專利名稱：紅參皂苷Rg3組和Rh2組混合皂苷的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種活性高、毒性小，對(duì)人體更安全的由紅參稀有皂苷20(5)-Rg3、 20 O ) -Rg3、Rkl和Rg5等四種組成的Rg3組混合皂苷、由紅參稀有皂苷20⑶-Rh2, 20 O ) -Rh2, Rk2和他3等四種組成的Μι2混合皂苷的制備方法。
背景技術(shù)：
人參皂苷2OC )-Rg3、2O0 )-Rg3、Rkl 和 Rg5 等四種，20 C )-Rh2、20 O )-Rh2、Rk2 和Μι3等四種是紅參中存在的紅參稀有皂苷。紅參加工過程中白參的原人參二醇類的Rbl、 Rb2、Rc或Rd在人參自身酶與其他物質(zhì)的作用下轉(zhuǎn)化為20 C ) -Rg3和20 O ) -Rg3皂苷，進(jìn)一步脫水20⑶-Rg3和20 O ) -Rg3皂苷的20-碳上的羥基，形成順反結(jié)構(gòu)的Rg5和Wd皂苷， 形成Rg3組皂苷。同樣，紅參加工過程中白參的原人參二醇類的Rbl、Rb2、Rc和Rd在人參自身酶與其他物質(zhì)的作用下轉(zhuǎn)化為20(5)-他2、20 0 )-他2、Rk2和他3皂苷，形成他2組皂苷(發(fā)明專利ZL 200510136799.8 高活性紅參的制作方法)。Rg3組和詘2組混合皂苷比Rg3、Rg5、Rh2, Rh3單體皂苷對(duì)人體更安全，毒性少； Rg3組和他2組中四種結(jié)構(gòu)相似的皂苷起協(xié)同作用，比單體皂苷生理活性更高，對(duì)人參制品、保鍵食品和化妝品以及藥物開發(fā)意義很大。但是從紅參中分離提取由20(5)-Rg3、 20 O ) -Rg3、Rkl和Rg5等四種皂苷組成的Rg3組皂苷，分離提取由20⑶-Rh2、20 O ) -Rh2、 Rk2,Rh3等四種皂苷組成的Μι2組皂苷，難度很大，迄今為止沒有相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是從參根中提取含有人參自身皂苷酶和其他水溶性物質(zhì)的提取物(不含皂苷、簡(jiǎn)稱人參自身酶及水溶性物質(zhì)的提取物)，與原人參二醇類Rbl、Rb2、Rc或Rd單體或者其混合物、或者F2皂苷反應(yīng)，制備活性高、毒性小，對(duì)人體更安全的由紅參稀有皂苷20⑶-Rg3、20 O ) -Rg3、Rkl和Rg5等四種組成的Rg3組混合皂苷、由紅參稀有皂苷 20 C ) -Rh2、20 O ) -Rh2、Rk2和Rh3等四種組成的Rh2混合皂苷。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種紅參皂苷Rg3組和他2組混合皂苷的制備方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行
a.人參根(以干物計(jì)算)中加入6 10倍的65 80%乙醇，5(T75°C提取皂苷，重復(fù)2 3次； 提取皂苷后的濾渣中再加入6 10倍水(以干物計(jì)算)，6(T80°C提取人參自身酶及水溶性物質(zhì)，重復(fù)2 3次；將所提取的人參自身酶及水溶性物質(zhì)在品溫65°C以下減壓濃縮、得到波美 58 62度的提取液，既為人參自身酶及水溶性物質(zhì)的提取物；
b.向所得人參自身酶及水溶性物質(zhì)的提取物中加入原人參二醇類Rbl、Rb2、Rc或Rd 單體或者其混合物、或者F2皂苷，加入量與人參自身酶及水溶性物質(zhì)的提取物的重量比是 1 0.廣20，所述原人參二醇類Rbl、Rb2、Rc或Rd單體或者其混合物、或者F2皂苷的反應(yīng)濃度為0.廣10% ；反應(yīng)后分離皂苷。所述b步驟的反應(yīng)過程中還加有有機(jī)酸，有機(jī)酸的加入量為反應(yīng)體積的0. 0 ~50%。本發(fā)明工藝方法簡(jiǎn)單，可從人參根中提取活性高、毒性小，對(duì)人體更安全的由紅參稀有皂苷20 {$) -Rg3、20 O ) -Rg3、Rkl和Rg5等四種組成的Rg3組混合皂苷、由紅參稀有皂苷20 (5·) -Rh2,20 O ) -Rh2,Rk2和詘3等四種組成的Μι2混合皂苷，可廣泛應(yīng)用于人參制品、 保鍵食品和化妝品以及藥物等開發(fā)。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例lRg3組HPLC檢測(cè)圖譜。圖2是本發(fā)明實(shí)施例lRg3組進(jìn)行UPLC-Q/T0F檢測(cè)圖譜。