專利名稱：誘導(dǎo)性多能干細胞的制備方法和用于制備誘導(dǎo)性多能干細胞的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及誘導(dǎo)性多能干細胞的制備方法和用于制備誘導(dǎo)性多能干細胞的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
胚胎干細胞被譽為"萬能細胞"，從理論上講，可分化為人體220種細胞中的任何ー種，從而構(gòu)成機體各種復(fù)雜的組織器官，隨著1981年小鼠胚胎干細胞和1998年人的胚胎干細胞的建系成功[1-2]，再生醫(yī)學(xué)的研究真正開始。胚胎干細胞的應(yīng)用前景主要是用于移植治療，以胚胎干細胞作為起始細胞，通過體外培養(yǎng)及定向分化，可以為臨床治療中提供 大量的組織和器官的移植材料。通過對于胚胎干細胞自我更新和定向分化機制的研究，許多特異性的細胞類型(例如神經(jīng)細胞、心肌細胞等)已經(jīng)具備了成熟的分化方法和相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)。它可以用于治療帕金森氏癥、脊髄損傷和糖尿病等組織器官缺損或功能障礙等多種疾病。但一直以來，為了獲取人體ES細胞，必須摧毀胚胎，這一點使胚胎干細胞治療研究ー直面臨的倫理和法律等諸多障礙。于是科學(xué)家們開始尋求不通過胚胎而將分化細胞重編程直接逆轉(zhuǎn)為干細胞的新方法。2006年8月，Yamanaka小組將24種轉(zhuǎn)錄因子排列組合導(dǎo)入小鼠成纖維細胞，最終確定最少有4種轉(zhuǎn)錄因子組合_0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4即可將小鼠成纖維細胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細胞(Induced Pluripotent StemCells, iPS Cells) [3]。2007 年底，Yamanaka小組和Thomson小組先后將人的體細胞重編程為iPS細胞[4_5]。2009年，研究人員首次利用iPS細胞通過四倍體囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，證明了 iPS細胞具有真正的全能性[6]。iPS作為誘導(dǎo)產(chǎn)生多能性干細胞的一種技術(shù)，在臨床疾病治療方面的應(yīng)用價值是巨大的，因為它不像傳統(tǒng)的核移植或者細胞融合等獲取干細胞的方式那樣需要人的卵子或人的胚胎干細胞，從而繞開了倫理和法律等諸多障礙，并且它利用由成體細胞重編程為干細胞的特性避免了免疫排斥使得自體移植變得更加可行；另一方面，iPS對于干細胞自我更新機制的研究、干細胞信號調(diào)控的研究以及探索很多疾病的發(fā)病機制并尋找治療方法都有很大意義。但是，iPS細胞的應(yīng)用仍然有兩大難題亟待解決生物安全問題和誘導(dǎo)效率問題。在生物安全問題方面，最初實驗體系中過表達的外源基因中含有兩個原癌基因(c-Myc，Klf-4)，并且外源基因的導(dǎo)入方式是通過逆轉(zhuǎn)錄病毒，病毒在基因組中有多個拷貝的插入也會導(dǎo)致基因突變及癌變。因此，大家致力于優(yōu)化iPS技術(shù)以提高其應(yīng)用的安全性，例如，借助轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法高效制備了無病毒(virus-free) iPS細胞[7_8];成功地從所獲得的iPS細胞中移除先前導(dǎo)入的轉(zhuǎn)錄因子基因[9] ;iPS的誘導(dǎo)過程中使用特定小分子化合物，在更少的外源基因?qū)氲那闆r下即可高效率獲得iPS細胞[10-17];以及直接通過添加透膜的轉(zhuǎn)錄因子蛋白的形式進行重編程[18]。這些發(fā)現(xiàn)使人們向制備無遺傳修飾的iPS細胞邁出了一大歩。另外誘導(dǎo)效率也是制約iPS細胞技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用的ー個限速歩驟，最初iPS的誘導(dǎo)效率一般都低于I%，而選用小分子化合物可大幅度提高重編程效率并且減少轉(zhuǎn)錄因子使用個數(shù)。同時，小分子資源豐富而且組合應(yīng)用靈活多樣，通過加入小分子改變細胞培養(yǎng)環(huán)境，從而激活細胞重編程相關(guān)信號通路，提高體細胞重編程效率，這ー技術(shù)領(lǐng)域正逐步為各國科學(xué)家所重視。細胞的培養(yǎng)環(huán)境對干細胞自我更新和分化尤為重要，通過添加利于干細胞生長的生長因子可以抑制干細胞分化，促進自我更新(例如在培養(yǎng)基中加入LIF (適合鼠干細胞)，加入bFGF (適合人干細胞)等等[19-20]);同樣在體細胞重編程過程中微環(huán)境的優(yōu)化也可以顯著提高iPS細胞誘導(dǎo)效率。除了添加相應(yīng)生長因子及小分子化合物改變細胞生長微環(huán)境之外，低氧這ー物理環(huán)境的改變也可以提高人和小鼠體細胞重編程效率或者促進ES細胞自我更新等等[21-23]，因此，物理環(huán)境的改變也是提高誘導(dǎo)重編程效率的一個值得探索的方向，對理解重編程機制也有著十分重要的作用。在以往的應(yīng)用研究中，高滲環(huán)境對于ES細胞有著促進分化的作用，高滲作為ー種環(huán)境刺激脅迫細胞，通過激活p38 MAPK信號途徑[24-26]，改變相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達進而誘導(dǎo)干細胞分化[27-28]。因此，目前用于干細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基Knockout DMEM是經(jīng)過優(yōu)化后的低滲培養(yǎng)基，經(jīng)測定其滲透壓為270m0SM/kg。傳統(tǒng)上認(rèn)為，經(jīng)過優(yōu)化的培養(yǎng)基滲透壓和小鼠胚胎組織滲透壓接近，更適于未分化的胚胎干細胞和誘導(dǎo)性多能干細胞的生長[29-30]。 但是，在小鼠體細胞重編程過程中應(yīng)用高滲環(huán)境，研究高滲透壓對于小鼠體細胞重編程過程的影響，以及高滲環(huán)境如何導(dǎo)致相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達的改變，目前尚無報道。因此，研究滲透壓在體細胞重編程過程的作用，尋找能夠提高iPS細胞誘導(dǎo)效率的培養(yǎng)條件，對推動iPS細胞的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用將有巨大幫助。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明人進行了廣泛和深入的研究，最終完成本發(fā)明。