專利名稱：粘質(zhì)沙雷氏菌lth-2及其篩選方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于粘質(zhì)沙雷氏菌篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種粘質(zhì)沙雷氏菌LTH-2及其篩選方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展，社會(huì)工業(yè)化進(jìn)程的加快，人們不合理的生活、生產(chǎn)方式等原因?qū)е铝怂蛑械?、磷等營(yíng)養(yǎng)鹽類大量富集，致使全球性水域富營(yíng)養(yǎng)化日益嚴(yán)重。水體富營(yíng)養(yǎng)化帶來(lái)的直接危害就是水華的產(chǎn)生。在溫暖的季節(jié)，藻類大量繁殖，往往漂浮在水面或分散在水中呈浮動(dòng)狀態(tài)形成一片片藍(lán)綠色的藻塊或藻的薄層即“水華”。最近十幾年來(lái)， 在滇池、太湖等水域，“水華”頻現(xiàn)?！八A”出現(xiàn)時(shí)，由于密集的藻類，導(dǎo)致水體透明度降低， 影響水中植物的光合作用；當(dāng)大量藻類死亡后，其迅速分解，消耗水中的溶解氧，使得溶解氧急劇減少，造成水體缺氧。缺氧引起水生生物窒息死亡，水體的正常生態(tài)平衡被打亂，生物種群會(huì)顯示劇烈的波動(dòng)，這種生物種類演替導(dǎo)致水生生物的穩(wěn)定性和多樣性降低，使水體失去以前的功能，出現(xiàn)湖泊老化。另外自來(lái)水廠的過(guò)濾裝置易會(huì)由于藻類“水華”而被填塞，影響混凝沉淀效果，影響出水濁度，從而影響自來(lái)水廠的生產(chǎn)和自來(lái)水的質(zhì)量。而有些藻類在代謝過(guò)程中或藻體破裂后會(huì)釋放藻毒素，微囊藻毒素就是一種很強(qiáng)的肝致癌物，長(zhǎng)期飲用則可能引發(fā)肝癌。綜上水體富營(yíng)養(yǎng)化所引起“水華”影響水體景觀，使水質(zhì)惡化，生態(tài)系統(tǒng)平衡遭破壞，影響自來(lái)水廠的生產(chǎn)和自來(lái)水的質(zhì)量，產(chǎn)生藻毒素，給水生態(tài)系統(tǒng)、公共衛(wèi)生安全帶來(lái)嚴(yán)重威脅。研究?jī)羲寮夹g(shù)，從而解決藻類泛濫、水華暴發(fā)，已經(jīng)成為的一個(gè)非常重要而緊迫的任務(wù)。目前，除藻技術(shù)主要有撈藻、挖泥、換水除藻、黏土絮凝和遮光技術(shù)等物理技術(shù)； 投加氧化型殺菌除藻劑以及無(wú)機(jī)金屬化合物及重金屬制劑等非氧化型殺菌除藻劑等化學(xué)技術(shù)；除此之外，還有水生植物控制、水生動(dòng)物控制和微生物除藻等生物除藻技術(shù)。物理除藻技術(shù)往往需要昂貴的經(jīng)濟(jì)成本，耗資大，因此該技術(shù)的運(yùn)用只局限于局部水域?；瘜W(xué)除藻技術(shù)顯效速度快、效果顯著，但殺菌滅藻劑往往對(duì)其他生物有副作用，加速藻毒素釋放，產(chǎn)生副產(chǎn)物，從而會(huì)不可避免地將造成環(huán)境的二次污染或破壞生態(tài)平衡，所以化學(xué)除藻技術(shù)只能作為權(quán)宜之計(jì)。生物除藻技術(shù)利用生態(tài)系統(tǒng)食物鏈攝取的原理及生物的相生相克關(guān)系來(lái)控制或抑制藻的泛濫生長(zhǎng)，將能夠有效地控制藍(lán)藻生長(zhǎng)的生物調(diào)動(dòng)起來(lái)。這種方法充分利用了生態(tài)系統(tǒng)中各生物的相互作用，可有效地控制藻類生長(zhǎng)。有關(guān)研究表明溶藻菌在水華消退過(guò)程中扮演重要的角色。因此，從自然界中分離純化土著溶藻菌以及其相關(guān)活性物質(zhì)，從而安全、高效地治理水華具有非常重要的實(shí)際意義。目前對(duì)土著溶藻菌的報(bào)道較少，尤其淡水中的土著溶藻菌以及其代謝產(chǎn)物的報(bào)道更少。 本發(fā)明因此而來(lái)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種粘質(zhì)沙雷氏菌(Sarratia marcesens) LTH-2，解決了現(xiàn)有技術(shù)中缺乏進(jìn)行水華處理的溶藻菌研究以及淡水水華污染凈化處理等技術(shù)難題。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種粘質(zhì)沙雷氏菌(Sarratia marcesens) LTH-2，該菌株的保藏編號(hào)為CCTCC M 2011209，其具有溶解微囊藻并產(chǎn)生靈菌紅素的能力。