專利名稱：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌的構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)營養(yǎng)缺陷型埃希氏菌屬(Escherichia)微生物的構(gòu)建及其應(yīng)用。更具體地講，是在埃希氏菌屬微生物胞內(nèi)置入一種可表達(dá)NAD跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的載體，并阻斷其天然的NAD生物合成途徑，獲得依賴于外源吡啶核苷酸輔酶生長的工程菌，并應(yīng)用于生物催化、NAD跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑篩選、代謝調(diào)控、非抗生素篩選標(biāo)記和蛋白質(zhì)表達(dá)等。
背景技術(shù)：
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)是非常重要的輔因子。NADH和NADPH分別是NAD和NADP的還原形態(tài)，它們在胞內(nèi)可以相互轉(zhuǎn)化。NAD、NADH、NADP和NADPH統(tǒng)稱為吡啶核苷酸輔酶。原核微生物細(xì)胞內(nèi)有300個(gè)以上的氧化還原反應(yīng)以它們?yōu)檩o因子，它們的濃度及相對含量變化會影響代謝網(wǎng)絡(luò)及生長特性。在乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)中高表達(dá)來源于變形鏈球菌(Streptococcus mutans)的NADH氧化酶，NADH/NAD比例降低，結(jié)果導(dǎo)致乳酸乳球菌由單一乳酸發(fā)酵變成了混合酸發(fā)酵(deFelipe et al. , J Bacteriol, 1998,180, 3804)。在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達(dá)乳酸乳球菌的NADH氧化酶，胞內(nèi)NADH濃度降低5倍，導(dǎo)致代謝網(wǎng)絡(luò)顯著改變，甘油、乙醇、琥珀酸、羥基戊二酸產(chǎn)量明顯降低，而一些氧化型產(chǎn)物乙醛、乙酸、乙偶姻產(chǎn)量增加(Heuxet al. ,Metab Eng, 2006,8, 303)。在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達(dá)來源于博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)甲酸脫氫酶，胞內(nèi)NADH含量增加，而NAD/NADH總量不變，結(jié)果乙醇/ 乙酸的比例從 I. 05 提高到 9. 45 (Sanchez et al. , J Biotechnol, 2005,117,395)。以上研究成功通過表達(dá)甲酸脫氫酶或NADH氧化酶調(diào)節(jié)胞內(nèi)NADH/NAD比例，但未能有效改變胞內(nèi)吡啶核苷酸輔酶總水平。通過操作NAD生物合成中間體形成的相關(guān)基因或NAD合酶基因，增加NAD⑶總水·平的研究已有報(bào)道(San et al. , Metab Eng, 2002,4,182 ；Heuser et al. , Eng Life Sci,2007，7，343)。但由于胞內(nèi)吡啶核苷酸輔酶水平受到嚴(yán)格調(diào)控，其生物合成途徑受到胞內(nèi)輔因子反饋調(diào)控(Foster et al. , J Bacteriol, 1990,172,4187),所以胞內(nèi)總輔因子濃度維持在一定范圍內(nèi)，難以進(jìn)行大幅度調(diào)控。大腸桿菌中存在兩種NAD生物合成途徑，一是NAD從頭合成途徑，即以天冬氨酸為前體，經(jīng)過喹啉酸生成煙酸單核苷酸(NAMN)，再經(jīng)煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(NadD)和NAD合酶(NadE)催化生成NAD。另一種途徑是分支途徑，即以NAD (H)分解中間產(chǎn)物煙酰胺單核苷酸(NMN)為原料，由 NadD 催化生成 NAD (Begley et al.，Vitam Horm，2001，61，103 ；Hove-Jensen et al. ,J Bacteriol, 1996,178, 714)。理論上敲除大腸桿菌基因組中的關(guān)鍵基因nadD和nadE,可得到NAD生物合成途徑阻斷的工程菌株。然而，敲除nadD或nadE后菌株不能正常產(chǎn)生NAD，并且微生物因缺少NAD (H)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)也無法從環(huán)境中獲取NAD。因此，nadD或nadE因敲除菌株因缺少細(xì)胞生長代謝必需的輔因子NAD而無法生長，即nadD或 nadE 被認(rèn)為是致死基因(Baba et al.，Mol Syst Biol，2006，2，20060008)。目前文獻(xiàn)中尚沒有成功獲得nadE或nadE基因敲除或缺失的埃希氏菌屬微生物工程菌株的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過在埃希氏菌屬微生物胞內(nèi)表達(dá)NAD跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并阻斷NAD生物合成途徑，構(gòu)建NAD營養(yǎng)缺陷型工程微生物，實(shí)現(xiàn)對胞內(nèi)吡啶核苷酸輔酶的調(diào)控，并將應(yīng)用于生物催化、NAD跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑篩選、代謝調(diào)控 、非抗生素篩選標(biāo)記和蛋白質(zhì)表達(dá)等生物技術(shù)領(lǐng)域。