熱穩(wěn)定天冬酰胺酶變體以及對(duì)其進(jìn)行編碼的多核苷酸的制作方法
【專利說明】熱穩(wěn)定天冬酰胺酶變體以及對(duì)其進(jìn)行編碼的多核苷酸
[0001] 序列表的引用
[0002] 本申請(qǐng)包括一個(gè)計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，將其通過引用結(jié)合在此。
[0003]發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及天冬酰胺酶變體、編碼這些變體的多核苷酸、產(chǎn)生這些變體的方法以 及使用這些變體的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用一種或多種發(fā)酵生物從植物材料生產(chǎn)糖、 糊精和發(fā)酵產(chǎn)品的方法。
[0005] 相關(guān)技術(shù)說明
[0006] 熟知的是，可以通過減少食物材料中的天冬酰胺的量的處理來減少加熱食物 產(chǎn)品中的丙烯酰胺形成，例如通過使食物材料經(jīng)受天冬酰胺酶的作用（參見例如，W0 2004/026042)〇
[0007] 已經(jīng)鑒定了多種真菌天冬酰胺酶；參見例如，W0 2004/030468或TO 2004/032648。已經(jīng)描述了用于改進(jìn)其特性的此類天冬酰胺酶的蛋白質(zhì)工程。TO 2008/128974、W0 2008/128975和W0 2011/134916披露了來自黑曲霉的在更堿性的pH下 具有改進(jìn)活性的天冬酰胺酶變體。W0 2008/110513披露了來自米曲霉的具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定 性的天冬酰胺酶變體。然而，在天冬酰胺酶的某些工業(yè)應(yīng)用中，例如，在法式炸薯?xiàng)l的生產(chǎn) 中，甚至更高的熱穩(wěn)定性是所希望的。
[0008] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供與其親本相比具有改進(jìn)的特性的天冬酰胺酶變體。
[0009] 現(xiàn)今，通過發(fā)酵生物生產(chǎn)大量難于合成地生產(chǎn)的商業(yè)產(chǎn)品。此類產(chǎn)品包括醇類 (例如，丁醇、乙醇、甲醇、1，3-丙二醇）；有機(jī)酸類（例如，乙酸、檸檬酸、葡糖酸鹽、葡糖酸、 衣康酸、乳酸、琥珀酸、2, 5-二酮-D-葡糖酸）；酮類（例如，丙酮）；氨基酸（例如，谷氨酸）； 氣體（例如，H2和C02);以及更復(fù)雜的化合物，包括例如抗生素（例如，青霉素和四環(huán)素）； 酶；維生素（例如，核黃素、B12、P-胡蘿卜素）；以及激素。發(fā)酵也通常被用于可食用酒精 (例如，啤酒和白酒）、乳制品（例如，用于生產(chǎn)酸奶酪和干酪）、皮革以及煙草工業(yè)中。
[0010] 在本領(lǐng)域已知大量通過由含淀粉材料的降解提供的糖進(jìn)行發(fā)酵來生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品 (例如，乙醇）的方法。
[0011] 然而，從此類植物材料中生產(chǎn)糖、糊精和發(fā)酵產(chǎn)品（例如乙醇）仍成本太高。因此， 對(duì)提供可以增加發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)率并且由此減少生產(chǎn)成本的方法存在需要。
[0012] 本發(fā)明的一個(gè)另外的目的是提供用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的改進(jìn)方法。
[0013]發(fā)明概述
[0014] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種天冬酰胺酶變體，該變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDN0:2的 位置140或241的一個(gè)或多個(gè)位置處包括取代，或在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO: 2的位置27的位置 處包括缺失，其中該變體與SEQIDN0:2或4的任一個(gè)的成熟多肽具有至少50%序列一致 性，并且其中該變體具有天冬酰胺酶活性。
[0015]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種天冬酰胺酶變體，該變體在對(duì)應(yīng)于SEQIDN0:2 的位置 122、140、197、238、239、240、241、253、258、259、297 或 373 的一個(gè)或多個(gè)位置處包括 取代，或在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的位置27、28或29的一個(gè)或多個(gè)位置處包括缺失，其中該 變體與SEQIDN0:2或4的任一個(gè)的成熟多肽具有至少80%序列一致性，并且其中該變體 具有天冬酰胺酶活性。
[0016] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種天冬酰胺酶變體，該變體包括（i)以下取代中 的一個(gè)或多個(gè)，其中每個(gè)位置都對(duì)應(yīng)于SEQIDN0:2中的位置：T71C、T74C、K122A、V139G、T140D、K194L、D197E、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258Y、R259C、R259V、S334W、 S338W、G356D、K363R或E373H，或（ii)缺失，該缺失位于對(duì)應(yīng)于SEQIDN0:2的位置27的 位置處；其中該變體與SEQIDN0:2或4的任一個(gè)的成熟多肽具有至少50%序列一致性， 并且其中該變體具有天冬酰胺酶活性。
