專利名稱：一種鴨瘟病毒檢測用引物組及其構成的lamp反應體系的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種鴨瘟病毒檢測用引物組及其構成的LAMP反應體系。
背景技術：
鴨瘟(Duck Plague，DP)，又名鴨病毒性腸炎，是由鴨腸炎病毒(Duck Enteritis virus, DEV)引起的鴨、鵝、天鵝等雁形目禽類的一種急性敗血性及高度致死性的病毒性傳染病。鴨瘟病毒屬皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科，球形有囊膜，直徑約為160 180 nm，衣殼為二十面體對稱，是一種泛嗜性感染的病毒(Kaleta，1990)。該病毒主要由核心(core)、 衣殼(capsid)、外膜(tegument)、囊膜(envelope)四部分組成，病毒核酸為線狀、雙股DNA。 衣殼的形態(tài)結構具有皰疹病毒的重要特征，它由162個相互連接呈放射狀排列且有中空軸孔的殼粒組成。核衣殼穿過宿主細胞核膜進入胞漿或其空泡中，外面包上一層由蛋白質組成的外膜，最后繞以囊膜形成成熟的子病毒(陳建君，2003)。病毒的囊膜表面無紅細胞凝集素，不具血凝特性和血細胞吸附作用。鴨瘟病毒對熱敏感，56 °C作用10 min會喪失感染力， 80 °C作用5 min即可死亡。此外，該病毒對乙醚和氯仿敏感。用胰蛋白酶和脂肪酶等處理能使病毒部分失活或者完全失活，在PH值為3的酸性和pH值為11的堿性環(huán)境中也很快失活。鴨瘟分布廣泛，具有傳播迅速、發(fā)病率高和死亡率大的特點。1923年Baudet首次報道荷蘭的家鴨暴發(fā)鴨瘟后，各養(yǎng)鴨國家和地區(qū)陸續(xù)報導有該病的發(fā)生和流行。我國于 1957年首次報道暴發(fā)鴨瘟，隨后該病在華南、華中和華東等養(yǎng)鴨較多的地區(qū)開始流行，是嚴重威脅養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一。鴨瘟潛伏期約2 5d，臨診特征為病初體溫升高，兩腳發(fā)軟無力，綠色下痢，流淚； 食道黏膜有小出血點，并有灰黃色假膜覆蓋或潰瘍，泄殖腔黏膜充血、出血、水腫和壞死；肝臟有大小不等的壞死灶及出血點；部分病鴨可見頭頸部粗腫，俗稱“大頭瘟”。病鴨后期體溫下降，衰竭死亡，死亡率可達90%以上，少數(shù)耐過的病鴨表現(xiàn)為生長不良和消瘦，眼角膜混濁或形成角膜潰瘍而失明(王春雨，2008 )。病毒可在9 14 d鴨胚中生長繁殖，并可引起胚胎死亡。致死的胚體出血，水腫，肝出血、壞死，部分絨毛尿囊膜上有灰白色壞死灶。病毒適應鴨胚后也可感染雞胚，可在鴨胚成纖維細胞和雞胚成纖維細胞中增殖傳代，產生蝕斑并形成核內包涵體(董嘉文等， 2009)?？焖贉蚀_地診斷病原是控制鴨瘟流行的前提。鴨瘟病毒只有一種血清型，雖然各毒株之間的毒力存在差異，但在免疫學特性上都高度近似(董嘉文等，2009 )。適用于鴨瘟病毒常規(guī)的血清學診斷方法主要有病毒分離與中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附測定、間接血凝試驗等方法，但這些檢測技術都不同程度地存在實驗周期長、實驗操作復雜、敏感性低、檢出率不高等缺陷，加之鴨瘟感染病程發(fā)展迅速，急需建立更加快速、特異和敏感的檢測方法
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術中的上述不足，提供一種鴨瘟病毒檢測用引物組。本發(fā)明的另一目的是提供由上述引物組構成的環(huán)介導等溫擴增(LAMP)反應體系。本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)上述目的 一種鴨瘟病毒檢測用引物組，具體組成如下 正向外側引物F3 =SEQ ID N0:1 ；