為解決NAD跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的問題，本發(fā)明采取的策略是在埃希氏菌屬微生物中導(dǎo)入一種可自我復(fù)制并攜帶NAD轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的蛋白質(zhì)表達(dá)載體。NAD跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因包括以下基因，來源于衣原體Protochlamydia amoebophila UWE25的ntt4(NCBIGeneID :2780098) (Haferkamp et al.，Nature，2004，432，622);或來源于釀酒酵母 S288C的ScNDTl(NCBI GeneID :854811)、ScNDT2(NCBI GeneID :856712) (Todisco et al. ,J BiolChem, 2006，281，1524);或來源于擬南芥的 AtNDTl (NCBI GeneID :819362)、AtNDT2 (NCBIGeneID :839124) (Palmieri et al.，J Biol Chem，2009，284，31249)或它們的具有相似功能的突變基因。其中來源于衣原體的ntt4編碼的蛋白NTT4既能轉(zhuǎn)運(yùn)MD，也能轉(zhuǎn)運(yùn)NADH，但對ATP或GTP等沒有明顯轉(zhuǎn)運(yùn)作用，因此，ntt4是優(yōu)選基因。本發(fā)明使用的可自我復(fù)制的蛋白質(zhì)表達(dá)載體為常用的含有誘導(dǎo)型啟動子tac、trc、Iac 或 T7 等的表達(dá)載體(Sambrook et al. , Molecular cloning A laboratorymanual, 2001, pp. 12171240, New York Cold Spring Harbor Laboratory Press);或含有組成型啟動子的表達(dá)載體(Alperatal.，Proc Natl Acad Sci USA，2005，102，12678)。NAD跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因采用成熟的基因克隆技術(shù)插入到蛋白質(zhì)表達(dá)載體中，并進(jìn)一步采用轉(zhuǎn)化方法置入到埃希氏菌屬微生物細(xì)胞內(nèi)(Sambrook et al. , Molecular cloning Alaboratory manual, 2001, pp. 9699, New York Cold Spring Harbor Laboratory Press)。為阻斷埃希氏菌屬微生物NAD生物合成途徑，本發(fā)明采取的策略是通過基因敲除(替換)或基因斷裂的分子生物學(xué)方法，使菌株基因組中編碼煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的基因nadD或編碼NAD合酶的基因nadE的一種或兩種失活。但是，同時(shí)失活基因nadD或基因nadE可更完全地去除胞內(nèi)NAD生物合成能力。埃希氏菌屬微生物基因失活可基于同源重組的原理進(jìn)行(Nelson ed. ,Lehninger Principles of Biochemistry,4th Edition,2005, pp. 978991, Freeman Press)。依據(jù)同源重組臂間插入DNA序列的大小或同源重組臂所對應(yīng)序列在基因組上位置的差異，所得工程菌株中靶基因?qū)?yīng)的DNA片段可以被完全刪除或部分刪除、同時(shí)引入或不引入外源DNA序列。基于同源重組技術(shù)發(fā)展起來的Red重組系統(tǒng)操作簡單、準(zhǔn)確率高，是基因失活的優(yōu)選方法(Datsenko et al. ,Proc Natl Acad SciUSA,2000,97,6640)。本發(fā)明在首先將埃希氏菌屬微生物中導(dǎo)入了可自我復(fù)制并攜帶NAD轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的蛋白質(zhì)表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，進(jìn)行NAD生物合成途徑阻斷改造。因此，本發(fā)明獲得的工程菌株具有NAD跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力，其生長嚴(yán)格依賴于從環(huán)境中獲取NAD(H)，即具有吡啶核苷酸輔酶營養(yǎng)缺陷型的表型。本發(fā)明所述埃希氏菌屬微生物是一類常見的兼性厭氧原核微生物，它們廣泛應(yīng)用在生物技術(shù)的各個(gè)領(lǐng)域，包括蛋白質(zhì)表達(dá)、基因克隆、生物基化學(xué)品生產(chǎn)、生物活性物質(zhì)篩選等。其中MG1655，BW25113等多個(gè)菌株已完成全基因組測序。埃希氏菌屬微生物如大腸桿菌 BW25113(CGSC No. 7636)、MG1655 (CGSC No. 6300)、DH5 a (CGSC No. 12384)、W3110 (CGSCNo. 4474)和DHl (CGSC No. 6040)可從CGSC(美國耶魯大學(xué)大腸桿菌菌種保藏中心)獲得；BL21 (ATCC No. BAA-1025)和 JM109(ATCC No. 53323)可從ATCC(美國典型菌種保藏中心)獲得。