專利名稱：核酸等溫?cái)U(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸等溫?cái)U(kuò)增方法，具體地涉及這樣的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法，其中靶RNA 鏈到模板DNA鏈中的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在具有該模板DNA鏈的擴(kuò)增反應(yīng)的一系列步驟(程序， procedure)中實(shí)施。
背景技術(shù)：
PCR(聚合酶鏈反應(yīng))已被用作核酸擴(kuò)增方法的一種方法。在PCR中，模板DNA鏈通過(guò)包括(1)熱變性、(2)退火和( 延伸反應(yīng)的三個(gè)溫度步驟的重復(fù)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。在第一個(gè)熱變性步驟中，模板DNA鏈從雙鏈離解成單鏈。用于該熱變性的反應(yīng)溫度通常為約94°C。在第二個(gè)退火步驟中，寡核苷酸引物結(jié)合(退火)至單鏈模板DNA 鏈。退火溫度通常為約50°C至60°C。在第三個(gè)延伸反應(yīng)中，利用該寡核苷酸引物作為起源(origin)，DNA聚合酶合成與單鏈部分互補(bǔ)的DNA。用于延伸反應(yīng)的反應(yīng)溫度通常為約 72 "C。對(duì)于基因表達(dá)水平分析和cDNA克隆，使用了 RT-PCR (逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))，其中mRNA到cDNA中的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在PCR之前實(shí)施。在RT-PCR中，已廣泛使用單步驟RT-PCR， 其中在前的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和接下來(lái)的擴(kuò)增反應(yīng)在一系列步驟中實(shí)施。在單步驟RT-PCR方法中，與處于表達(dá)分析或被克隆的RNA鏈(mRNA)互補(bǔ)的DNA 鏈(cDNA)首先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成。該反應(yīng)利用保持在通常約42°C溫度下的包含RNA鏈、 逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄寡核苷酸引物的反應(yīng)溶液實(shí)施。在接下來(lái)的擴(kuò)增反應(yīng)中，利用合成的DNA 鏈作為模板實(shí)施PCR反應(yīng)。通常選擇用于該擴(kuò)增反應(yīng)的引物以在不同于用于逆轉(zhuǎn)錄的寡核苷酸引物的結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)處結(jié)合至RNA鏈(或模板DNA鏈)堿基序列。近年來(lái)，一種更容易的方法，稱為等溫?cái)U(kuò)增，已經(jīng)被用作能夠消除對(duì)于重復(fù)溫度循環(huán)的需要的一種核酸擴(kuò)增方法。例如，在LAMP(環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增)中，模板核酸鏈與諸如寡核苷酸引物、鏈置換型DNA合成酶和核酸單體的試劑混合，并將該混合物保持在恒定溫度 (在65°C附近)以進(jìn)行該反應(yīng)。關(guān)于本發(fā)明，Light-Triggered Polymerase Chain Reaction，Chem. Commun.， 2008,462-464描述了一種用于控制PCR反應(yīng)的技術(shù)，其中利用在其堿基序列中包括連接了光可降解保護(hù)基團(tuán)的胸腺嘧啶的寡核苷酸引物。在這種技術(shù)中，通過(guò)UV射線照射而離解的 6-硝基胡椒基氧甲基(6-nitropiperonyloxymethyl) (NPOM)基團(tuán)用作光可降解保護(hù)基團(tuán) (光P華角軍 呆護(hù)基，photodegradable protecting group)

發(fā)明內(nèi)容
在等溫?cái)U(kuò)增中也廣泛采用在一系列步驟中實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和擴(kuò)增反應(yīng)的技術(shù)，如在單步驟RT-LAMP的情況下。然而，與PCR不同，LAMP參與在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之后在恒定溫度下進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)。如已知的，單步驟RT-LAMP的一個(gè)缺點(diǎn)是較差的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率，其由通過(guò)鏈置換型DNA合成酶進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)利用由逆轉(zhuǎn)錄酶促進(jìn)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引起。降低的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率降低擴(kuò)增反應(yīng)中用作模板的核酸鏈的量，其結(jié)果是基因表達(dá)水平分析的準(zhǔn)確性或克隆的效率可能會(huì)降低。