反向外側引物B3 =SEQ ID NO:2 ； 正向內側引物FIP :SEQ ID NO:3 ； 反向內側引物BIP :SEQ ID N0:4。本發(fā)明所述鴨瘟病毒，是指鴨腸炎病毒(Duck Enteritis virus，DEV)。以上引物組是通過Blast、MegAlign和DNAMar程序篩選出的DEV UL6蛋白基因的保守序列(GenBank: AY995224. 1, 2198-2435)作為模板，用 Primer Explorer V4 軟件設計所得。該引物組包括兩條內引物(FIP和BIP)和兩條外引物(F3和B3)，內引物FIP由Flc (TCCAGAGGATGGTTTGTCCCGT,SEQ ID N0:5)禾口 F2 (ATGTATCATGGACGGCGGT,SEQ ID NO:6)組成，為利于后續(xù)擴增產物的酶切鑒定，BIP由Blc(CAGCGAGTGGGAACGAAAAGC，SEQ ID NO: 7)、 B2 (TCGCACATTAGACGCGGTATC, SEQ ID NO 8)禾口 GAATTC (.EcoR I 酶切位點序列)作為連接子組成。鴨瘟病毒的引物設計比較復雜，且對引物擴增區(qū)的要求較高。所以引物設計沒有普通引物設計簡單，要設計出優(yōu)良的引物，需要在各種生物信息軟件評估的基礎上進行費時的篩選。由于所設計的引物具有高度的選擇特異性，在進行病原檢測時，要求引物所針對的靶序列位點應該相當保守，這樣所建立的方法才具有適用性。研究中也可以設計一些兼并引物以增強其應用的廣泛性，但兼并度高的引物會對擴增反應造成負面影響。靶序列長度應控制在200 bp左右，才有利于擴增反應的進行，過長會給反應起始物的形成與后期循環(huán)反應帶來困難，有時甚至在1 h內沒有明顯擴增。對于一些具有GC含量高、變異性強、保守區(qū)離散等特點的目的序列，沒有辦法設計出非常適用的引物，使LAMP技術的應用受到限制。由于LAMP產物的獨特性給線性雙鏈DNA的分離增加了難度，更加有效的分離方法有待于進一步的研究。產物電泳圖為梯狀拖帶圖樣，一旦出現(xiàn)非特異性擴增就不易被察覺， 所以用限制性內切酶進行鑒定就顯得十分必要。該技術非常適用于鑒定某種基因的存在， 但擴增產物對于基因克隆與測序意義不大。因此，在分子生物學領域，LAMP技術在疾病診斷、性別鑒定與食品安全有著比常規(guī)PCR技術更出色的表現(xiàn)，但在很多方面，如基因序列確定、文庫建立，是無法取代傳統(tǒng)PCR技術的。一種檢測鴨瘟病毒的LAMP反應體系，其特征在于該反應體系包括反應緩沖液 (200 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 20 mM MgSO4, 100 mM (NH4)2SO4, 1% Triton X-100)， dNTPs (包括等比例的 dATPs、dTTPs、dGTPs 和 dCTPs)，上述引物組(F3、B3、FIP 和 BIP)，Mg2+ (一般用MgSO4),甜菜堿(Betaine)，Bst DNA聚合酶，待檢樣品基因組DNA和去離子水。Mg2+穩(wěn)定堿基配對，維持聚合酶的反應活性都有重要作用，它對LAMP的影響方式與PCR的相同，濃度太高或太低都使反應無法進行或時間延長同時反應過程中焦磷酸鎂沉淀的析出使反應體系中Mg2+的濃度不斷下降，因此摸索Mg2+最佳濃度很有意義。經過多次試驗篩選，LAMP反應體系中Mg2+濃度優(yōu)選4 7 mM，最佳為5 mM。甜菜堿濃度最佳為0. 4 M0 dNTPs 濃度為 1. 2 mM(即 dATPs、dTTPs、dGTPs 和 dCTPs 的濃度均為1. 2 mM)。作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明的LAMP反應體系為每25PL中含有以下組分 IO反應緩沖液2.5 pL
dNTPs (10 mM)3 μ
FIP (10 μΜ)2“L
BP (10 μΜ)2 μ
F3 (10 μΜ)0.5 pL
Β3 (10 μΜ)0.5 pL。
MgSO4 (25 mM)3 μ
甜菜堿(0.4 Μ)2.5 μ!
