專利名稱：用于艾滋病基因治療的攜帶多靶點(diǎn)RNAi的慢病毒制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及ー種攜帶與HIV病毒生活周期相關(guān)基因的多靶點(diǎn)RNAi的慢病毒及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
艾滋病(acquiredimmunodeficiency syndrome, AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染引起的一種嚴(yán)重危害人們生命健康的傳染性疾病。目前，艾滋病臨床治療方法主要是高效抗逆?zhèn)麂洸《警煼?Highly activeantiretroviral therapy, HAART),由于它能有效減少病毒載量(virus load)和保護(hù)免疫功能，從而相應(yīng)地延長(zhǎng)了 HIV感染者的存活時(shí)間。然而，該療法只能控制病毒復(fù)制，不能徹底清除病毒，而且抗HIV藥物價(jià)格昂貴，具有較嚴(yán)重的副作用，藥物使用不當(dāng)，也會(huì)誘發(fā)耐 藥株的產(chǎn)生。HIV疫苗被認(rèn)為是控制HIV感染的最有潛力的手段，但疫苗開(kāi)發(fā)尚待時(shí)日。因此，發(fā)展新的HIV治療技術(shù)和方法是擺在人們面前亟待解決的問(wèn)題。基因治療是目前生物醫(yī)學(xué)上新發(fā)展的一種高科技醫(yī)療技術(shù)，它能夠通過(guò)載體將抗HIV基因?qū)塍w內(nèi)并長(zhǎng)期表達(dá)，獲得長(zhǎng)期抑制HIV病毒復(fù)制的能力，因而，基因治療為抗HIV感染開(kāi)辟了新的途徑。到目前為止，國(guó)外相繼已有近百個(gè)抗HIV/艾滋病的基因治療方案進(jìn)入臨床試驗(yàn)(http://www. wiley. co. uk/genmed/ clinical/),獲得了一定的療效，給艾滋病病人帶來(lái)了新的希望。但真正令人們興奮的是最近德國(guó)研究人員將一名急性髓系白血病合井“艾滋病”患者在接受HIV-I輔助受體CCR5基因純合突變個(gè)體的骨髓干細(xì)胞移植治療之后，即使在高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療停藥，三年多的時(shí)間里體內(nèi)再?zèng)]有發(fā)現(xiàn)艾滋病的病毒，這是世界上首例治愈艾滋病感染者的報(bào)道；該結(jié)果提示了細(xì)胞受體CCR5遺傳性基因突變能夠自然抵抗艾滋病感染，是ー種治療艾滋病病毒感染者有希望的策略(Gero Hutter et al. Long-Term Control of HIV by CCR5 Delta32/Delta32 Stem-CellTransplantation, N Engl J Med 2009; 360:692-8.)。但這一骨髓干細(xì)胞移植治療由于僅1%白人存在CCR5基因純合突變?cè)诩由先祟惏准?xì)胞抗原相匹配的限制，因而，該療法很難在臨床上應(yīng)用。然而，卻給艾滋病基因治療提供了新的思路。美國(guó)加州大學(xué)艾滋病研究所的科學(xué)家依據(jù)上述臨床研究中發(fā)現(xiàn)，嘗試將人類細(xì)胞上受體CCR5基因沉寂。他們選用人源化的小鼠為模型，給小鼠體內(nèi)注入小RNA分子(短鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA，shRNA)，通過(guò)RNAi干擾機(jī)制阻斷小鼠體內(nèi)的人體血液干細(xì)胞CCR5受體的表達(dá)。令人欣喜的是，CCR5受體表達(dá)受阻的小鼠對(duì)艾滋病表現(xiàn)出穩(wěn)定的抵抗力?？茖W(xué)家們認(rèn)為，這ー研究成果證實(shí)了使用RNAi技術(shù)阻斷CCR5受體的治療方式可能成為治療HIV的好辦法(Shimizu et al. A highlyefficient snort hairpin RNA potently down-regulates CCRd expression in systemiclymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood, 25 February 2010, Vol. 115,No. 8，pp. 1534-1544)