為了提高iPS細胞的誘導(dǎo)效率，本發(fā)明提供了通過改變培養(yǎng)基滲透壓制備誘導(dǎo)性多能干細胞的方法，該方法包括以下步驟步驟I，將ー個或多個干細胞多能性因子導(dǎo)入體細胞；步驟2，使用干細胞培養(yǎng)基對步驟I中制備的導(dǎo)入了干細胞多能性因子的體細胞進行培養(yǎng)，其中，在該過程中，進ー步包括使用高滲透壓培養(yǎng)基對所述細胞進行培養(yǎng)；以及步驟3，鑒定誘導(dǎo)性多能干細胞克隆。優(yōu)選地，所述方法進ー步包括將報告基因?qū)塍w細胞以此通過報告基因來指示所述誘導(dǎo)性多能干細胞的產(chǎn)生及其產(chǎn)生效率。優(yōu)選地，所述報告基因為0ct4-GFP或Nanog-GFP。且更優(yōu)選地，所述報告基因為0ct4_GFP。優(yōu)選地，在步驟I中，將所述干細胞多能性因子的cDNA以病毒感染方式導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細胞。優(yōu)選地，在步驟I中，所述干細胞多能性因子可選自0ct4、Sox2、Soxl、Klf4、Klf2、Klf5> Nanog、c_Myc、L-Myc> N-Myc> Lin28和Esrrb中。且更優(yōu)選地,所述干細胞多能性因子可為包括0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc的四因子；或者，所述干細胞多能性因子可為包括0ct4、Sox2和Klf4的三因子；或者，所述干細胞多能性因子可為包括0ct4和Sox2的ニ因子。
優(yōu)選地，在步驟2中，從導(dǎo)入所述因子后第3至6天開始使用高滲透壓培養(yǎng)基對所述細胞進行培養(yǎng)I至9天。更優(yōu)選地，在步驟2中，在導(dǎo)入所述因子后第3至第6天，或者在導(dǎo)入所述因子后第3至第8天，或者在導(dǎo)入所述因子后第3至第10天，或者在導(dǎo)入所述因子后第3至第12天，或者在導(dǎo)入所述因子后第6至第9天，使用高滲透壓培養(yǎng)基對所述細胞進行培養(yǎng)。優(yōu)選地，在步驟2中，所述高滲透壓培養(yǎng)基是通過在普通等滲培養(yǎng)基中外加NaCl、蔗糖(sucrose)、甘露醇、Na2SO4、葡甲胺等離子型或非離子型滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)而制備的培養(yǎng)基。更優(yōu)選地，在所述高滲透壓培養(yǎng)基中，用來提高滲透壓的物質(zhì)選自NaCl和蔗糖中。最優(yōu)選地，在所述高滲透壓培養(yǎng)基中，用來提高滲透壓的物質(zhì)為NaCl。優(yōu)選地，在步驟2中，所述高滲透壓培養(yǎng)基的滲透壓為380-480m0SM/kg。更優(yōu)選地，在四因子(0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4)感染小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)誘導(dǎo)iPS條件下，滲透壓為480m0SM/kg(即在等滲培養(yǎng)基中外加IOOmM NaCl或200mM蔗糖)?；蚋鼉?yōu)選地，在ニ因子(0ct4和Sox2)感染 MEF誘導(dǎo)iPS條件下，滲透壓為380m0SM/kg(即在等滲培養(yǎng)基中外加NaCl 50mM)。滲透壓 超過480m0SM/kg時，長期培養(yǎng)將導(dǎo)致細胞死亡；滲透壓低于380m0SM/kg時，不能顯著增加iPS細胞的誘導(dǎo)效率。步驟2中，所述高滲透壓培養(yǎng)基可為提高滲透壓的mES培養(yǎng)基和/或提高滲透壓的KSR培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述高滲透壓培養(yǎng)基進ー步包含選自VPA、LiCl、CHIR99021、Repsox, Parnate等中的小分子化合物。所述mES培養(yǎng)基為添加有15%胎牛血清、1000U/mL白血病抑制因子(LIF)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和￠-巰基こ醇的DMEM (Dulbcco’ s ModifiedEagle’ s Medium);以及所述 KSR 培養(yǎng)基為添加有 15%替代血清、1000U/mL白血病抑制因子(LIF)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和￠-巰基こ醇的 Knockout DMEM。優(yōu)選地，在步驟2中，所述使用高滲透壓培養(yǎng)基對所述細胞進行培養(yǎng)為先使用提高滲透壓的mES培養(yǎng)基對所述細胞進行培養(yǎng)0至3天，再使用所述提高滲透壓的KSR培養(yǎng)基對所述細胞進行培養(yǎng)0至6天。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)性多能干細胞的制備方法，包括步驟1，將 0ct4、Sox2、Klf4 和 c_Myc 四因子或 0ct4、Sox2、Klf4 三因子或 0ct4、Sox2兩因子導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細胞，其中，進ー步包括將報告基因0ct4-GFP導(dǎo)入體細胞；步驟2，將步驟I中制備的導(dǎo)入了 0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc四因子或0ct4、Sox2、Klf4三因子或0ct4、Sox2兩因子的小鼠胚胎成纖維細胞在第二天消化并接種到飼養(yǎng)層細胞中，使用mES培養(yǎng)基培養(yǎng)，并在第三天使用滲透壓為380 480m0SM/kg的高滲透壓mES培養(yǎng)基培養(yǎng)，在第六天換為滲透壓為380 480m0SM/kg的高滲透壓KSR培養(yǎng)基培養(yǎng)，在第八天換為等滲透壓KSR培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，其中，以步驟I的將0ct4、Sox2、Klf4和c_Myc四因子或0ct4、Sox2、Klf4三因子或0ct4、Sox2兩因子導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細胞當(dāng)天記為第0天；以及步驟3，挑選具有良好干細胞形態(tài)或0ct4_GFP陽性的克隆進行傳代?！傲己酶杉毎麡有螒B(tài)”是指與小鼠干細胞形態(tài)相似的克隆?！?ct4_GFP陽性”是指轉(zhuǎn)基因0ct4-GFP報告基因陽性的克隆。0ct4是干細胞特異性基因，其表達比較真實地表征小鼠胚胎成纖維細胞已經(jīng)重編程為干細胞。