以大腸桿菌 BW25113 為例，基因 nadE(NCBI Gene ID :945248)和基因 nadE(NCBI GeneID :946946)的DNA序列已知，可以準(zhǔn)確地敲除或斷裂這兩個(gè)基因，阻斷其NAD生物合成途徑。由于埃希氏菌屬微生物基因序列同源很高，采用本發(fā)明的策略完全可以對其他菌株進(jìn)行相同的基因工程改造。本發(fā)明構(gòu)建了一系列埃希氏菌屬微生物基因工程菌株，它們均具有吡啶核苷酸輔酶營養(yǎng)缺陷型的表型，其中 E. coli YJE003 (CGMCC 4988)或 E. coli YJE004(CGMCC 4989)已由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏。本發(fā)明獲得的具有NAD營養(yǎng)缺陷型表型的埃希氏菌屬微生物，可在一系列生物技 術(shù)領(lǐng)域中應(yīng)用。首先，通過改變培養(yǎng)環(huán)境中吡啶核苷酸輔酶的濃度，可在更大范圍內(nèi)調(diào)控胞內(nèi)吡啶核苷酸輔酶的濃度，為氧化還原代謝提供更強(qiáng)的動力，促進(jìn)生物基化學(xué)品生產(chǎn)。由于本發(fā)明獲得的工程菌株的生長受NAD轉(zhuǎn)運(yùn)能力的制約，當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中存在其他物質(zhì)影響NAD轉(zhuǎn)運(yùn)過程時(shí)，工程菌株的生長也受到影響，利用該特征可評估和篩選NAD轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及相關(guān)生物化學(xué)過程的抑制劑，具有篩選新藥物(如抗衣原體感染)的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明獲得的工程菌株生長嚴(yán)格依賴于環(huán)境中NAD(H)的特點(diǎn)，還可作為非抗生素篩選平臺，用于基因克隆和蛋白質(zhì)表達(dá)，用在抗體和醫(yī)藥用蛋白質(zhì)制備領(lǐng)域。


圖I為NAD營養(yǎng)型缺陷型大腸桿菌菌株YJE003表型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。取ImL菌體密度為IOVmL(OD600 = I)的細(xì)胞分別稀釋至10-1 10_6，取IOyL點(diǎn)到對應(yīng)平板上。YJE003能在含有NAD或NADH的LB平板上生長，但不能在含有NAD生物合成的中間體煙酰胺單核苷酸(NMN)，煙酸(NA)平板上生長。說明￥邛003完全依賴于外源的應(yīng)0 01)才能生長，是NAD (H)
營養(yǎng)型缺陷型菌株。圖2為AMP類似物6e和6i對大腸桿菌YJE003生長影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在含NAD的M9培養(yǎng)基中，加入AMP類似物6e和6i,72h后YJE003菌體密度OD600分別為3. O和O. 40 ；而不添加AMP類似物時(shí)0D_達(dá)到3. I。同時(shí)，野生型菌株BW25113在含有AMP類似物6i的M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h后菌體密度0D_也為3. I。說明應(yīng)用YJE003可以方便地篩選發(fā)現(xiàn)對NAD跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有抑制作用的活性化合物。圖3為大腸桿菌YJE003作為宿主提高甘油轉(zhuǎn)化為二羥丙酮效率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。利用野生型菌株BW25113在不添加和添加NAD的條件下，二羥丙酮濃度分別為I. Og/L和7. Og/L ;而利用大腸桿菌YJE003作為宿主，在添加NAD的條件下二羥丙酮濃度達(dá)到14. lg/L。說明NAD營養(yǎng)型缺陷型菌株可用于提高生物轉(zhuǎn)化的效率。保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)的菌株大腸埃希氏菌 E. coli Y JE003 (Escherichia coli YJE003)，保藏編號CGMCC 4988 ;保藏時(shí)間:2011年6月24日；保藏地點(diǎn)北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號；
保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)的大腸埃希氏菌E. coli YJE004(Escherichia coli YJE004)，保藏編號:CGMCC4989 ;保藏時(shí)間2011 年6月24日；保藏地點(diǎn)北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例有助于了解本專利，但不限定本發(fā)明所涉及的菌株、載體及基因材料。實(shí)施例I :(I)、將 Red 重組酶表達(dá)質(zhì)粒 pKD46 (NCBI Accession No. AY048746)轉(zhuǎn)化到BW25113 中，獲得菌株 BW25113(pKD46)。 (2)、NAD轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NTT4表達(dá)載體構(gòu)建參照衣原體ntt4(NCBI GeneID :2780098)的序列，委托TaKaRa公司(中國大連)通過全基因合成技術(shù)合成ntt4基因。以該合成基因材料為模板，利用ntt4-F/ntt4-R引物和PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa，中國大連)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)克隆ntt4，將擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pET15b(Novagen，USA)進(jìn)行NdeI和BamHII雙酶切，并利用T4連接酶進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒 pET15b-NTT4。以 pET24b (Novagen，USA)為模板，kan-F/kan-R 為引物克隆卡那霉素抗性編碼基因kan。然后采用RF克隆(van den Ent F and Lowe J, JBiochem Biophys Methods, 2006,67,67)方法將kan替換氨節(jié)青霉素抗性編碼基因bla,得到載體pET15k-NTT4，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BW25113 (pKD46)中，得到菌株BW25113 (pKD46，pET15k-NTT4)。ntt4克隆引物(下劃線表示酶切位點(diǎn))ntt4-F :5’ -GAGCATATGAGTAAAACAAACCAG-3’ (NdeI)ntt4-R :5’ -TACGGATCCTTATTTTTTTATAAAAG-3，(BamHI)·卡那霉素抗性編碼基因kan克隆引物kan-F :5’-TTAAACATGCCAGTGATGCAAAGGTAGTGCAAGAGCTATGACATATACCTGCCGTTCAC-3’kan-R :5’-TCAGGCGGTCAGTGTATCATCACTCATACTCTGCCCGACACCATGGTCATAGCTGTTTC-3’(3)、nadE敲除盒的構(gòu)建以 nadE :cat_F/nadE :cat_R 從模板質(zhì)粒 pKD3 (NCBI Accession No. AY048742)中通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增帶有氯霉素抗性基因cat的敲除盒nadE :cat。敲除盒nadE cat構(gòu)建引物nadE :cat_F :5’-CTGTTGTGCCATAAACCCCTGGCGGACGTATTTATCGACGGTTGATATGAtgggaattagccatggtcc-3’nadE :cat_R :5’-CGCATCATGCCCTCCGTAACGACAGGTATCAGCGATACAAGCCTTGTTGgtgtaggctggagctgcttc-3’(引物中大寫堿基表示nadE基因外側(cè)同源重組序列，小寫部分為cat基因序列)。(4)、敲除盒轉(zhuǎn)化及篩選
將敲除片段nadE cat電轉(zhuǎn)化到BW25113 (pKD46，pET15k_NTT4)中，涂布于含有50 μ g/mL卡那霉素，25 μ g/mL氯霉素和500 μ M NAD的SOB平板(20g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，0.5g/L NaCl, 2. 5mM KCl, ImM MgCl2, ImM MgSO4,15g/L 瓊脂)上，37C，培養(yǎng) 24 天。選取單菌落，于37C在以下平板上梯度稀釋培養(yǎng)，包括含有50 μ g/mL卡那霉素，25 μ g/mL氯霉素和500 μ M NAD 的 LB 平板(10g/L 蛋白胨，5g/L 酵母粉，10g/L NaCl，15g/L 瓊脂)、含有 50 μ g/mL卡那霉素，25 μ g/mL氯霉素和500 μ M NADH的LB平板、含有50 μ g/mL卡那霉素，25 μ g/mL氯霉素和500 μ M NMN的LB平板、含有50 μ g/mL卡那霉素，25 μ g/mL氯霉素和500 μ M煙酸(NA)的LB平板和含有50 μ g/mL卡那霉素和25 μ g/mL氯霉素的LB平板。實(shí)施例結(jié)果見圖I。發(fā)現(xiàn)得到的工程菌株可以在含有50 μ g/mL卡那霉素，25 μ g/mL氯霉素和500 μ M NAD的LB平板或含有50 μ g/mL卡那霉素，25 μ g/mL氯霉素和500 μ MNADH的LB平板上生長，但不能在其他3種平板上生長，說明構(gòu)建的工程菌株具有NAD (H)營養(yǎng)缺陷型表型。 該菌株命名為大腸桿菌(E. coli)YJE003,已其由中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)保藏，菌株保藏號為CGMCC 4988。實(shí)施例2(I)、nadD敲除盒的構(gòu)建以 nadD :cat_F/nadD :cat_R 從模板質(zhì)粒 pKD3 (NCBI Accession No. AY048742)中通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增帶有氯霉素抗性基因cat的敲除盒nadD :cat。nadD :cat_F :5’-CGGGTTAGCTTTAAGGAAGTTTTGTCTTTTCTGTCTGGAGGGGTTCAatgggaattagccatggtcc-3’nadD :cat_R :5’-CTTTTTCGCACAATCCAATATGTGCAAATTATTACTTTTTCCAGAAATCATCgtgtaggctggagctgcttc-3’(引物中大寫堿基表示nadD基因外側(cè)同源重組序列，小寫部分為cat基因序列)。