本發(fā)明的另一目的在于提供一種粘質(zhì)沙雷氏菌LTH-2的培養(yǎng)篩選方法，其特征在于所述方法包括將富營(yíng)養(yǎng)化的太湖水樣品進(jìn)行稀釋后在固體分離培養(yǎng)基平皿上進(jìn)行需氧培養(yǎng)形成菌落，然后挑單菌落分離純化得到純化的粘質(zhì)沙雷氏菌LTH-2菌株。優(yōu)選的，所述方法中需氧培養(yǎng)在溫度控制在28 30°C范圍內(nèi)、PH值控制在6. 8 7. 2下進(jìn)行。優(yōu)選的，所述方法中采用的固體分離培養(yǎng)基以其組分的配比計(jì)包括牛肉膏5重量份數(shù)；蛋白胨10重量份數(shù)；NaCl5重量份數(shù)；瓊脂粉2重量份數(shù)；蒸餾水100重量份數(shù)；固體分離培養(yǎng)基的pH值控制在6. 8 7. 2范圍內(nèi)。優(yōu)選的，所述方法中還包括將所述純化的粘質(zhì)沙雷氏菌LTH-2菌株按照3 5% 的接種量接入液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的PH值控制在6. 8 7. 2范圍內(nèi)，培養(yǎng)溫度為觀 30°C，培養(yǎng)時(shí)間為24h 48h，得到擴(kuò)大培養(yǎng)的粘質(zhì)沙雷氏菌LTH-2菌株。優(yōu)選的，所述方法中所述的液體培養(yǎng)基以其組分的配比計(jì)包括牛肉膏5重量份數(shù)；蛋白胨10重量份數(shù)；NaCl5重量份數(shù)；蒸餾水100重量份數(shù)；且液體培養(yǎng)基的pH值控制在6. 8 7. 2。本發(fā)明的又一目的在于提供一種粘質(zhì)沙雷氏菌LTH-2在凈化含銅綠微囊藻液污水中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于環(huán)保技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從富營(yíng)養(yǎng)化湖泊細(xì)菌中篩選出來(lái)可以高效率溶解微囊藻的淡水土著菌菌株以及制備其產(chǎn)生的靈菌紅素的方法。本發(fā)明揭示了一種從富營(yíng)養(yǎng)化湖泊細(xì)菌中篩選出來(lái)可以高效率溶解微囊藻的淡水土著細(xì)菌菌株以及該菌生產(chǎn)溶藻代謝產(chǎn)物靈菌紅素，從而消除微囊藻水華及其水華帶來(lái)的環(huán)境污染。使用的微生物使用的微生物為粘質(zhì)沙雷氏菌，根據(jù)其生物類別情況命名為粘質(zhì)沙雷氏菌 (Sarratia marcesens) LTH-2，來(lái)自中華人民共和國(guó)江蘇省無(wú)錫市太湖湖水中分離獲得，現(xiàn)在已經(jīng)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，該保藏中心的地址位于湖北省武漢市武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院武漢市武昌珞珈山；粘質(zhì)沙雷氏菌(Sarratia marcesens) LTH-2的保藏日期為 2011年6月23日，保藏期限為30年，保藏編號(hào)為CCTCC M 2011209。本發(fā)明提供的溶藻菌是從江蘇省無(wú)錫市富營(yíng)養(yǎng)化程度嚴(yán)重且微囊藻水華頻發(fā)的太湖中篩選的得到的菌株。該菌株為太湖中土著的異養(yǎng)細(xì)菌，命名為L(zhǎng)TH-2，此菌經(jīng)過(guò)Biolog微生物鑒定系統(tǒng)鑒定以及此菌16S rDNA序列分析，其屬于粘質(zhì)沙雷氏菌(Sarratia marcesens)中的成員。菌LTH-2的16SrDNA全基因序列已向美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心 (NCBI)的Genebank基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)遞交，登錄號(hào)為HM640277。粘質(zhì)沙雷氏菌LTH-2的微生物學(xué)特性1、形態(tài)學(xué)方面的特性微生物本身形態(tài)學(xué)特性菌體為革蘭氏陰性短桿狀，大小為(0.7 0.9) μ mX (1. O 1. 3) μ m，周身鞭毛，有動(dòng)力，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜。2、培養(yǎng)學(xué)方面的特性培養(yǎng)基用的是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。其在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上的微生物學(xué)特性菌落呈圓形，光滑，濕潤(rùn)，表面凸起，中心不透明，邊緣不規(guī)則，大小為l_3mm，均產(chǎn)生紅色色素，有輕微異味。該菌為為兼性好氧菌。3、生理生化特征