步驟3中，鑒定誘導(dǎo)多能性干細胞克隆包括AP染色，內(nèi)源0ct4表達檢測，熒光定量PCR檢測多 能性標(biāo)志物表達水平，外源病毒基因的沉默，以及畸胎瘤的形成。本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，所述體細胞來自哺乳動物的體細胞。且更優(yōu)選地，所述哺乳動物選自小鼠、大鼠、兔、豬、羊、牛、猴或人。此外，本發(fā)明提供了一種用于制備誘導(dǎo)性多能干細胞的培養(yǎng)基，其進ー步為提高滲透壓的培養(yǎng)基，更進一歩為誘導(dǎo)前期給予高滲條件更利于iPS形成，后期給與高滲條件并無明顯效果。所述用于制備誘導(dǎo)性多能干細胞的培養(yǎng)基可為提高滲透壓培養(yǎng)基，優(yōu)選地，可為提高滲透壓的mES培養(yǎng)基和/或提高滲透壓的KSR培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述高滲透壓培養(yǎng)基進一步包含選自VPA、LiCl、CHIR99021、Repsox、Parnate等中的小分子化合物。所述mES培養(yǎng)基為添加有15%胎牛血清、1000U/mL白血病抑制因子(LIF)、L_谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和β -疏基こ醇的DMEM (Dulbcco ’ s Modified Eagle，s Medium);以及所述KSR培養(yǎng)基為添加有15%替代血清、1000U/mL白血病抑制因子(LIF)、L_谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和巰基こ醇的Knockout DMEM。優(yōu)選地,所述提高滲透壓培養(yǎng)基的滲透壓為380_480m0SM/kg。優(yōu)選地,所述高滲透壓培養(yǎng)基是指在普通等滲培養(yǎng)基中外加NaCl、鹿糖(sucrose)、Na2SO4、葡甲胺等離子型或非離子型滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基。更優(yōu)選地，在所述高滲透壓培養(yǎng)基中，用來提高滲透壓的物質(zhì)選自NaCl和蔗糖中。最優(yōu)選地，在所述高滲透壓的培養(yǎng)基中，用來提高滲透壓的物質(zhì)為NaCl。本發(fā)明通過提高培養(yǎng)基滲透壓能高效產(chǎn)生iPS細胞。克隆計數(shù)實驗顯示高滲的實驗組比對照組iPS誘導(dǎo)效率提高15-20倍(轉(zhuǎn)導(dǎo)四因子實驗)和6倍(轉(zhuǎn)導(dǎo)ニ因子實驗)。在iPS誘導(dǎo)過程中提高培養(yǎng)基的滲透壓也可以加快重編程的過程，高滲誘導(dǎo)的實驗組在感染后第6天即可檢測到0ct4-GFP陽性的克隆，而對照組一般要到8天以后才能檢測到0ct4-GFP陽性的克隆。通過高滲誘導(dǎo)的iPS細胞具有良好的全能性，轉(zhuǎn)導(dǎo)四因子或ニ因子的iPS克隆均能形成畸胎瘤，向三個胚層分化。與現(xiàn)有技術(shù)不同，本發(fā)明首次提出高滲透壓培養(yǎng)環(huán)境有利于重編程的進行，證明細胞培養(yǎng)過程中物理微環(huán)境的改變和體細胞重編程有著緊密聯(lián)系。高滲環(huán)境比其他提高重編程效率的方法更直接，更容易。本發(fā)明提供的高效誘導(dǎo)iPS細胞的方法對推動iPS的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用有著重要的意義。


圖I為利用提高滲透壓的干細胞培養(yǎng)基促進iPS細胞的形成的實驗操作流程圖。圖2為顯示高滲透壓的干細胞培養(yǎng)基提高四因子誘導(dǎo)iPS效率并加快iPS誘導(dǎo)進程的圖。A為顯示感染后第14天96孔板內(nèi)三副孔的代表性圖像的照片，其中，50mM和IOOmMNaCl處理的孔中出現(xiàn)較多的Oct-GFP陽性克??；B為顯示對Oct-GFP陽性克隆的統(tǒng)計數(shù)據(jù)的圖，在感染后第8天，添加了 50mM和IOOmM NaCl高滲培養(yǎng)基處理的孔中即能分別觀察到10-15個左右Oct-GFP陽性克隆，而對照孔無克隆。在感染后第11天，高滲處理的孔中即能觀察到20-30個左右Oct-GFP陽性克隆，而對照孔為3-5個左右。在感染后第14天，高滲處理的孔中即能觀察到30-40個左右Oct-GFP陽性克隆，而對照孔僅有5個左右。與對照組相比，*, P < O. 05 ;**, P < O. 01 ;***, P < O. 001。圖3為顯示流式細胞儀檢測高滲環(huán)境提高四因子誘導(dǎo)iPS效率的圖。A為顯示感染后第14天細胞消化后經(jīng)流式細胞儀分析的GFP陽性細胞百分比的圖。B為顯示3次獨立實驗的統(tǒng)計數(shù)據(jù)的圖。*#，ρ<0·001。圖4為顯示向干細胞培養(yǎng)基中添加IOOmM NaCl或200mM蔗糖均可提高四因子誘導(dǎo)iPS效率的圖。A為顯示感染后第14天96孔板內(nèi)三副孔的代表性圖像的照片。B為顯示對Oct-GFP陽性克隆的3次獨立實驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)的圖，其中，加入NaCl或蔗糖提高培養(yǎng)基滲透壓的實驗組可以在感染后第14天獲得近30個克隆，而對照組僅有3-5個克隆。與對照組相比，**，P < O. 01 ;***, P < O. 001。圖5為顯示在重編程的早期提高培養(yǎng)基滲透壓對iPS的形成更為有利的圖。A為高滲處理的時間段示意圖。B顯示了分別在四因子病毒感染后第3 -6天、6-9天或9-12天予以高滲處理，在感染后第14天96孔板內(nèi)的代表性圖像。C為顯示對圖B中Oct-GFP陽性克隆的3次獨立實驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)的圖。與對照組相比，*，P < O. 05 ;林*，P < O. OOl0 D顯示了分別在感染后第3-4天、3-6天、3-8天、3-10天或3_12天予以高滲處理，在感染后第14天96孔板內(nèi)Oct-GFP陽性克隆的3次獨立實驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)。與對照組相比，*，P < O. 05 ;**，P < O. 01 ο圖6為顯示了高滲透壓培養(yǎng)基與其他化學(xué)小分子如丙戊酸(VPA)或LiCl共同作用提高四因子誘導(dǎo)重編程效率的圖。A為感染后第14天96孔板內(nèi)GFP陽性克隆數(shù)的統(tǒng)計圖。該圖顯示了NaCl和VPA均能增加iPS的誘導(dǎo)效率，而兩者在低濃度時(VPA O. 5mM+NaCl50mM)的效果有協(xié)同作用。