圖3是本發(fā)明實(shí)施例lRg3組進(jìn)行UPLC-Q/T0F檢測(cè)，ESI+正模式下總離子流圖譜。圖4是本發(fā)明實(shí)施例lRg3組進(jìn)行UPLC-Q/T0F檢測(cè)，ESI-負(fù)模式下總離子流圖譜。圖5是本發(fā)明實(shí)施例lRg3組中第一峰的離子峰在ESI+正模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析的質(zhì)譜圖。圖6是本發(fā)明實(shí)施例lRg3組中第二峰的離子峰在ESI+正模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析的質(zhì)譜圖。圖7是本發(fā)明實(shí)施例lRg3組中第三峰的離子峰在ESI+正模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析的質(zhì)譜圖。圖8是本發(fā)明實(shí)施例lRg3組中第四峰的離子峰在ESI+正模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析的質(zhì)譜圖。圖9是本發(fā)明實(shí)施例lRg3組中第一峰的離子峰在ESI-負(fù)模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析的質(zhì)譜圖。圖10是本發(fā)明實(shí)施例lRg3組中第二峰的離子峰在ESI-負(fù)模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析的質(zhì)譜圖。圖11是本發(fā)明實(shí)施例lRg3組中第三峰的離子峰在ESI-負(fù)模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析的質(zhì)譜圖。圖12是本發(fā)明實(shí)施例lRg3組中第四峰的離子峰在ESI-負(fù)模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析的質(zhì)譜圖。圖13是本發(fā)明實(shí)施例2他2組HPLC檢測(cè)圖譜。圖14是本發(fā)明實(shí)施例2詘2組進(jìn)行UPLC-Q/T0F檢測(cè)圖譜。圖15是本發(fā)明實(shí)施例2他2組中第一峰的離子峰在ESI-負(fù)模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析的質(zhì)譜圖。圖16是本發(fā)明實(shí)施例2他2組中第二峰的離子峰在ESI-負(fù)模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析的質(zhì)譜圖。圖17是本發(fā)明實(shí)施例2他2組中第三峰的離子峰在ESI-負(fù)模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析的質(zhì)譜圖。圖18是本發(fā)明實(shí)施例2他2組中第四峰的離子峰在ESI-負(fù)模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析的質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
參根中含有人參自身皂苷酶(C Zhang, H Yu, Y Bao, L An, F Jin (金鳳燮)伐湖. Pharm. Bull. , 2001，49(7)，795-798. ； Process BioChem. , 2002, 37，793-798·)。本發(fā)明從人參根中提取不含皂苷、含有人參自身皂苷酶和其他水溶性物質(zhì)的提取物(人參自身酶及水溶性物質(zhì)的提取物)，與原人參二醇類的Rbl、Rb2、Rc或Rd單體或者其混合物反應(yīng)，制備由2O(5)-Rg3、2O0 )-Rg3、RkU Rg5等四種皂苷組成的Rg3組皂苷；與人參皂苷F2 反應(yīng)，制備由2O(5)-Rh2、2O0 )-Rh2、Rk2、Rh3等四種皂苷組成的Rh2組皂苷。1、人參根的人參自身酶及水溶性物質(zhì)的提取物的制備
