專利名稱：來源于棉花的miRNA-GhmiR171及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來源于棉花的miRNA-GhmiR171及其應用。
背景技術(shù)：
MicroRNA (miRNA)是一類長度為21_22nt的，內(nèi)源產(chǎn)生的非編碼RNA，廣泛存在于原核生物禾口真核生物(Bartel D P. MicroRNAs :genomics, biogenesis, mechanisms, and function. Cell, 2004,116 :281-297.)。1993 年 Ambros 研究組在線蟲中發(fā)現(xiàn)第一個miRNA， lin-4，至今已在105個物種中發(fā)現(xiàn)有9539個miRNA。miRNA特異地作用于靶基因mRNA， 抑制靶基因表達，在調(diào)節(jié)生長發(fā)育、細胞增殖、凋亡、抵御環(huán)境脅迫等各種生命活動中發(fā)揮
白勺(Bushati N, Cohen S Μ. MicroRNA functions. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 2007,23 :175-205.；金龍國，王川，劉進元.植物MicroRNA.中國生物化學與分子生物學報，2006，22 =609-614.)。植物miRNA主要通過切割靶基因mRNA,或抑制靶mRNA翻譯，來調(diào)控植物個體生長發(fā)育并影響其生理過程，是一種新的基因調(diào)控模式，具有重要的研究意義(Voinnet 0. Origin,biogenesis,and activity of plant microRNAs. Cell,2009,136 669-687.)。棉花是世界最重要的經(jīng)濟作物之一，同時棉花纖維也是研究單細胞伸長的良好模型。與擬南芥、水稻等模式生物相比，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的棉花miRNA數(shù)量可謂寥寥無幾，因此通過高通量測序技術(shù)，有望挖掘出更多的棉花miRNA，這對于全面了解棉花乃至整個植物 miRNA的形成過程、結(jié)構(gòu)特點和功能機制具有現(xiàn)實意義。另外，棉花中miRNA可能在諸多生理過程(如纖維的起始與伸長等)發(fā)揮重要功能，但棉花中關(guān)于miRNA的生物學功能研究甚少，因此，通過關(guān)注特定發(fā)育時期、特定組織中的miRNA，有望闡明棉花miRNA參與的生理過程，以及在該過程中具體發(fā)揮的作用。我國是世界上主要的棉花生產(chǎn)和消費國，棉花對于我國具有舉足輕重的地位。國內(nèi)外除了利用常規(guī)育種手段之外，逐步運用基因工程技術(shù)對水稻品質(zhì)(產(chǎn)量、抗蟲等)進行遺傳改良已經(jīng)成為了一種趨勢。由于miRNA對植物有廣泛的調(diào)控作用，很可能成為植物遺傳改良的重點研究基因之一，因此迫切需要通過大規(guī)模測序方法充分挖掘和開發(fā)屬于本國知識產(chǎn)權(quán)的新的miRNA基因，從而為后期定向改良和培育優(yōu)質(zhì)性狀的棉花品種奠定基礎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供來源于棉花的miRNA-GhmiR171及其應用。本發(fā)明保護的miRNA-GhmiR171的序列如下(5' — 3')UGAUUGAGCC⑶GCCAAUAUC (序列表的序列 1)。本發(fā)明保護的miRNA-GhmiR171 前體(pre-GhmiR171)序列如下(5' — 3')UACAGGGGAAAGCUG⑶GAUUGAGCCGCGCCAAUAUCCCUUGCGCGAGUACCGGAUCACCG⑶UUCGAU CAGCUCUGCGGCCUGAAUUAAUUGGUCUAUUAUUGCCUGCUGAAGCU⑶UG⑶UCGCCAUUUCAUCA⑶CACUAUC。 (序列表的序列2)。
本發(fā)明還保護序列1所示RNA或序列2所示的RNA在抑制GRAS轉(zhuǎn)錄因子 (ES822760)表達中的應用；所述GRAS轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列為序列表的序列3 ；所述GRAS 轉(zhuǎn)錄因子基因的核苷酸序列為序列表的序列4。本發(fā)明還保護序列1所示RNA或序列2所示的RNA在促進GRAS轉(zhuǎn)錄因子基因 (ES822760)的mRNA降解中的應用；所述GRAS轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列為序列表的序列3。所述GRAS轉(zhuǎn)錄因子基因的核苷酸序列為序列表的序列4 ；所述促進GRAS轉(zhuǎn)錄因子基因的mRNA降解為切割GRAS轉(zhuǎn)錄因子基因的mRNA。本發(fā)明還包括序列1所示RNA或序列2所示的RNA在棉花纖維品質(zhì)改良中的應用。本發(fā)明的實驗證明，Solexa克服了常規(guī)miRNA克隆技術(shù)的缺點，具有靈敏度高的優(yōu)點，能夠檢測出最少一個小RNA分子，并且準確性高，檢出的小RNA分子堿基錯誤率極低。