Bst DNA 聚合賄1 μΙ-
待檢樣品基因組DNA1 μ ·
去離子水加至25 μ ο本發(fā)明的檢測鴨瘟病毒的LAMP反應體系的使用方法，優(yōu)選反應溫度為62°C，反應時間為50 mim。本發(fā)明的反應體系可以進行簡化的反應步驟，即將反應體系所需各組分混合完畢，放置于恒溫水浴鍋進行反應。反應完畢后可憑借液體渾濁度肉眼判定擴增結果，渾濁管偉陽性，清亮管為陰性，也可加入STOR Green I進行核酸染色，亮綠色為陽性，保留染料初始棕紅色為陰性。簡化步驟中反應體系最好用前現(xiàn)配，避免反應緩沖液失效造成假陽性。為避免反應產物揮發(fā)帶來交叉污染和殘留污染，反應體系配置完畢后每管添加惰性液體礦物油30 μ L，以起到液封反應液的作用。上述LAMP反應體系用于檢測鴨瘟病毒可以通過在反應產物中加入熒光顯色劑 SYBR green I，根據(jù)反應顏色直接觀察，如果反應產物溶液變?yōu)椴菥G色，則檢測結果為陽性，表明有鴨瘟病毒，如果反應產物溶液為橙黃色，則為陰性。或者將反應產物進行電泳，如果電泳結果在195 bp, 255 bp和310 bp處出現(xiàn)條帶，則檢測結果為陽性。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果
(1)只需要在恒定溫度下就能進行擴增反應，可以直接使用水浴鍋進行反應。不需要預先進行雙鏈DNA的變性及類似于PCR循環(huán)反應中的反復變性、退火、延伸等變溫過程。(2)高特異性應用四條引物識別目的片段的六個區(qū)域，并且這六個區(qū)域的順序、 長短、退火溫度都有相應要求。理論上LAMP法擴增的特異性很高，可以根據(jù)是否擴增就能判斷目標基因的存在與否，可應用于遺傳背景相似的細菌或病毒的分型定性檢測。(3)擴增反應快速、高效整個擴增在不到1 h即可完成，且產率可達到0. 15 mg/ mL。為提高LAMP反應的速度。
(4)靈敏度高擴增模板可達10拷貝，比常規(guī)PCR法高1至3個數(shù)量級。本研究中，LAMP方法比PCR方法要敏感100倍。(5)步驟簡單擴增DNA可在反應體系配置完畢后放置恒溫水浴鍋進行反應，擴增RNA只要在DNA基因擴增試劑的基礎上加上逆轉錄酶，進行短暫的反轉錄時間后就能夠完全如DNA基因擴增一樣，一步法實現(xiàn)RNA擴增(Hiroko et al. ,2006 ；Soliman et al.， 2006 ；Kazuya et al.，2007)，RT-LAMP反應同樣不需PCR儀和其他特殊試劑。(6)鑒定簡便在核酸大量合成時，添加核酸染色劑STOR green I，可根據(jù)反應液顏色變化直觀明了地判定實驗結果。高效擴增反應時產生的焦磷酸根離子與反應溶液中的 Mg2+結合，產生副產物(焦磷酸鎂沉淀)，通過肉眼觀察或濁度儀檢測沉淀濁度就能夠判斷擴增與否。雖然僅靠這些判斷并不準確，也不能排除非特異性擴增，但結果的可視觀察可以脫離凝膠成像的操作要求和儀器限制，加上擴增是等溫進行，不用依賴PCR儀復雜的循環(huán)溫度變化來完成，在水浴鍋中就能進行，這些都使該技術在小型研究所、獸醫(yī)站乃至普通養(yǎng)殖戶有著更廣闊的應用前景。


圖1 DEV UL6基因保守區(qū)LAMP擴增電泳圖，M =DNA分子量標準DL2000 ；1為DEV 弱毒苗株的擴增結果；2為陰性對照。圖2.自然光下LAMP產物的沉淀可視結果，a為陽性擴增產物管，顯渾濁；b為陰性對照。圖3.自然光下LAMP產物添加核酸染料變色結果，其中a為陽性擴增產物管，顯示草綠色；b為陰性對照，顯示橙黃色。圖4.在不同反應溫度下LAMP擴增產物的電泳圖，M :DNA分子量標準DL2000 ；泳道1 5依次分別為在61 0C >62 0C >63 °C >64 °C >65 °C條件下DEV基因DNA的LAMP擴增產物；N為陰性對照。圖5.選擇不同Mg2+濃度時LAMP擴增產物的電泳結果圖，M :DNA分子量標準 DL2000 ；泳道 1 8 從左到右依次是 MgSO4 濃度為 7 mM、6 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM、l mM、 0 mM時的LAMP擴增；N為陰性對照。圖6.