粘質沙雷氏菌ll-413菌株及其制備舍雷肽酶的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種粘質沙雷氏菌LL?413菌株及其制備舍雷肽酶的應用，將粘質沙雷氏菌LL?413菌株接種入產(chǎn)酶培養(yǎng)基，于28～32℃、200～250r/min發(fā)酵20～42h，獲得含有舍雷肽酶的發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)過離心后去除菌體，上清液再經(jīng)過鹽析、透析和冷凍干燥后，即可得到舍雷肽酶；本發(fā)明LL?413菌株生長快、容易培養(yǎng)，發(fā)酵周期短；產(chǎn)舍雷肽酶活性高，在優(yōu)選的條件下，搖瓶發(fā)酵的酶活可達1126U/mL，10L發(fā)酵罐發(fā)酵酶活可達1505U/mL；分離純化工藝簡單，經(jīng)鹽析和透析脫鹽后，舍雷肽酶的凍干粉酶活達2843U/mg，舍雷肽酶分子量為50kDa，纖溶活性達112357U/g。CCTCC No：M 201578020151225
【專利說明】
粘質沙雷氏菌LL-413菌株及其制備舍雷肽酶的應用 (一)
技術領域
[0001 ] 本發(fā)明涉及一株舍雷肽酶產(chǎn)生菌一粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)LL_413 菌株，及其在制備舍雷肽酶中的應用。 (二)
【背景技術】
[0002] 舍雷肽酶（861^&1：；[0口6口1：1(1&86或861'抑口6口七&86)，又名沙雷肽酶、沙雷蛋白酶等， 是來源于微生物的一種蛋白酶，因其最初發(fā)現(xiàn)于粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens)而 得名。該酶的發(fā)現(xiàn)者Dr Hans稱該酶為"奇跡之酶"，它具有良好的抗炎、抗腫脹、促進痰液、 膿液溶解與排泄以及鎮(zhèn)痛作用，臨床用于手術后及外傷的消炎;副鼻竇炎、乳汁潴留性乳腺 炎、膀胱炎、附睪炎、智齒周圍炎及牙槽膿腫時的消炎；以及治療支氣管炎、肺結核、支氣管 哮喘時痰液不易咳出等。研究也表明，舍雷肽酶具有出色的纖溶活性，使其在治療動脈粥樣 硬化方面也有潛在的應用。目前市場上已有舍雷肽酶相關藥品，如國內市場上的"達先"、 "釋瑞達"和"曲坦"等腸溶片，國外市場上的"Dasen"和"Seradase"等;舍雷肽酶也可作為非 處方藥使用，具有對抗炎癥、解除疼痛和腫脹，還具有加速復原與激發(fā)免疫系統(tǒng)等功效，產(chǎn) 品如市場上的 "Serretia"、"Natto-Serra" 和 "SerraGold"膠囊等。
[0003]舍雷肽酶的分子量在40_60kDa之間，是一種含有鋅離子的金屬蛋白酶。從基因序 列推導出的氨基酸序列可知，該酶是由470個氨基酸組成。該酶最大的特點是其氨基酸序列 中不包含硫氨基酸，水解蛋白的主要位點是甘氨酸和疏水性氨基酸（如亮氨酸、苯丙氨酸 等）的肽鍵部位。目前舍雷肽酶主要生產(chǎn)菌種是粘質沙雷氏菌E15菌株，該菌株是從日本蠶 蛹內臟中篩選得到，蠶蛹就是利用該酶破壞繭殼，從而化蛹成蛾。粘質沙雷氏菌又名靈桿 菌，是革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌，屬于腸桿菌科^11〖61'(^3(^6143〇636)沙雷氏菌屬 (Serrtia)。該菌的最大特征在28~30°C下培養(yǎng)產(chǎn)生鮮紅的色素一靈菌紅素(prodigiosin， 又稱靈桿菌素）；37 °C下培養(yǎng)不產(chǎn)生紅色色素，靈菌紅素具有抗菌、抑癌、提高免疫力等生理 活性，具有一定的開發(fā)潛質。
[0004] 近些年來，舍雷肽酶在作為藥物在臨床的使用量逐年增長，國內外市場需求量非 常大，而且售價較高，國內舍雷肽酶類藥物的原料多從國外進口，生產(chǎn)的企業(yè)屈指可數(shù)，也 未見相關發(fā)酵工藝研究的報道。目前，日本和印度工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模較大，國際市場多向這兩 個國家采購，所以國內迫切需要開發(fā)具自主知識產(chǎn)權的舍雷肽酶生產(chǎn)工藝。本發(fā)明篩選出 舍雷肽酶高產(chǎn)菌株，優(yōu)化了舍雷肽酶發(fā)酵工藝，建立了酶的分離純化方法，開發(fā)出一條完整 的舍雷肽酶生產(chǎn)工藝，從而可以擴大國內舍雷肽酶的生產(chǎn)能力，滿足國內外市場需求。 (三)

