酒干燥產(chǎn)物(IC50＝2.00×10-3g/ml，IC50如參考實施例1所定義)；和用作陽性對照的氨甲酰膽堿。記錄每套裝置中縱肌的運動，且一旦實現(xiàn)穩(wěn)定的自發(fā)運動，則向每套裝置中的肌肉施用每一種試驗產(chǎn)品、對照和陽性對照，并測量每塊肌肉的收縮。
結(jié)果示于圖17中。從圖中可以看出，大麥芽提取物的干燥產(chǎn)物在0.005-0.5mg/ml的濃度范圍內(nèi)以劑量-依賴的方式引起豚鼠回腸縱肌的收縮。假設氨甲酰膽堿(5×10-3M)引起的收縮為100，大麥芽提取物干燥產(chǎn)物顯示出高達約20倍于作為對照的干燥啤酒產(chǎn)物的活性。
這些觀測結(jié)果表明含有活性物質(zhì)的大麥芽提取物具有對胃腸運動性的強刺激能力。
實施例6人類的感官試驗在該實施例中，制備了作為本發(fā)明食品和飲料的實例的飲料(酒精飲料)，其含有刺激胃腸運動性的組合物，所述組合物從含有本發(fā)明活性物質(zhì)(即活性物質(zhì)α和β)的天然產(chǎn)物和經(jīng)加工的天然產(chǎn)物獲得。對該飲料評估其刺激胃腸運動性和泌尿的能力。
1、酒精飲料的制備在實施例4中，我們證實了大麥芽含有天然活性物質(zhì)(即活性物質(zhì)α和β)?；谶@一發(fā)現(xiàn)，制備了含有以大麥芽水提取物(大麥芽的水溶性級分)形式獲得的特定組合物的酒精飲料。所用的組合物為約30g干燥產(chǎn)物，其制備如下粉碎約150g大麥芽，接著用純水提取并過濾(約20％的產(chǎn)率(w/w)；相當于約22.5mg活性物質(zhì)α和約75mg活性物質(zhì)β)。
按以下方式制備了作為李子味酒精飲料的試驗產(chǎn)品1，其含5％的酒精將850ml 59％的酒精、100ml濃縮了5倍的澄清李汁、200g糖、20g檸檬酸、6ml香料和30g上述組合物(即大麥芽的水提取物)混合在一起，并加入純水直至最終體積為10L。對該混合物加熱滅菌，冷卻后，加入加壓的二氧化碳。將混合物灌入250ml的罐中并將該罐密封。最終產(chǎn)物含有分別為約2.25mg/L和7.5mg/L的活性物質(zhì)α和β。
還制備了不含所述組合物的類似酒精飲料并指定為對照產(chǎn)品1。
2、感官試驗在人類受試者中評估試驗產(chǎn)品1和對照產(chǎn)品1刺激胃腸運動性和泌尿的能力。按以下方式進行評估。
將20名健康的男性受試者分成分別為10人的兩組。一組指定為試驗產(chǎn)品1，另一組為對照產(chǎn)品1。按照雙盲法進行試驗。在兩周的間隔后將兩組進行交換。
讓受試者以2.4ml/kg/15分鐘的速度消費試驗產(chǎn)品1或?qū)φ债a(chǎn)品1兩小時。還讓受試者以0.2g/kg/15分鐘的速度消費2小時的薯片。
為評估每種產(chǎn)品刺激胃腸運動性的能力，在60和120分鐘后請受試者評定胃膨脹的程度并將評定結(jié)果寫下來。
3、評估標準1)按以下尺度評定胃膨脹程度胃感覺膨脹 3分胃感覺有點膨脹 2分完全或幾乎沒有膨脹感 1分
2)為評估每種產(chǎn)品刺激泌尿的能力，讓受試者在試驗前排尿并在試驗過程中每30分鐘請他們?nèi)バl(wèi)生間并測量尿液體積。
4、結(jié)果胃膨脹感的評估結(jié)果示于下表1中。
表1

從以上結(jié)果可以看出，許多攝入了試驗產(chǎn)品1的受試者在60分鐘后幾乎或完全沒有感覺胃膨脹，在120分鐘后，很少人感覺明顯胃脹，許多人僅感覺稍許胃脹。
作為對比，許多飲用了對照產(chǎn)品1的受試者在60分鐘后開始感到稍許胃脹，120分鐘后感覺明顯胃脹。
這些結(jié)果說明含有含本發(fā)明活性物質(zhì)的組合物的試驗產(chǎn)品1，具有抑制胃膨脹感程度和刺激胃腸運動性的顯著能力。