該圖為3次獨立重復(fù)實驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)，與對照組相比，#，p<0.01 ；***，P < O. OOl0 B為感染后第14天96孔板內(nèi)GFP陽性克隆數(shù)的統(tǒng)計。該圖顯示了 NaCl和LiCl均能增加iPS的誘導(dǎo)效率，而兩者在低濃度時(LiCl 5mM+NaCl 50mM)的效果有協(xié)同作用。該圖為3次獨立重復(fù)實驗統(tǒng)計數(shù)據(jù),相對于對照組P < O. 01< O. 001。圖7顯示了ニ因子(0ct4，Sox2)誘導(dǎo)時，高滲透壓條件可與小分子化合物組合(Repsox I μ M，CHIR 3 μ M和Parnet 5 μ Μ)共同作用，顯著提高iPS克隆形成數(shù)目。A為顯示ニ因子感染后第18天在高滲透壓條件下誘導(dǎo)形成的iPS克隆具有類似胚胎干細胞的形態(tài)且表達0ct4-GFP的圖片。B為感染后第18天GFP陽性克隆數(shù)的統(tǒng)計圖。其中，對照組為ニ因子誘導(dǎo)，在等滲培養(yǎng)基中加入小分子化合物組合Otepsox I μ Μ, CHIR 3μ M和Parnet5 μ Μ)時獲得的克隆數(shù)。在上述條件下額外加入50mM NaCl提高滲透壓可以大大提高iPS的克隆數(shù)目。C為顯示ニ因子iPS克隆中病毒DNA的鑒定的圖。其中，以四因子誘導(dǎo)得到的iPS克隆作為陽性對照，以水作為陰性對照，可以看到所有ニ因子iPS克隆均只有0ct4和Sox2的基因整合，而無Kif4和c-Myc的基因插入。圖8為顯示在高滲透壓條件下誘導(dǎo)的iPS克隆的多能性標(biāo)記物染色的圖。A為顯示四因子在高滲透壓條件下誘導(dǎo)的iPS克隆的堿性磷酸酶染色及免疫熒光染色的圖。其中，第一行圖片顯示在高滲條件下誘導(dǎo)的iPS細胞系具有類似胚胎干細胞的形態(tài)，強烈表達0ct4-GFP，堿性磷酸酶(AP)染色呈陽性并且均一；第二行和第三行分別為干細胞特異性蛋白Nanog和SSEA-I的免疫熒光染色，iPS細胞系表達這兩種干細胞特異性蛋白，Hoechst顯示細胞核DNA染色。B為顯示了ニ因子(0ct4和Sox2)在高滲透壓條件下誘導(dǎo)的iPS克隆的堿性磷酸酶染色及免疫熒光染色。其中，第一行圖片顯示在高滲條件下誘導(dǎo)的iPS細胞系具有類似胚胎干細胞的形態(tài)，強烈表達0ct4-GFP，堿性磷酸酶染色呈陽性并且均一；第二行和第三行分別為干細胞特異性蛋白Nanog和SSEA-I的免疫熒光染色，iPS細胞系表達這兩個干細胞特異性蛋白，Hoechst顯示細胞核DNA染色。圖9為熒光定量PCR檢測干細胞特異性基因的表達以及外源病毒基因的沉默的圖。A :以小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)為陰性對照，小鼠胚胎干細胞系E14細胞(ES)為陽性對照，檢測iPS克隆中干細胞內(nèi)源特異基因的表達。所有在高滲透壓條件下誘導(dǎo)的四因子iPS克隆均高表達干細胞特異基因，包括內(nèi)源0ct4，內(nèi)源Sox2，Nanog和Rexl ;B:以病毒感染后4天的小鼠胚胎成纖維細胞為陽性對照，ES細胞為陰性對照，檢測外源病毒基因的沉默。所有在高滲透壓條件下誘導(dǎo)的四因子iPS克隆均顯示良好的外源病毒基因沉默。圖10為顯示高滲條件下誘導(dǎo)的四因子iPS形成畸胎瘤實驗的結(jié)果的圖。經(jīng)HE染色并由組織結(jié)構(gòu)判斷，iPS細胞系能夠分化形成三個胚層的特有組織，其中，a為外胚層的神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)，b為中胚層的軟骨樣結(jié)構(gòu)，c為外胚層表皮樣結(jié)構(gòu)，d為內(nèi)胚層的消化道管腔 上皮樣結(jié)構(gòu)。
具體實施例方式定義和技術(shù)除非另外指明，本發(fā)明的實驗將使用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)和重組DNA傳統(tǒng)技術(shù),其屬于本領(lǐng)域技術(shù)范圍。參見例如,Sambrook, Fritsch和Maniatis,分子克隆實驗指南，第三版(2002) ； CurrentProtoco I s in Molecular Biology (F.M. Ausubel 等人編著(1987));叢書 Methodsin Enzymology (酶學(xué)方法)(Academic Press,Inc. ) ；PCR2 A Practical Approach(PCR 實驗方法)(M. J. MacPherson, B. D. Hames和 G. R. Taylor 編著，(1995)) ；Antibodies, A Laboratory Manual and Animal CellCulture (抗體實驗手冊 及動物細胞培養(yǎng))(R. I. Freshney編著,(1987)) ；Handbood ofStemCells (干細胞手冊' ),卷2 (W. French等人編著)。除非另外說明，本文中所用的術(shù)語均具有本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)理解的含義，為了便于理解本發(fā)明，將本文中使用的ー些術(shù)語進行了下述定義。本文所述的“誘導(dǎo)性多能干細胞(iPS) ”是這樣的細胞，其來源是體細胞通過導(dǎo)入干細胞多能性因子在體外重編程而成。這樣的細胞在胚胎干細胞(ES)培養(yǎng)條件下，在細胞形態(tài)、生長特性、特異性基因表達、DNA甲基化方式等性質(zhì)均與小鼠ES細胞非常相似，而且在畸胎瘤形成、嵌合體動物形成和生殖系傳遞等方面也與小鼠ES細胞非常相似。本文所述的“誘導(dǎo)體細胞重編程的干細胞多能性因子”為對于干細胞多能性維持關(guān)鍵的因子，通過向體細胞導(dǎo)入這些因子可以誘導(dǎo)體細胞重編程為干細胞。已有多篇文獻報導(dǎo)了多個這樣的可以誘導(dǎo)重編程的因子[31-35]。優(yōu)選地，所述的多能性因子包括0ct4，Sox2 (或 Soxl), Klf4 (或 Klf2 或 Klf5), Nanog, c-Myc (或 L-Myc 或 N_Myc), Lin28 及 Esrrb。上述干細胞多能性因子可以根據(jù)需要來源于任何物種，優(yōu)選為小鼠的干細胞多能性因子。本文所述的“誘導(dǎo)重編程”(有時也僅被簡化為“誘導(dǎo)”)是指將體細胞去分化為多能性干細胞的過程。優(yōu)選地，通過將維持干細胞多能性所需的多能性因子cDNA導(dǎo)入體細胞可以誘導(dǎo)體細胞去分化為多能干細胞。其中，優(yōu)選地，所述的多能性因子包括0ct4，Sox2 (或 Soxl), Klf4 (或 Klf2 或 5), Nanog, c-Myc (或 L-或 N_Myc), Lin28 及 Esrrb 中的ー個或多個。