因此，需要能夠改善等溫?cái)U(kuò)增中的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效率的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和擴(kuò)增反應(yīng)在一系列步驟中實(shí)施。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供了一種核酸等溫?cái)U(kuò)增方法，其包括(1)實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以將靶RNA鏈逆轉(zhuǎn)錄到模板DNA鏈中；(2)用光照射反應(yīng)溶液以離解結(jié)合至寡核苷酸引物的序列中的核苷酸的光可降解保護(hù)基團(tuán)；以及⑶對(duì)該模板DNA鏈實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)。在本發(fā)明實(shí)施方式的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法中，寡核苷酸引物包括在其序列中的連接了光可降解保護(hù)基團(tuán)的核苷酸，并因此該寡核苷酸引物與互補(bǔ)鏈的結(jié)合在(1)中被所述光可降解保護(hù)基團(tuán)抑制。寡核苷酸引物僅在光可降解保護(hù)基團(tuán)在O)中離解之后才在(3)中結(jié)合至該互補(bǔ)鏈。在該核酸等溫?cái)U(kuò)增方法中，優(yōu)選光可降解保護(hù)基團(tuán)結(jié)合至該核苷酸的堿基部分， 并且例如使用6-硝基胡椒基氧甲基基團(tuán)。擴(kuò)增反應(yīng)可以是LAMP。在這種情況下，連接了光可降解保護(hù)基團(tuán)的核苷酸優(yōu)選包括在寡核苷酸引物的序列中，該寡核苷酸參與使靶RNA鏈從模板DNA鏈脫離的同時(shí)合成互補(bǔ)DNA鏈的鏈置換反應(yīng)。如本文中使用的，“核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)”涵蓋不涉及溫度循環(huán)的各種各樣的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。該等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)涵蓋用于核酸擴(kuò)增的廣泛的等溫反應(yīng)，包括例如LAMP(環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增)、SMAP(Smart 擴(kuò)增法(SMart Amplification Process)、NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增，Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)、ICAN (等溫和嵌合弓I 物弓I 發(fā)的核酸擴(kuò)增，Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)、TRC(轉(zhuǎn)錄-逆轉(zhuǎn)錄協(xié)同，Transcription-Reverse Transcription Concerted)反應(yīng)、SDA(鏈置換擴(kuò)增，Strand Displacement Amplification)、TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增，Transcription-Mediated Amplification)和 RCA(滾環(huán)擴(kuò)增，Rolling Circle Amplification)。這些核酸擴(kuò)增反應(yīng)包括這樣的反應(yīng)，如實(shí)時(shí)(RT) LAMP，其涉及核酸鏈的擴(kuò)增與擴(kuò)增的核酸鏈的量化。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的方法能夠改善其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和擴(kuò)增反應(yīng)在一系列步驟中實(shí)施的等溫?cái)U(kuò)增中的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效率。


圖1是解釋靶RNA鏈和寡核苷酸引物的序列的圖示。圖2是解釋連接于核苷酸的6-硝基胡椒基氧甲基基團(tuán)(NPOM)的光降解反應(yīng)的圖
7J\ ο圖3是解釋逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的DNA合成的圖示。圖4A和圖4B是解釋在擴(kuò)增反應(yīng)早期的DNA合成反應(yīng)的圖示。
具體實(shí)施例方式以下參考附圖描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。應(yīng)當(dāng)注意，以下描述的實(shí)施方式僅僅是本發(fā)明的舉例說(shuō)明，并且不應(yīng)當(dāng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。將以以下順序進(jìn)行描述。
4