圖18顯示了30、60、90和120分鐘后尿液體積的測量結(jié)果(平均值)。
結(jié)果說明，在各自的時間點，飲用試驗產(chǎn)品1小組的尿液體積顯著高于飲用對照產(chǎn)品1的小組。
這證明本發(fā)明的物質(zhì)不僅具有刺激胃腸運動性的能力，還具有刺激泌尿的能力，這通過各種生理活動中涉及的毒蠅堿M3受體表現(xiàn)出來。
實施例7已知活性物質(zhì)(即活性物質(zhì)α和β)具有刺激胃腸運動性和泌尿能力，我們檢測了活性物質(zhì)在小鼠中提高可飲用性的能力。
1、方法具體而言，通過向3％的糖水溶液中加入與實施例6相同的組合物(大麥芽的水提取物組合物)至與實施例6相同的最終濃度(3g/升大麥芽水提取物)，制備了非酒精飲料。將該飲料指定為試驗產(chǎn)品2(最終產(chǎn)品含有約2.25mg活性物質(zhì)α和約7.5mg活性物質(zhì)β)。以不含活性物質(zhì)的3％糖水溶液形式制備了另一種非酒精飲料并指定為對照產(chǎn)品2。
讓兩組大鼠(每組中3只動物)單獨自由地用每種試驗產(chǎn)品2和對照產(chǎn)品2來喂養(yǎng)，測量5天攝取的水量。
2、結(jié)果圖19顯示了在進行評估的每個期間用試驗產(chǎn)品2或?qū)φ债a(chǎn)品2喂養(yǎng)的每只大鼠攝取的水量平均值(即第一天-第二天、第二天-第三天、第三天-第四天和第四天-第五天)。
從結(jié)果可以看出，在每個評估期中，用試驗產(chǎn)品2喂養(yǎng)的小組的水消耗量顯著大于用對照產(chǎn)品2喂養(yǎng)的小組。
這些結(jié)果表明本發(fā)明的活性物質(zhì)，在刺激胃腸運動性的能力之外，還具有提高可飲用性的能力?；钚晕镔|(zhì)的這一能力不僅使加入該物質(zhì)的飲料能夠被大量地飲用并仍能保持鮮爽，其還能夠影響飲料本身的鮮爽度。在本實施例中，表明本發(fā)明的活性物質(zhì)能夠賦予加入該活性物質(zhì)的飲料以這種有利的特性。
實施例8人類食品和飲料攝取行為的對比作為發(fā)酵酒的例子制備了含有本發(fā)明組合物(即大麥芽的水提取物組合物)的啤酒，所述組合物含有活性物質(zhì)，并觀測了其在人類受試者中的攝取行為。
采用麥芽、啤酒花、含活性物質(zhì)的組合物(即大麥芽的水提取物組合物)和水作為原料，按照常規(guī)技術制備啤酒制備了100L的成分并使其經(jīng)過發(fā)酵和過濾。將得到的產(chǎn)品灌裝到容器中。更具體而言，在發(fā)酵桶中加工15kg粉碎的麥芽，將淀粉轉(zhuǎn)化成糖，并將上述組合物(0.4kg，相當于2kg大麥芽)作為次級原料加入。將得到的材料在過濾容器中過濾。隨后，加入啤酒花并在蒸煮容器中將得到的材料煮沸。在稱作回轉(zhuǎn)池的沉淀容器中除去形成的沉淀。向得到的澄清溶液中加入酵母使溶液發(fā)酵并在1℃下貯存。
隨后，過濾發(fā)酵的溶液除去酵母。這得到酒精含量約為4％的發(fā)酵酒(指定為試驗產(chǎn)品3。最終產(chǎn)品含有活性物質(zhì)α和β的量分別為約3.0mg/L和約10.0mg/L)。還制備了用作對照的不含大麥芽的類似啤酒(指定為對照產(chǎn)品3)。
按照與雙盲法結(jié)合的交叉試驗法進行食品和飲料攝取行為的對比。具體而言，將20名受試者分成兩組，在2小時內(nèi)，讓每組都自由地飲用含大麥芽的啤酒和不含大麥芽的啤酒的每一種，同時食用特定的食物，想吃多少就吃多少。2小時后，監(jiān)測啤酒消費量的變化并測量剩余食物的量。具體而言，提供的食物組成如下在0分鐘時為各種開胃品、豆腐和生魚片，在30分鐘時為肉排，在60分鐘時為烤茄子和炸豆腐，在90分鐘時為米飯、湯和水果。每30分鐘測量啤酒的消耗量，共計120分鐘。