選擇不同甜菜堿濃度的LAMP擴增產物的電泳結果圖，M =DNA分子量標準 DL2000 ；泳道1 6依次是甜菜堿濃度為0 M、0. 2 M、0. 4 M、0. 6 M、0. 8 M、1 M時的LAMP擴增；N為陰性對照。圖7.選擇不同dNIPs濃度時LAMP擴增產物的電泳結果圖，M =DNA分子量標準 DL2000 ；泳道 1 6 依次是MgSO4 濃度為 1. 6 mM、1.4 mM、1.2 mM、1.0 mM、0. 8 mM、0. 6 mM 時的LAMP擴增；N為陰性對照。圖8.不同反應時間LAMP擴增產物的電泳結果圖，M :DNA分子量標準DL2000 ；泳道1 4分別為DEV基因在反應60 min、50 min、40 min、30 min后的LAMP擴增結果，N為陰性對照。圖9. DEV LAMP反應特異性試驗電泳結果圖，M:DNA分子量標準DL2000 ；泳道1 6從左到右分別為DEV LAMP引物檢測DEV、MDV、MDPV, DHV I、H9 AIV和MDRV的結果。圖10. DEV LAMP反應產物的酶切鑒定電泳圖，M:DNA分子量標準DL2000 ；泳道1
6為終產物；2為內切酶I消化后的結果。圖11. DEV LAMP反應的靈敏度試驗電泳圖，M =DNA分子量標準DL2000 ；圖a泳道 Γ8分別為模板稀釋至ΙΟ—^ΙΟΛΙΟΛΙΟΛΙΟΛΙΟΛΙΟ—^ΙΟ—8倍的LAMP檢測結果，圖b泳道1 8分別為模板稀釋至10人10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7、10_8倍的常規(guī)PCR檢測結果。
具體實施例方式以下實施例中如無特殊說明，均為本領域常規(guī)實驗試劑和常規(guī)操作步驟。實施例1鴨瘟病毒獲取及鑒定 1.材料
1.1病毒和病料
鴨瘟弱毒疫苗株由廣東溫氏食品集團禽病室提供。對照病原禽傳染性喉氣管炎陽性毒株(ILTV)、番鴨細小陽性毒株(MDPV)、H9亞型禽流感病毒抗原(H9 AIV)、鴨病毒性肝炎I型毒株(DHV I )和番鴨呼腸孤病毒株(MDRV) 為華南農業(yè)大學動物科學學院家禽研究室分離保存。15份病死鴨及發(fā)病鴨內臟組織由中山獸醫(yī)防疫監(jiān)督所、廣東溫氏食品集團莆田分公司提供。1. 2 鴨胚
13 14日齡非免疫鴨胚由廣東溫氏食品集團莆田分公司提供。1. 3主要試劑
Bst DNA聚合酶(8 U/μ L)及配套緩沖液為NEB公司產品；AMV反轉錄酶(5 U/yL)、 HRP RNA 酶抑制劑(40 U/μ L)及相應緩沖液、Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L), dNTPs (2.5 mM each)、^boR I (15 U/μ L)、DNA Marker DL 2000 均為 TaKaRa 產品。DNA Mark DL 2000 :2000、1000、750、500、250、100 bp。DNA提取試劑盒ChargeSwitch gDNA為hvitrogen公司產品；RNA提取試劑 TRIzol ReagentShvitrogen公司產品；DEPC和飽和酚購自上海生工生物工程公司；甜菜堿betaine購自Sigma公司；10000 X STOR Green I購自百維信生物科技有限公司；氨芐青霉素、鏈霉素、溴化乙錠(EB)購自寶泰克生物科技有限公司；瓊脂糖購自基因有限公司。1. 4常用溶液
PBS 緩沖溶液(pH 7. 2) =KH2PO4 0. 2 g, Na2HPO4 · 12H20 2. 85 g, NaCl 8 g，KCl 0.2 g 力口超純水定容至1000 mL。無RNA酶的DEPC水按1 1000的比例將DEPC加入超純水，室溫放置12 h以上，
高壓滅菌。50XTAE =Tris 堿 M2 g, Na2EDTA 37. 2 g，冰醋酸 57. 1 mL，加超純水定容至 1000 mL。使用液為IX TAE溶液。1. 5主要儀器及設備
PCR Express Gradient PCR儀，法國HYBAID公司產品；水浴鍋，上海一恒科技有限公司產品；凝膠成像及分析系統(tǒng)，法國VL產品；Allegra TM 64R centrifuge臺式高速冷凍離心機，BECKMAN公司產品；AIR-TECH醫(yī)用超凈工作臺，上海沙瀘凈化設備廠產品；METTLER TOLEDO AB204-E分析天平，梅特勒托利多儀器，上海有限公司。