(2)、敲除盒轉(zhuǎn)化及篩選將敲除片段nadE cat電轉(zhuǎn)化到實(shí)施例I構(gòu)建好的BW25113 (pKD46，pET15k_NTT4)中，涂布于含有50 μ g/mL卡那霉素，25 μ g/mL氯霉素和500 μ M NAD的SOB平板上，37C，培養(yǎng)24天。選取單菌落，于37C在不同平板上梯度稀釋培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)所得工程菌株和Ε. coliYJE003具有相同的NAD(H)營養(yǎng)缺陷型表型。該菌株命名為大腸桿菌(E. coli)YJE004,已其由中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)保藏，菌株保藏號為CGMCC 4989。實(shí)施例3 (I)、將 Red 重組酶表達(dá)質(zhì)粒pKD46(NCBI Accession No. AY048746)轉(zhuǎn)化到MG1655中，獲得菌株MG1655 (pKD46)。(2)、NAD轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ScNDTl表達(dá)載體構(gòu)建以釀酒酵母S288C基因組DNA為模板，利用ScNDTl-F/ScNDTl-R引物和PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa，中國大連)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)克隆ScNDTl，將擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pET15b(Novagen，USA)進(jìn)行NdeI和BamHI雙酶切，并利用T4連接酶進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒 pET15b_ScNDTl。然后米用 RF 克隆(van den Ent F and Lowe J, J BiochemBiophys Methods, 2006,67,67)方法將卡那霉素抗性編碼基因kan替換氨節(jié)青霉素抗性編碼基因bla，得到載體pET15k-ScNDTl，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655 (pKD46)中，得到菌株MG1655(pKD46, pET15k_ScNDTl)。ScNDTl克隆引物(下劃線表示酶切位點(diǎn))ScNDTl-F 5 ~GAGCATATGACACAGACTGATAATCC~3 (NdeI)ScNDTl-R 5 -TACGGATCCTTAAATTACCATAGTGCTAATATT-3> (BamHI)(3)、敲除盒轉(zhuǎn)化及篩選 將實(shí)施例I構(gòu)建的敲除盒nadE cat電轉(zhuǎn)化到MG1655 (pKD46，pET15k_ScNDTl)中，涂布于含有50 μ g/mL卡那霉素，25 μ g/mL氯霉素和500 μ M NAD的SOB平板上，37C，培養(yǎng)24天。選取單菌落，于37C在不同平板上梯度稀釋培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)所得工程菌株和Ε. coli YJE003具有相似的NAD(H)營養(yǎng)缺陷型表型，但其生長速度較慢。實(shí)施例3說明利用其他NAD轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ScNDTl)和不同埃希氏菌屬微生物菌種(MG1655)，按照本發(fā)明的方法，均可以獲得具有NAD營養(yǎng)缺陷型表型的工程菌株。實(shí)施例4 (I)、將 Red 重組酶表達(dá)質(zhì)粒 pKD46 (NCBI Accession No. AY048746)轉(zhuǎn)化到 B121中，獲得菌株B121(pKD46)。(2)、NAD轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtNDT2表達(dá)載體構(gòu)建參照擬南芥AtNDT2 (NCBI Gene ID :839124)的序列，委托TaKaRa公司(中國大連)通過全基因合成技術(shù)合成AtNDT2基因。以該合成基因材料為模板，利用AtNDT2-F/AtNDT2-R引物和PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa，中國大連)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)克隆AtNDT2，將擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pET15b (Novagen, USA)進(jìn)行NdeI和BamHI雙酶切，并利用T4連接酶進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pET15b-AtNDT2。然后采用RF克隆(van den Ent F and Lowe J,JBiochem Biophys Methods, 2006,67,67)方法將卡那霉素抗性編碼基因kan替換氨節(jié)青霉素抗性編碼基因bla，得到載體pET15k-A tNDT2，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655 (pKD46)中，得到菌株 MG1655 (pKD46, pET15k_AtNDT2)。