專利名稱：一種用cyp710a11基因培育抗脅迫轉(zhuǎn)基因植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用番茄細(xì)胞色素P450基因CYP710A11， 通過基因工程等技術(shù)手段，培育抗脅迫植物，提高植物耐鹽、耐干旱等抗脅迫的能力。
背景技術(shù)：
已知基因新功能的發(fā)掘利用，以及未知基因的功能研究，為拓展基因資源庫及有效利用基因資源提供重要的依據(jù)，是基因功能研究的重要方向之一。干旱和土壤鹽害是威脅全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最重要的逆境因子。加之氣候變化、環(huán)境破壞使近年來干旱低溫冷凍等極端天氣加劇，使受干旱、鹽害面積不斷擴(kuò)大，作物生產(chǎn)受到極大威脅?？鼓嬷参镄虏牧系呐嘤且粋€(gè)持續(xù)而長久的課題，抗逆基因的發(fā)掘及利用具有重要意義。細(xì)胞色素P450 (Cytochrome P450，簡稱CYP450，P450)是一類以還原態(tài)與CO結(jié)合后在波長450nm處有吸收峰的含血紅素的蛋白酶類，廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌等細(xì)胞內(nèi)，是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、質(zhì)體、高爾基體等細(xì)胞器膜結(jié)合的氧化還原酶類，其編碼基因家族，是一個(gè)龐大的超基因家族。它們參與多種生物化學(xué)反應(yīng)，其功能主要可歸為兩大類 1)參與生物合成途徑，2)參與生物解毒途徑賀麗虹等，2008。截止2010年，已鑒定了 11500 多個(gè) P450 蛋白http://en. wikipedia. org/wiki/Cytochrome P450。在植物體內(nèi)，P450基因估計(jì)占已知基因的Mizutani M&Ohta D. 2010，是高等植物中最大的酶蛋白家族，廣泛地催化單加氧/羥基化反應(yīng)，合成多種初級和次生代謝產(chǎn)物如苯丙烷類，生物堿，萜類，脂肪酸，生氰糖苷，硫甙類和植物激素等，而且參與許多外源性物質(zhì)包括除草劑、農(nóng)藥等的生物氧化MA S&fferck-Reichhart D. 2003 ；Nelson DR, et al. 2008。有關(guān)細(xì)胞色素P450基因的研究極其繁多，主要集中在它們的生物合成和生物解毒功能上。它們催化產(chǎn)生的一些重要次生代謝產(chǎn)物，在植物抵抗病蟲害及生產(chǎn)重要藥用價(jià)值的天然化合物中，具有重要作用。并能分解有毒物質(zhì)如除草劑、農(nóng)藥等，使植物抵抗有毒逆境的脅迫楊致榮等，2003 ；賀麗虹等，2008。迄今仍然有大部分的P450基因的功能未得到鑒定，擬南芥中含有246個(gè)P450基因，其中只有約60個(gè)通過突變體或者異源表達(dá)鑒定了功能，尚有70%未被鑒定Mizutani M&Ohta D.2010。目前尚沒有關(guān)于它們在植物干旱、鹽害等非生物脅迫中作用的報(bào)道。在植物基因工程研究中，P450基因的利用，多集中在生產(chǎn)具有重要醫(yī)藥價(jià)值的天然化合物iTakemura T, et al. 2010 ；Pfalz M，2011 Jensen K，2011 ，提高植物對病原菌的抗性Cheng Dff et al,2010 ；Griebel T&Zeier J，2010，提高植物解毒能力如培育抗除草劑新材料Xia XJ et al,2009 ；Busi R，et al 2010，培育能清除污染環(huán)境的修復(fù)植物 [Van Aken B，2009等。而有關(guān)P450用于抗干旱、高鹽、低溫等非生物逆境的基因工程研究，未見報(bào)道。在植物中，細(xì)胞色素P450大家族中CYP710A亞家族基因編碼留醇C_22去飽和酶。 目前獲得的編碼基因有 CYP710A1、CYP710A2、CYP710A3、CYP710A4、CYP710A5、CYP710A6、 CYP710A7、CYP710A8 和 CYP710A11。其中 CYP710A1 CYP710A4 來自擬南芥(Arabidopsisthaliana) ,CYP710A5 CYP710A8 來自水稻(Oryza Sativa)，CYP710A11 來自番茄(Solanum lycopersicum) [Morikawa T. et al,2006 ；Nelson DR, et al，2004，2008。其中來自擬南芥的CYP710A1和來自番茄的CYP710A11基因具有相同的功能，編碼的甾醇C-22去飽和酶催化谷留醇生成豆留醇，是留醇合成途徑中的關(guān)鍵酶，在留醇合成中起重要作用。