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種古老而保守的生物現(xiàn)象,它由21 23個(gè)核苷酸的雙鏈RNA通過(guò)堿基互補(bǔ)靶向識(shí)別并降解mRNA，導(dǎo)致序列特異的基因沉默。與反義RNA和核酶(Ribozymes)技術(shù)相比，RNAi設(shè)計(jì)上的特異性和簡(jiǎn)單性,干擾的高效性以及不引起免疫反應(yīng)等特性使其更易應(yīng)用到抗病毒感染臨床治療上。目前，國(guó)外學(xué)者已對(duì)宿主細(xì)胞CD4，CCR5, CXCR4及HIV-I的tat、rev、nef、env和gag等相關(guān)基因?yàn)榘袠?biāo)進(jìn)行了抗HIV感染研究，這些研究都表明RNAi是ー種抑制HIV基因表達(dá)或降低HIV感染的有力工具。2005年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了首個(gè)RNAi的I/II期臨床試驗(yàn)，既是針對(duì)HIV tat和rev為靶基因，由慢病毒載體系統(tǒng)介導(dǎo)的抗HIV感染的臨床試驗(yàn)(http://www. wiley. co. uk/genmed/clinical/)。目前，雖然以宿主細(xì)胞CCR5及HIV-I的tat、rev等相關(guān)基因?yàn)榘袠?biāo)進(jìn)行RNAi已有報(bào)道，但利用新型慢病毒載體針對(duì)多個(gè)HIV-I靶標(biāo)結(jié)合進(jìn)行RNAi仍未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種可以針對(duì)多個(gè)HIV-I靶標(biāo)結(jié)合進(jìn)行RNAi的安全的重組慢病毒表達(dá)載體系統(tǒng)。為了解決上述問(wèn)題，目前比較可行的方法是找到ー種新型的攜帯了特定RNAi核苷酸片段的重組慢病毒載體系統(tǒng)。這主要需要解決兩方面的問(wèn)題，ー是如何進(jìn)行RNAi，有效的抑制目的基因的表達(dá)；另ー個(gè)是如何使重組慢病毒載體系統(tǒng)安全，降低插入突變的風(fēng)險(xiǎn)。RNAi是較有前途的抑制目的基因表達(dá)的方法，但仍有許多問(wèn)題需要解決①針對(duì)HIV-I變異，如何設(shè)計(jì)有效的siRNA 因?yàn)椹`些病毒能產(chǎn)生突變的子代分子，可逃避免疫監(jiān)視及藥物，對(duì)抗siRNA的識(shí)別，因此必須使所設(shè)計(jì)的siRNA作用于病毒RNA保守、在不同病毒株間不存在突變的序列，并要設(shè)計(jì)作用于RNA保守序列的多個(gè)siRNA;同時(shí)siRNA很少引起免疫反應(yīng)，siRNA容易與其他siRNA結(jié)合產(chǎn)生協(xié)同或相加效應(yīng)，因而多個(gè)siRNA同時(shí)使用可有效對(duì)抗HIV的突變株。②如何將siRNA更有效地轉(zhuǎn)人體內(nèi)細(xì)胞？目前，慢病毒載體是在靶細(xì)胞進(jìn)行siRNA有效轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定表達(dá)的最好選擇，但仍需解決載體安全性問(wèn)題。③怎樣增強(qiáng)siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性。如在siRNA鏈中加人某些化學(xué)元素如氟等以對(duì)抗核酸酶的降解等。④如何將siRNA與抗HIV-I藥物有效結(jié)合起來(lái)或?qū)⒍鄠€(gè)siRNA結(jié)合起來(lái)將是抗HIV感染的研究熱點(diǎn)。