專利名稱：制備提純靈菌紅素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備提純靈菌紅素的方法。
背景技術(shù)：
靈菌紅素(Prodigiosin)，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示，正式名稱為2-methyl_3-pe ntyl-6-methoxyprodiginine)，是 Prodiginin 白勺一禾中，是由粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)和多種放線菌(Str印tomyces)等細(xì)菌合成的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物。靈菌紅素， 又名靈菌素、靈桿菌素，具有三吡咯環(huán)骨架結(jié)構(gòu)，其中的一個(gè)吡咯環(huán)C2上帶有一個(gè)甲基，C3 上則有一個(gè)戊基。
權(quán)利要求
1.一種制備提純靈菌紅素的方法，其特征在于所述方法包括先培養(yǎng)粘質(zhì)沙雷氏菌 (Serratia marcescens)LTH_2 菌株，然后從粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)LTH_2 菌株代謝產(chǎn)物中分離純化獲得靈菌紅素的步驟；所述粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens) LTH-2菌株現(xiàn)在已經(jīng)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2011209。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法具體包括以下步驟(1)用粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens) LTH-2生產(chǎn)菌株，經(jīng)粘質(zhì)沙雷氏菌母種發(fā)酵培養(yǎng)，提取紅色代謝產(chǎn)物并濃縮得到靈菌紅素粗品；(2)對(duì)靈菌紅素粗品使用硅膠柱層析法進(jìn)行初步分離純化，所述初步分離純化的條件是洗脫液采用石油醚、乙酸乙酯混合物進(jìn)行梯度洗脫；梯度控制的條件為起始階段石油醚與乙酸乙酯的體積比為50:1，中間階段采用的石油醚與乙酸乙酯的體積比為20 :1和10 1，最后階段石油醚與乙酸乙酯的體積比為5 :1，收集石油醚與乙酸乙酯的比例為5:1時(shí)的洗脫下來(lái)的組分并濃縮形成靈菌紅素次純品；(3)對(duì)靈菌紅素次純品通過(guò)高效液相色譜分離法進(jìn)行進(jìn)一步純化，高效液相色譜分離法的條件是色譜柱采用C18柱，柱溫控制在觀！，流動(dòng)相采用甲醇、0. 1%冰乙酸，進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫的條件是0 5min采用體積比占65%的甲醇以及體積比占35%的0. 1% 冰乙酸混合流動(dòng)相洗脫；5. 01 i:3min只采用甲醇洗脫；13. θΓ 5. ^iin采用體積比占65% 的甲醇以及體積比占35%的0. 1%冰乙酸混合流動(dòng)相洗脫；以雙波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)靈菌紅素純化過(guò)程①檢測(cè)波長(zhǎng)為535nm，參比波長(zhǎng)為630nm ；②檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，參比波長(zhǎng)為360nm ；根據(jù)顏色變化和色譜檢測(cè)器信號(hào)的變化，收集2. 0 4. Omin時(shí)間段的紅色組分，即可得到含有甲醇和0. 1%冰乙酸的靈菌紅素溶液，并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除甲醇形成靈菌紅素高純品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法步驟(1)中粘質(zhì)沙雷氏菌母種通過(guò)以下方法制備在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)生產(chǎn)發(fā)酵母種，將顏色深紅的菌株接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，并將此菌株作為發(fā)酵母種菌株使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法步驟(1)中發(fā)酵培養(yǎng)粘質(zhì)沙雷氏菌母種的方法是接種生產(chǎn)發(fā)酵母種于發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵條件是通氣培養(yǎng)，生產(chǎn)溫度控制在^ 30°C得到發(fā)酵液；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基以其組分的重量百分比計(jì)包括牛肉膏5重量份數(shù)；蛋白胨 10重量份數(shù)；NaCl 5重量份數(shù)；蒸餾水 100重量份數(shù)；所述液體培養(yǎng)基的PH值控制在6. 8 7. 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述方法步驟(1)靈菌紅素粗品是通過(guò)將發(fā)酵液離心，上清液用乙酸乙酯萃取，沉淀物溶解于甲醇，合并上清液中的乙酸乙酯紅色萃取物和沉淀物中的甲醇紅色提取物得到含靈菌紅素的混合液，將含靈菌紅素的混合液濃縮后溶解于乙酸乙酯，去除不溶物得到靈菌紅素粗品。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述方法步驟(3)中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除甲醇再經(jīng)真空低溫冷凍干燥除去溶劑形成靈菌紅素高純品。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種制備提純靈菌紅素的方法，該方法是用粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)生產(chǎn)菌株，經(jīng)粘質(zhì)沙雷氏菌母種發(fā)酵培養(yǎng)，提取紅色代謝產(chǎn)物并濃縮得到靈菌紅素粗品；然后對(duì)靈菌紅素粗品通過(guò)硅膠柱層析法、高效液相色譜分離法進(jìn)行純化，再通過(guò)真空低溫冷凍干燥獲得靈菌紅素高純品。該方法制備的高純品產(chǎn)品純度為≥98%，而且生產(chǎn)方法高效，使用的有機(jī)溶劑可以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)而回收循環(huán)利用。
文檔編號(hào)C12R1/43GK102311981SQ20111020199
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2011年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月19日
發(fā)明者吳巍, 尹立紅, 楊飛, 浦躍樸 申請(qǐng)人:東南大學(xué)