將所述干細胞多能性因子cDNA導(dǎo)入體細胞的方法可采用多種方法，包括病毒感染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔、粒子轟擊、轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的插入表達、穿膜蛋白、藥物誘導(dǎo)等各種將DNA轉(zhuǎn)入細胞的方法。優(yōu)選地，使用包含cDNA的病毒載體進行轉(zhuǎn)染，所述病毒載體包括慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等多種病毒載體。優(yōu)選地逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(PMX載體)。本文所述的培養(yǎng)基可為添加有15%胎牛血清、1000U/mL白血病抑制因子(LIF)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和￠-巰基こ醇的DMEM (Dulbcco’s ModifiedEagle’s Medium) (mES培養(yǎng)基)和添加有15%替代血清、1000U/mL白血病抑制因子(LIF)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和￠-巰基こ醇的Knockout DMEM (KSR培養(yǎng)基)。本文所示用來提高滲透壓的物質(zhì)以及培養(yǎng)基的滲透壓由FM-8P全自動冰點滲透壓計測定(上海醫(yī)大儀器廠)。具體數(shù)值100mM NaCl滲透壓為190m0SM/kg，200mM蔗糖滲 透壓為 190m0SM/kg，50mM NaCl 滲透壓為 90m0SM/kg，IOOmM 蔗糖滲透壓為 90m0SM/kg。DMEM 培養(yǎng)基(GIBCO)滲透壓為290m0SM/kg，視為等滲條件。Knockout DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)滲透壓為270m0SM/kg，亦視為等滲條件。DMEM外加IOOmM NaCl后滲透壓值為480m0SM/kg，視為高滲條件。DMEM外加200mM蔗糖后滲透壓值為480m0SM/kg，視為高滲條件。DMEM外加50mM NaCl后滲透壓為380m0SM/kg，視為中等高滲條件。DMEM外加IOOmM蔗糖后滲透壓為380m0SM/kg,視為中等聞滲條件。本發(fā)明所述的報告基因是指能夠指示細胞已經(jīng)轉(zhuǎn)變到類似胚胎干細胞的階段，包括利用轉(zhuǎn)基因或同源重組手段加入的一段熒光蛋白序列或針對抗生素的抗性基因序列，這段序列處于胚胎干細胞特異表達的ー些基因的啟動子控制下，故而可以在細胞到達類似胚胎干細胞狀態(tài)時激活這段熒光蛋白或抗性基因的表達，從而使這個細胞具有某些可以被檢測的特征。本實施例中使用的小鼠胚胎成纖維細胞為0G2(0ct4-GFP+/-)細胞，分離自純合0G2 (0ct4-GFP+/+)雄鼠與129母鼠交配產(chǎn)生的13. 5天的胚胎。本發(fā)明所述的檢測細胞多能性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括AP染色，細胞熒光染色，PCR鑒定干細胞特異基因表達，熒光定量PCR分析病毒基因的沉默，分析體內(nèi)分化為畸胎瘤的能力。下列實施例舉例說明了發(fā)明人的標(biāo)準(zhǔn)實驗室實踐，用于示范本發(fā)明的模式，而不應(yīng)將本發(fā)明理解為限定于這些實施例的范圍。本發(fā)明中所用技術(shù)概述除了特別說明，以下實施例中提及的各種物質(zhì)均購自Invitrogen。反轉(zhuǎn)錄病毒牛產(chǎn)以及產(chǎn)牛iPS細胞的實驗過稈如下:從Addgene公司購置包含小鼠0ct4, Sox2, Klf4, c-Myc的cDNA的反轉(zhuǎn)錄病毒載體(pMXs)。使用Fugene HD (羅氏)按其產(chǎn)品說明書進行轉(zhuǎn)染至Plat-E細胞以產(chǎn)生病毒，48小時后收集病毒上清液并且過濾，補充l，5-ニ甲基-l，5-ニ氮^^一亞甲基聚甲溴化物(8mg/L)后感染小鼠胚胎成纖維細胞。添加病毒上清液的當(dāng)天被定義為第0天。將病毒感染后的成纖維細胞培養(yǎng)在mES培養(yǎng)基中，在感染后第6天更換為KSR培養(yǎng)基，在感染后第14-18天(四因子感染實驗)或第20-24天(ニ因子感染實驗)挑取iPS集落，這是基于Oct-GFP的表達和典型的干細胞形態(tài)來挑取的。
重編程效率的定量的實驗過程如下:用于計算重編程效率的主要方法是計數(shù)Oct-GFP陽性克隆1、對四因子或ニ因子感染后第14天的細胞在原孔中直接用熒光顯微鏡計數(shù)Oct-GFP陽性克隆數(shù)；2、利用流式細胞儀對四因子感染后第14天的或ニ因子感染后第18天的細胞測定Oct-GFP陽性的細胞比例。iPS細胞的鑒定實驗過程如下:進行堿性磷酸酶染色、干細胞標(biāo)記蛋白熒光染色、鑒定多能性基因的表達、病毒基因的沉默、畸胎瘤的形成[36-37]。實施例I :加入NaCl提高滲透壓的高滲干細胞培養(yǎng)基能促進四因子誘導(dǎo)的iPS的形成

a.將四因子(0ct4, Sox2, Klf4, c_Myc)的病毒以等體積混合,加入到6孔板的一孔中共計18萬個0G2小鼠胚胎成纖維細胞中，在37°C、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)在添加了 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。以加入病毒當(dāng)天記為第O天，第2天將細胞消化并重懸于mES培養(yǎng)基中，并接種到預(yù)先種滿飼養(yǎng)層細胞(放射線處理的小鼠胚胎成纖維細胞)的96孔板中，每孔5000個細胞。從第3天開始使用具有不同滲透壓值的mES培養(yǎng)基(即添加50mM或IOOmM的NaCl使等滲培養(yǎng)基成為高滲培養(yǎng)基，高滲培養(yǎng)基的滲透壓分別為380m0SM/kg和480m0SM/kg)進行培養(yǎng)，第6天開始換為高滲透壓值的KSR培養(yǎng)基(即添加50mM或IOOmM的NaCl使等滲培養(yǎng)基成為高滲培養(yǎng)基，高滲培養(yǎng)基的滲透壓分別為380m0SM/kg和480m0SM/kg)進行培養(yǎng)。從第8天開始再換為KSR培養(yǎng)基(等滲培養(yǎng)基條件)進行培養(yǎng)，整個過程如圖I所示。對照組為等滲培養(yǎng)基條件(290m0SM/kg)培養(yǎng)的細胞。b.