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明提供一株新的舍雷肽酶產(chǎn)生菌一粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens) LL-413菌株，及其在制備舍雷肽酶中的應用，具有舍雷肽酶發(fā)酵活力單位高，發(fā)酵周期短， 分離純化成本低等優(yōu)點。
[0006] 本發(fā)明采用的技術方案為：
[0007]本發(fā)明提供一株新的舍雷肽酶產(chǎn)生菌--粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens) LL-413菌株，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號:CCTCC No:M2015780，保藏日期為 2015年12月25日，地址：中國武漢，武漢大學，郵編:430072。
[0008] 所述的粘質沙雷氏菌LL-413菌株的培養(yǎng)特征如下，將LL-413菌株接種在營養(yǎng)瓊脂 平板上培養(yǎng)，30°C下培養(yǎng)24h后，正面可見鮮紅色菌落，菌落邊緣整齊，表面光滑有光澤；背 面也呈鮮紅色;在37 °C下培養(yǎng)24h后可見淺粉色菌落，菌落表面光滑，邊緣整齊，背面呈淺黃 色;有輕微的臭味。將所述LL-413菌株接種在脫脂牛奶平板培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)24h后可以 看到鮮紅色的菌落以及菌落四周明顯的透明圈。
[0009] 所述粘質沙雷氏菌LL-413菌株的菌體特征如下:革蘭氏陰性，短桿狀，長約2.0~ 2.5以111，寬約0.8~1.(^111，無鞭毛和莢膜。
[0010]所述粘質沙雷氏菌LL-413菌株的16S rDNA的部分核苷酸序列如SEQ ID N0.1所 不。
[0011] 本發(fā)明還涉及所述的粘質沙雷氏菌LL-413菌株在發(fā)酵制備舍雷肽酶中的應用。所 述的應用是將粘質沙雷氏菌LL-413菌株接種入產(chǎn)酶培養(yǎng)基，于28~32°C、200~250r/min發(fā) 酵20~42h，得干菌體濃度為2 · 67~9 · 40g/L，舍雷肽酶活力為360 · 0~1505U/mL的發(fā)酵液， 發(fā)酵液經(jīng)過離心后去除菌體，上清液再經(jīng)過鹽析、透析和冷凍干燥后，即可得到舍雷肽酶； 所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基終濃度組成為:酵母浸出粉5~1 lg/L，牛肉膏3.0~6.6g/L，麥芽浸粉10.0 ~12.28/1，1%3〇4 18/1，似(：158/1，溶劑為水，初始?!1為7.5~8.5。
[0012] 所述粘質沙雷氏菌LL-413菌株在產(chǎn)酶培養(yǎng)前，通常需要先經(jīng)斜面活化培養(yǎng)，然后 經(jīng)種子培養(yǎng)、獲得種子液再接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，具體步驟如下：
[0013] (1)將粘質沙雷氏菌LL-413菌株接種于斜面培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)24~36h，得到活 化后的斜面菌體;所述的斜面培養(yǎng)基終濃度組成為:蛋白胨l〇g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L， 瓊脂20g/L，溶劑為水，初始pH為7.0;
[0014] (2)將步驟（1)活化后的斜面菌體接種至種子培養(yǎng)基中，于30°C、200~250r/min振 蕩條件下培養(yǎng)18~24h，得到種子液;所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為:蛋白胨10g/L，牛肉膏 3g/L，NaCl 5g/L，溶劑為水，初始pH為7 · 0;
[0015] (3)將步驟(2)種子液以體積濃度1 %~2 %的接種量，移種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于30 °C、200~250r/min振蕩條件下培養(yǎng)24~42h，得到含舍雷肽酶的發(fā)酵液;所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基終 濃度組成為:酵母浸出粉5~11 g/L，牛肉膏3 · 0~6 · 6g/L，麥芽浸粉10 · 0~12 · 2g/L，MgS〇4 lg/L，NaCl 5g/L，溶劑為水，培養(yǎng)基初始pH為7 · 5~8 · 5。
[0016] 本發(fā)明所述發(fā)酵液于4°C條件下5000g離心10min，分離除去菌體，得澄清的舍雷肽 酶粗酶液。