2.方法與結果
2. 1病毒分離鑒定病毒分離與繁殖
病死鴨與發(fā)病鴨肝脾組織加無菌IXPBS漂洗去除多余血液與雜物，加液氮研磨成糜， 加入含青霉素2000 IU/mL、鏈霉素1000 IU/mL的PBS制成20% (W/V)懸液，反復凍融三次，37 °C作用30 min,5000 rpm離心10 min，取上清0. 2 mL以尿囊腔途徑接種14日齡未免疫的鴨胚，0.2 mL/胚，每病料接種兩個胚蛋，另設兩胚接種0.2 mL PBS作為對照，隨后放置在38 ！恒溫箱繼續(xù)孵育，每隔12 h照蛋1次，棄去對h內死亡胚蛋，無菌收獲72 96 h內感染胚尿囊液，用于核酸抽提，然后用PCR法進行鑒定，余下-80 °C保存?zhèn)溆?。結果病料上清液接種于30枚鴨胚，24 h內無鴨胚死亡，48 h后陸續(xù)死亡，主要集中于接種后3 5 d，最終死亡率達100 %，接種PBS胚體發(fā)育正常。將死胚置4 °C冰箱過夜，收取尿囊液。死亡胚的胚液清亮，絨毛尿囊膜增厚，有出血點，胚體全身出血。病毒鑒定的提取
總DNA的提取使用ChargeSwitch gDNA試劑盒(美國)。提取出的DNA片段置于100 μ 洗脫緩沖液并儲存在-20 °C，備用。具體操作過程如下
(1)先將250μ 尿囊液加200 μ L緩沖液GA，振蕩至徹底懸?。?br> (2)加入20μ L蛋白酶K (20 mg/μ L)，混勻，進行下一步；
(3)加入220μ L緩沖液GB，充分顛倒混勻，70 °C放置10 min，簡短離心以除去管蓋內壁的水珠；
(4)加220μ L無水乙醇，充分振蕩混勻15 sec，簡短離心以除去管蓋內壁的水
珠；
(5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000 rpm離心1 min倒掉廢液，吸附柱CB3放回收集管中；
(6)向吸附柱CB3中加入500 μ L去蛋白液⑶，12000 rpm離心1 min，棄廢液，吸附柱 CB3放回收集管中；
(7)向吸附柱CB3中加入700μ L漂洗液PW，12000 rpm離心1 min，棄廢液，吸附柱CB3放回收集管中；
(8)向吸附柱CB3中加入700μ L漂洗液PW，12000 rpm離心1 min，棄廢液；
(9)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2 min。將吸附柱CB3置于50 V 恒溫箱放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；
(10)將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μ L 經65 70 ！水浴預熱的洗脫緩沖液ΤΕ，室溫放置2 5 min, 12000 rpm離心30 sec ；
(11)離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2min, 12000 rpm離心^iiin。抽提所得到的病毒DNA樣品保存于-20 °C冰箱。運用PCR技術鑒定DEV
所用弓丨物對 DEV-F :5，-GTAGACGAAGGCGGGTATG-3，(SEQ ID NO:9)與 DEV-R 5‘-CGTATTGGTTTCTGAGTTGG-3‘ (SEQ ID NO: 10)針對鴨癌病毒UL31基因設計，理論擴增產物長度為563 bp。PCR反應體系(20 μι)包括1 μ DNA模板，0.25 mM DEV上下游引物，2μ 10XPCR buffer, 2. 5 mM dNTPs mixture (1 μ ), 15. 5 μ ddH20 和 1· 5 U Ex Taq DNA 聚合酶。PCR反應程序為94 °C預變性3 min ；94 °C變性40 sec,53 °C退火40 sec,72 V 延伸40 sec，共反應30個循環(huán)；隨后進行72 °C延伸10 min。結果以30枚病死鴨胚與正常鴨胚尿囊液抽提的DNA為模板進行PCR鑒定，結果判定有6個病樣接種胚(12枚鴨胚)呈現(xiàn)陽性，初步判定獲得6株鴨瘟病毒。實施例2鴨瘟病毒LAMP檢測方法的建立引物設計與合成