使用如a所述的方法，從第8天開始，每天在倒置熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)Oct-GFP陽性克隆數(shù)，同時使用熒光顯微鏡拍照。圖2A為第14天時96孔板中代表性的圖片，可以看到添加了 IOOmM NaCl的培養(yǎng)基處理的孔相對于不處理的對照孔，有更多Oct-GFP陽性的克隆。圖2B是對Oct-GFP陽性克隆的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。在感染后第8天，添加了50mM和IOOmM NaCl高滲培養(yǎng)基處理的孔中即能分別觀察到10-15個左右Oct-GFP陽性克隆，而對照孔無克隆。在感染后第11天，高滲處理的孔中即能觀察到20-30個左右Oct-GFP陽性克隆，而對照孔為3-5個左右。在感染后第14天，高滲處理的孔中即能觀察到30-40個左右Oct-GFP陽性克隆，而對照孔僅有5個左右。統(tǒng)計數(shù)據(jù)可以看到高滲環(huán)境可以提高重編程效率達到對照組的10倍左右。c.使用如a所述的方法，在第14天消化細胞，利用流式細胞儀檢測Oct-GFP陽性的細胞比例。圖3A為代表性的流式數(shù)據(jù)圖；圖38是對3次實驗的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，顯示在四因子誘導(dǎo)條件下，添加IOOmM NaCl的培養(yǎng)基處理可提高iPS誘導(dǎo)效率28倍。實施例2 :加入蔗糖的干細胞培養(yǎng)基也能促進四因子誘導(dǎo)的iPS的形成a.將四因子(0ct4, Sox2,Klf4, c-Myc)的病毒以等體積混合,感染到6孔板的一孔中共計18萬個0G2小鼠胚胎成纖維細胞中，在37°C、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)在添加了 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。以加入病毒當(dāng)天為第O天，第2天將細胞消化并重懸于mES培養(yǎng)基中，并種在預(yù)先種滿飼養(yǎng)層細胞(放射線處理的小鼠胚胎成纖維細胞)的96孔板中，每孔5000個細胞。從第3天開始分別使用高滲透壓值的mES培養(yǎng)基(即分別添加IOOmMNaCl和200mM蔗糖使等滲培養(yǎng)基成為高滲培養(yǎng)基，高滲培養(yǎng)基的滲透壓值均為480m0SM/kg)進行培養(yǎng)，第6天開始分別換為高滲透壓值的KSR培養(yǎng)基(即分別添加IOOmM NaCl和200mM蔗糖使等滲培養(yǎng)基成為高滲培養(yǎng)基，高滲培養(yǎng)基的滲透壓值均為480m0SM/kg)進行培養(yǎng)。第8天開始再換為KSR培養(yǎng)基(等滲培養(yǎng)基條件)進行培養(yǎng)。對照組為等滲培養(yǎng)基條件(290m0SM/kg)培養(yǎng)的細胞。整個過程如圖I所示。b.使用如a所述的方法，從第12天開始，每天在倒置熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)Oct-GFP陽性克隆數(shù)，同時使用熒光顯微鏡拍照。如圖4A為第14天時96孔板代表性圖片。c.使用如a所述的方法，在第14天固定細胞，如圖4B對Oct-GFP陽性克隆的統(tǒng)計數(shù)據(jù)所示，與對照組相比，添加IOOmM NaCl和200mM蔗糖的培養(yǎng)基均能夠顯著提高iPS效
率，且二者效率并無顯著差異。實施例3 :在重編程前期提高培養(yǎng)基滲透壓更有利于iPS細胞的形成。a.將四因子(0ct4, Sox2, Klf4, c-Myc)的病毒以等體積混合,感染到6孔板的一孔中，共計18萬個0G2小鼠胚胎成纖維細胞，在37°C、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)在添加了 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。以加入病毒當(dāng)天為第0天，第2天將細胞消化并重懸于mES培養(yǎng)基中，并種在預(yù)先種滿飼養(yǎng)層細胞(放射線處理的小鼠胚胎成纖維細胞)的96孔板中，每孔5000個細胞。從第3天開始使用高滲透壓的mES培養(yǎng)基(即添加IOOmM NaCl的培養(yǎng)基)培養(yǎng)I至3天，第6天開始換為高滲透壓的KSR培養(yǎng)基(即添IOOmMNaCl的培養(yǎng)基)再培養(yǎng)0至6天，以后換為正常滲透壓的KSR培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至克隆計數(shù)。高滲透壓開始處理的時間及處理時間的長短如圖5A所示。對照組為等滲培養(yǎng)基條件培養(yǎng)的細胞。b.使用如a所述的方法，從第8天開始，每天在倒置熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)Oct-GFP陽性克隆數(shù)，同時使用熒光顯微鏡拍照。圖5B所示為感染后第14天96孔板內(nèi)的代表性圖像。圖5C為感染后第14天對96孔板內(nèi)Oct-GFP陽性克隆的統(tǒng)計數(shù)據(jù)?？梢钥闯鲈诘?-6天使用高滲培養(yǎng)基所誘導(dǎo)的iPS數(shù)量最多，第6-9天使用高滲培養(yǎng)基也有顯著效果，而在9-12天使用高滲培養(yǎng)基則無明顯效果。這說明高滲培養(yǎng)基發(fā)揮作用只在重編程的前期。圖顯示了分別在感染后第3-4天、3-6天、3-8天、3-10天或3_12天予以高滲處理，在感染后第14天96孔板內(nèi)Oct-GFP陽性克隆的3次獨立實驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)。進ー步說明 高滲培養(yǎng)基發(fā)揮作用只在重編程前期，而且過長時間用高滲培養(yǎng)基處理對iPS細胞的生長不利。實施例4 :高滲培養(yǎng)基與其他化學(xué)小分子共同作用提高4因子誘導(dǎo)的重編程效率a.將四因子(0ct4，Sox2, Klf4，c-Myc)的病毒以等體積混合，加入到6孔板的一孔中共計18萬個0G2小鼠胚胎成纖維細胞中，在37°C、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)在添加了 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。以加入病毒當(dāng)天記為第0天，第2天將細胞消化并重懸于mES培養(yǎng)基中，并接種到預(yù)先種滿飼養(yǎng)層細胞(放射線處理的小鼠胚胎成纖維細胞)的96孔板中，每孔5000個細胞。從第3天開始使用不同滲透壓值的mES培養(yǎng)基(即添加50mM或IOOmM NaCl的高滲培養(yǎng)基，滲透壓分別為380m0SM/kg和480m0SM/kg)，并與不同濃度的小分子化合物(VPA和LiCl)聯(lián)用；第6天開始換為高滲透壓值的KSR培養(yǎng)基(即添加50mM或IOOmM NaCl的高滲培養(yǎng)基，滲透壓分別為380m0SM/kg和480m0SM/kg)，同時添加不同濃度的小分子化合物(VPA和LiCl)(培養(yǎng)基和小分子化合物的具體情況如圖6所示)。第8天開始再換為KSR培養(yǎng)基培養(yǎng)(等滲培養(yǎng)基條件)，整個過程如圖I所示。對照組為轉(zhuǎn)入四因子，等滲培養(yǎng)基條件培養(yǎng)的細胞，并且不加入任何小分子化合物。