[0017] 本發(fā)明還涉及利用10L機械攪拌發(fā)酵罐對粘質沙雷氏菌LL-413菌株進行發(fā)酵制備 舍雷肽酶的應用。所述應用為:將粘質沙雷氏菌LL-413菌株經(jīng)斜面培養(yǎng)基進行活化后，接種 入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)18~24h后，將種子液以體積濃度1-2 %的接種量接入5.0~6.5L的產(chǎn)酶 培養(yǎng)基中，控制溫度為30 ± 2 °C，pH為8.0 ± 0.5，調節(jié)通氣量0.6~1. Ov/v · min，攪拌轉速 300~500r/min，使溶氧飽和度50%~100%，發(fā)酵運行20~24h后，得到含有舍雷肽酶的發(fā) 酵液，將發(fā)酵液進行離心去除菌體后，即得到舍雷肽酶粗酶液。
[0018] 本發(fā)明所述粘質沙雷氏菌LL-413菌株發(fā)酵所產(chǎn)的含舍雷肽酶粗酶液進行分離純 化的方法為:將粘質沙雷氏菌LL-413菌株發(fā)酵所得的舍雷肽酶粗酶液，經(jīng)過硫酸銨(NH4S04) 沉淀、透析除鹽和冷凍干燥后獲得舍雷肽酶。具體的，所述分離純化方法如下：
[0019] (1)往舍雷肽酶粗酶液中加入硫酸銨，使其飽和度達到30~45 %，4 °C沉淀12~ 24h，之后將粗酶液于4°C、8000g條件下離心10min，去除沉淀，保留上清液；
[0020] (2)往步驟(1)中經(jīng)硫酸銨沉淀后所得的上清液中再次加入硫酸銨，使其飽和度達 到70~80 %，4°C沉淀12~24h，之后將粗酶液于4°C、8000g條件下離心10min，棄去上清液， 沉淀物用pH值8.0的Tris-HCl緩沖液溶解，此時得到舍雷肽酶粗品的濃縮液；
[0021] (3)將步驟(2)所得濃縮液裝入截留分子量為14kDa的透析袋中，以去離子水為透 析液透析除鹽后，于-40°C冷凍干燥，即得到舍雷肽酶凍干酶粉。
[0022] 本發(fā)明中，所述的舍雷肽酶活力定義為：在37°C反應條件下，lmin水解濃度為 20mg/mL的酪蛋白產(chǎn)生lyg酪氨酸所需的酶量(mL)作為一個酶活力單位(U)。
[0023] 本發(fā)明提供了產(chǎn)舍雷肽酶的LL-413菌株，以及發(fā)酵制備舍雷肽酶的應用，其有益 效果主要體現(xiàn)在：（1)粘質沙雷氏菌LL-413菌株生長快、容易培養(yǎng)，發(fā)酵周期短；（2)粘質沙 雷氏菌LL-413菌株產(chǎn)舍雷肽酶活性高，在優(yōu)選的條件下，搖瓶發(fā)酵的酶活可達1126U/mL， 10L發(fā)酵罐發(fā)酵酶活可達1505U/mL;(3)舍雷肽酶的分離純化工藝簡單，經(jīng)鹽析和透析脫鹽 后，舍雷肽酶的凍干粉酶活達到2843U/m g<3(4)本發(fā)明制備的舍雷肽酶分子量為50kDa，纖溶 活性達 112357U/g。 (四）
【附圖說明】
[0024]圖1 A66Q-酪氨酸濃度標準曲線；
[0025]圖2平板培養(yǎng)基上LL-413菌株的菌落形態(tài)照片；
[0026]圖3光學顯微鏡下LL-413菌株的菌體形態(tài)照片；
[0027]圖4由LL-413菌株發(fā)酵制備的舍雷肽酶的電泳圖，泳道1:標準蛋白Marker;泳道2: 舍雷肽酶樣品(實施例7制備）。 (五)
【具體實施方式】
[0028] 下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0029] 實施例1:產(chǎn)舍雷肽酶菌株的分離與篩選
[0030] 所述的LL-413菌株的分離和篩選方法如下：
[0031 ] (1)平板初篩:取蠶繭1只（3 . lg)，剝去繭殼，取出蠶蛹（1.6g)，于體積濃度75 %的 乙醇水溶液中浸泡15s后取出，用鑷子和剪刀小心剪去頭部，剖開腹腔取出內臟;將內臟放 入無菌研缽，加入lmL無菌去離子水研磨至勻漿;將勻漿液用無菌水梯度稀釋至Π ^-ΠΓ6 倍。吸取0.2mL各稀釋度溶液，涂布到脫脂牛奶平板培養(yǎng)基上，30°C恒溫箱培養(yǎng)至菌落數(shù)不 再增加。挑取紅色且在平板上形成透明圈的菌落，劃線接種于新鮮的營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基 上。30°C恒溫箱培養(yǎng)至長出單菌落。純化后的單菌落接種于斜面培養(yǎng)基，每個菌株給以編 號，共獲得7個具上述特征的菌株，分別編號(見表1)，4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0032] (2)搖瓶復篩:從斜面培養(yǎng)基挑取上述分離純化后獲得的菌株菌體，接入營養(yǎng)瓊脂 平板培養(yǎng)基于30°C培養(yǎng)36h，活化培養(yǎng)后挑取菌體接入50mL初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于30°C、 200r/min搖床中發(fā)酵培養(yǎng)24h，將發(fā)酵液5000g離心10min，上清液即為粗酶液。測定粗酶液 的沙雷肽酶活力，不同菌株產(chǎn)舍雷肽酶的活力及干菌體濃度見表1，可見活力最高的菌株為 LL-413菌株，舍雷肽酶的活力為113 · 4U/mL。