AtNDT2克隆引物(下劃線表示酶切位點(diǎn))AtNDT2~F 5 -GAGCATATGATTGAACATGGGAACTCTAC-3> (NdeI)AtNDT2~R 5 -TACGGATCCTTATTTGCTTCCAAGAGGGATATG-3> (BamHI)(3)、敲除盒轉(zhuǎn)化及篩選將實(shí)施例I構(gòu)建的敲除盒nadE cat電轉(zhuǎn)化到MG1655 (pKD46，pET15k_AtNDT2)中，涂布于含有50 μ g/mL卡那霉素，25 μ g/mL氯霉素和500 μ M NAD的SOB平板上，37C，培養(yǎng)24天。選取單菌落，于37C在不同平板上梯度稀釋培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)所得工程菌株和Ε. coli YJE003具有相似的NAD (H)營養(yǎng)缺陷型表型，但其生長速度非常慢，原因可能是AtNDT2來源于擬南芥，在大腸桿菌活性不足。實(shí)施例4進(jìn)一步說明利用其他NAD轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AtNDT2)和不同埃希氏菌屬微生物菌種(BL21)，按照本發(fā)明的方法，均可以獲得具有NAD營養(yǎng)缺陷型表型的工程菌株。實(shí)施例5
工程菌株E.coli YJE003在37°C，含有ΙΟΟμΜ NAD的LB液體培養(yǎng)基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl)中培養(yǎng)12h，收集細(xì)胞并用M9培養(yǎng)基(葡萄糖4. Og/L, Na2PO4 · 7H20 12. 8g/L, ΚΗ2Ρ043· Og/L, NaCl 0. 5g/L, NH4Cl I. Og/L, MgSO4 0. 24g/L,CaCl2O. Olg/L)洗滌 2 遍，接種到含 100 μ MAMP 類似物 6e 或 6i (Hou et al.，Bioorg MedChem Lett, 2011, 21,1667)和ΙΟΟμΜ NAD的LB液體培養(yǎng)基中，初始細(xì)胞光密度0D_ (細(xì)胞懸濁液在波長600nm處的吸收值，光路徑長度為Icm)為O. 04，72h后測定細(xì)胞光密度0D_。大腸桿菌BW25113在37°C，含有100 μ MNAD的 LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，收集細(xì)胞并用M9培養(yǎng)基洗滌2遍，接種到含100 μ M AMP類似物6i和100 μ MNAD的LB液體培養(yǎng)基中，初始細(xì)胞光密度0D_為0. 04，72h后測定細(xì)胞光密度OD6tltl值。實(shí)施例結(jié)果見圖2。發(fā)現(xiàn)在含NAD的M9培養(yǎng)基中，加入AMP類似物6e和6i，72h后YJE003菌體光密度OD600分別為3. O和O. 40 ;而不添加AMP類似物時(shí)OD600達(dá)到3. I。而野生型菌株BW25113在含有AMP類似物6i的M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h后菌體密度0D_也為
3.I。表明AMP類似物6i對E. coliYJE003生長有抑制作用，而對BW25113沒有抑制作用。由于E. coli YJE003Y生長依賴NTT4轉(zhuǎn)運(yùn)NAD，AMP類似物6i對E. coli YJE003生長有抑制作用說明，類似物6i對NAD轉(zhuǎn)運(yùn)過程具有抑制作用。因此，NAD營養(yǎng)缺陷型菌株可以方便地發(fā)現(xiàn)對NAD跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有抑制作用的活性化合物，用于建立抗衣原體的藥物活性篩選平臺。實(shí)施例6 (I)、催化甘油生成二羥丙酮菌株構(gòu)建以大腸桿菌BW25113基因組DNA為模板，利用gldA-F/gldA-R引物和PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa，中國大連)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)克隆得到甘油脫氫酶基因 gldA(NCBI GeneID :948440);以 Enterococcus faecalis V583 基因組 DNA 為模板，利用 EfN0X-F/EfN0X-R 克隆得到 NADH 氧化酶基因 Efnox (NCBI GeneID :1200486)。隨后以 gldA-F/EfNOX-R 為引物、gldA 及 EfNOX 為模板，通過重疊延伸 PCR(Horton，R. M. et al,Gene, 1989, 77,61)獲得雙基因表達(dá)盒 gldA-Efnox。然后通過 RF 克隆(van den Ent F andLowe J, J Biochem Biophys Methods, 2006,67,67)將 gldA-Efnox 克隆到 pTrc99A (NCBIAccession No. U13872)載體的Trc啟動子后面獲得雙基因表達(dá)質(zhì)粒pTr99A-gldA_efN0X。分別將質(zhì)粒 pTr99A-gldA-efN0X 轉(zhuǎn)化到 E. coli BW25113 和 E. coli YJE003 中，得到菌株E.coli GNOl 和 E. coli GN03。