專(zhuān)利名稱(chēng)：來(lái)源于棉花的miRNA-GhmiR156及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種來(lái)源于棉花的miRNA-GhmiR156及
其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
miRNA(microRNA,微小RNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度約為20_24nt的內(nèi)源單鏈非編碼小分子 RNA，在生物體中廣泛存在(Bartel D P. MicroRNAs genomics, biogenesis, mechanisms, and function. Cell, 2004,116 :281-297.)。近年來(lái)大量研究表明，miRNA能夠調(diào)控生物體中許多基因的表達(dá)，在調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、抵御環(huán)境脅迫等諸多方面發(fā)揮重要
(Bushati N, Cohen S Μ. MicroRNA functions. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. ,2007,23 175-205.；金龍國(guó)，王川，劉進(jìn)元.植物MicroRNA.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2006， 22 =609-614.)。植物miRNA主要通過(guò)切割靶基因mRNA，或抑制靶mRNA翻譯，來(lái)調(diào)控植物個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育并影響其生理過(guò)程，是一種新的基因調(diào)控模式，具有重要的研究意義(Voirmet 0. Origin,biogenesis, and activity of plant microRNAs· Cell，2009，136 :669-687.)。棉花是世界最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，同時(shí)棉花纖維也是研究單細(xì)胞伸長(zhǎng)的良好模型。與擬南芥、水稻等模式生物相比，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的棉花miRNA數(shù)量可謂寥寥無(wú)幾，因此通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，有望挖掘出更多的棉花miRNA，這對(duì)于全面了解棉花乃至整個(gè)植物 miRNA的形成過(guò)程、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能機(jī)制具有現(xiàn)實(shí)意義。另外，棉花中miRNA可能在諸多生理過(guò)程(如纖維的起始與伸長(zhǎng)等)發(fā)揮重要功能，但棉花中關(guān)于miRNA的生物學(xué)功能研究甚少，因此，通過(guò)關(guān)注特定發(fā)育時(shí)期、特定組織中的miRNA，有望闡明棉花miRNA參與的生理過(guò)程，以及在該過(guò)程中具體發(fā)揮的作用。我國(guó)是世界上主要的棉花生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，棉花對(duì)于我國(guó)具有舉足輕重的地位。國(guó)內(nèi)外除了利用常規(guī)育種手段之外，逐步運(yùn)用基因工程技術(shù)對(duì)水稻品質(zhì)(產(chǎn)量、抗蟲(chóng)等)進(jìn)行遺傳改良已經(jīng)成為了一種趨勢(shì)。由于miRNA對(duì)植物有廣泛的調(diào)控作用，很可能成為植物遺傳改良的重點(diǎn)研究基因之一，因此迫切需要通過(guò)大規(guī)模測(cè)序方法充分挖掘和開(kāi)發(fā)屬于本國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新的miRNA基因，從而為后期定向改良和培育優(yōu)質(zhì)性狀的棉花品種奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供來(lái)源于棉花的miRNA-GhmiR156及其應(yīng)用。本發(fā)明保護(hù)的miRNA-GhmiR156的序列如下(5' — 3')UUGACAGAAGAUAGAGAGCAC (序列表的序列 1)。本發(fā)明保護(hù)的miRNA-GhmiR156 前體(pre-GhmiR156)序列如下(5' — 3')GAGAG⑶UUGACAGAAGAGAGUGAGCACACGCAGGCAGAUU⑶AUGAAAGGCCAUACCUUUGCCCGCCG UGUGCUCACUUCUCUUCU⑶CAGCUUA。(序列表的序列 2)。本發(fā)明還保護(hù)序列1所示RNA或序列2所示的RNA在抑制SPL9轉(zhuǎn)錄因子 (DW504749)基因表達(dá)中的應(yīng)用；所述SPL9轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列為序列表的序列3。
