專利名稱：DNA重組酶Cre基因的改造、重組蛋白表達(dá)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程，具體地說(shuō)，涉及Cre重組酶突變體的構(gòu)建及在胰島beta細(xì)胞標(biāo)記中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
成年胰腺中存在一種自發(fā)的再生現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，胰腺beta細(xì)胞在正常生理狀態(tài)下，不斷進(jìn)行著低水平分裂和死亡。在一些特殊生理(如肥胖、妊娠、胰島素阻抗)和病理 (如胰腺損傷、毒素作用)壓力下，胰腺細(xì)胞包括beta細(xì)胞都會(huì)有一定程度的再生。通過(guò)研究各種胰腺再生動(dòng)物模型(如注射連脲霉素、胰管結(jié)扎、胰腺部分切除)，一些觀點(diǎn)認(rèn)為新生的beta細(xì)胞由胰腺祖細(xì)胞分裂分化而來(lái)。這一結(jié)論與形態(tài)學(xué)上的研究相一致，許多新生的胰島或胰島素陽(yáng)性細(xì)胞與胰管結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因此，一部分胰管細(xì)胞有可能是腺祖細(xì)胞。然而，另外一些研究，利用可誘導(dǎo)的Cre-1oxP系統(tǒng)，特異性地將beta細(xì)胞標(biāo)記上堿性磷酸酶。 這些譜系追蹤研究表明新生beta細(xì)胞是從已有的beta細(xì)胞通過(guò)分裂而形成的。目前在新生beta細(xì)胞的來(lái)源及其再生機(jī)制上都有嚴(yán)重分歧，很大部分原因是目前的細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)可能存在一些缺陷，從而也就無(wú)法確定beta細(xì)胞再生的來(lái)源。
目前已建立了多種細(xì)胞標(biāo)記與追蹤技術(shù)，如熒光染料PKH26和Dil可以通過(guò)疏水作用插入到細(xì)胞膜的脂雙層，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞膜的標(biāo)記；核苷類似物5-溴脫氧尿嘧啶核苷 (BrdU)，可以插入分裂細(xì)胞的基因組，然后通過(guò)抗BrdU抗體加以檢測(cè)；報(bào)告基因GFP、β半乳糖苷酶、熒光素酶等被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞標(biāo)記。為實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的永久性標(biāo)記則需要改變基因組的結(jié)構(gòu)，如利用慢病毒將報(bào)告基因插入染色體。目前最常見(jiàn)的是利用Cre-1oxP系統(tǒng)進(jìn)行永久性基因組DNA改變，并實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的標(biāo)記。
Cre是一種來(lái)源于卩遼菌體Pl的重組酶,其名稱來(lái)源于Causes of recombination, 屬于λ整合酶超基因 家族。Cre基因的表達(dá)產(chǎn)物為343個(gè)氨基酸的單聚體蛋白，分子量為 38kDa,能對(duì)兩個(gè)特異位點(diǎn)(IoxP)之間的DNA序列進(jìn)行重組。整合酶家族重組酶的共同特點(diǎn)是這些酶均由單個(gè)多肽構(gòu)成，作用于核苷酸序列時(shí)，不需要其它輔助因子的參與，也不額外消耗能量。
LoxP (locus of X-over Pl)序列來(lái)源于Pl卩遼菌體，由兩個(gè)13bp反向重復(fù)序列和 8bp中間間隔序列共同組成，8bp的間隔序列同時(shí)也確定了 LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過(guò)程中與DNA共價(jià)結(jié)合，13bp的反向重復(fù)序列是Cre酶的結(jié)合域。其序列如下5’ - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3’3’ - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5’兩個(gè)LoxP之間的方向和位置可以決定重組后的三種結(jié)果刪除、翻轉(zhuǎn)、或整合。如果兩個(gè)Loxp位點(diǎn)同向且位于一條DNA鏈上，那么Cre重組酶將切除它們之間的序列；如果這兩個(gè)Loxp位點(diǎn)反向位于一條DNA鏈上,它們之間的序列方向發(fā)生倒轉(zhuǎn)；如果LoxP位點(diǎn)位于不同的DNA鏈，兩條DNA鏈將通過(guò)LoxP位點(diǎn)進(jìn)行整合。
在胰腺發(fā)育研究中，Melton實(shí)驗(yàn)室采用基于Cre-1oxP重組系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠以標(biāo)記胰島beta細(xì)胞。這個(gè)系統(tǒng)需要構(gòu)建兩個(gè)品系轉(zhuǎn)基因小鼠，一個(gè)攜帶了融合了突變型雌激素受體(ER)的重組酶CreER，由胰島素啟動(dòng)子控制其表達(dá)，在沒(méi)有誘導(dǎo)物時(shí)，重組酶定位在胞衆(zhòng)中，如加入Tamoxifen, CreER則進(jìn)入細(xì)胞核；另一個(gè)品系攜帶由組成型啟動(dòng)子(CMV) 控制的一段終止序列和報(bào)告基因，在終止序列前后有兩個(gè)同向IoxP位點(diǎn)。在無(wú)Cre酶存在的情況下，報(bào)告基因因終止序列的存在而不能表達(dá)。當(dāng)兩個(gè)品系的小鼠雜交，其后代小鼠的 beta細(xì)胞表達(dá)重組酶CreER,在誘導(dǎo)物Tamoxifen的作用下，CreER進(jìn)入細(xì)胞核，并切除兩個(gè)IoxP位點(diǎn)之間的終止序列，報(bào)告基因得以表達(dá)，實(shí)現(xiàn)beta的永久標(biāo)記，即無(wú)論被標(biāo)記的 beta細(xì)胞表型如何變化，報(bào)告基因始終表達(dá)。Melton研究組利用該項(xiàng)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，生理?xiàng)l件下及病理?xiàng)l件下新產(chǎn)生的beta細(xì)胞來(lái)自已有的beta細(xì)胞的分裂，而不是來(lái)自胰腺干細(xì)胞的分化。