[0033]表1不同菌株產(chǎn)舍雷肽酶的活力比較
[0034]
[0035]所述的蠶繭采集自浙江省杭州臨安市，采集時間為2015年3月。
[0036]所述脫脂牛奶平板培養(yǎng)基終濃度組成及配制方法為:NaCl 1 Og/L，瓊脂40g/L，pH 7.0，121°C高壓蒸汽滅菌20min。滅菌結束后加入等體積的60°C保存的無菌脫脂牛奶，混合 均勻倒平板。
[0037]所述斜面培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基組成相同，終濃度組成及配制方法為：蛋 白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，瓊脂20g/L，pH 7.0。培養(yǎng)基加熱至瓊脂溶化后分裝試 管或三角瓶中，經(jīng)高壓蒸汽121°C滅菌15min后擱置斜面或倒入無菌培養(yǎng)皿。
[0038]所述初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基終濃度組成及配制方法為：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0,250mL三角瓶裝50mL，8層紗布扎口，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0039]所述的舍雷肽酶活力測定方法為：
[0040] 取4支試管分別編號1、2、3、4;先在4支試管中分別加入用pH 8.0的Tris-HCl緩沖 液稀釋20~50倍的酶液lmL;然后，1號試管中加入TCA終止液2mL，2、3、4加入20mg/mL酪蛋白 溶液lmL;將4支試管一起放入37°C的恒溫水浴中反應lOmin后，1號試管加入lmL酪蛋白溶 液，作為空白對照。2、3、4號試管立刻加入TCA終止液2mL終止反應。將4支試管中的反應液 8000g離心5min，分別取出lmL上清液，加入5mL Na2C〇3溶液，再加入lmL福林酸試劑快速混 勾；于37°C保溫顯色30min后，在660nm波長處測定吸光值A66〇。
[0041] 測出的2、3、4號試管樣品A_平均值代入以下公式計算被測舍雷肽酶的活力。
[0043] 式中：A = 660nm處吸光度值;K =吸光常數(shù)，由酪氨酸濃度-A66Q標準曲線算得;n = 酶液稀釋倍數(shù);10為反應時間lOmin; 4為反應體系4mL。
[0044] 所述的酪氨酸濃度-A66Q標準曲線繪制方法為：取濃度為0、10、20、30、40、50yg/mL 的酪氨酸水溶液各1 mL于6支試管中，各加入0.4mo 1 /L的Na 2 CO3水溶液5mL，福林酸試劑1 mL， 于漩渦振蕩器上混勻30s后，靜置于37°C的恒溫水浴鍋內顯色30min。顯色結束后，在660nm 波長處測定吸光值A_。以測得的吸光值為橫坐標，酪氨酸濃度為縱坐標，繪制標準曲線，標 準曲線見附圖1，由線性擬合公式計算得K值為105.2。
[0045]本發(fā)明中，所述的舍雷肽酶活力定義為：在37°C反應條件下，lmin水解濃度為 20mg/mL的酪蛋白產(chǎn)生lyg酪氨酸所需的酶量(mL)作為一個酶活力單位(U)。
[0046] 所述的TCA(三氯乙酸)終止液的配制方法:精確稱取三氯乙酸18g，無水乙酸鈉30g 以及冰醋酸30mL用去離子水定容至1L。
[0047] 所述的20mg/mL酪蛋白溶液配制方法為:稱取酪蛋白2g，用pH 8.0的Tris-HCl緩沖 液溶解并且定容至1 〇〇mL，4 °C冰箱保存48h之內使用。
[0048] 所述的Tris-HCl緩沖液配制方法為：先稱取Tris (三羥甲基氨基甲烷）19g，用 900mL去離子水溶解后，用1M的鹽酸將pH調至8.0，再定容至1L。
[0049] 所述的福林酚試劑為成品試劑，購自國藥集團化學試劑有限公司。
[0050] 實施例2:LL-413菌株的分類鑒定
[0051]將LL-413菌株接種在營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)，30°C下培養(yǎng)24h后，正面可見鮮紅色菌 落，菌落邊緣整齊，表面光滑有光澤；背面也呈鮮紅色；在37 °C下培養(yǎng)24h后可見淺粉色菌 落，菌落表面光滑，邊緣整齊，背面呈淺黃色;有輕微的臭味。將所述LL-413菌株接種在脫脂 牛奶平板培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)24h后可以看到鮮紅色的菌落以及菌落四周明顯的透明圈，菌 落照片見附圖2。