(1)細(xì)胞產(chǎn)生紅色色素；
(2)桿狀；
(3)革蘭氏陰性；
(4)氧化/發(fā)酵(0/F) =F發(fā)酵型
(5)氧化酶陰性；
(6)鳥(niǎo)氨畫(huà)？:陽(yáng)性；
(7)賴氨畫(huà)？:陽(yáng)性；
(8)乳糖陰性；
(9)蔗糖陽(yáng)性；
(10)苯丙氨酸陰性；
(11)葡萄'糖酸鹽陽(yáng)性;
(12)甘露醇陽(yáng)性；
(13)尿素陰性；
(14)丙二酸眼陰性;
(15)明膠液化弱陽(yáng)性02度)
(16)七葉苷陽(yáng)性;
(17)水楊苷陰性；
(18)麥芽'糖陰性；
(19)半乳'糖陽(yáng)性；
(20)硝酸鹽還原陽(yáng)性；
(21)木糖陰性；
(22)密二-糖弱陽(yáng)性；
(23)肌醇陽(yáng)性;
(24)海藻-糖陽(yáng)性；
(25)棉籽-糖陰性；
(26)吲哚陰性；
(27)鼠李,糖陰性；
5
(28)動(dòng)力學(xué)檢查陽(yáng)性(懸滴檢查)，半固體為動(dòng)力弱陽(yáng)性。通過(guò)生理生化檢測(cè)、Biolog微生物鑒定系統(tǒng)鑒定以及此菌16S rDNA序列分析均表明此菌為粘質(zhì)沙雷氏菌中的成員，因此可以精確地將本發(fā)明的LTH-2分類為粘質(zhì)沙雷氏菌，從而建立了分類鑒定微生物的一種快速(利用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)，1 內(nèi)即可得到鑒定結(jié)果)、可靠、準(zhǔn)確的途徑。該菌株能夠高效溶解微囊藻，24h溶藻率78. 6%。產(chǎn)生溶解微囊藻的紅色代謝產(chǎn)物靈菌紅素，代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高。本發(fā)明所提供制備靈菌紅素的方法，是用LTH-2為生產(chǎn)菌株，經(jīng)母種發(fā)酵培養(yǎng)，提取紅色代謝產(chǎn)物和純化代謝產(chǎn)物的過(guò)程。經(jīng)理化特性、分子量、1H-NMR、FT_IR、GC-MS檢測(cè)，代謝產(chǎn)物的數(shù)據(jù)與靈菌紅素一致，即經(jīng)過(guò)理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的鑒定試驗(yàn)可知此制備方法所得的產(chǎn)品是較純的靈菌紅素。將代謝產(chǎn)物溶于微量甲醇中，然后加入藻密度為3X IO6個(gè)/mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微囊藻液中，然后在顯微鏡下計(jì)數(shù)藻細(xì)胞濃度。在對(duì)內(nèi)，其對(duì)銅綠微囊藻的半數(shù)抑制濃度IC5tl為 1. 9(士0. 1) X 10-1 μ gml—1。通過(guò)形態(tài)學(xué)、一系列生化試驗(yàn)等生理生化特性以及16S rDNA序列分析，將此溶藻菌最終確定為粘質(zhì)沙雷氏菌。經(jīng)過(guò)對(duì)該產(chǎn)物理化性質(zhì)、分子量、結(jié)構(gòu)和溶藻效果分析，可證明由菌株LTH-2發(fā)酵提取的深紅色代謝物為靈菌紅素，且具有較強(qiáng)的溶藻效果，具有很好地開(kāi)發(fā)成一種見(jiàn)效快、 用量少、對(duì)環(huán)境友好的除藻劑的巨大潛力。該菌株的獲得為消除微囊藻水華及其水華帶來(lái)的環(huán)境污染增添了一種生物途徑，也為開(kāi)發(fā)出廉價(jià)但高效的生物活性物質(zhì)以及天然色素奠定了菌種基礎(chǔ)，有很好的研究前景。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明提供了一種能夠從淡水細(xì)菌篩選出來(lái)可以高效率溶解微囊藻的淡水細(xì)菌菌株。該菌株遺傳穩(wěn)定，繁殖快，溶解微囊藻效率高，可進(jìn)行大批量發(fā)酵生產(chǎn)，以消除微囊藻水華。另外，本發(fā)明提供一種制備該菌株產(chǎn)生的溶藻代謝產(chǎn)物靈菌紅素方法。利用此制備方法，不必用到昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器，所以不僅可以快速、簡(jiǎn)單易行地得到較純的高效溶藻活性物質(zhì)-靈菌紅素，而且將發(fā)酵液中的上清液和菌體分別進(jìn)行提取紅色代謝產(chǎn)物，大大節(jié)約了有機(jī)溶劑的用量。