在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過量表達(dá)CYP710A11基因，能提高豆甾醇含量6- 倍 [Morikawa Τ. et al，2006。另外，CYP710A11在番茄果實(shí)成熟過程中表達(dá)增加，同時(shí)豆甾醇含量也增加Whitaker BD and Gapper NE, 2008 Morikawa Τ.等和 Whitaker BD 等分離克隆的番茄CYP710A11基因在GenBank中的登錄號分別為ΑΒ223043和EU224275。脫落酸(Abscisic acid, ABA)調(diào)節(jié)植物對非生物逆境的抗性得到廣泛的證實(shí)，脫落酸一個(gè)很重要的功能是調(diào)節(jié)植物對環(huán)境的適應(yīng)性，在提高植物對逆境脅迫如干旱、高鹽、 低溫的耐受力方面，發(fā)揮重要的作用，有關(guān)研究已有大量的報(bào)道Hirayama，T&Shinozaki, K，2007，2010。了解ABA與CYP710A11基因的關(guān)系，有助于了解該基因的抗逆功能。目前還沒有關(guān)于CYP710A11基因是否具有調(diào)節(jié)植物抗逆境脅迫功能的報(bào)道，亦沒有在提高植物抗逆境脅迫中應(yīng)用的報(bào)道。本發(fā)明從番茄中分離克隆了 CYP710A11基因，該基因⑶S長度為1506bp，編碼長度為501個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。通過熒光定量PCR技術(shù)研究，表明CYP710A11基因受脫落酸 (Abscisic acid，ABA)誘導(dǎo)表達(dá)。通過轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證，鑒定了 CYP710A11基因具有顯著提高植物對高鹽、干旱和高滲透、ABA脅迫、重金屬脅迫等耐受力的功能。環(huán)境脅迫(干旱、鹽、重金屬等)對植物的生長有很大的影響。傳統(tǒng)育種方法培育新的抗逆品種周期長且見效慢，轉(zhuǎn)基因方法見效快，但又不影響其他已有的好的性狀，逐漸成為抗逆品種改良的主要方法。本發(fā)明所提供的番茄P450基因CYP710A11在煙草中過量表達(dá)，使得轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株明顯增強(qiáng)了對高鹽、干旱、ABA脅迫、重金屬脅迫的耐受性。表明CYP710A11基因具有抗非生物逆境的功能，能顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草抗逆境脅迫如干旱、高鹽、重金屬脅迫的能力，在多種環(huán)境條件脅迫下對植物起保護(hù)作用。因此， CYP710A11基因可以作為一個(gè)有效的目標(biāo)基因用于培育其他耐高鹽或者耐干旱或者耐重金屬的轉(zhuǎn)基因植物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一個(gè)番茄P450基因CYP710A11在提高植物抗非生物脅迫方面的應(yīng)用，以拓展基因CYP710A11的應(yīng)用范圍。本發(fā)明的目的還在于提供番茄P450基因CYP710A11在培育抗逆轉(zhuǎn)基因植物方面的應(yīng)用。本發(fā)明所述的CYP710A11基因cDNA全長是從番茄幼苗中克隆獲得，登錄GenbanK 獲得編號為JN388603。本發(fā)明所提供的番茄甾醇C-22去飽和酶，名稱為CYP710A11，來源于茄科 (Solanaceae) ^jp M (Solanum)番爺(Solanum lycopersicum),具有序列表中的 SEQ ID No. 2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。上述番茄甾醇C-22去飽和酶編碼基因(CYP710A11)，具有序列表中SEQ ID No. 1 的DNA序列。
序列表中的SEQ ID No. 1由1506個(gè)堿基組成，為一個(gè)完整的開放讀碼框，編碼501 個(gè)氨基酸的蛋白。與GenbanK中公布的CYP710A11基因序列AB223043和EU2M275，同源性極高，達(dá)到99%以上。所述的基因CYP710A11受ABA誘導(dǎo)表達(dá)，在逆境脅迫中發(fā)揮作用。具體而言，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一個(gè)番茄P450基因CYP710A11在培育抗脅迫轉(zhuǎn)基因植物方面的應(yīng)用。