1、根據(jù)第一實(shí)施方式的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法(1)寡核苷酸引物的設(shè)計(jì)(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(3)光可降解保護(hù)基團(tuán)的降解(4)擴(kuò)增反應(yīng)2、核酸等溫?cái)U(kuò)增方法的變形例1、根據(jù)第一實(shí)施方式的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法包括(1)實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以將靶 RNA鏈逆轉(zhuǎn)錄到模板DNA鏈中；(2)用光照射反應(yīng)溶液以離解結(jié)合至寡核苷酸引物序列中的核苷酸的光可降解保護(hù)基團(tuán)；以及(3)對(duì)模板DNA鏈實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)。以下利用基于LAMP的RT-LAMP作為(3)中的擴(kuò)增反應(yīng)的一個(gè)實(shí)例，參考圖1至圖 4A和圖4B具體地描述根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的步驟。(1)寡核苷酸引物的設(shè)計(jì)圖1是示意性地舉例說(shuō)明靶RNA鏈(mRNA)和寡核苷酸引物(下文中，也簡(jiǎn)稱為 “引物”)的序列的圖示。在RT-LAMP，六個(gè)區(qū)域選自靶RNA鏈的序列，并設(shè)計(jì)了四種寡核苷酸引物。所選區(qū)域是從靶RNA鏈的5'端的F3、F2、Fl和Blc、B2c、B3c。具有與靶RNA鏈互補(bǔ)的堿基序列的模板DNA鏈(cDNA)具有分別與靶RNA鏈的六個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的堿基序列的 F3c、F2c、Flc 和 B1、B2、B3。弓丨物BIP設(shè)計(jì)成具有與區(qū)域Blc和B2相同的堿基序列。序列B3具有與區(qū)域B3 相同的堿基序列。引物FIP具有與區(qū)域Flc和F2相同的堿基序列。引物F3設(shè)計(jì)成具有與區(qū)域F3相同的堿基序列。每個(gè)引物的鏈長(zhǎng)度設(shè)置成具有根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溫度的恰當(dāng)融化溫度(Tm)。引物的融化溫度設(shè)置成使得每個(gè)引物能夠在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溫度條件下結(jié)合至靶RNA或模板DNA。引物的鏈長(zhǎng)度通常為約20個(gè)堿基(20mer)。引物B3和F3的序列包括結(jié)合至光可降解保護(hù)基團(tuán)，具體地為6_硝基胡椒基氧甲基(NPOM)基團(tuán)的核苷酸，如在附圖中作為引物B3(籠狀(Caged)和引物F3(籠狀)示出的。圖2表示連接至核苷酸的NPOM的光降解反應(yīng)。NPOM結(jié)合至引物序列的核苷酸的堿基(這里，胸腺嘧啶(T))部分。核苷酸中的該堿基與互補(bǔ)堿基(這里，腺嘌呤(A))形成氫鍵。然而，氫鍵合(hydrogen bonding)在結(jié)合了 NPOM的核苷酸堿基處不發(fā)生，因?yàn)橛兄跉滏I合的氫原子被NPOM取代。因此，在它們的序列中具有連接了 NPOM的核苷酸的引物與它們的互補(bǔ)鏈的鍵合力降低，并由此降低熔化溫度。連接至堿基的NPOM通過(guò)在UV射線下發(fā)生降解而離解。離解NPOM使堿基游離 (free)，從而與其互補(bǔ)堿基形成氫鍵。因此，在NPOM已從引物序列中的核苷酸離解之后，引物恢復(fù)其與互補(bǔ)鏈的鍵合力，并且熔化溫度升高。對(duì)引物序列中連接了 NPOM的核苷酸的數(shù)目沒(méi)有特別限制，只要該引物的熔化溫度在NPOM離解前后足夠不同從而能夠?qū)崿F(xiàn)反應(yīng)控制，如在下文描述的。連接了 NPOM的核苷酸的數(shù)目可以根據(jù)引物的鏈長(zhǎng)度恰當(dāng)選擇。對(duì)于平均鏈長(zhǎng)度(約20個(gè)堿基)，連接了 NPOM 的核苷酸的數(shù)目為1或2，或者甚至可以為3以上。
(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)圖3示意性地表示逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的DNA合成。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，靶RNA鏈和反應(yīng)溶液混合，并且該混合物保持在反應(yīng)溫度下以從靶RNA鏈合成模板DNA鏈。反應(yīng)溶液包含例如鏈置換型DNA合成酶(例如Bst酶)、逆轉(zhuǎn)錄酶(例如AMV酶)、引物、核酸單體(dNTP)和緩沖溶質(zhì)(buffer solute)。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，引物BIP結(jié)合(退火)至靶RNA鏈的區(qū)域B2c，并且與靶RNA鏈互補(bǔ)的模板DNA鏈通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶合成(參見(jiàn)圖中的箭頭)。注意，當(dāng)圖中所示的靶RNA鏈?zhǔn)怯煞戳xRNA鏈附帶的有義鏈(sense strand)，相同逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)從其中引物FIP已結(jié)合于反義RNA鏈的區(qū)域F2c的區(qū)域進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在預(yù)定反應(yīng)溫度(例如40°C至65°C )下實(shí)施。