圖20中顯示了啤酒消費量的平均值。結(jié)果表明加入了含活性物質(zhì)的組合物(即大麥芽水提取物組合物)的啤酒(試驗產(chǎn)品3)的消費量比不含該組合物的啤酒(對照產(chǎn)品3)大，說明試驗產(chǎn)品3的可飲用性更高。
2小時后剩余食物顯示于下表2中。
表2

從結(jié)果可以看出，攝取試驗產(chǎn)品3的小組的剩余食物的量明顯少于攝取對照產(chǎn)品3的小組。這表明試驗產(chǎn)品3具有刺激食欲的能力。
這些觀測結(jié)果集中地表明含有含活性物質(zhì)的組合物的飲料具有提高可飲用性和刺激人類食欲的能力。
現(xiàn)在參考實施例描述本發(fā)明，其中檢測了含有本發(fā)明活性物質(zhì)的飲料和藥物前體。
實施例9無酒精飲料的制備作為一類無酒精飲料，按照常規(guī)方法制備了果汁基“類水(nearwater)”產(chǎn)品將果汁、檸檬酸、糖、香料和含有活性物質(zhì)的組合物(即大麥芽水提取物組合物)混合在一起，得到最終1000ml的體積。將混合物滅菌，然后灌裝到容器中。更具體而言，稱量40g的砂糖并將其在50℃溶解在純水中。向該溶液中，和0.15g檸檬酸、3g本發(fā)明組合物、2ml香料和0.25g L-抗壞血酸一道，加入各種濃縮的濃果汁(例如，橙汁(5倍濃縮)和蘋果汁(4倍濃縮))，接著通過加入水將混合物最終體積調(diào)節(jié)到1000ml(根據(jù)未濃縮果汁濃度測量為1％)。在100℃對得到的混合物實施20分鐘巴氏滅菌，將100ml等分試樣裝入110ml的透明瓶中，密封所述瓶得到含有各種果汁的類水產(chǎn)品(1％果汁；最終產(chǎn)物含有的活性物質(zhì)α和β分別為約2.25mg/L和約7.5mg/L)。
實施例10茶基飲料的制備將0.3L綠茶葉子、0.3g碳酸氫鈉和含有活性物質(zhì)的組合物(即大麥芽水提取物組合物)混合在一起并加入純水將溶液總體積調(diào)節(jié)至1L。然后將溶液加熱至85℃并灌裝到190g的罐中。然后在罐頭滅菌瓶(125℃，90分鐘)對溶液滅菌，制成罐裝飲料(最終產(chǎn)物含有的活性物質(zhì)α和β的量分別為約0.25ml和約0.75ml)。
實施例11保健食品用純水提取約1.5kg大麥芽并通過陽離子交換色譜和ODS-HPLC提純提取物，得到約3g粗產(chǎn)物(產(chǎn)率約為0.2％(w/w))。該產(chǎn)物含有的活性物質(zhì)α和β分別為約250mg和約750mg)。
隨后，將50mg該粗產(chǎn)物、120g乳糖和30mg結(jié)晶纖維素混合在一起制備封裝的保健食品膠囊，每個膠囊含有200mg內(nèi)容物(最終產(chǎn)物含有的活性物質(zhì)α和β的量分別為約4.17mg/膠囊和約12.5mg/膠囊)。
實施例12藥品前體用純水對約150kg大麥芽進行提取并通過陽離子交換色譜、凝膠過濾色譜和ODS-HPLC提純提取物，并經(jīng)過干燥形成固體產(chǎn)物。將干燥產(chǎn)物溶解在蒸餾水中并對溶液滅菌、過濾，然后經(jīng)超濾得到約45g純度為約99％(按HPLC分析測定)的活性物質(zhì)α提純產(chǎn)物。
工業(yè)應用性如前所述，本發(fā)明提供了從啤酒中分離出的并能夠通過作用于毒蠅堿M3受體來刺激胃腸運動性的物質(zhì)，和/或能夠提高可飲用性的物質(zhì)。所述物質(zhì)可以以得自含有該物質(zhì)的天然產(chǎn)物或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物的組合物或提純產(chǎn)物的形式獲得。然后可以將所述復合物或提純產(chǎn)物用作食品和飲料的添加劑，以賦予所述產(chǎn)物刺激胃腸運動性的能力。