將CYP710A11基因連接到植物表達(dá)載體上，構(gòu)建該基因過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化獲得抗逆境脅迫的轉(zhuǎn)基因植物。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，包括大腸桿菌、農(nóng)桿菌、植物細(xì)胞。本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)揭示了 CYP710A11基因在逆境脅迫中的作用。本發(fā)明利用甘露醇高滲透壓脅迫試驗(yàn)，確定了 CYP710A11基因在高滲透脅迫中能顯著提高轉(zhuǎn)基因植物的抗性。本發(fā)明利用人工干旱控水脅迫試驗(yàn)，確定了 CYP710A11基因在干旱透脅迫中能顯著提高轉(zhuǎn)基因植物的抗性。本發(fā)明利用NaCl高鹽脅迫試驗(yàn)，確定了 CYP710A11基因在高鹽脅迫中能顯著提高轉(zhuǎn)基因植物的抗性。本發(fā)明利用CuSO4脅迫抗性試驗(yàn)，確定了 CYP710A11基因在高含量重金屬Cu2+離子脅迫中能顯著提高轉(zhuǎn)基因植物的抗性。本發(fā)明的CYP710A11基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇標(biāo)記(GUS基因、GFP基因等)或具有抗生素抗性的基因(氨基糖苷類抗性基因nptll，潮霉素抗性基因hpt等)。被轉(zhuǎn)化的植物宿主可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如水稻、小麥、玉米、黑麥草、煙草、番茄、 黃瓜、草坪草、苜蓿等。攜帶有本發(fā)明的CYP710A11基因表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物技術(shù)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物經(jīng)組織培養(yǎng)成植株。本發(fā)明提供了一個(gè)能提高受體植物耐高鹽、耐干旱、耐重金屬能力的基因，通過轉(zhuǎn)基因的方法將該基因?qū)胧荏w植物中，能顯著提高轉(zhuǎn)基因植物對高鹽、干旱、重金屬的耐受能力。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但是這些圖片和具體實(shí)驗(yàn)是示例性的，不能將它們視為對本發(fā)明的限制。圖1.高鹽(NaCl，200mmOl/L)脅迫下，煙草在培養(yǎng)基中的生長狀況。其中W為對照野生型；PI、P2、P3分別為3個(gè)轉(zhuǎn)CYP710A11基因株系。培養(yǎng)42d后測定鮮重，方差分析及顯著性檢驗(yàn)表明，差異顯著P <0.01。轉(zhuǎn)基因植株的生長情況明顯優(yōu)于野生型。圖2.不同濃度甘露醇脅迫下，煙草在培養(yǎng)基中的生長狀況。其中W為對照野生型； P1、P2、P3分別為3個(gè)轉(zhuǎn)CYP710A11基因株系。轉(zhuǎn)基因植株的生長情況明顯優(yōu)于野生型。
具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但是這些具體實(shí)驗(yàn)是示例性的，不能將它們視為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1CYP710A11基因的分離克隆以番茄(Solanum lycopersicum)Mill. cv. Ailsa Craig，播種在盆缽中，溫室中培養(yǎng)，以生長2-3周的幼苗作試驗(yàn)材料。用Trizol試劑盒(Invitrogen)從番茄幼苗中提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫CYP710A11基因登錄號為AB223043和EU224275所示的序列， 分析序列的開放閱讀框和酶切位點(diǎn)，應(yīng)用I^rimer 5. O軟件設(shè)計(jì)引物并合成。在起始密碼子和終止密碼子兩端均加上相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，以便進(jìn)行載體構(gòu)建。AB223043是Morikawa T等從番茄中克隆的Morikawa Τ. et al，2006，EU224275 是 Whitaker BD 和 Gapper NE 從番茄栽培品種 Rutgers 中獲得的WhitakerBD and GapperNE，2008。擴(kuò)增引物如下上游引物(BamHI) 5’ GGATCCATGGCATCCATTTGGGGTTTGTTA 3，下游引物(KpnI)5，GGTACCTCATCGTGTGCACCTGTGTGCAAG 3，用高保真Tag酶(TaKaRa)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的片段約1500bp，回收片段克隆到PMD18-T載體(TaKaRa)中并測序(上海生工)。