[0052] 所述LL-413菌株的菌體特征如下:革蘭氏陰性，短桿狀，長約2.0~2.5μπι，寬約0.8 ~1 · Own，無鞭毛和莢膜，菌體照片見附圖3。
[0053] 提取LL-413菌株的總DNA，利用細菌通用16S rDNA引物進行PCR擴增，獲得該菌株 的16S rDNA片段，經(jīng)測序，其16S rDNA的序列大小為1430bp，具體序列（SEQ ID N0.1)如下：
[0055] 將上述序列與美國國立生物信息中心（National Center for Biotechnology Information USA，NCBI)的基因庫中的微生物16sRNA序列比對，結果表明該菌株與35株粘 質沙雷氏菌同源性達到99%及以上。依據(jù)16S rDNA序列，繪制的該菌株與沙雷氏菌屬不同 種的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，該菌株與粘質沙雷氏菌親緣關系較近，與沙雷氏菌屬其他種的親緣 關系相對較遠，所以可以判斷該菌株是1株粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens)，定名為 粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens)LL_413菌株。該菌株已遞交中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，保藏編號(〇^0：吣.）：]\12015780，保藏日期為2015年12月25日。
[0056] 實施例3:初始條件下LL-413菌株搖瓶發(fā)酵制備舍雷肽酶的方法
[0057] 以LL-413菌株為產(chǎn)酶菌種，在50mL搖瓶發(fā)酵規(guī)模下，增加了種子擴大培養(yǎng)步驟，搖 瓶發(fā)酵制備舍雷肽酶的方法如下：
[0058] (1)將LL-413菌株接種于斜面培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)36h，得到LL-413菌株的活化斜 面;所述的斜面培養(yǎng)基終濃度組成為:蛋白胨l〇g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，瓊脂20g/L，溶 劑為水，初始pH為7.0。培養(yǎng)基加熱至瓊脂溶化后分裝于試管中，經(jīng)高壓蒸汽121°C滅菌 15min后擱置斜面；
[0059] (2)將步驟（1)活化培養(yǎng)后LL-413菌株的菌體接種至50mL種子培養(yǎng)基中，于30°C、 200r/min振蕩條件下培養(yǎng)24h，得到種子液;所述種子培養(yǎng)基組成為：蛋白胨10g/L，牛肉膏 3g/L，NaCl 5g/L，溶劑為水，初始pH為7.0，250mL的三角瓶裝50mL種子培養(yǎng)基，8層紗布扎 口，高壓蒸汽121°C滅菌20min;
[0060] (3)將步驟（2)種子液以體積濃度1 %的接種量，移種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于30 °C、 200r/min振蕩條件下培養(yǎng)24h，得干菌體濃度為1.79g/L的發(fā)酵液;所述初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基組 成為：蛋白胨l〇g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，溶劑為水，初始pH為7 · 0，250mL的三角瓶裝 50mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基，8層紗布扎口，高壓蒸汽121°C滅菌20min;
[0061] (4)將步驟(3)含舍雷肽酶的發(fā)酵液于4°C條件下5000g離心10min，分離除去菌體， 得澄清的舍雷肽酶粗酶液。
[0062]按實施例3方法，所得上清液的舍雷肽酶活力為229.3U/mL，實施例3方法重復實驗 3批次，3批次實驗結果無顯著性差異，表明LL-413菌株發(fā)酵制備舍雷肽酶性能穩(wěn)定。
[0063] 實施例4: LL-413菌株搖瓶發(fā)酵制備舍雷肽酶的方法
[0064] 以LL-413菌株為菌種，改變了產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成，搖瓶發(fā)酵制備舍雷肽酶的活力單 位較實施例3有所提高，具體步驟如下：