下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述圖1為本發(fā)明實(shí)施例獲得的溶藻菌LTH-2溶藻效果；圖2為本發(fā)明實(shí)施例獲得的溶藻菌LTH-2系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；圖3為本發(fā)明實(shí)施例制備的較純代謝產(chǎn)物靈菌紅素甲醇溶液的紫外可見(jiàn)吸收光譜；圖4為本發(fā)明實(shí)施例制備的較純的靈菌紅素的1H-NMR圖譜；圖5為本發(fā)明實(shí)施例制備的靈菌紅素的GC-MS圖譜；圖6為本發(fā)明實(shí)施例制備靈菌紅素高效溶藻過(guò)程。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。實(shí)施例1粘質(zhì)沙雷氏菌(Sarratia marcesens)LTH-2的篩選和形態(tài)學(xué)觀察粘質(zhì)沙雷氏菌(Sarratia marcesens)LTH-2自中華人民共和國(guó)江蘇省無(wú)錫市太湖湖水中分離獲得，現(xiàn)在已經(jīng)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2011209。篩選粘質(zhì)沙雷氏菌(Sarratia marcesens)LTH-2采用的原料為太湖湖水。具體篩選步驟如下(1)配制溶藻菌固體分離培養(yǎng)基牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaC15g，瓊脂粉2g，蒸餾 7jC IOOmL, pH7. 2 ；(2)將太湖水樣品進(jìn)行梯度稀釋，10倍稀釋形成濃度梯度，分別取每一濃度的樣品0. ImL涂布于固體培養(yǎng)基平皿上，培養(yǎng)M小時(shí)形成菌落，然后挑單菌落分離純化得到純化菌株；(3)配制液體培養(yǎng)基牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaC15g，蒸餾水IOOmL ；(4)擴(kuò)大培養(yǎng)將純化的菌株按照4%的接種量接入液體培養(yǎng)基，液體pH7. 2，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間為48h ；(5)溶藻效果的實(shí)驗(yàn)取ImL培養(yǎng)48h的菌液接種于19mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的銅綠微囊藻液中作為實(shí)驗(yàn)組，微囊藻濃度為3 X IO6個(gè)/mL。以未加入菌液而加入等體積的菌培養(yǎng)基的藻液組為對(duì)照組。兩天后觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的藻液黃化和藻體凝結(jié)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入菌LTH-2菌的實(shí)驗(yàn)組藻液明顯黃化，藻體凝結(jié)出現(xiàn)沉淀，對(duì)照組藻液未黃化和凝結(jié)沉淀。依據(jù)經(jīng)典形態(tài)學(xué)方法，對(duì)分離獲得的菌進(jìn)行肉眼和顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察，合并表型相同的菌株，篩選分離表型不同的菌株，并結(jié)合溶藻效果實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，最后獲得一株土著高效溶藻且產(chǎn)靈菌紅素的菌株LTH-2。溶藻菌LTH-2溶藻效果參見(jiàn)附圖1。實(shí)施例2粘質(zhì)沙雷氏菌(Sarratia marcesens)LTH-2的鑒定本實(shí)施例對(duì)培養(yǎng)得到的粘質(zhì)沙雷氏菌(Sarratia marcesens)LTH-2建立了分類鑒定微生物的一種快速(利用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)，16小時(shí)內(nèi)即可得到鑒定結(jié)果)、可靠、 準(zhǔn)確的途徑。