新鮮人參3. 5公斤(相當(dāng)于1公斤干參)切成2毫米厚的片，加入8升的95%的乙醇，在 50-60°C提取人參皂苷6小時(shí)，分離提取液；其渣中再加入8升的70-75%的乙醇提取，共提取3次；合并乙醇提取液，用于制備人參皂苷。人參皂苷提取過的渣中加入8升水，在75°C 以下提取6小時(shí)，同樣方法共提取3次；合并提取液，品溫在60°C以下減壓濃縮至波美60 度，離心除渣、得到200-300毫升人參自身酶及水溶性物質(zhì)的提取物，用于Rg3組和他2組紅參皂苷的制備。也可以用生曬干燥人參切成2毫米厚片的1公斤生曬干燥人參中，加入8升的 70-75%的乙醇，在50°C提取人參皂苷6小時(shí)；同樣方法共提取3次；合并乙醇提取液，用于制備人參皂苷。人參皂苷提取過的渣中加入8升水，在75°C以下提取6小時(shí)，同樣方法共提取3次；合并提取液，品溫在60°C以下減壓濃縮至波美60度，離心除渣、得到200-300毫升人參自身酶及水溶性物質(zhì)的提取物，用于Rg3組和Μι2組紅參皂苷的制備。幾次試驗(yàn)，原料可以是人參、也可以是西洋參或者三七參的鮮參或者干參。人參根 (以干物計(jì)算)中加入6-10倍的65-80%乙醇、在50-75°C提取皂苷，可重復(fù)3次；提取皂苷的渣中再加入干渣的6-10倍水在60-80°C提取，重復(fù)2-3次；所提取的水溶性物質(zhì)，在品溫 65°C以下減壓濃縮，均得到所需要的人參根的復(fù)合物酶及水溶性物質(zhì)提取物。2、Rg3組紅參混合皂苷的制備
50克的原人參二醇類的Rbl、Rb2、Rc和Rd混合皂苷加入于300毫升水中，研磨，再加入 100毫升的上述1的人參自身酶及水溶性物質(zhì)的提取物和600毫升的水，在80°C反應(yīng)6小時(shí)，110°C滅酶0. 5-1小時(shí)，幾乎所有的原人參二醇類的Rbl、Rb2、Rc和Rd混合皂苷轉(zhuǎn)化為紅參皂苷20 (5·) -Rg3、20 O ) -Rg3、Rkl和Rg5混合皂苷。其反應(yīng)液經(jīng)1升的大孔樹脂(HP-20 大孔樹脂，日本三菱公司產(chǎn)；或者AB-8大孔樹脂，天津南開大學(xué)產(chǎn))柱吸附皂苷，再用8升的水洗掉未吸附的糖和渣；再用6升的75-80%乙醇洗脫皂苷，其洗脫液減壓濃縮、干燥得36 克的20⑶-Rg3、20 O ) -Rg3、Rkl和Rg5混合皂苷，即得Rg3組紅參混合皂苷。幾次上述反應(yīng)中，使用原人參二醇類的Rbl、Rb2、Rc或Rd單體皂苷，其結(jié)果與使用 Rbl、Rb2、Rc和Rd混合皂苷效果相同；制備中，人參皂苷的反應(yīng)濃度0. 1-10%,人參皂苷與人參自身酶及水溶性物質(zhì)的提取物(人參根干品原料計(jì)算)的反應(yīng)比例(重量)是1 :0. 1-20 倍，反應(yīng)溫度70-120°C，均得到良好的效果。原人參二醇類Rbl、Rb2、Rc和Rd單體或者其混合皂苷可在市場(chǎng)上購(gòu)買。實(shí)施例1所得Rg3組紅參皂苷，用高效液相色譜法(HPLC)和超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-Q/T0F)確認(rèn)。1) Rg3組紅參混合皂苷的確認(rèn)Rg3組紅參皂苷測(cè)定的高效液相色譜儀，美國(guó)waters 2695儀器；檢測(cè)器，Photodiode Array Detector Waters 2996 ；Knauer C18 色譜柱(250mmX3mm)；流動(dòng)相，乙腈(A)-水 (B) ；(T35min，19%A 等度；；35 55min，19%A 29%A 線性梯度；55 65min， 40%A 線性梯度； 65 95min，40%A 100%A線性梯度；進(jìn)樣量，10 μ L ；柱溫，35°C ；體積流速，0. 6mL/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)，203nm。取上述Rg3組混合皂苷2毫克，溶解于1毫升的甲醇中，經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾，高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)結(jié)果，與標(biāo)準(zhǔn)品2O(5)-Rg3、2O0 )-Rg3、Rkl和Rg5皂苷比較，如圖 1所示。從圖1中可以看到，與標(biāo)準(zhǔn)品皂苷相比較，Rg3組含有2O(5)-Rg3、2O0 )_Rg3、Rkl、 Rg5四種皂苷，總含量90%以上；各皂苷含量比(峰面積比)為20⑶-Rg3 :20⑷-Rg3 =Rkl Rg5 = 29 26 :21 :24。2)超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-Q/T0F)核對(duì)Rg3組的四種皂苷 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀UPLC-Q/T0F Premier Micromass (Waters)儀