但是這個(gè)系統(tǒng)有幾項(xiàng)缺陷，一是對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高，需要構(gòu)建兩個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠品系；二是只能實(shí)現(xiàn)一種細(xì)胞的標(biāo)記，如前述實(shí)驗(yàn)中只標(biāo)記胰島素陽(yáng)性細(xì)胞，而不標(biāo)記胰島素陰性細(xì)胞，因而無(wú)法直接地明確回答新生beta細(xì)胞是否也有來(lái)自胰腺干細(xì)胞的分化；三是CreER的誘導(dǎo)并非絕對(duì)特異，即在沒(méi)有加入誘導(dǎo)物時(shí)，也會(huì)有少量的重組酶進(jìn)入細(xì)胞核， 這也許是其他研究組利用同樣的技術(shù)卻得到不同的結(jié)論的原因；四是RIP的組織特異性在 Cre酶的放大作用下有所減弱，詳細(xì)情況將在后面實(shí)驗(yàn)部分?jǐn)⑹觥?br> 由于目前的的Cre-LoxP系統(tǒng)在進(jìn)行組織特異性標(biāo)記時(shí)(如胰島beta細(xì)胞)，具有費(fèi)時(shí)費(fèi)力，及產(chǎn)生非特異性等特點(diǎn)，因此，本發(fā)明旨在通過(guò)改造Cre重組酶，增強(qiáng)RIP的組織特異性，并構(gòu)建一個(gè)雙質(zhì)粒的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞的標(biāo)記系統(tǒng)。發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一種酶活性減弱的Cre突變體，從而提高RIP的組織特異性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述酶活性減弱的Cre突變體的構(gòu)建方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供DNA重組酶活力減弱的重組蛋白的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過(guò)如下途徑實(shí)現(xiàn)的通過(guò)PCR技術(shù)，對(duì)DNA重組酶Cre的基因進(jìn)行改造，即將其173位點(diǎn)的精氨酸改變?yōu)榻M氨酸，獲得Cre (R173H)。
本發(fā)明對(duì)DNA重組酶Cre的基因進(jìn)行改造，其所述Cre (R173H)突變體173位點(diǎn)組氨酸的核苷酸序列為CGT。
本發(fā)明對(duì)DNA重組酶Cre的基因進(jìn)行改造，按如下步驟進(jìn)行i·根據(jù)Cre重組酶173位點(diǎn)的核苷酸序列合成兩條單鏈寡核苷酸作為PCR用引物，ii·以 pRIP-Cre 為模板，PCR 采用 TAKARA 試劑盒 PrimStar Mix ；ii1.將PCR產(chǎn)物自連，轉(zhuǎn)染感受態(tài)菌株T0P10，擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，獲得點(diǎn)突變的 pRIP-Cre (R173H);經(jīng)測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)染胰島beta細(xì)胞NIT-1。
本發(fā)明對(duì)DNA重組酶Cre進(jìn)行二次基因改造，其特征在于所述點(diǎn)突變PCR引物核苷酸序列為前引物 5' -AACACCCTGTTACATATAGCCGAAATT-3'，后引物 5' -ATAAGCAATCCCCAGAAATGCCA-3'本發(fā)明進(jìn)一步提供用作細(xì)胞標(biāo)記的報(bào)告載體。
具體地，本發(fā)明提供一個(gè)選擇性表達(dá)報(bào)告基因DsRed或EGFP的載體。其特征在于包括如下步驟采用限制性酶切技術(shù)分別獲得CMV啟動(dòng)子、dsRed和EGFP序列元件；通過(guò)寡聚核苷酸合成Cre酶的作用位點(diǎn)IoxP ;采用亞克隆技術(shù)將上述各元件組裝成一個(gè)細(xì)胞標(biāo)記載體，所述載體具有如下順序排列的原件CMV-loxP2-DsRed-loxP-EGFP。