同時該技術(shù)還具有高通量、大規(guī)模的特點，兩個文庫的測序量高達500萬條小RNA序列以上?；谶@種最新的測序手段，將有望識別棉花中特定發(fā)育時期特定組織特異表達的新 miRNAο本發(fā)明采用國際上先進的Solexa高通量測序技術(shù)結(jié)合生物信息學分析、 Northern雜交、5' RACE等多種生物學手段，首次從基因組水平鑒定到miRNA_GhmiR171，并且證實GhmiR171的靶基因為GRAS轉(zhuǎn)錄因子基因，參與了棉花纖維起始及胚珠發(fā)育的調(diào)控。 這都將為棉花的品質(zhì)育種(如提高棉纖維產(chǎn)量)提供寶貴的基因資源，帶來一定的研究價值和社會效益，并最終用于實際生產(chǎn)。本發(fā)明提供的miRNA廣泛參與了棉花多種生命活動的調(diào)節(jié)，具有重要的生物學意義和潛在應用價值。


圖1為小RNA測序數(shù)據(jù)中分離和鑒定新miRNA的流程2為GhmiR171的前體二級結(jié)構(gòu)圖；黑色部分指示成熟miRNA所在的位置圖3為Northern雜交檢測開花前3天至開花后3天野生型及突變體棉花胚珠中 GhmiR171的表達圖4為GhmiR171的靶基因5' RACE驗證；序列上方的箭頭表示發(fā)生切割的位點， 數(shù)值表示該切點處發(fā)生切割的克隆數(shù)與克隆總數(shù)比值 圖5為實時定量PCR檢測在開花前3天至開花后3天野生型及突變體棉花胚珠中 GhmiR171靶基因GRAS的表達
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實施例中所用棉花品種包括陸地棉徐州142 (Gossypium hirsutum cv. Xuzhoul42)及其無纖維突變體，以下分別簡稱野生型、突變體。棉花種子來源于棉花種質(zhì)中期庫，野生型中期庫號為110599，突變體中期庫號為140142。實施例l、miRNA_GhmiR171 的發(fā)現(xiàn)一、樣品采集
棉花于每年四月下旬種植于田間，常規(guī)作業(yè)，開花前一天花苞套袋，防止花粉傳播造成異花傳粉，開花當天除袋，并掛牌標記。分別收取開花前3天、開花前1天、開花當天、 開花后1天、開花后3天的棉鈴，剖取胚珠，迅速凍存于液氮，保存于_80°C備用。二、miRNA_GhmiR171 的發(fā)現(xiàn)1、RNA 提取將由上述一得到的棉花胚珠樣品在液氮中研磨，研磨過程中加入PVP (按1/5質(zhì)量比)以防止酚類氧化，用PureLink Plant RNA Reagent(Invitrogen)提取總RNA，操作步驟如下(以0. Ig材料為例，相應試劑量可根據(jù)材料量按比例調(diào)整)①磨好的胚珠粉末加入到Iml提取緩沖液中，加20μ 1 β-巰基乙醇，混勻后置于室溫10-15分鐘。4度12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)至新的離心管，加入100 μ 1 5MNaCl，混勻后加入300 μ 1氯仿，充分混勻，4度12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)至新的離心管；②將轉(zhuǎn)出的溶液依次用氯仿、酚、酚氯仿(1 1)、氯仿抽提，經(jīng)四次抽提后的上清液轉(zhuǎn)入新的離心管，加入100 μ 1多糖去除劑(北京華越洋生物科技有限公司)，混勻后加入200 μ 1氯仿，充分混勻，4度12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)至新的離心管；③加入等體積的異丙醇，混勻后置-20度1小時以上，4度12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清，離心得到的沉淀用75%的乙醇洗滌，晾干后溶于適量的DEPC水中。使用Ultrospec 3000型紫外分光光度計(Amersham Biosciences)測定提取的 RNA在260nm(0D26Q)和280nm(OD28tl)波長的吸光度值以確定RNA的純度和濃度。質(zhì)量合格的RNA濃度應在1 μ g/ μ 1以上，0D26(1/0D28(1的比值在1. 8-2. 0之間，且經(jīng)電泳檢測條帶清晰，無明顯降解和DNA污染。2、小RNA文庫的構(gòu)建將質(zhì)量檢驗合格的棉花胚珠總RNA用于構(gòu)建小RNA文庫。5個不同時期的胚珠樣品提取的RNA各取10 μ g等量混合，總共50 μ g用于構(gòu)建小RNA文庫。小RNA文庫的構(gòu)建按照Illumina Sample Preparation Protocol文庫構(gòu)建方法進行，構(gòu)建好的文庫采用Solexa 高通量測序(北京華大基因研究中心)，獲得高質(zhì)量的18-30nt的小RNA序列。3、小RNA文庫中保守的miRNA的鑒定植物miRNA在各物種間表現(xiàn)出較高的進化保守性，而且往往越是在體內(nèi)發(fā)揮重要功能的miRNA，其物種間保守型越高。