所述SPL9轉(zhuǎn)錄因子基因的核苷酸序列為序列表的序列4。本發(fā)明還保護(hù)序列1所示RNA或序列2所示的RNA在促進(jìn)SPL9轉(zhuǎn)錄因子基因 (DW504749)的mRNA降解中的應(yīng)用；所述SPL9轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列為序列表的序列3。所述SPL9轉(zhuǎn)錄因子基因的核苷酸序列為序列表的序列4 ；所述促進(jìn)SPL9轉(zhuǎn)錄因子基因的mRNA降解為切割SPL9轉(zhuǎn)錄因子基因的mRNA。本發(fā)明還保護(hù)序列1所示RNA或序列2所示的RNA在棉花纖維品質(zhì)改良中的應(yīng)用。Solexa克服了常規(guī)miRNA克隆技術(shù)的缺點(diǎn)，具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，能夠檢測(cè)出最少一個(gè)小RNA分子，并且準(zhǔn)確性高，檢出的小RNA分子堿基錯(cuò)誤率極低。同時(shí)該技術(shù)還具有高通量、大規(guī)模的特點(diǎn)，兩個(gè)文庫(kù)的測(cè)序量高達(dá)500萬(wàn)條小RNA序列以上。基于這種最新的測(cè)序手段，將有望識(shí)別棉花中特定發(fā)育時(shí)期特定組織特異表達(dá)的新miRNA。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明采用國(guó)際上先進(jìn)的Solexa高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析、Northern雜交、5' RACE等多種生物學(xué)手段，首次從基因組水平鑒定到 miRNA-GhmiR156，并且證實(shí)GhmiR156的靶基因?yàn)镾PL9轉(zhuǎn)錄因子基因，參與了棉花纖維起始及胚珠發(fā)育的調(diào)控。這都將為棉花的品質(zhì)育種(如提高棉纖維產(chǎn)量)提供寶貴的基因資源， 帶來(lái)一定的研究?jī)r(jià)值和社會(huì)效益，并最終用于實(shí)際生產(chǎn)。本發(fā)明提供的miRNA廣泛參與了棉花多種生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)，具有重要的生物學(xué)意義和潛在應(yīng)用價(jià)值。


圖1為小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)中分離和鑒定新miRNA的流程2為GhmiR156的前體二級(jí)結(jié)構(gòu)圖；黑色框部分指示成熟miRNA所在的位置圖3為Northern雜交檢測(cè)開(kāi)花前3天至開(kāi)花后3天野生型及突變體棉花胚珠中 GhmiR156的表達(dá)圖4為GhmiR156的靶基因5' RACE驗(yàn)證；序列上方的箭頭表示發(fā)生切割的位點(diǎn)， 數(shù)值表示該切點(diǎn)處發(fā)生切割的克隆數(shù)與克隆總數(shù)比值圖5為實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)在開(kāi)花前3天至開(kāi)花后3天野生型及突變體棉花胚珠中 GhmiR156靶基因SPL9的表達(dá)，黑色表示野生型，白色表示突變
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。下述實(shí)施例中的％，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。以下實(shí)施例中所用棉花品種包括陸地棉徐州142 (Gossypium hirsutum cv. Xuzhoul42)及其無(wú)纖維突變體，以下分別簡(jiǎn)稱(chēng)野生型及突變體。棉花種子來(lái)源于棉花種質(zhì)中期庫(kù)，野生型中期庫(kù)號(hào)為110599，突變體中期庫(kù)號(hào)為140142。實(shí)施例l、miRNA-GhmiR156 的發(fā)現(xiàn)一、樣品采集棉花于每年四月下旬種植于田間，常規(guī)作業(yè)，開(kāi)花前一天花苞套袋，防止花粉傳播造成異花傳粉，開(kāi)花當(dāng)天除袋，并掛牌標(biāo)記。分別收取開(kāi)花前3天、開(kāi)花前1天、開(kāi)花當(dāng)天、 開(kāi)花后1天、開(kāi)花后3天的棉鈴，剖取胚珠，迅速凍存于液氮，保存于_80°C備用。