[0065] (1)將LL-413菌株接種于斜面培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)36h，得到活化后的LL-413菌株 的活化斜面;所述的斜面培養(yǎng)基組成和制備方法同實施例3;
[0066] (2)將步驟（1)活化培養(yǎng)后LL-413菌株的菌體接種至50mL種子培養(yǎng)基中，于30°C、 200r/min振蕩條件下培養(yǎng)24h，得到種子液;所述種子培養(yǎng)基組成和制備方法同實施例3; [0067] (3)將步驟（2)種子液以體積濃度1 %的接種量，移種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于30 °C、 200r/min振蕩條件下培養(yǎng)24h，得干菌體濃度為2.67g/L的發(fā)酵液;所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為： 酵母浸出粉5g/L，牛肉膏3g/L，麥芽浸粉10g/L，MgS〇4 lg/L，NaCl 5g/L，溶劑為水，初始pH 為7.0，250mL的三角瓶裝50mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基，8層紗布扎口，高壓蒸汽121°C滅菌20min;
[0068] (4)將步驟(3)含舍雷肽酶的發(fā)酵液于4°C條件下5000g離心10min，分離除去菌體， 得澄清的舍雷肽酶粗酶液。
[0069]按實施例4方法，所得上清液的舍雷肽酶活力為360.0 U/mL，是實施例3的1.57倍。
[0070] 實施例5:優(yōu)選條件下LL-413菌株搖瓶發(fā)酵制備舍雷肽酶的方法
[0071] 以LL-413菌株為菌種，經(jīng)過產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成及初始pH和發(fā)酵時間優(yōu)化后，搖瓶發(fā) 酵制備舍雷肽酶的活力單位顯著提高，具體步驟如下：
[0072] (1)將LL-413菌株接種于斜面培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)24h，得到活化后的LL-413菌株 的活化斜面;所述的斜面培養(yǎng)基組成和制備方法同實施例3;
[0073] (2)將步驟（1)活化培養(yǎng)后LL-413菌株的菌體接種至種子培養(yǎng)基中，于30°C、250r/ min振蕩條件下培養(yǎng)18h，得到種子液;所述種子培養(yǎng)基組成和制備方法同實施例3;
[0074] (3)將步驟（2)種子液以體積濃度1 %的接種量，移種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于30 °C、 250r/min振蕩條件下培養(yǎng)42h，得干菌體濃度為5.51g/L的發(fā)酵液;所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為： 酵母浸出粉1 lg/L，牛肉膏6 · 6g/L，麥芽浸粉12 · 2g/L，MgS〇4 lg/L，NaCl 5g/L，溶劑為水，初 始pH為8.0，250mL的三角瓶裝50mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基，8層紗布扎口，高壓蒸汽121°C滅菌20min;
[0075] (4)將步驟(3)含舍雷肽酶的發(fā)酵液于4°C條件下5000g離心10min，分離除去菌體， 得澄清的舍雷肽酶粗酶液。
[0076] 按實施例5方法，所得上清液的舍雷肽酶活力為1126U/mL，是實施例4的提高了 3.13 倍。
[0077] 實施例6: LL-413菌株發(fā)酵罐中制備舍雷肽酶的方法
[0078] 以LL-413菌株為菌種，利用10L機械攪拌發(fā)酵罐發(fā)酵制備舍雷肽酶，具體方法如 下：
[0079] (1)將LL-413菌株接種于斜面培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)24h，得到活化后的LL-413菌株 的活化斜面;所述的斜面培養(yǎng)基組成和制備方法同實施例3;
[0080] (2)將步驟（1)活化培養(yǎng)后LL-413菌株的菌體接種至種子培養(yǎng)基中，于30°C、250r/ min振蕩條件下培養(yǎng)18h，得到種子液;所述種子培養(yǎng)基組成和制備方法同實施例3;