因?yàn)镠IV-I生活周期是ー個(gè)多個(gè)環(huán)節(jié)的過(guò)程，對(duì)其單一環(huán)節(jié)靶點(diǎn)干預(yù)難以獲得持續(xù)有效的療效，將多個(gè)siRNA結(jié)合有可能增加其協(xié)同或相加效應(yīng)。關(guān)于載體系統(tǒng)的選擇方面，本發(fā)明經(jīng)過(guò)了一系列的研究后認(rèn)為慢病毒是比較理想的工具。慢病毒(Lentivirus)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒亞屬，以人類免疫缺陷病毒(humanimmunodefficiency virus, HIV)為代表.慢病毒不僅具有感染分裂祀細(xì)胞并整合其基因組中，尤其是具有感染包括神經(jīng)元細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞和干細(xì)胞等在內(nèi)的多種非分裂細(xì)胞能力，因而，慢病毒載體已作為基因轉(zhuǎn)移的有效工具，被廣泛應(yīng)用于基因功能尤其是基因治療的研究。然而，同其它病毒如反轉(zhuǎn)錄病毒一祥，慢病毒的整合是隨機(jī)的，因而常導(dǎo)致插入突變之風(fēng)險(xiǎn)，該風(fēng)險(xiǎn)巨大阻礙著慢病毒載體系統(tǒng)在基因功能和基因治療上的廣泛地應(yīng)用。前期我們?cè)l(fā)明了ー種新型慢病毒載體系統(tǒng)即位點(diǎn)特異整合性慢病毒載體系統(tǒng)(ー種位點(diǎn)特異整合性慢病毒載體及制備方法，授權(quán)專利號(hào)ZL200810037440.9)，大幅降低了一般慢病毒載體系統(tǒng)隨機(jī)整合導(dǎo)致插入突變之風(fēng)險(xiǎn)。該位點(diǎn)特異性整合慢病毒載體系統(tǒng)，由FattbC31UGW質(zhì)粒、CMV A 8. 9-D64N/D116N和包膜質(zhì)粒VSVG組成(其結(jié)構(gòu)示意圖分別如圖5、2和3所示)；FattbC31UGW質(zhì)粒是將attB位點(diǎn)序列和位點(diǎn)特異整合酶C31基因序列依次連接并且克隆到FUGW載體的PACI酶切點(diǎn)而得；CMV A 8. 9-D64N/D116N質(zhì)粒是由CMV A 8. 9質(zhì)粒中的pol基因D64N和D116N突變而得。FUGff, pCMV A 8. 9 (即 CMV A 8. 9 質(zhì)粒)及 VSVG 來(lái)源于美國(guó) Carlos Lois 博士惠贈(zèng)。本發(fā)明的FUGW慢病毒載體來(lái)源于文章Lois C，et al. Germline transmissionand tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.Science, 2002,295:868-72。FUGW以除去有害基因后的HIV作為骨架，表達(dá)由泛素(Ubiquitin-C, UBC)調(diào)控的綠色熒光蛋白基因(EGFP) ；pCMV A 8. 9為包裝結(jié)構(gòu)質(zhì)粒，主要起病毒包裝功能，表達(dá)酶蛋白形成病毒衣殼結(jié)構(gòu)及整合酶(IN) ； VSVG為包膜質(zhì)粒。一方面，包裝載體 CMV A 8. 9-D64N/D116N 是由 CMV A 8. 9 中 pol 基因(其 NCBI 登陸號(hào)AAC54634 )編碼的HIV整合酶D64N和D116N雙突變而成，使其僅有包裝功能而未整合作用。另ー方面，F(xiàn)attbC31UGW質(zhì)粒是由attB位點(diǎn)序列和位點(diǎn)特異整合酶基因C31 (即 phi C31,其NCBI登陸號(hào)AX816372)序列克隆到FUGW載體的pacl酶切點(diǎn)而得到，賦予了該載體位點(diǎn)特異整合的功能。本發(fā)明利用了上述位點(diǎn)特異整合性慢病毒載體，通過(guò)提供一系列產(chǎn)生誘導(dǎo)RNAi途徑，使艾滋病相關(guān)基因得以高度、特異性抑制的新型重組慢病毒載體構(gòu)建方法，生產(chǎn)出可供給艾滋病基因治療研究和臨床應(yīng)用的重組慢病毒。