b.使用如a所述的方法，從第8天開始，每天在倒置熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)Oct-GFP陽性克隆數(shù)，同時使用熒光顯微鏡拍照。如圖6A顯示，NaCl和VPA均能增加iPS的誘導(dǎo)效率，而兩者在低濃度合用時(VPA O. 5mM+NaCl 50mM)的效果有協(xié)同作用。圖6B顯示了 NaCl和LiCl均能增加iPS的誘導(dǎo)效率，而兩者在低濃度合用時(LiCl 5mM+NaCl 50mM)的效果有協(xié)同作用。顯示了高滲透壓培養(yǎng)基與其他化學(xué)小分子(VPA或LiCl)共同作用提高四因子誘導(dǎo)重編程效率。實施例5 :提高滲透壓并結(jié)合其他小分子化合物能促進ニ因子誘導(dǎo)的iPS的形成a.將兩因子(0ct4和Sox2)的病毒以等體積混合，感染到6孔板的一孔中共計18萬個0G2小鼠胚胎成纖維細胞中，在37°C、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)在添加了 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。以加入病毒當(dāng)天為第O天，第2天實驗組換成加入小分子化合物組合(CHIR99021 3 μ MjRepsox I μ M，Parnet5 μ Μ)，以及 50mM NaCl 的 KSR 培養(yǎng)基(中等高滲培養(yǎng)基條件)；對照組換成僅加入小分子化合物組合(CHIR99021 3 μ M, Repsox I μ M, Parnet5 μ Μ)的KSR(等滲培養(yǎng)基條件)培養(yǎng)基。第6天實驗組和對照組均換液為僅加入小分子化 合物組合(CHIR99021 3 μ M, Repsox I μ M, Parnet 5 μ Μ)的KSR(等滲培養(yǎng)基條件)培養(yǎng)基，第10天換為無化合物添加的KSR培養(yǎng)基(等滲培養(yǎng)基條件)繼續(xù)培養(yǎng)。b.使用如a所述的方法，從第12天開始，每天在倒置熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)Oct-GFP陽性克隆數(shù)，同時使用熒光顯微鏡拍照。如圖7A所示，感染后第18天ニ因子iPS克隆iPS細胞系具有類似胚胎干細胞的形態(tài)。圖7B是對Oct-GFP陽性克隆的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。在感染后第18天，對照孔僅有2個克隆，而添加了 50mM NaCl的中等高滲培養(yǎng)基處理的孔中能觀察到13個Oct-GFP陽性克隆。c.使用如a所述的方法，在第20天挑取iPS克隆團，消化細胞傳代培養(yǎng)后得到兩因子iPS細胞系，并提取DNA通過PCR檢測病毒基因的整合情況，證實iPS克隆確實為兩因子(0ct4和Sox2)誘導(dǎo)生成。在提取DNA之前，利用差速貼壁法去除滋養(yǎng)層細胞，使用Trizol (Invitrogen公司)試劑,按照制造商說明提取iPS細胞的總DNA,同時應(yīng)用TaKaRaTaq 試劑盒(Takara公司)，Bio_Rad DNA Engine PCR儀進行PCR鑒定。上述PCR均使用常規(guī)PCR條件，按照試劑盒制造商說明進行。其中鑒定病毒基因插入使用的引物列表如表I所示。如圖7C所示，所有兩因子iPS克隆均只有病毒0ct4和Sox2的基因插入，未見Kif4和c-Myc的插入。表I
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)性多能干細胞的制備方法，該方法包括以下步驟 步驟1，將ー個或多個干細胞多能性因子導(dǎo)入體細胞； 步驟2，使用干細胞培養(yǎng)基對步驟I中制備的導(dǎo)入了干細胞多能性因子的體細胞進行培養(yǎng)，其中，在該過程中，進ー步包括使用高滲透壓培養(yǎng)基對所述細胞進行培養(yǎng)；和 步驟3，鑒定誘導(dǎo)性多能干細胞克隆。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，進ー步包括將報告基因?qū)塍w細胞，以此報告基因來指示所述誘導(dǎo)性多能干細胞的產(chǎn)生及其產(chǎn)生效率。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述報告基因為0ct4-GFP或Nanog-GFP，優(yōu)選為0ct4-GFP。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，在步驟I中，將所述干細胞多能性因子的cDNA以 病毒感染方式導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，在步驟I中，所述干細胞多能性因子選自0ct4、Sox2、Soxl、Klf4、Klf2、Klf5、Nanog、c_Myc、L-Myc> N-Myc> Lin28 和 Esrrb 中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，在步驟I中，所述干細胞多能性因子為包括0ct4.Sox2.Klf4和c-Myc的四因子，或者為包括0ct4、Sox2和Klf4的三因子，或者為包括0ct4和Sox2的ニ因子。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，在步驟2中，從導(dǎo)入所述因子后第3至6天開始使用高滲透壓培養(yǎng)基對所述細胞進行培養(yǎng)I至9天。