能夠選擇任何反應(yīng)溫度，只要它落入在其中逆轉(zhuǎn)錄酶是活性的溫度范圍內(nèi)。引物B3(籠狀)和引物F3(籠狀)由于在它們的序列中存在連接了 NPOM的核苷酸而具有低熔化溫度。因此，引物B3和F3在逆轉(zhuǎn)錄溫度下或在擴(kuò)增反應(yīng)溫度下不能直接結(jié)合至靶RNA鏈(以下描述)。同樣，僅引物BIP和FIP在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中能夠結(jié)合至靶RNA鏈，并且靶RNA鏈到模板DNA鏈中的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)利用這些引物作為起源有效地進(jìn)行。(3)光可降解保護(hù)基團(tuán)的降解在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之后，反應(yīng)溶液利用紫外射線照射以降解和離解連接于引物B3和 F3的序列中的核苷酸的ΝΡ0Μ。離解NPOM增高引物B3和F3的熔化溫度。這使得引物B3和F3能夠在擴(kuò)增反應(yīng)溫度下結(jié)合至靶RNA鏈，如下描述的。(4)擴(kuò)增反應(yīng)圖4A和圖4B示意性地表示在擴(kuò)增反應(yīng)早期的DNA合成反應(yīng)。在擴(kuò)增反應(yīng)中，NPOM離解之后的引物B3 (圖中的引物B3 (未籠狀化的 (uncaged)))結(jié)合在引物BIP的外側(cè)上，并且當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中從引物BIP延伸的模板DNA鏈從靶RNA鏈脫離時(shí)，合成新cDNA(參見(jiàn)圖4A中的箭頭)。當(dāng)存在反義RNA鏈時(shí)，NPOM離解后的引物F3結(jié)合在引物FIP的外側(cè)上，并且進(jìn)行相同的鏈置換反應(yīng)。為了簡(jiǎn)潔，以下僅描述有義鏈反應(yīng)。然后，引物FIP結(jié)合至從弓丨物BIP延伸并從靶RNA鏈脫離的模板DNA鏈的區(qū)域F2c。 在引物FIP結(jié)合之后，與模板DNA鏈互補(bǔ)的DNA鏈利用引物FIP作為起源通過(guò)鏈置換型DNA 合成酶合成(參見(jiàn)圖4B中的箭頭)。然后，引物F3結(jié)合在引物FIP的外側(cè)上，并且隨著與模板DNA鏈互補(bǔ)且從引物FIP 通過(guò)鏈置換型DNA合成酶延伸的DNA鏈脫離而合成新DNA鏈(未示出)。脫離的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的DNA鏈然后用作擴(kuò)增循環(huán)的起源結(jié)構(gòu)，從而以常規(guī)LAMP中的相同方式對(duì)該模板 DNA鏈進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)在預(yù)定反應(yīng)溫度(例如40°C至65°C )下實(shí)施?？梢赃x擇任意反應(yīng)溫度， 只要它落入其中鏈置換型DNA合成酶是活性的溫度范圍內(nèi)。在根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法中，NPOM連接于引物B3(和引物 F3)序列中的核苷酸以在逆轉(zhuǎn)錄中控制和防止引物B3(籠狀)與靶RNA鏈結(jié)合(參見(jiàn)圖3)。CN 102382814 A
說(shuō)明書(shū)
5/5頁(yè) 而且，通過(guò)在光可降解保護(hù)基團(tuán)的降解中離解連接于引物B3序列中的核苷酸的ΝΡ0Μ，引物 B3 (未籠狀化的)能夠被控制而僅在擴(kuò)增反應(yīng)中結(jié)合至靶RNA鏈(參見(jiàn)圖4A)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中引物B3與靶RNA鏈的結(jié)合，使得從引物BIP延伸的模板DNA鏈通過(guò)從已結(jié)合在引物BIP外側(cè)上的引物B3延伸的cDNA脫離。而且，非特異性連接于靶RNA鏈的引物B3可以抑制從引物BIP合成模板DNA鏈。在這任一種情況下，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效率可能降低。根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法控制NPOM的結(jié)合和離解，從而使得引物B3僅能夠在擴(kuò)增反應(yīng)中結(jié)合至靶RNA鏈。因此可以通過(guò)引物B3與靶RNA鏈在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的結(jié)合而防止逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效率降低。2、核酸等溫?cái)U(kuò)增方法的變形例在前述第一實(shí)施方式中，通過(guò)連接了 NPOM的核苷酸僅存在于引物B3(和引物F3) 的序列中的情形描述了核酸等溫?cái)U(kuò)增方法。然而，連接了 NPOM的核苷酸也可以存在于引物 BIP(和引物FIP)中。然而，要求引物B3包括比引物BIP更大數(shù)量的連接了 NPOM的核苷酸。具體地，引物B3需要通過(guò)包括更大數(shù)量的連接了 NPOM的核苷酸而具有更低的熔化溫度。在這種情況下，能夠通過(guò)使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)溫度比引物B3的熔化溫度更高而控制引物B3不結(jié)合至靶RNA鏈。