本發(fā)明的物質(zhì)能夠作用于毒蠅堿M3受體以刺激胃腸運動性，可以將其用來有效地刺激厭食癥、消化不良、餐后飽脹感、胃重感、惡心、嘔吐、上腹部痛和其它胃腸運動性下降引起的胃腸癥狀的患者的胃腸運動性。其提高可飲用性的能力能夠刺激食欲以及可飲用性。
而且，含有能夠刺激胃腸運動性和/或提高可飲用性物質(zhì)的組合物可以用來提供各種飲料和功能食品。因而，該組合物具有重要的應用價值。
權利要求
1.以下化學式(I)表征的化合物
2.以下化學式(II)表征的化合物
3.以下化學式(III)表征的化合物
4.從酵母發(fā)酵產(chǎn)物、大麥、發(fā)芽的大麥或發(fā)芽的大麥的分級分離產(chǎn)物分離出的權利要求1、2或3的化合物。
5.權利要求4的化合物，其中發(fā)芽的大麥的分級分離產(chǎn)物是大麥芽。
6.權利要求1-5中任意一項的化合物，其通過作用于毒蠅堿M3受體表現(xiàn)出其活性。
7.權利要求6的化合物，其中經(jīng)由毒蠅堿M3受體引起的化合物的活性是刺激胃腸運動性、胃酸分泌、泌尿或食欲或提高可飲用性的能力。
8.一種食品或飲料、食品或飲料的添加劑、藥品或動物飼料，其特征在于含有含權利要求1-7中任意一項的化合物的天然產(chǎn)物或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物。
9.權利要求8的食品或飲料、食品或飲料的添加劑、藥品或動物飼料，其中含有權利要求1-7中任意一項的化合物的天然產(chǎn)物或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物是酵母發(fā)酵產(chǎn)物、大麥、發(fā)芽的大麥或發(fā)芽的大麥的分級分離產(chǎn)物。
10.權利要求8的食品或飲料、食品或飲料的添加劑、藥品或動物飼料，其中含有權利要求1-7中任意一項的化合物的天然產(chǎn)物或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物是大麥芽或大麥芽的加工產(chǎn)物。
11.經(jīng)由毒蠅堿M3受體表現(xiàn)其活性的組合物，其特征在于其含有權利要求1-7中任意一項的化合物或含該化合物的天然產(chǎn)物或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物。
12.權利要求11的組合物，其中經(jīng)由毒蠅堿M3受體引起的活性是刺激胃腸運動性、胃酸分泌、泌尿或食欲或提高可飲用性的能力。
13.權利要求11的組合物，其能夠刺激胃腸運動性和/或提高可飲用性。
14.權利要求11-13中任意一項的組合物，其中含有權利要求1-7中任意一項的化合物的天然產(chǎn)物或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物是酵母的發(fā)酵產(chǎn)物、大麥、發(fā)芽的大麥或發(fā)芽的大麥的分級分離產(chǎn)物。
15.權利要求11-13中任意一項的組合物，其中含有權利要求1-7中任意一項的化合物的天然產(chǎn)物或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物是大麥芽或大麥芽的加工產(chǎn)物。
16.一種食品或飲料，其含有權利要求1-7中任意一項的化合物、含有所述化合物的天然產(chǎn)物或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物或組合物。
17.權利要求16的食品或飲料，其是酒精飲料或非酒精飲料。