通過Blast、MegAlign和DNAMar程序選擇了鴨瘟病毒UL6蛋白基因的保守段，并應用 Primer Explorer V4軟件分別設計4條引物，其中包括兩條內引物(FIP和BIP)和兩條外引物(F3和B3)，內引物FIP由Flc、F2組成，為利于后續(xù)擴增產物的酶切鑒定，BIP由Blc、 B2和GAATTC CFcoR I酶切位點序列)作為連接子組成。本試驗還利用了診斷鴨瘟病毒的 PCR引物對DEV-F與DEV-R，用于PCR檢測方法與新建立LAMP檢測方法的比較，所有引物由北京奧科生物工程公司合成。合成后的引物用超純水稀釋成10 mmol/mL溶液，-20 ！保存。引物序列如下
表1. 1 DEV檢測用LAMP引物
權利要求
1.一種鴨瘟病毒檢測用引物組，其特征在于，所述引物組組分如下正向外側引物F3 =SEQ ID N0:1 ；反向外側引物B3 =SEQ ID NO:2 ；正向內側引物FIP :SEQ ID NO:3 ；反向內側引物BIP :SEQ ID N0:4。
2.一種檢測鴨瘟病毒的LAMP反應體系，其特征在于該反應體系包括反應緩沖液， dNTPs，權利要求1所述引物組，Mg2+，甜菜堿，Bst DNA聚合酶，待檢樣品基因組DNA和去離子水。
3.根據(jù)權利要求2所述檢測鴨瘟病毒的LAMP反應體系，其特征在于LAMP反應體系中 Mg2+濃度為5 mM。
4.根據(jù)權利要求2所述檢測鴨瘟病毒的LAMP反應體系，其特征在于LAMP反應體系中甜菜堿濃度為0. 4 M0
5.根據(jù)權利要求2所述檢測鴨瘟病毒的LAMP反應體系，其特征在于LAMP反應體系中 dNTPs終濃度為1. 2 mM。
6.根據(jù)權利要求2所述檢測鴨瘟病毒的LAMP反應體系，其特征在于每25PL中含有以下組分10 X 反應緩沖液 2. 5 μ , dNTPs (10 mM) 3 μ , FIP (10 μΜ) 2 μ , BIP (10 μΜ) 2 μ , F3 (10 μΜ) 0. 5 μ , Β3 (10 μΜ) 0. 5 μ , MgSO4 (25 mM) 3 41^，甜菜堿(0.4 Μ) 2. 5 μ , Bst DNA聚合酶1 μ ，待檢樣品基因組DNA 1 μ ，去離子水加至25 μ 。
7.權利要求2飛所述任意一項檢測鴨瘟病毒的LAMP反應體系的使用方法，其特征在于 LAMP的反應溫度為62°C，反應時間為50 mim。
8.權利要求2飛所述任意一項檢測鴨瘟病毒的反應體系的使用方法，其特征在于是將反應體系所需各組分混合完畢，放置于恒溫水浴鍋進行反應，反應完畢后可憑借液體渾濁度肉眼判定擴增結果，渾濁管為陽性，清亮管為陰性；或反應完畢后加入STOR Green I進行核酸染色，亮綠色為陽性，保留染料初始棕紅色為陰性。
9.權利要求8所述檢測鴨瘟病毒的LAMP反應體系的使用方法，其特征在于所述LAMP 反應體系使用之前現(xiàn)配，配制完畢后每25PL添加礦物油30μ 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鴨瘟病毒檢測用引物組及其構成的LAMP反應體系。該檢測用引物組包括正向外側引物F3SEQ ID NO:1、反向外側引物B3SEQ ID NO:2、正向內側引物FIPSEQ ID NO:3和反向內側引物BIPSEQ ID NO:4。由前述引物組成的LAMP反應體系，還包括反應緩沖液，dNTPs，Mg2+，甜菜堿，BstDNA聚合酶，待檢樣品基因組DNA和去離子水等。該反應體系操作方法簡單，特異性和靈敏度高，檢測結果鑒定簡便，在小型研究所、獸醫(yī)站乃至普通養(yǎng)殖戶有著更廣闊的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK102304590SQ20111024567
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月25日 優(yōu)先權日2011年8月25日
發(fā)明者冀君, 孫寶麗, 畢英佐, 謝青梅, 鄒祿生, 馬靜云 申請人:華南農業(yè)大學