而且，通過(guò)使擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溫度低于從NPOM游離的引物B3的熔化溫度，能夠控制引物B3在光可降解保護(hù)基團(tuán)降解之后在擴(kuò)增反應(yīng)中結(jié)合至靶RNA鏈。而且，在前述實(shí)施方式中，通過(guò)利用NPOM作為光可降解保護(hù)基團(tuán)描述了核酸等溫?cái)U(kuò)增方法。然而，對(duì)光可降解保護(hù)基團(tuán)沒(méi)有特別限制，只要它能夠結(jié)合至引物序列中的核苷酸的堿基部分從而抑制該堿基和互補(bǔ)堿基之間形成氫鍵，以及它能夠通過(guò)光照射而降解而消除抑制作用。連接了光可降解保護(hù)基團(tuán)的堿基不局限于胸腺嘧啶(T)，并且可以是腺嘌呤 (A)、胞嘧啶(C)或鳥(niǎo)嘌呤(G)，取決于使用的保護(hù)基團(tuán)?？梢允褂庙憫?yīng)于光而經(jīng)歷構(gòu)象(順-反)變化的光響應(yīng)物質(zhì)(photoresponsive substance)來(lái)代替光可降解保護(hù)基團(tuán)。這樣的光響應(yīng)物質(zhì)可以例如是偶氮苯，其在核酸雙鏈形成的光調(diào)控中具有用途，如在Photoregulation of DNA Triplex Formation by Azobenzene, J Am Chem Soc. 2002，Vol. 124，No. 9，p. 1877-83 中報(bào)道的。堿基對(duì)之間的氫鍵能夠通過(guò)將偶氮苯結(jié)合至核苷酸的堿基部分或結(jié)合至核苷酸的鏈結(jié)構(gòu)部分，以及通過(guò)光照射轉(zhuǎn)化構(gòu)象而變得穩(wěn)定或不穩(wěn)定。連接于偶氮苯的引物由此能夠在構(gòu)象變化前后具有不同的熔化溫度，并且該反應(yīng)能夠以與連接了光可降解保護(hù)基團(tuán)的引物的情形的相同方式被控制。根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法能夠改善逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效率，并由此能夠改善基因表達(dá)水平分析和克隆的準(zhǔn)確性和效率。本發(fā)明包含與于2010年9月2日向日本專利局提交的日本在先專利申請(qǐng)JP 2010-196609中公開(kāi)的主題相關(guān)的主題，將其全部?jī)?nèi)容結(jié)合于此供參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)設(shè)計(jì)要求和其他因素可以發(fā)生各種更改、組合、子組合和變形，只要它們?cè)谒綑?quán)利要求或其等同替換的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種核酸等溫?cái)U(kuò)增方法，包括實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以將靶RNA鏈逆轉(zhuǎn)錄到模板DNA鏈中；用光照射反應(yīng)溶液以離解結(jié)合至寡核苷酸引物的序列中的核苷酸的光可降解保護(hù)基團(tuán)；以及對(duì)所述模板DNA鏈實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述光可降解保護(hù)基團(tuán)結(jié)合至所述核苷酸的堿基部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述光可降解保護(hù)基團(tuán)是6-硝基胡椒基氧甲基基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述擴(kuò)增反應(yīng)是LAMP。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，結(jié)合了所述光可降解保護(hù)基團(tuán)的所述核苷酸包含在參與使所述模板DNA鏈從所述靶RNA鏈脫離的同時(shí)合成互補(bǔ)DNA鏈的鏈置換反應(yīng)的所述寡核苷酸引物的序列中。
全文摘要
本發(fā)明涉及核酸等溫?cái)U(kuò)增方法。更具體地，涉及一種核酸等溫?cái)U(kuò)增方法，包括實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以將靶RNA鏈逆轉(zhuǎn)錄到模板DNA鏈中；用光照射反應(yīng)溶液以離解結(jié)合至寡核苷酸引物序列中的核苷酸的光可降解保護(hù)基團(tuán)；以及對(duì)該模板DNA鏈實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)。本發(fā)明提供了一種能在以一系列步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和擴(kuò)增反應(yīng)的等溫?cái)U(kuò)增方法中有效進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的方法。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102382814SQ20111024559
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月2日
發(fā)明者世取山翼 申請(qǐng)人:索尼公司