為了挖掘高通量測序庫中的保守的miRNA， 參考之前國外文獻對高通量測序數(shù)據(jù)分析的成功方法(Jones-I^hoades M W，Bartel D P. Computational identification of plant miRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol· Cell, 2004,14 :787-799.)，建立了一套計算機分析方法用來發(fā)現(xiàn)和鑒定測序數(shù)據(jù)中的保守的棉花miRNA (分析流程如圖1所示)。①將獲得的兩個小RNA文庫中的原始序列通過計算機方法去掉3'接頭，并過濾掉序列長度在18nt以下的序列，獲得所謂的“干凈”序列庫；②將“干凈”的序列與國際權(quán)威的miRNA數(shù)據(jù)庫 miRBase (http //microrna. Sanger, ac. uk/sequences/)中公布的 miRNA 成熟序列進行 BLAST，從而發(fā)現(xiàn)哪些序列來自于已知的miRNA，已知miRNA不超過2個錯配的序列再進入下一步分析；③將潛在miRNA序列庫中的序列與已有的棉花數(shù)據(jù)庫進行BLAST，數(shù)據(jù)庫包括棉花 EST (http //compbio. dfci. harvard, edu)、棉花 GSS (NCBI)、以及已有的部分雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)的基因組序列。將找到的棉花數(shù)據(jù)庫中對應的序列進行下一步分析。④使用 miRNA 前體結(jié)構(gòu)預測軟件 mireap_0. 2 (http //sourceforge. net/pro iects/ lim)，對獲取的棉花數(shù)據(jù)庫中有小RNA對應的序列進行二級結(jié)構(gòu)分析，若能形成類似 miRNA前體(pre-miRNA)的良好莖環(huán)結(jié)構(gòu)則該序列可以認為是候選的新miRNA ；⑤對候選的新的miRNA繼續(xù)進行篩選，考察候選的新miRNA序列所在的莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體的小RNA分布特征，若主要分布在候選的新miRNA區(qū)域以及對應的miRNA*區(qū)域，則認為該候選的新miRNA序列高度可信，是真實的 miRNA 序列(MeyersBC, AxtellMJ, BartelB, BartelDP, BaulcombeD, BowmanJL,CaoX,CaringtonJC,ChenX,GreenPJ,et al. Criteria for annotation of plant microRNAs. Plant Cell, 2008，20 :3186-3190.)。鑒定到1 個 miRNA，命名為 GhmiR171。GhmiR171 的序列如下(5' — 3' ) :UGAUUGAGCC⑶GCCAAUAUC(序列 1)。野生型小RNA文庫的測序次數(shù)(Qwt)為753，突變體小RNA文庫(Qw)的測序次數(shù)為 362。miRNA前體(pre_miRNA)序列的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)是miRNA基因最顯著的特點之一，也是所有miRNA鑒定方法都不可逾越的重要規(guī)則。GhmiR171 前體(pre-GhmiR171)序列如下(5' — 3')UACAGGGGAAAGCUG⑶GAUUGAGCCGCGCCAAUAUCCCUUGCGCGAGUACCGGAUCACCGGUUUCGA UCAGCUCUGCGGCCUGAAUUAAUUGGUCUAUUAUUGCCUGCUGAAGCUGUUGGUUCGCCAUUUCAUCAGUCACUAU C (序列表的序列2)。pre-GhmiR171能形成良好的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，成熟的miRNA從miRNA前體的莖部產(chǎn)生，完全符合miRNA前體的結(jié)構(gòu)特征(見圖2)。也可人工合成序列1和序列2。三、miRNA Northern 雜交為了進一步檢測GhmiR171在開花前3天至開花后3天在棉花胚珠中的表達模式， 采用miRNA Northern雜交檢測其表達情況。1、制備探針檢測GhmiR171 的探針(5' — 3')的序列GATATTGGCACGGCTCAATCA。采用T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs)對上述序列末端磷酸基團進行同位素(Y -32P ATP)標記，得到探針，用Microspin G-25柱(GE Healthcare)純化探針， 去除未標記的同位素，純化后的探針用于Northern雜交。2、miRNA Northern 雜交Northern雜交中，每個泳道上樣量為30 μ g總RNA，U6RNA作為內(nèi)參，與miRNA在同一張膜上檢測。U6基因的探針序列(5' — 3')為TGTATCGTTCCAATTTTATCGGATGT。(1)分別提取步驟一制備的各胚珠樣品的總RNA。( miRNA Northern 雜交①取30 μ g量的總RNA，加入等體積的2XRNA上樣緩沖液(95 %甲酰胺， 18mMEDTA,0. 溴酚藍和0. 二甲苯青)，混合后95°C變性5min，得到RNA樣品。②RNA樣品用15%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后用電轉(zhuǎn)移裝置 (BIO-RAD)轉(zhuǎn)移到 HybondN+尼龍膜(Amersham Biosciences)上。