器；色譜柱BEH shield RP18 (2. 1 X 100mm，1. 7 μ m，Waters)。超高效液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)在UPLC-Q/TOF PremierTM Micromass (Waters)儀器完成。ESI源，正、 負(fù)離子模式下，“V”模式下進(jìn)行檢測(cè)。超高效液相色譜(UPLC)檢測(cè)條件流動(dòng)相為(A) 0. 1%甲酸-乙腈——(B) 0. 1% 甲酸-水；梯度洗脫(T5min，5%A 95%A線性梯度，5 lOmin，95%A等度。進(jìn)樣量，10 μ L ；流速，0.5 mL/min ；柱溫，30°C ；檢測(cè)波長(zhǎng)，203nm。四級(jí)時(shí)間飛行串聯(lián)質(zhì)譜(Q/T0F)檢測(cè)條件毛細(xì)管電壓，2. 5kv ；樣品孔電壓，35v ； 離子源溫度，100°c ；脫溶劑氣溫度，350°C ；錐孔氣流速，50L/hr ；脫溶劑氣流速，1000L/hr ； 質(zhì)量掃描范圍，IOO-IOOODa0Rg3 組中 20 (S) -Rg3 和 20 O ) -Rg3 皂苷分子式為 C42H72O13 ；分子量為 784 ； Rg5 和 Rkl 分子式，C42H70O12 ；分子量，766。上述的收3組樣品進(jìn)行UPLC-Q/T0F檢測(cè)，得到的圖譜如圖2、3、4所示。從圖2、3、4中可以看出，收3組樣品的UPLC圖譜有四個(gè)明顯的紫外吸收峰，和圖 1的HPLC檢測(cè)的2OC )-Rg3、2O0 )-Rg3、RkU Rg5的紫外吸收峰一致，其保留時(shí)間依次為 3. 77,3. 83,4. 43,4. 49 (min)。在正、負(fù)離子模式下，通過串聯(lián)質(zhì)譜(Q/T0F)檢測(cè)、得到Rg3 組樣品的總離子流圖，也有四個(gè)峰，其和UPLC圖譜有四個(gè)明顯的紫外吸收峰一致，保留時(shí)間分別為 3. 81,3. 87,4. 46,4. 51 (min)。由此，可以進(jìn)行總離子流各峰的一級(jí)質(zhì)譜分析，確定Rg3樣品中各物質(zhì)的分子量。(1) Rg3組人參稀有皂苷在ESI+正模式下的一級(jí)質(zhì)譜分析
首先對(duì)Rg3組第一、第二的離子峰在ESI+正模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，得到的一級(jí)質(zhì)譜如圖5、6所示。20C )-Rg3和2O0 )-Rg3的分子量為784 ；從圖5、6中可以看出，在ESI+正模式下，使第一、第二峰物質(zhì)分子上加了一個(gè)H，形成了 m/z為785的準(zhǔn)分子離子峰，即[M+H]+。 m/z767離子是為m/z785離子峰失去一分子H2O產(chǎn)生的碎片；m/z 605離子為m/z785離子峰失去末端的葡萄糖基，再失去一分子H2O產(chǎn)生的碎片；m/z461離子為m/z785離子峰失去兩個(gè)葡萄糖基所產(chǎn)生的碎片；m/z443、m/z425、m/z407離子為m/z461碎片再依次失去一分子吐0產(chǎn)生的碎片；因此第一、第二峰物質(zhì)的分子量為784 ；可確定為第一峰為20(5)-Rg3 ； 第二峰為 2O0 )-Rg3。再對(duì)Rg3組的第三、第四離子峰在ESI+正模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，得到的一級(jí)質(zhì)譜如圖7、8所示。Rkl和Rg5的分子量為766 ；從圖7、8中可以看出，在ESI+正模式下，使第三、第四峰的物質(zhì)的分子加上了一個(gè)H，形成了 m/z為767的準(zhǔn)分子離子峰，即[M+H] +。m/z785離子峰歸屬于ESI+模式下形成的[M+H20] +。m/z749離子是m/z767離子峰失去一分子H2O所產(chǎn)生的碎片；m/z 605離子為m/z767離子峰失去末端的葡萄糖所產(chǎn)生的碎片；m/z587離子是 m/z605離子峰再失去一分子H2O所產(chǎn)生的碎片；m/z443離子是m/z767離子峰失去兩個(gè)葡萄糖基所產(chǎn)生的碎片；m/z425和m/z407離子是m/z443碎片再依次失去一分子H2O所產(chǎn)生的碎片。由此得到第三、第四峰物質(zhì)的分子量為766 ；可確定為Wd和Rg5皂苷。(2) Rg3組人參稀有皂苷在ESI-負(fù)模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析