進(jìn)一步地，本發(fā)明將上述胰島細(xì)胞標(biāo)記系統(tǒng)，即pRIP-Cre (R173H)和 pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP,轉(zhuǎn)入Ad293和NIT-1細(xì)胞，48小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記情況。經(jīng)熒光顯微鏡檢測(cè)，約30%的Ad293細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，無(wú)細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光；約10%的NIT-1 細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，其中的50%的細(xì)胞還同時(shí)呈現(xiàn)綠色熒光。上述結(jié)果證實(shí)胰島細(xì)胞標(biāo)記質(zhì)粒有效地標(biāo)記了胰島素陽(yáng)性細(xì)胞，即NIT-1細(xì)胞，但不標(biāo)記胰島素陰性細(xì)胞，即Ad293細(xì)胞。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果將pRIP-Cre和 pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP轉(zhuǎn)入Ad293細(xì)胞，48小時(shí)后呈現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞約占呈現(xiàn)紅色熒光的細(xì)胞的40%。因此，本發(fā)明首次在真核細(xì)胞中采用雙質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)胰島素陽(yáng)性細(xì)胞的標(biāo)記與追蹤，為研究胰島發(fā)育與beta細(xì)胞特異性基因治療方案的研制奠定了基礎(chǔ)。


圖1為本發(fā)明DNA重組酶Cre突變體Cre(R173H)的構(gòu)建方案圖。
圖2為本發(fā)明點(diǎn)突變PCR電泳鑒定結(jié)果圖。
圖3為本發(fā)明pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP的構(gòu)建方案圖。
圖4為本發(fā)明pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP的電泳鑒定結(jié)果圖。
圖5 為本發(fā)明用 pRIP-Cre 與 pCMV-loxP-DsRed/loxP-EGFP 共轉(zhuǎn)染 Ad293 和 NIT-1 細(xì)胞細(xì)胞48小時(shí)后的熒光鑒定圖。a: Ad293細(xì)胞紅色熒光照片；b: Ad293細(xì)胞綠色熒光照片；c: NIT-1細(xì)胞紅色熒光照片；d: NIT-1細(xì)胞綠色熒光照片。
圖6 為本發(fā)明用 pRIP-Cre 與 pCMV-DsRed/IoxP2-EGFP 共轉(zhuǎn)染 Ad293 和 NIT-1 細(xì)胞48小時(shí)后的EGFP陽(yáng)性細(xì)胞與DsRed陽(yáng)性細(xì)胞的比例統(tǒng)計(jì)鑒定 7 為本發(fā)明用 pRIP-Cre (R173H)與 pCMV-loxP-DsRed/loxP-EGFP 共轉(zhuǎn)染 Ad293 和NIT-1細(xì)胞細(xì)胞48小時(shí)后的熒光鑒定圖。a: Ad293細(xì)胞紅色熒光照片；b: Ad293細(xì)胞綠色熒光照片；c: NIT-1細(xì)胞紅色熒光照片；d: NIT-1細(xì)胞綠色熒光照片。
圖8 為本發(fā)明用 pRIP-Cre (R173H)與 pCMV-DsRed/IoxP2-EGFP 共轉(zhuǎn)染 Ad293 和 NIT-1細(xì)胞48小時(shí)后的EGFP陽(yáng)性細(xì)胞與DsRed陽(yáng)性細(xì)胞的比例統(tǒng)計(jì)鑒定圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例1 Cre突變體的構(gòu)建。
通過(guò)PCR進(jìn)行Cre的點(diǎn)突變，在后引物中將173位精氨酸的密碼子替換為組氨酸的密碼子，以pRIP-Cre質(zhì)粒為模板，進(jìn)行全長(zhǎng)質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化去除作為底物的PRIP-Cre質(zhì)粒，PCR產(chǎn)物自連后，轉(zhuǎn)化E. coli T0P10 (天根公司)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆接種含有抗生素的LB培養(yǎng)基，37° C振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，質(zhì)粒提取后經(jīng)測(cè)序鑒定，選取正確pRIP-Cre (R173H)。所述點(diǎn)突變PCR引物核苷酸序列為前引物 5' -AACACCCTGTTACATATAGCCGAAATT-3'，后引物 5' -ATAAGCAATCCCCAGAAATGCCA-3'所述點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增體系為模板(pRIP-Cre) 前引物(10 μΜ) 后引物(10 μΜ)50 ng2x Master Mix ddH2025 μ I 補(bǔ)至50 μ所述點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增條件為94 °C94 °C55 °C72 °C72 °C 3 min (40個(gè)循環(huán)) 30 s (40個(gè)循環(huán)) 30 s (40個(gè)循環(huán))60 s 5 min hold實(shí)施例2用作細(xì)胞標(biāo)記的報(bào)告載體的構(gòu)建。