獲得該基因cDNA完整的開放讀碼框，共 1506bpo利用Genebank BLAST進(jìn)行序列比對，用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性分析， 結(jié)果表明與Genebank數(shù)據(jù)庫CYP710A11基因序列(AB223043)同源性達(dá)到99%，有6個(gè)堿基的差異；氨基酸序列5個(gè)殘基的差異，同源性達(dá)99%。與GenBank中EU224275同源性高達(dá)99. 93%，只有1個(gè)堿基差異；氨基酸序列1個(gè)殘基的差異，同源性達(dá)99. 8%。表明獲得的基因是番茄CYP710A11基因，核苷酸序列和氨基酸序列見SEQ ID No. 1和No. 2。含有該基因的 PMD18-T 載體命名為 pMD18-T-CYP710All。實(shí)施例2ABA誘導(dǎo)的CYP710A11基因表達(dá)分析番茄(Solanum lycopersicum)小康2號種子(購自成都科農(nóng)實(shí)業(yè)有限公司)，播種在盆缽中，溫室中培養(yǎng)，以生長2-3周的幼苗作試驗(yàn)材料。試驗(yàn)分為2組進(jìn)行。一組用 2mg/L的ABA噴施葉片；一組用清水作為對照處理噴施葉面。每個(gè)處理組共3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10株幼苗。Mir后取葉片，提取RNA (Trizol試劑盒，Invitrogen)并反轉(zhuǎn)錄(反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TAKARA)合成為cDNA模板。選取植物中保守的Actin基因作為內(nèi)參基因，擴(kuò)增片段約180bp，所用引物為ACT-F :5’ GGGATGATATGGAGAAGATA 3’ACT-R :5’ AGTACAGCCTGAATAGCAAC 3’根據(jù)CYP710A11基因設(shè)計(jì)熒光定量引物，擴(kuò)增片段184bp，所用引物為CYP-F :5，CTTCTACTTCTGCTCTGT 3，CYP-R :5’ GCTCTGATTCTGATTATCTC 3’SYBRgreenz染料法進(jìn)行熒光定量PCR檢測CYP710A11基因的表達(dá)。結(jié)果表明，ABA 誘導(dǎo)下，CYP710A11基因表達(dá)量顯著提高，表達(dá)量是對照的2. 5 5. 4倍(P < 0. 05)。實(shí)施例3番茄CYP710A11基因植物過表達(dá)載體構(gòu)建
將實(shí)施例1中獲得的含有CYP710A11基因的載體pMD18-T-CYP710All，經(jīng)過相應(yīng)的 BamH I和Kpn I雙酶切，T4連接酶(NEB)連接，構(gòu)建到植物表達(dá)載體p235馬欣榮，2008
中，命名為P23-CYP710A11。質(zhì)粒p2355由本實(shí)驗(yàn)室在pCAMBIA2301 (獲得CAMBIA使用許可)基礎(chǔ)上構(gòu)建，長度為12577bp，具卡那霉素抗性基因和GUS標(biāo)記基因；含1個(gè)啟動(dòng)子、終止子單元，其間是多克隆位點(diǎn)區(qū)，外源片段由此插入。將構(gòu)建的載體p23-CYP710All凍融法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，液氮保存。實(shí)施例4培育抗逆能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因煙草轉(zhuǎn)化過程中用于煙草培養(yǎng)的培養(yǎng)基見表1。1.煙草遺傳轉(zhuǎn)化取飽滿的煙草成熟種子，用70%乙醇清洗lmin，然后浸泡于活性氯含量4%的次氯酸鈉溶液中振蕩lOmin，用無菌水清洗4-5次；接種于含MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，25°C，暗培養(yǎng)5d后，進(jìn)行光培養(yǎng)，光周期為1 光/ 暗；20-30天，萌發(fā)生長出無菌苗后待用；將無菌苗接到含MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中生長，每30天換一次培養(yǎng)基，無菌苗可以通過試管苗繁殖并保存。