18.權利要求16的食品或飲料，其是發(fā)酵麥芽飲料。
19.權利要求18的食品或飲料，其中所述發(fā)酵麥芽飲料是啤酒、低度麥芽啤酒(low malt beer)或低酒精發(fā)酵麥芽飲料。
20.權利要求18的食品或飲料，其是茶基飲料。
21.權利要求16-20的食品或飲料，其中該食品或飲料成品含有0.01mg/L-100mg/L的權利要求1-7中任意一項的化合物。
22.權利要求16的食品或飲料，其是保健食品和/或?qū)ｉT設計的食品。
23.一種食品或飲料添加劑或藥品，其含有權利要求1-7中任意一項的化合物、含有所述化合物的天然產(chǎn)物或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物或組合物。
24.權利要求23的食品或飲料添加劑或藥品，其能夠作用于毒蠅堿M3受體。
25.權利要求1-7中任意一項的能作用于毒蠅堿M3受體的化合物，含有該化合物的天然產(chǎn)物、經(jīng)加工的天然產(chǎn)物或組合物在食品或飲料、食品或飲料添加劑、藥品或動物飼料的制備或胃腸運動性刺激劑或可飲用性增強劑的制備中的應用，其中所述食品或飲料、食品或飲料添加劑、藥品或動物飼料具有刺激胃腸運動性、胃酸分泌、泌尿或食欲的能力或提高可飲用性的能力。
26.權利要求25的應用，其特征在于含有能夠通過毒蠅堿M3受體刺激胃腸運動性的物質(zhì)的天然產(chǎn)物或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物是酵母發(fā)酵產(chǎn)物、大麥、發(fā)芽的大麥、發(fā)芽的大麥的分級分離產(chǎn)物或大麥芽。
27.分離/離析權利要求1-3中任意一項的化合物的方法，其包括以下步驟制(準)備含有權利要求1-7中任意一項的化合物的天然產(chǎn)物或經(jīng)加工的天然產(chǎn)物作為原料；當原料是固體產(chǎn)物時，經(jīng)由提取/固液分離/干燥工藝除去揮發(fā)性成分，當原料是液體產(chǎn)物時，經(jīng)由干燥工藝除去揮發(fā)性成分，由此收集非揮發(fā)性成分；使所述非揮發(fā)性成分經(jīng)過采用疏水吸附劑(例如合成吸附劑)的色譜，除去未被吸附的成分并收集被吸附的成分作為含有濃縮活性物質(zhì)的粗級分；使所述粗級分經(jīng)過陽離子交換色譜(例如弱酸性陽離子交換樹脂)以除去未被吸附的成分；用酸性甲醇(甲醇/鹽酸)洗提活性物質(zhì)；使洗脫液經(jīng)過采用0.01N鹽酸的凝膠過濾色譜以獲得提純的級分；和使提純的級分經(jīng)過ODS-HPLC(C18-高效液相色譜)以進一步提純。
28.權利要求27的方法，其特征在于所述原料是酵母發(fā)酵產(chǎn)物、大麥、發(fā)芽的大麥、發(fā)芽的大麥的分級分離產(chǎn)物或大麥芽。
29.權利要求2的化合物，其顯示出圖13的圓二色性譜。
30.權利要求3的化合物，其顯示出圖14的圓二色性譜。
全文摘要
能夠刺激消化道運動的物質(zhì)，包含式(I)的化合物(互為立體異構(gòu)體的活性物質(zhì)α和活性物質(zhì)β)，該物質(zhì)衍生自天然產(chǎn)物，因而不會造成副作用，即使在長期連續(xù)應用時也是高度安全的并可以廣泛用作飲食品的添加劑等；和含有包含所述刺激性物質(zhì)的添加劑的飲食品。特別地，經(jīng)過分離和提純從啤酒獲得的能夠作用于毒蠅堿M
文檔編號A61P13/02GK1665798SQ03815179
公開日2005年9月7日 申請日期2003年6月26日 優(yōu)先權日2002年6月26日
發(fā)明者諏訪芳秀, 藤居亙, 堀妃佐子, 橫尾芳明, 糠谷東雄, 辻邦郎 申請人:三得利株式會社