利用限制性內(nèi)切酶PacI 和 MluI 切除 pCMV-DsRed-H19-RIP/LoxP2_EGFP (本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建)中的H19-RIP的片段，利用NEB公司的T4聚合酶補(bǔ)平末端，然后使載體自連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli T0P10 (天根公司)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆接種含有抗生素的LB培養(yǎng)基，于37° C振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，質(zhì)粒提取后經(jīng)測(cè)序鑒定，選取正確報(bào)告載體，即 pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP。
實(shí)施例3胰島素陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)記載體的功能驗(yàn)證。
轉(zhuǎn)染前一天接種Ad293和NIT-1細(xì)胞，約16_20小時(shí)細(xì)胞約鋪滿培養(yǎng)板的70 %面積，且細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。于一個(gè)0.5 ml離心管中加入0.5 yg的 pRIP-Cre 和 pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP，或加入 0. 5 yg 的 pRIP-Cre (R173H)和 pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP,加入無(wú)血清培養(yǎng)液將總體積補(bǔ)足至30 μ 1，混勻，加入2. 5 μ I的lipsome?；靹颍覝仂o置5-10分鐘，吸去培養(yǎng)板細(xì)胞中的培養(yǎng)液，向DNA-1ipsome 復(fù)合物中加入100 μ I完全培養(yǎng)液，混勻，馬上加入到細(xì)胞。細(xì)胞在正常生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)48 小時(shí)，然后于熒光顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)呈現(xiàn)紅色熒光及綠色熒光的細(xì)胞比例。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的，因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
<110〉汕頭大學(xué)
<120> DNA重組酶Cre突變體的構(gòu)建及應(yīng)用<130>26<140>2<150>Patent In Version 3.2<210>1<211>5779
權(quán)利要求
1.一種DNA重組酶活力減弱的重組蛋白，其特征在于所述重組蛋白是對(duì)DNA酶重組酶Cre的氨基酸序列進(jìn)行改造，將其173位點(diǎn)的精氨酸改造成組氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA重組酶活力減弱的重組蛋白，其特征在于所述重組蛋白173位點(diǎn)組氨酸的核苷酸序列為CGT。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA重組酶活力減弱的重組蛋白的表達(dá)方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行i ·根據(jù)Cre重組酶173位點(diǎn)的核苷酸序列合成兩條單鏈寡核苷酸作為PCR用引物， 以pRIP-Cre為模板； ·將PCR產(chǎn)物自連，轉(zhuǎn)染感受態(tài)菌株Τ0Ρ10，擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，獲得點(diǎn)突變的 pRIP-Cre (R173H)；ii1.經(jīng)測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)染胰島beta細(xì)胞NIT-1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA重組酶活力減弱的重組蛋白的表達(dá)方法，其特征在于 所述點(diǎn)突變PCR引物核苷酸序列為前引物 5' -AACACCCTGTTACATATAGCCGAAATT-3'，后引物 5' -ATAAGCAATCCCCAGAAATGCCA-3'。
5.權(quán)利要求3所述的DNA重組酶活力減弱的重組蛋白在胰島beta細(xì)胞標(biāo)記中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及DNA重組酶Cre氨基酸序列的改造和應(yīng)用，其是通過(guò)點(diǎn)突變技術(shù)將Cre基因第173位的精氨酸改變?yōu)榻M氨酸，上述Cre突變體由一個(gè)大鼠胰島素啟動(dòng)子(RIP)控制其在胰島beta細(xì)胞中的表達(dá)。另外，本發(fā)明對(duì)Cre突變體在胰島beta標(biāo)記中的應(yīng)用進(jìn)行了初步研究，利用Cre突變體及其作用位點(diǎn)loxP、CMV啟動(dòng)子、綠色熒光報(bào)告基因(EGFP)、及紅色熒光報(bào)告基因(DsRed)，組裝成一個(gè)雙質(zhì)粒的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞的標(biāo)記系統(tǒng)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK103013934SQ201110297620
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月27日
發(fā)明者魏熾炬, 范文竹, 李迪崢 申請(qǐng)人:汕頭大學(xué)