從液氮罐中取出凍存的EHAp23-CYP710All，蘸取菌液于LB+利福平(Rif)25mg/ L+卡那霉素(Kan) 50mg/L的平板上劃線培養(yǎng)，觀°C，3天；從平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，接種到LB+利福平(Rif) 25mg/L+卡那霉素(Kan) 50mg/L的液體培養(yǎng)基中，觀°C，搖床2rpm 培養(yǎng)過夜；取培養(yǎng)過夜的菌液，按-2%的比例，轉(zhuǎn)入新配制的無抗生素的液體共培養(yǎng)基 (COM) +200 μ mol/L 乙酰丁香酮(AS)中。28°C，200rpm 培養(yǎng) 5h 左右，OD600 為 0. 4-0. 6 即可用于轉(zhuǎn)化。取無菌培養(yǎng)的煙草葉片，將葉片剪成約0.5cm見方的小塊并劃網(wǎng)狀裂紋；將農(nóng)桿菌菌液和葉片混勻，浸泡IOmin后取出葉片，置于無菌濾紙上吸去多余的菌液，將煙草葉片置于共培養(yǎng)基(COM)中，共培養(yǎng)3d。共培養(yǎng)后的煙草葉片置于無菌濾紙上，吸去多余的農(nóng)桿菌；將煙草葉片轉(zhuǎn)至選擇分化培養(yǎng)基(SR)中進(jìn)行培養(yǎng)，25°C，1 光照/8h暗，約2周后長出叢生芽，再移入新的選擇培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)2周。之后將小苗剝離，放置到生根選擇培養(yǎng)基(冊)中培養(yǎng)，25°C，1 光照/ 暗，培養(yǎng)30天，期間更換一次培養(yǎng)基。待植株生根后，株高約5-lOcm時(shí)，移出培養(yǎng)瓶，于盆缽中栽培。并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株檢測。表1.煙草遺傳轉(zhuǎn)化過程中使用的培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.一種用CYP710A11基因培育抗脅迫轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征是將番茄(Solanum lycopersicum)基因CYP710A11連接到不同種類植物表達(dá)載體上，通過不同的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化獲得抗逆的轉(zhuǎn)基因植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育抗脅迫轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于所述的 CYP710A11基因⑶S長度為1506，編碼501個(gè)氨基酸的蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培育抗脅迫轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于所述的基因 CYP710A11編碼一種細(xì)胞色素P450蛋白甾醇C-22去飽和酶(sterol 22-desaturase)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培育抗脅迫轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于所述的基因 CYP710A11的表達(dá)受逆境脅迫激素ABA的誘導(dǎo)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育抗脅迫轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于所述的植物包括煙草和其他植物。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用番茄細(xì)胞色素P450基因CYP710A11，通過基因工程等技術(shù)手段，培育抗脅迫植物，提高植物耐鹽、耐干旱等抗脅迫的能力。將番茄(Solanum lycopersicum)基因CYP710A11連接到不同種類植物表達(dá)載體上，通過不同的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化獲得抗逆的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明能顯著提高轉(zhuǎn)基因植物對高鹽、干旱、重金屬的耐受能力。
文檔編號C12N15/82GK102304532SQ20111021540
公開日2012年1月4日 申請日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者栗丹, 毛萍, 馬欣榮 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所