具體鑒定步驟如下A. Biolog微生物鑒定系統(tǒng)鑒定Biolog微生物鑒定系統(tǒng)測(cè)試的是微生物在鑒定板中利用或氧化化和物的能力。測(cè)試會(huì)產(chǎn)生特征性的紫色孔模式，組成代謝指紋，系統(tǒng)軟件自動(dòng)和數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，如果能找到合適的匹配，就可以得出一個(gè)鑒定結(jié)果。具體方法參加Biolog公司的MicroLogTM System, Release 4. 2指導(dǎo)手冊(cè)。(1)平板選擇針對(duì)溶藻菌LTH-2選擇Biolog GN板(2)樣品制備將菌接LTH-2種于Biolog接種液中，并控制到適宜濃度，使?jié)岫葹?61% T。(3)加樣取一定體積菌液(150 μ L/孔)，平行加入Biolog GN板中各孔，共加96 孔。
(4)培育與讀數(shù)生化培養(yǎng)箱中37°C恒溫培育16-24h，放入讀數(shù)儀，A-I孔位于左上方。即可點(diǎn)擊“Read This”進(jìn)行讀數(shù)。本發(fā)明實(shí)施例獲得的Biolog微生物鑒定系統(tǒng)鑒定溶藻菌LTH-2的鑒定結(jié)果自動(dòng)顯示在屏幕下方，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行保存即可。鑒定結(jié)果參見(jiàn)下表。
權(quán)利要求
1.一種粘質(zhì)沙雷氏菌(Sarratia marcesens) LTH-2，該菌株的保藏編號(hào)為CCTCC M 2011209，其具有溶解微囊藻并產(chǎn)生靈菌紅素的能力。
2.—種權(quán)利要求1所述的粘質(zhì)沙雷氏菌LTH-2的培養(yǎng)篩選方法，其特征在于所述方法包括將富營(yíng)養(yǎng)化的太湖水樣品進(jìn)行稀釋后在固體分離培養(yǎng)基平皿上進(jìn)行需氧培養(yǎng)形成菌落，然后挑單菌落分離純化得到純化的粘質(zhì)沙雷氏菌LTH-2菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法中需氧培養(yǎng)在溫度控制在觀 30°C范圍內(nèi)、pH值控制在6. 8 7. 2下進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法中采用的固體分離培養(yǎng)基以其組分的配比計(jì)包括牛肉膏 5重量份數(shù)；蛋白胨 10重量份數(shù)；NaCl 5重量份數(shù)； 瓊脂粉 2重量份數(shù)；蒸餾水 100重量份數(shù)；固體分離培養(yǎng)基的pH值控制在6. 8 7. 2范圍內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法中還包括將所述純化的粘質(zhì)沙雷氏菌LTH-2菌株按照3 5%的接種量接入液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的pH值控制在6. 8 7. 2范圍內(nèi)，培養(yǎng)溫度為觀 30°C，培養(yǎng)時(shí)間為24h 48h，得到擴(kuò)大培養(yǎng)的粘質(zhì)沙雷氏菌 LTH-2菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中所述的液體培養(yǎng)基以其組分的配比計(jì)包括牛肉膏 5重量份數(shù)；蛋白胨 10重量份數(shù)；NaCl 5重量份數(shù)；蒸餾水 100重量份數(shù)；且液體培養(yǎng)基的pH值控制在6. 8 7. 2。
7.—種權(quán)利要求1所述的粘質(zhì)沙雷氏菌LTH-2在凈化含銅綠微囊藻液污水中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種粘質(zhì)沙雷氏菌(Sarratiamarcesens)LTH-2，該菌株的保藏編號(hào)為CCTCCM2011209，其具有溶解微囊藻并產(chǎn)生靈菌紅素的能力。該菌生產(chǎn)溶藻代謝產(chǎn)物靈菌紅素，可以消除微囊藻水華及其水華帶來(lái)的環(huán)境污染。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102337234SQ20111021531
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者吳巍, 尹立紅, 楊飛, 浦躍樸 申請(qǐng)人:東南大學(xué)