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，在步驟2中，在導(dǎo)入所述因子后第3至第6天，或者在導(dǎo)入所述因子后第3至第8天，或者在導(dǎo)入所述因子后第3至第10天，或者在導(dǎo)入所述因子后第3至第12天，或者在導(dǎo)入所述因子后第6至第9天，使用高滲透壓培養(yǎng)基對所述細胞進行培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，在步驟2中，所述高滲透壓培養(yǎng)基是通過在普通等滲培養(yǎng)基中外加離子型或非離子型滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)(優(yōu)選為NaCl、蔗糖、甘露醇、Na2SO4和葡甲胺)而制備的培養(yǎng)基，更優(yōu)選地，所述滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)包括NaCl和蔗糖，最優(yōu)選地，所述滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)為NaCl。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，在步驟2中，所述高滲透壓培養(yǎng)基的滲透壓為380 480m0SM/kg。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，在步驟2中，所述高滲透壓培養(yǎng)基為提高滲透壓的mES培養(yǎng)基和/或提高滲透壓的KSR培養(yǎng)基，優(yōu)選地，所述高滲透壓培養(yǎng)基進ー步包含選自VPA、LiCl、CHIR99021、Repsox和Parnate中的小分子化合物，其中，所述mES培養(yǎng)基為添加有15%胎牛血清、1000U/mL白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和β -巰基こ醇的DMEM ；以及所述KSR培養(yǎng)基為添加有15%替代血清、1000U/mL白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和β -巰基こ醇的KnockoutDMEM。
12.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，在步驟2中，所述使用高滲透壓培養(yǎng)基對所述細胞進行培養(yǎng)為先使用提高滲透壓的mES培養(yǎng)基對所述細胞進行培養(yǎng)O至3天，再使用提高滲透壓的KSR培養(yǎng)基對所述細胞進行培養(yǎng)O至6天。
13.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，包括步驟 1，將 0ct4、Sox2、Klf4 和 c_Myc 四因子或 0ct4、Sox2、Klf4 三因子或 0ct4、Sox2兩因子導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細胞，其中，進ー步包括將報告基因0ct4-GFP導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細胞； 步驟2，將步驟I中制備的導(dǎo)入了 Oct4、Sox2、Klf4和c_Myc四因子或Oct4、Sox2、Klf4三因子或0ct4、Sox2兩因子的小鼠胚胎成纖維細胞在第二天消化并接種到飼養(yǎng)層細胞中，使用mES培養(yǎng)基培養(yǎng)，并在第三天使用滲透壓為380 480m0SM/kg的高滲透壓mES培養(yǎng)基培養(yǎng)，在第六天換為滲透壓為380 480m0SM/kg的高滲透壓KSR培養(yǎng)基培養(yǎng)，在第八天換為等滲透壓KSR培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，其中，以步驟I的將Oct4、Sox2、Klf4和c_Myc四因子或Oct4、Sox2、Klf4三因子或Oct4、Sox2兩因子導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細胞當(dāng)天記為第O天；以及 步驟3，挑選具有良好干細胞形態(tài)或0ct4-GFP陽性的克隆進行傳代。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述體細胞是來自哺乳動物的體細 胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述哺乳動物選自小鼠、大鼠、兔、豬、羊、牛、猴或人。
16.一種用于制備誘導(dǎo)性多能干細胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基為提高滲透壓的培養(yǎng)基，優(yōu)選地，所述高滲透壓培養(yǎng)基進ー步包含選自VPA、LiCl, CHIR99021、Repsox和Parnate中的小分子化合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基的滲透壓為380 480m0SM/kg。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基為提高滲透壓的mES培養(yǎng)基和/或提高滲透壓的KSR培養(yǎng)基，其中，所述mES培養(yǎng)基為添加有15%胎牛血清、1000U/mL白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和β -巰基こ醇的DMEM ；以及所述KSR培養(yǎng)基為添加有15%替代血清、1000U/mL白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和巰基こ醇的Knockout DMEM。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)性多能干細胞的制備方法，該方法包括以下步驟步驟1，將一個或多個干細胞多能性因子導(dǎo)入體細胞；步驟2，使用干細胞培養(yǎng)基對步驟1中制備的導(dǎo)入了干細胞多能性因子的體細胞進行培養(yǎng)，其中，在該過程中，進一步包括使用高滲透壓培養(yǎng)基對所述細胞進行培養(yǎng)；和步驟3，鑒定誘導(dǎo)性多能干細胞克隆。此外，本發(fā)明還提供了一種用于制備誘導(dǎo)性多能干細胞的培養(yǎng)基。本發(fā)明提出了將提高滲透壓的培養(yǎng)基應(yīng)用于高效制備iPS中。在本發(fā)明中，高滲透壓環(huán)境能夠使小鼠iPS細胞的產(chǎn)生效率提高10-25倍。本發(fā)明提供的高效率誘導(dǎo)iPS細胞的方法對iPS技術(shù)安全性的提高和iPS細胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有重要意義。
文檔編號C12N15/86GK102851314SQ20111018334
公開日2013年1月2日 申請日期2011年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月1日
發(fā)明者謝欣, 許新秀, 張儒 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所