雙基因gldA-Efnox表達(dá)載體構(gòu)建引物gldA-F CAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGACCGCATTATTCAATCACgI dA-R GTGTATATCTCCTTCTCTAGTAGCGATCTATTATTCCCACTCTTGCAGGefN0X-F CTACTAGAGAAGGAGATATACACATGAAAGTCGTAGTCGTAGGe FNOX-R CAAAACAGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTACATATTTTCTAAAGCGGCTTG(2)、工程菌株GNOl和GN03細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化甘油生成二羥丙酮E. coli GNOl在37°C，含有100 μ M NAD的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，收集細(xì)胞并用M9培養(yǎng)基洗滌2遍，接種到含100 μ M NAD的LB液體培養(yǎng)基中，初始細(xì)胞光密度0D_為
0.04，培養(yǎng)至細(xì)胞光密度0D_為0. 40. 6，加0. 5mM異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)20h，收集細(xì)胞用IOOmM Na2HPO4緩沖液(pH 9. 4)清洗2遍，重懸于含有100 μ M NAD的IOOmM Na2HPO4緩沖液(pH 9.0)中，細(xì)胞密度為2g干菌體(DCW)/L，加入30g/L甘油，37°C，200rpm反應(yīng)3h,測定二輕丙酮濃度。以E.coli GN03為菌株材料，按照上述條件操作，測定二羥丙酮濃度。實(shí)施例結(jié)果見圖3。利用E. coli GN03在不添加和添加NAD的條件下，二羥丙酮濃度分別為I. Og/L和7. Og/L ;而利用E. coli GNOl在添加NAD的條件下二羥丙酮濃度達(dá)到14. lg/L。說明NAD營養(yǎng)型缺陷型菌株可用于提高生物轉(zhuǎn)化的效率。實(shí)施例6說明NAD營養(yǎng)缺陷型菌株R. coli YJE003可作為氧化還原催化體系的宿主，通過在培養(yǎng)基中增加輔因子供給，提高催化轉(zhuǎn)化效率。實(shí)施例7 (I)、催化丙酮酸生成D-乳酸菌株構(gòu)建 以大腸桿菌BW25113基因組DNA為模板，利用ldhA_F/ldhA-R引物和PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa，中國大連)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，克隆得到D-乳酸脫氫酶基因 ldhA(NCBI GeneID :946315);以博伊丁假絲酵母 C.boidinii ATCC 46498 基因組DNA為模板，利用CbFDH-F/CbFDH-R克隆得到甲酸脫氫酶基因Cbfdh (NCBI AccessionNo. AF004096)。隨后以ldhA-F/CbFDH-R為引物、IdhA及CbFDH為模板，通過重疊延伸PCR(Horton et al.，Gene，1989，77，61)獲得雙基因表達(dá)盒 ldhA-fdh。然后通過 RF 克隆(van den Ent F and Lowe J, J Biochem Biophys Methods, 2006,67,67)將 ldhA-fdh 克隆到pTrc99A(NCBI Accession No. U13872)載體的Trc啟動子后面，獲得到雙表達(dá)質(zhì)粒pTr99A-ldhA-fdh。分別將質(zhì)粒pTr99A-ldhA-fdh轉(zhuǎn)化到E. coli YJE004和E. coli BW25113中，得到菌株 E.coli LFOl 和 E.coli LF03。IdhA-F CAATTTCACACAGGAAACAGACCATGAAACTCGCCGTTTATAGIdhA-R GTGTATATCTCCTTCTCTAGTAGCGATCTATTAAACCAGTTCGTTCGGcbFDH-F GATCGCTACTAGAGAAGGAGATATACACATGAAGATCGTTTTAGTCcbFDH-R AAAACAGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTATTTCTTATCGTGTTTAC(2)、工程菌株LFOl和LF03細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化丙酮酸生成D-乳酸溶 E.coli LFOl在37°C，含有100 μ M NAD的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，收集細(xì)胞并用M9培養(yǎng)基洗滌2遍，接種到含100 μ M NAD的LB液體培養(yǎng)基中，初始細(xì)胞光密度0D_為0. 04，培養(yǎng)至細(xì)胞光密度 OD600 為 O. 40. 6，加 O. 5mM IPTG 誘導(dǎo) 30h,收集細(xì)胞用 IOOmM Na2HPO4 緩沖液(pH 8. 0)清洗2遍，重懸于含有IOOmM Na2HPO4緩沖液(pH 8.0)中，細(xì)胞密度為以2. 5g DCW/L，加入一定濃度的丙酮酸鈉和一定濃度的NADH，370C，200rpm反應(yīng)3h，測定乳酸濃度。以E.coli LF03為菌株材料，按照上述條件操作，測定乳酸濃度。實(shí)施例結(jié)果見表I。在不添加NADH的條件下，工程菌株LFOl和LF03催化反應(yīng)的乳酸沒有明顯差別。但是，當(dāng)反應(yīng)體系中加入ΙΟΟμΜ NADH后，工程菌株LFOI比LF03取得了更高乳酸產(chǎn)率。