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二、miRNA_GhmiR156 的發(fā)現(xiàn)1、RNA 提取將由上述一得到的棉花胚珠樣品在液氮中研磨，研磨過(guò)程中加入PVP (按1/5質(zhì)量比)以防止酚類(lèi)氧化，用PureLink Plant RNA Reagent(Invitrogen)提取總RNA，操作步驟如下(以0. Ig材料為例，相應(yīng)試劑量可根據(jù)材料量按比例調(diào)整)①磨好的胚珠粉末加入到Iml提取緩沖液中，加20μ 1 β-巰基乙醇，混勻后置于室溫10-15分鐘。4度12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)至新的離心管，加入100 μ 1 5MNaCl，混勻后加入300 μ 1氯仿，充分混勻，4度12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)至新的離心管；②將轉(zhuǎn)出的溶液依次用氯仿、酚、酚氯仿(1 1)、氯仿抽提，經(jīng)四次抽提后的上清液轉(zhuǎn)入新的離心管，加入100 μ 1多糖去除劑(北京華越洋生物科技有限公司)，混勻后加入200 μ 1氯仿，充分混勻，4度12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)至新的離心管；③加入等體積的異丙醇，混勻后置-20度1小時(shí)以上，4度12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清，離心得到的沉淀用75%的乙醇洗滌，晾干后溶于適量的DEPC水中。使用Ultrospec 3000型紫外分光光度計(jì)(Amersham Biosciences)測(cè)定提取的 RNA在260nm(0D26Q)和280nm(OD28tl)波長(zhǎng)的吸光度值以確定RNA的純度和濃度。質(zhì)量合格的RNA濃度應(yīng)在1 μ g/ μ 1以上，0D26(1/0D28(1的比值在1. 8-2. 0之間，且經(jīng)電泳檢測(cè)條帶清晰，無(wú)明顯降解和DNA污染。2、小RNA文庫(kù)的構(gòu)建將質(zhì)量檢驗(yàn)合格的棉花胚珠總RNA用于構(gòu)建小RNA文庫(kù)。5個(gè)不同時(shí)期的胚珠樣品提取的RNA各取10 μ g等量混合，總共50 μ g用于構(gòu)建小RNA文庫(kù)。小RNA文庫(kù)的構(gòu)建按照Illumina Sample Preparation Protocol文庫(kù)構(gòu)建方法進(jìn)行，構(gòu)建好的文庫(kù)采用Solexa 高通量測(cè)序(北京華大基因研究中心)，獲得高質(zhì)量的18-30nt的小RNA序列。3、小RNA文庫(kù)中保守的miRNA的鑒定植物miRNA在各物種間表現(xiàn)出較高的進(jìn)化保守性，而且往往越是在體內(nèi)發(fā)揮重要功能的miRNA，其物種間保守型越高。為了挖掘高通量測(cè)序庫(kù)中的保守的miRNA， 參考之前國(guó)外文獻(xiàn)對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析的成功方法(Jones-I^hoades M W，Bartel D P. Computational identification of plant miRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell, 2004,14 :787-799.)，建立了一套計(jì)算機(jī)分析方法用來(lái)發(fā)現(xiàn)和鑒定測(cè)序數(shù)據(jù)中的保守的棉花miRNA(分析流程如圖1所示)。①將獲得的兩個(gè)小RNA文庫(kù)中的原始序列通過(guò)計(jì)算機(jī)方法去掉3'接頭，并過(guò)濾掉序列長(zhǎng)度在18nt以下的序列，獲得所謂的“干凈”序列庫(kù)；②將“干凈”的序列與國(guó)際權(quán)威的miRNA數(shù)據(jù)庫(kù) miRBase (http //microrna. Sanger, ac. uk/sequences/)中公布的 miRNA 成熟序列進(jìn)行 BLAST，從而發(fā)現(xiàn)哪些序列來(lái)自于已知的miRNA，已知miRNA不超過(guò)2個(gè)錯(cuò)配的序列再進(jìn)入下一步分析；③將潛在miRNA序列庫(kù)中的序列與已有的棉花數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST，數(shù)據(jù)庫(kù)包括棉花 EST (http://compbio. dfci. harvard, edu)、棉花 GSS(NCBI)、以及已有的部分雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)的基因組序列。將找到的棉花數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)應(yīng)的序列進(jìn)行下一步分析。④使用 miRNA 前體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件 mireap_0. 