[0081 ] (3)將步驟(2)種子液以體積濃度2 %的接種量，即130mL的種子液移種到6.5L產(chǎn)酶 培養(yǎng)基中。溫度設定30±2°C，調節(jié)通氣量0.6~1 .Ov/v · min，攪拌轉速300~500r/min(發(fā) 酵開始時，通氣量〇.6v/v · min，轉速300r/min)，使得溶氧飽和度在50%~100%，通過流加 2m〇L/L的NaOH水溶液或2m 〇L/L的HC1水溶液，控制pH=8.0 ± 0.5，流加聚醚消泡劑控制泡沫 的產(chǎn)生。發(fā)酵運行20h放罐，得干菌體濃度為9.40g/L的發(fā)酵液;所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為:酵 母浸出粉llg/L，牛肉膏6.6g/L，麥芽浸粉12.2g/L，MgS〇4 lg/L，NaCl 5g/L，溶劑為水，10L 發(fā)酵罐裝6.5L，原位高壓蒸汽121°C滅菌20min;
[0082] (4)將步驟(3)含舍雷肽酶的發(fā)酵液于4°C條件下5000g離心10min，分離除去菌體， 得澄清的舍雷肽酶粗酶液。
[0083]按實施例6方法，所得上清液的舍雷肽酶活力為1505U/mL，是實施例5的1.34倍。 [0084]實施例7:舍雷肽酶的分離純化
[0085]將實施例6制備的舍雷肽酶粗酶液，經(jīng)過硫酸銨沉淀、透析除鹽和冷凍干燥，得舍 雷肽酶純化產(chǎn)品。
[0086] (1)往500mL的舍雷肽酶粗酶液中，邊攪拌邊加入145.5g硫酸銨，使其飽和度至 45 %，4°C沉淀12h，之后將上述溶液于4°C、8000g條件下離心10min，棄去沉淀，得上清液 580mL；
[0087] (2)繼續(xù)往步驟（1)中所得的上清液中加入110.2g硫酸銨，使其飽和度達到75%，4 °C沉淀12h，之后將上述溶液于4°C、8000g條件下離心10min，棄去上清液，用30mL的pH 8. OTris-HCl緩沖液將沉淀溶解，此時得到舍雷肽酶粗品的濃縮液約35mL;
[0088] (3)將步驟(2)所得濃縮液，裝入截留分子量為14kDa的透析袋中，用去離子水作為 透析液，透析12h除鹽；
[0089] (4)將步驟（3)透析除鹽的舍雷肽酶濃縮液轉入潔凈培養(yǎng)皿中，于_40°C、真空度 10Pa條件下冷凍干燥，得到215.6mg舍雷肽酶凍干酶粉，此凍干粉的酶活力2843U/mg，舍雷 肽酶的純化收率為81.5%。
[0090] 實施例8:舍雷肽酶水解纖維蛋白原的應用
[0091] 取在55°C保存的15g/L瓊脂糖水溶液40mL，加入在37°C保溫的濃度1.5mg/mL牛血 纖維蛋白原溶液40mL，迅速混勻并注意不要產(chǎn)生氣泡，再加入20U/mL凝血酶溶液2mL，立即 混勻，快速倒入直徑6cm的平皿中，室溫下放置lh至凝固。用直徑2mm的打孔器打孔，用濾紙 吸干孔里殘留的液體，然后吸取10yL活力為28000U/mL舍雷肽酶液(實施例7制備的舍雷肽 酶凍干酶粉用pH 8.0的Tris-HCl緩沖液配制而成）加入到孔里，蓋上皿蓋，37°C恒溫孵育 18h后，用卡尺測量溶解圈兩垂直直徑，對照纖溶活性與溶解圈兩垂直直徑的乘積標準曲 線，計算出舍雷肽酶的纖溶活性。此法測得LL-413菌株所產(chǎn)的舍雷肽酶的纖溶活性為 112357U/g〇
[0092] 所述的20U/mL凝血酶溶液配制方法為：100U/支的凝血酶，加入5mL的PBS緩沖液溶 解，既得到20U/mL的凝血酶溶液。
[0093] 所述的1.5mg/mL牛血纖維蛋白原溶液配制方法為:稱取60mg牛血纖維蛋白原，加 入40mL的PBS緩沖液溶液溶解。
[0094] 所述的PBS緩沖液的配制方法為：稱取Na2HP〇4 · H20 7.16g，用去離子水定容至 100mL(A液）；稱取NaH2P〇4 · 2H20 3.12g，用去離子水定容至100mL(B液）；取81mL的A液和 19mL的B液混合，即得到pH 7 · 4的PBS緩沖液。
[0095]所述的纖溶活性與溶解圈兩垂直直徑的乘積標準曲線回歸方程為：Υι?. 0000004839X2+0.02203X-12. 2715 ， 式中， X 為酶的纖溶活性 (U/mL) ， Y 為溶解圈的兩垂直 直徑乘積(mm2)。該標準曲線回歸方程引用自文獻:楊祖?zhèn)ィ囋滦?瓊脂糖-纖維蛋白平板 法測定納豆凍干粉中納豆激酶活性.醫(yī)學信息，2015，（ 5): 67-72。
【主權項】