[0017] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種天冬酰胺酶變體，該變體包括（i)以下取代中 的一個(gè)或多個(gè)，其中每個(gè)位置都對(duì)應(yīng)于SEQIDN0:2中的位置：T71C、I74A、T74C、K122A、K122R、V139G、T140D、K194L、D197E、I228M、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258V、 I258Y、R259C、R259V、S297V、S299A、T314A、P333L、S334P、S334W、E337S、S338G、S338W、 G356D、K363R或E373H，或（ii)缺失，該缺失位于對(duì)應(yīng)于SEQIDNO: 2的位置27、28或29 的一個(gè)或多個(gè)位置處；其中該變體與SEQIDN0:2或4的任一個(gè)的成熟多肽具有至少80% 序列一致性，并且其中該變體具有天冬酰胺酶活性。
[0018] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種天冬酰胺酶變體，該變體具有至少76 °C，優(yōu)選至 少77°C、至少78°C、至少79°C或至少80°C，例如至少81 °C、至少82°C、至少83°C、至少84°C或至少85°C的解鏈溫度Tm，其中該Tm是通過差示掃描量熱法確定，并且該變體與SEQID N0:2或4的任一個(gè)的成熟多肽具有至少50%序列一致性。
[0019] 本發(fā)明還涉及編碼這些變體的分離的多核苷酸；包含這些多核苷酸的核酸構(gòu)建 體、載體和宿主細(xì)胞；以及產(chǎn)生這些變體的方法。
[0020] 本發(fā)明還涉及在食物產(chǎn)品的生產(chǎn)中使用這些變體的方法。
[0021] 本發(fā)明還涉及獲得這些變體的方法。
[0022] 本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，包括：
[0023] (a)在本發(fā)明的天冬酰胺酶的存在下，用a_淀粉酶將一種含淀粉材料液化為糊 精；
[0024] (b)用糖化酶將該糊精糖化為糖；并且
[0025] (c)使用發(fā)酵生物發(fā)酵該糖，以生產(chǎn)該發(fā)酵產(chǎn)品。
[0026] 本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)糖的方法，包括：
[0027] (a)在本發(fā)明的天冬酰胺酶的存在下，用a_淀粉酶將一種含淀粉材料液化為糊 精；并且
[0028] (b)用糖化酶將該糊精糖化為糖。
[0029] 本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，包括：
[0030] (a)用本發(fā)明的天冬酰胺酶處理一種含淀粉材料；
[0031] (b)用a_淀粉酶將該處理的含淀粉材料液化為糊精；
[0032] (c)用糖化酶將該糊精糖化為糖；并且
[0033] (d)使用發(fā)酵生物發(fā)酵該糖，以生產(chǎn)該發(fā)酵產(chǎn)品。
[0034] 本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)糊精的方法，包括：
[0035] (a)在本發(fā)明的天冬酰胺酶的存在下，用a _淀粉酶將一種含淀粉材料液化為糊 精；并且
[0036] (b)回收該糊精。
[0037] 本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，包括：
[0038] (a)用本發(fā)明的天冬酰胺酶處理一種含淀粉材料；
[0039] (b)用a _淀粉酶將該處理的含淀粉材料液化為糊精；
[0040] (c)用糖化酶將該糊精糖化為糖；并且
[0041] (d)使用發(fā)酵生物發(fā)酵該糖，以生產(chǎn)該發(fā)酵產(chǎn)品。
[0042] 本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)糖的方法，包括：
[0043] (a)用本發(fā)明的天冬酰胺酶處理一種含淀粉材料；
[0044] (b)用a _淀粉酶將該處理的含淀粉材料液化為糊精；并且
[0045] (c)用糖化酶將該糊精糖化為糖。
[0046] 本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)糊精的方法，包括：
[0047](a)用本發(fā)明的天冬酰胺酶處理一種含淀粉材料；并且
[0048] (b)用a _淀粉酶將該處理的含淀粉材料液化為糊精。
[0049] 本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，包括用a_淀粉酶將一種含淀粉材料轉(zhuǎn) 化為糊精；用葡糖淀粉酶將該糊精糖化為糖；并且在本發(fā)明的天冬酰胺酶的存在下，使用 發(fā)酵生物在低于該含淀粉材料的初始凝膠化溫度的溫度下以一個(gè)單一步驟發(fā)酵該糖。
[0050] 本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，包括
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