2 (http //sourceforRe. net/pro iects/ liM)，對(duì)獲取的棉花數(shù)據(jù)庫(kù)中有小RNA對(duì)應(yīng)的序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，若能形成類(lèi)似miRNA前體(pre-miRNA)的良好莖環(huán)結(jié)構(gòu)則該序列可以認(rèn)為是候選的新miRNA ；⑤對(duì)候選的新的miRNA繼續(xù)進(jìn)行篩選，考察候選的新miRNA序列所在的莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體的小RNA分布特征，若主要分布在候選的新miRNA區(qū)域以及對(duì)應(yīng)的miRNA*區(qū)域，則認(rèn)為該候選的新miRNA序列高度可信，是真實(shí)的 miRNA 序列(MeyersBC, AxtellMJ, BartelB, BartelDP, BaulcombeD, BowmanJL,CaoX,CaringtonJC,ChenX,GreenPJ,et al. Criteria for annotation of plant microRNAs. Plant Cell, 2008，20 :3186-3190.)。鑒定到1 個(gè) miRNA，命名為 GhmiR156。GhmiR156 的序列如下(5' — 3' ) :UUGACAGAAGAUAGAGAGCAC(序列 1)。野生型小RNA文庫(kù)的測(cè)序次數(shù)(Qwt)為22808，突變體小RNA文庫(kù)( )的測(cè)序次數(shù)為20352。miRNA前體(pre_miRNA)序列的二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)是miRNA基因最顯著的特點(diǎn)之一，也是所有miRNA鑒定方法都不可逾越的重要規(guī)則。GhmiR156 前體(pre-GhmiR156)序列如下(5' — 3')GAGAG⑶UUGACAGAAGAGAGUGAGCACACGCAGGCAGAUU⑶AUGAAAGGCCAUACCUUUGCCCGCCG UGUGCUCACUUCUCUUCU⑶CAGCUUA (序列表的序列 2)。pre-GhmiR156能形成良好的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，成熟的miRNA從miRNA前體的莖部產(chǎn)生，完全符合miRNA前體的結(jié)構(gòu)特征(見(jiàn)圖2)。也可人工合成序列1和序列2。三、miRNA Northern 雜交為了進(jìn)一步檢測(cè)GhmiR156在開(kāi)花前3天至開(kāi)花后3天在棉花胚珠中的表達(dá)模式， 采用miRNA Northern雜交檢測(cè)其表達(dá)情況。1、制備探針檢測(cè)GhmiR156 的探針(5' — 3')的序列GTGCTCTCTATCTTCTGTCAA。采用T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs)對(duì)上述序列末端磷酸基團(tuán)進(jìn)行同位素(Y -32P ATP)標(biāo)記，得到探針，用Microspin G-25柱(GE Healthcare)純化探針， 去除未標(biāo)記的同位素，純化后的探針用于Northern雜交。2、miRNA Northern 雜交Northern雜交中，每個(gè)泳道上樣量為30 μ g總RNA，U6RNA作為內(nèi)參，與miRNA在同一張膜上檢測(cè)。U6基因的探針序列(5' — 3')為T(mén)GTATCGTTCCAATTTTATCGGATGT。(1)分別提取步驟一制備的各胚珠樣品的總RNA。( miRNA Northern 雜交①取30 μ g量的總RNA，加入等體積的2XRNA上樣緩沖液(95 %甲酰胺， 18mMEDTA,0. 溴酚藍(lán)和0. 二甲苯青)，混合后95°C變性5min，得到RNA樣品。②RNA樣品用15%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后用電轉(zhuǎn)移裝置 (BIO-RAD)轉(zhuǎn)移到 HybondN+尼龍膜(Amersham Biosciences)上。③轉(zhuǎn)移有RNA樣品的尼龍膜經(jīng)6XSSC溶液短暫漂洗，紫外交聯(lián) (Stratagene) 5min,再80°C烘烤2h，使RNA完全固定在尼龍膜上。④將轉(zhuǎn)移了 RNA的尼龍膜放入雜交管中，加入5ml ULTRAhyb-Oligo雜交液 (Ambion)在雜交爐中42°C預(yù)雜交池，然后加入探針，混勻，42°C雜交過(guò)夜。