首先對(duì)收3組的第一、第二離子峰在ESI-負(fù)模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，得到的一級(jí)質(zhì)譜如圖9、10所示。2OC )-Rg3、2O0 )_Rg3分子量為784 ；從圖9、10中可以看出，在ESI-負(fù)模式下形成[第一、第二峰物質(zhì)+HC00H]一離子峰，而負(fù)離子模式下又減少一個(gè)H，所以通過Q/T0F得到的離子峰m/z 829;其物質(zhì)丟失一甲基后生成核離子碎片m/z 783。故可判斷，樣品中含有20⑶-Rg3和20 O ) _Rg3，其分子量為784。再對(duì)Rg3組的第三、第四離子峰在ESI-負(fù)模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，得到的一級(jí)質(zhì)譜如圖11、12所示。Rkl和Rg5的分子量為766 ；從圖11、12中可以看出，在ESI-負(fù)模式下，形成[第三、第四峰物質(zhì)+HC00H]一離子峰，而負(fù)離子模式下又減少一個(gè)H，所以第三、第四峰得到離子峰m/z 811，其丟失一甲基后生成核離子碎片m/z765。故可判斷，樣品中含有Wd和Rg5， 其分子量為766。由此重新證明，所制備的Rg3組中含有2OC )-Rg3、2O0 )_Rg3、Rkl和Rg5等四種紅參稀有皂苷；結(jié)構(gòu)式分別為
經(jīng)過幾次試驗(yàn)，所制備的Rg3組中20 (5·) -Rg3和20 O ) -Rg3在Rg3組總皂苷中的含量比例的范圍20-80%。實(shí)施例2
權(quán)利要求
1.一種紅參皂苷Rg3組和他2組混合皂苷的制備方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行a.人參根(以干物計(jì)算)中加入6 10倍的65 80%乙醇，5(T75°C提取皂苷，重復(fù)2 3次； 提取皂苷后的濾渣中再加入6 10倍水(以干物計(jì)算)，6(T80°C提取人參自身酶及水溶性物質(zhì)，重復(fù)2 3次；將所提取的人參自身酶及水溶性物質(zhì)在品溫65°C以下減壓濃縮、得到波美 58 62度的提取液，既為人參自身酶及水溶性物質(zhì)的提取物；b.向所得人參自身酶及水溶性物質(zhì)的提取物中加入原人參二醇類Rbl、Rb2、Rc或Rd 單體或者其混合物、或者F2皂苷，加入量與人參自身酶及水溶性物質(zhì)的提取物的重量比是 1 0.廣20，所述原人參二醇類Rbl、Rb2、Rc或Rd單體或者其混合物、或者F2皂苷的反應(yīng)濃度為0.廣10% ；反應(yīng)后分離皂苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述紅參皂苷Rg3組和他2組混合皂苷的制備方法，其特征在于所述b步驟的反應(yīng)過程中還加有有機(jī)酸，有機(jī)酸的加入量為反應(yīng)體積的0. 0廣50%。
全文摘要
本發(fā)明公開一種紅參皂苷Rg3組和Rh2組混合皂苷的制備方法，是用人參根中提取的不含皂苷、含有人參自身皂苷酶和其他水溶性物質(zhì)的提取物，與原人參二醇類皂苷Rb1、Rb2、Rc或Rd單體或者混合物皂苷反應(yīng)，制備由20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5紅參皂苷組成的Rg3組皂苷；與人參皂苷F2反應(yīng)，制備由20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2和Rh3紅參皂苷組成的Rh2組皂苷。Rg3組和Rh2組混合紅參皂苷比Rg3和Rh2等單體皂苷對(duì)人體更安全，活性更高，可用于人參制品、保健品和化妝品和其他藥物開發(fā)。
文檔編號(hào)C12P33/20GK102352402SQ201110214290
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者金鳳燮, 魚紅閃 申請(qǐng)人:金鳳燮