1. 粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens)LL-413菌株，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，保藏編號：CCTCC N〇:M2015780,保藏日期為2015年12月25日，地址：中國武漢，武漢大 學，郵編：430072。2. -種權利要求1所述粘質沙雷氏菌LL-413菌株在制備舍雷肽酶中的應用。3. 如權利要求2所述的應用，其特征在于所述應用方法為:將粘質沙雷氏菌LL-413菌株 接種入產(chǎn)酶培養(yǎng)基，于28~32°C、200~250r/min發(fā)酵20~42h，獲得含有舍雷肽酶的發(fā)酵 液，發(fā)酵液經(jīng)過離心后去除菌體，上清液再經(jīng)過鹽析、透析和冷凍干燥后，即可得到舍雷肽 酶;所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基終濃度組成為:酵母浸出粉5~1 lg/L，牛肉膏3.0~6.6g/L，麥芽浸粉 10.0~12.2g/L，MgS〇4 lg/L，NaCl 5g/L，溶劑為水，初始pH為7.5~8.5。4. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基終濃度組成為：酵母浸出粉 1 lg/L，牛肉膏6 · 6g/L，麥芽浸粉12 · 2g/L，MgS〇4 lg/L，NaCl 5g/L，溶劑為水，初始pH為8 · 0。5. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述發(fā)酵液制備方法為： (1) 將粘質沙雷氏菌LL-413菌株接種于斜面培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)24~36h，得到活化后 的斜面菌體;所述的斜面培養(yǎng)基終濃度組成為:蛋白胨l〇g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，瓊脂 20g/L，溶劑為水，初始pH為7.0; (2) 將步驟（1)活化后的斜面菌體接種至種子培養(yǎng)基中，于30°C、200~250r/min振蕩條 件下培養(yǎng)18~24h，得到種子液;所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為:蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L， NaCl 5g/L，溶劑為水，初始pH為7.0; (3) 將步驟（2)種子液以體積濃度1%~2%的接種量，移種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于30°C、 200~250r/min振蕩條件下培養(yǎng)24~42h，得到含舍雷肽酶的發(fā)酵液。6. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述應用方法為:將粘質沙雷氏菌LL-413菌株 經(jīng)斜面培養(yǎng)基進行活化后，接種入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)18~24h后，將種子液以體積濃度1-2% 的接種量接入含產(chǎn)酶培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，控制溫度為30 ± 2°C，pH為8.0 ± 0.5，調節(jié)通氣量 0.6~1.0￥八.111；[11，攬摔轉速300~5001'/111；[11，使溶氧飽和度50%~100%，發(fā)酵運彳丁20~ 24h后，得到含有舍雷肽酶的發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)過離心后去除菌體，上清液再經(jīng)過鹽析、透析 和冷凍干燥后，即可得到舍雷肽酶。7. 如權利要求2所述的應用，其特征在于所述發(fā)酵液在4°C條件下5000g離心10min，獲 得上清液。8. 如權利要求2所述的應用，其特征在于所述上清液再經(jīng)過鹽析、透析和冷凍干燥方法 為： (1) 往上清液中加入硫酸銨，使其飽和度達到30~45 %，4°C沉淀12~24h，之后于4°C、 8000g條件下離心10min，去除沉淀，收集上清液； (2) 往步驟（1)中經(jīng)硫酸銨沉淀后所得的上清液中再次加入硫酸銨，使其飽和度達到70 ~80%，4°C沉淀12~24h，之后于4°C、8000g條件下離心10min，棄去上清液，沉淀用pH值8.0 的Tris-HCl緩沖液溶解，獲得濃縮液； (3) 將步驟(2)所得濃縮液用截留分子量為14kDa的透析袋，以去離子水為透析液透析 除鹽后，于-40°C冷凍干燥，即得到舍雷肽酶凍干酶粉。
【文檔編號】C12N1/20GK105969691SQ201610407429
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】梅建鳳, 李靚, 應國清, 易喻, 陳建澍, 張彥璐
【申請人】浙江工業(yè)大學