③轉(zhuǎn)移有RNA樣品的尼龍膜經(jīng)6XSSC溶液短暫漂洗，紫外交聯(lián) (Stratagene) 5min,再80°C烘烤2h，使RNA完全固定在尼龍膜上。④將轉(zhuǎn)移了 RNA的尼龍膜放入雜交管中，加入5ml ULTRAhyb-Oligo雜交液 (Ambion)在雜交爐中42°C預雜交池，然后加入探針，混勻，42°C雜交過夜。⑤雜交結(jié)束后，小心倒出雜交液，加入含0. 5% SDS的2XSSC溶液，42°C洗滌三次， 每次IOmin。⑥洗膜結(jié)束后，將膜用保鮮膜包裹，平整壓于X光片下，附加增感屏，-70°C曝光2 周。⑦曝光結(jié)束后，沖洗X光片，進行光密度掃描，以對照組的雜交信號為1，計算各個樣品雜交信號的相對強度。結(jié)果見圖3，Northern雜交結(jié)果顯示，野生型(WT)中，GhmiR171在開花前3天至開花后3天，表達量呈現(xiàn)下降趨勢，在突變體(MU)中，GhmiR171的表達量亦先下降后上升趨勢，二者的表達譜不同，暗示了 GhmiR171在棉花纖維發(fā)育過程中可能起重要的作用。定量選用TotalLab軟件對X光片上的條帶進行光密度掃描，分別得到GhmiR171 和U6 RNA的光密度值，二者的比值見圖3中所標注的數(shù)值，即為各個胚珠樣品中GhmiR171 的相對含量。實施例2、miRNA的靶基因預測與驗證由于植物miRNA與靶基因mRNA近乎完全互補，因此可以通過生物信息學方法預測 GhmiR171 的靶基因。采用在線軟件 psRNATarget (http //plantgrn. noble, org/ psRNATarget/)在棉花EST數(shù)據(jù)庫CGIlO中尋找到能與miRNA序列近乎完全互補的cDNA或基因，即為miRNA的靶標；參數(shù)設置為=PsRNATarget程序參數(shù)為默認設置，靶標的功能通過 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)同源性檢索，以同源性最高的已知功能基因進行注釋。預測結(jié)果見表1。表lGhmiR171的靶基因及功能
權(quán)利要求
1.序列表的序列1所示的RNA。
2.序列表的序列2所示的RNA。
3.權(quán)利要求1或2所述RNA在抑制GRAS轉(zhuǎn)錄因子基因表達中的應用；所述GRAS轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列為序列表的序列3。
4.如權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于所述GRAS轉(zhuǎn)錄因子的基因的核苷酸序列為序列表的序列4。
5.權(quán)利要求1或2所述RNA在促進GRAS轉(zhuǎn)錄因子的基因的mRNA降解中的應用；所述 GRAS轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列為序列表的序列3。
6.如權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于所述GRAS轉(zhuǎn)錄因子基因的核苷酸序列為序列表的序列4 ；所述促進GRAS轉(zhuǎn)錄因子基因的mRNA降解為切割GRAS轉(zhuǎn)錄因子基因的mRNA。
7.權(quán)利要求1或2所述RNA在棉花纖維品質(zhì)改良中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了來源于棉花的miRNA-GhmiR171及其應用。本發(fā)明保護的GhmiR171是序列表的序列1所示的RNA。本發(fā)明保護的GhmiR171前體(pre-GhmiR171)是序列表的序列2所示的RNA。本發(fā)明還保護序列1所示RNA在抑制GRAS轉(zhuǎn)錄因子基因表達和/或促進GRAS轉(zhuǎn)錄因子基因的mRNA降解中的應用。所述GRAS轉(zhuǎn)錄因子如序列表的序列3所示。所述GRAS轉(zhuǎn)錄因子基因如序列表的序列4所示。應用miRNA-GhmiR171有望獲得在生長發(fā)育方面有重要表型的植株，具有重要的生物學意義和潛在應用價值，將為棉花的品質(zhì)育種(如培育抗逆性棉花)提供寶貴的基因資源，帶來一定的研究價值和社會效益，并最終用于實際生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/113GK102286485SQ20111021407
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月28日
發(fā)明者劉進元, 王正明, 薛偉 申請人:清華大學