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⑤雜交結(jié)束后，小心倒出雜交液，加入含0. 5% SDS的2XSSC溶液，42°C洗滌三次， 每次IOmin。⑥洗膜結(jié)束后，將膜用保鮮膜包裹，平整壓于X光片下，附加增感屏，-70°C曝光2 周。⑦曝光結(jié)束后，沖洗X光片，進(jìn)行光密度掃描，以對(duì)照組的雜交信號(hào)為1，計(jì)算各個(gè)處理組雜交信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度。結(jié)果見(jiàn)圖3，Northern雜交結(jié)果顯示，野生型(WT)中，GhmiR156在開(kāi)花前3天至開(kāi)花后3天，表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在突變體(MU)中，GhmiR156的表達(dá)量亦呈下降趨勢(shì)，然而在開(kāi)花后3天，野生型中GhmiR156含量要明顯低于突變體，暗示了 GhmiR156在棉花纖維發(fā)育過(guò)程中可能起重要的作用。定量選用TotalLab軟件對(duì)X光片上的條帶進(jìn)行光密度掃描，分別得到GhmiR171 和U6RNA的光密度值，二者的比值見(jiàn)圖3中所標(biāo)注的數(shù)值，即為各個(gè)胚珠樣品中GhmiR171 的相對(duì)含量。實(shí)施例2、miRNA的靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證由于植物miRNA與靶基因mRNA近乎完全互補(bǔ)，因此可以通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè) GhmiR156 的靶基因。采用在線(xiàn)軟件 psRNATarget (http //plantgrn. noble, org/ psRNATarget/)在棉花EST數(shù)據(jù)庫(kù)CGIlO中尋找到能與miRNA序列近乎完全互補(bǔ)的cDNA或基因，即為miRNA的靶標(biāo)；參數(shù)設(shè)置為=PsRNATarget程序參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置，靶標(biāo)的功能通過(guò) NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)同源性檢索，以同源性最高的已知功能基因進(jìn)行注釋。預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。表lGhmiR156的靶基因及功能
權(quán)利要求
1.序列表的序列1所示的RNA。
2.序列表的序列2所示的RNA。
3.權(quán)利要求1或2所述RNA在抑制SPL9轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)中的應(yīng)用；所述SPL9轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列為序列表的序列3。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述SPL9轉(zhuǎn)錄因子基因的核苷酸序列為序列表的序列4。
5.權(quán)利要求1或2所述RNA在促進(jìn)SPL9轉(zhuǎn)錄因子基因的mRNA降解中的應(yīng)用；所述 SPL9轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列為序列表的序列3。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述SPL9轉(zhuǎn)錄因子基因的核苷酸序列為序列表的序列4 ；所述促進(jìn)SPL9轉(zhuǎn)錄因子基因的mRNA降解為切割SPL9轉(zhuǎn)錄因子基因的mRNA。
7.權(quán)利要求1或2所述RNA在棉花纖維品質(zhì)改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了來(lái)源于棉花的miRNA-GhmiR156及其應(yīng)用。本發(fā)明保護(hù)的GhmiR156是序列表的序列1所示的RNA。本發(fā)明保護(hù)的GhmiR156前體(pre-GhmiR156)是序列表的序列2所示的RNA。本發(fā)明還保護(hù)序列1所示RNA在抑制SPL9轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)和/或促進(jìn)SPL9轉(zhuǎn)錄因子基因的mRNA降解中的應(yīng)用。所述SPL9轉(zhuǎn)錄因子如序列表的序列3所示。所述SPL9轉(zhuǎn)錄因子基因如序列表的序列4所示。應(yīng)用miRNA-GhmiR156有望獲得在生長(zhǎng)發(fā)育方面有重要表型的植株，具有重要的生物學(xué)意義和潛在應(yīng)用價(jià)值，將為棉花的品質(zhì)育種(如培育抗逆性棉花)提供寶貴的基因資源，帶來(lái)一定的研究?jī)r(jià)值和社會(huì)效益，并最終用于實(shí)際生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102277357SQ20111021405
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月28日
發(fā)明者劉進(jìn)元, 王正明, 薛偉 申請(qǐng)人:清華大學(xué)