并且，增加反應(yīng)體系中NADH的濃度，可以促進(jìn)乳酸生成。增加丙酮酸初始濃度，雖然乳酸產(chǎn)率下降，但乳酸濃度明顯提高。說明NAD營養(yǎng)型缺陷型菌株可用于提高生物轉(zhuǎn)化的效率。實(shí)施例7說明NAD營養(yǎng)缺陷型菌株Ε. coli YJE004也可作為氧化還原催化體系的宿主，通過增加輔因子供給，提高催化效率。表I :工程菌株LFOl和LF03轉(zhuǎn)化丙酮酸的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)營養(yǎng)缺陷型的埃希氏菌屬(Escherichia)微生物，其構(gòu)建過程如下， 1)將一種表達(dá)NAD跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的可自我復(fù)制的載體導(dǎo)入埃希氏菌屬微生物細(xì)胞內(nèi)； 2)采用基因敲除和/或基因斷裂的方法使埃希氏菌屬微生物基因組中編碼煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的基因nadD、編碼NAD合酶的基因nadE中的一種或兩種失活。
2.按照權(quán)利要求I所述的微生物，其特征在于所述NAD跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因是衣原體的基因 ntt4(NCBI GeneID :2780098)、或酵母的基因 ScNDTl (NCBI GeneID :854811)、或酵母的 ScNDT2 (NCBI GeneID :856712)、或擬南芥的基因 AtNDTl (NCBI GeneID :819362)、或擬南芥的AtNDT2(NCBI GeneID :839124)、或它們的具有相似功能的突變基因。
3.按照權(quán)利要求I所述的微生物，其特征在于其生長依賴于培養(yǎng)環(huán)境中存在的NAD或其還原態(tài)化合物NADH、或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或其還原態(tài)化合物NADPH中的一種或多種組合。
4.按照權(quán)利要求1、2或3所述的微生物，其特征在于該微生物為保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)的菌株大腸埃希氏菌E. coli YJE003，保藏編號CGMCC 4988 ;保藏時(shí)間2011年6月24日；保藏地點(diǎn)北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號； 或該微生物為保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)的大腸埃希氏菌E. coli YJE004，保藏編號CGMCC 4989 ;保藏時(shí)間2011年6月24日；保藏地點(diǎn)北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。
5.—種權(quán)利要求1、2、3或4所述微生物的應(yīng)用,其特征在于所述微生物生長培養(yǎng)時(shí)，通過在埃希氏菌屬微生物培養(yǎng)基中添加總濃度為O. 005mmo 1/L lOmmol/L的吡啶核苷酸輔酶，調(diào)控胞內(nèi)吡啶核苷酸輔酶的濃度，改善細(xì)胞的代謝行為，進(jìn)而獲得一種或多種埃希氏菌屬微生物代謝物產(chǎn)量。
6.—種權(quán)利要求1、2、3或4所述微生物的應(yīng)用,其特征在于所述微生物生長培養(yǎng)時(shí)，通過在埃希氏菌屬微生物培養(yǎng)基中添加終濃度分別為O. 005mmol/L IOmmoI/L的吡啶核苷酸輔酶和待篩選的化合物，通過觀測該微生物的生長速度變化，獲知被篩選的化合物對NAD跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制性能。
7.一種權(quán)利要求1、2、3或4所述微生物的應(yīng)用，其特征在于所述微生物通過下述方式之一，應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達(dá)I)向所述微生物導(dǎo)入攜帶表達(dá)特定蛋白質(zhì)編碼基因的可自我復(fù)制的載體，或，2)向所述微生物導(dǎo)入攜帶表達(dá)特定蛋白質(zhì)編碼基因并且表達(dá)nadD基因或nadE基因的可自我復(fù)制的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)營養(yǎng)缺陷型埃希氏菌屬(Escherichia)微生物的構(gòu)建及其應(yīng)用。通過向埃希氏菌屬微生物引入NAD轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并且阻斷胞內(nèi)NAD生物合成途徑，構(gòu)建出依賴于外源吡啶核苷酸輔酶生長的埃希氏菌屬工程菌。NAD營養(yǎng)缺陷型埃希氏菌可在生物技術(shù)領(lǐng)域用于篩選吡啶核苷酸輔酶代謝的抑制藥物、提高氧化還原生物轉(zhuǎn)化效率、建立基因克隆和蛋白質(zhì)異源表達(dá)的非抗生素篩選平臺等。
文檔編號C12N15/70GK102925398SQ201110227540
公開日2013年2月13日 申請日期2011年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月9日
發(fā)明者趙宗保, 周雍進(jìn), 林心萍, 張素芳 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所