本發(fā)明提供了一種攜帶了特定RNAi核苷酸片段的重組慢病毒表達(dá)載體，重組慢病毒載體FattbC3IUGWshRNA表達(dá)載體是在FattbC31UGW載體中加入對(duì)重組慢病毒外殼內(nèi)包囊攜帯的特定RNAi核苷酸片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控元件構(gòu)成。所述的重對(duì)重組慢病毒外殼內(nèi)包囊攜帶的特定RNAi核苷酸片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控元件結(jié)構(gòu)是在U6 snRNA或HiRNA啟動(dòng)子控制下的可形成雙個(gè)shRNA產(chǎn)物的重組慢病毒載體。本發(fā)明選用的是針對(duì)CCR5和Tat/Rev的RNAi核苷酸片段。分別設(shè)計(jì)了三組RNAi核苷酸片段，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，表明第2組的消減效率比較明顯。所述的針對(duì)CCR5 的 RNAi 核苷酸片段是 sense siRNA-GAGCAAGCTCAGUUUACACC-1oop-UUGUCCGAC-antisense siRNA_GGUGUAAACUGAGCUUGCUC_UU3。所述的針對(duì)Tat/Rev 的 RNAi 核苷酸片段是 Tat/Rev: sense siRNA- GCUCUUCGUCGCU⑶CUCCGC-loop-UUGUCCGAC-antisense siRNA- GCGGAGACAGCGACGC -UU3。本發(fā)明提供了一種攜帶了特定RNAi核苷酸片段的重組慢病毒載體系統(tǒng)，該重組慢病毒載體系統(tǒng)包括重組慢病毒載體FattbC3IUGWshRNA表達(dá)載體、重組慢病毒包裝結(jié)構(gòu)質(zhì)粒 CMV8. 9-. D64N/D116N 和包膜質(zhì)粒 VSVG。
上述的重組慢病毒表達(dá)載體的制備方法是分別設(shè)計(jì)合成特定RNAi核苷酸片段對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)DNA寡核苷酸，退火形成雙鏈DNA寡核苷酸，應(yīng)用Gateway技術(shù)克隆入線性入門(mén)載體；在LR克隆酶II的催化下，pENTRTM/U6入門(mén)載體的U6 RNAi盒通過(guò)LR重組反應(yīng)重組入FattbC3 IUGff目的載體，形成FattbC3 IUGWshRNA表達(dá)載體。
所述的特定RNAi核苷酸片段對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)DNA寡核苷酸是針對(duì)編碼CCR5基因及TAT/REV shRNA的ー對(duì)特異互補(bǔ)DNA寡核苷酸。具體制備過(guò)程如下
FattbC3 IUGff shRNA質(zhì)粒構(gòu)建運(yùn)用Dharmacon的SMART篩選計(jì)算法則分別設(shè)計(jì)了三組RNAi核苷酸片段，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，表明第2組的消減效率比較明顯。靶向作用于CCR5的siRNA, siRNA由20_mers組成，包括正義鏈和反義鏈，并且在兩條鏈的3’ 末端有尿嘧啶。正義鏈 si RNA-GAGCAAGCTCAGUUUACACC-1 oop-UUGUCCGAC-反義鏈siRNA-GGUGUAAACUGAGCUUGCUC-UU3。靶向作用于 TAT/REV 的 siRNA 由 21_mers 組成正義鏈siRNA- GCUCUUCGUCGCU⑶CUCCGC-loop-UUGUCCGAC-反義鏈 siRNA_GCGGAGACAGCGACGC_UU3.構(gòu)建在U6 snRNA啟動(dòng)子或HiRNA啟動(dòng)子分別控制下針對(duì)CCR5及TAT/REV靶基因序列的可形成 shRNA 產(chǎn)物的 FattbC3 IUGWshRNA 質(zhì)粒。pENTRTM/U6 來(lái)源于 Invitrogen 公司，慢病毒載體源于前期我們發(fā)明了ー種新型慢病毒載體系統(tǒng)即位點(diǎn)特異整合性慢
病毒載體系統(tǒng)FattbC31UGW (—種位點(diǎn)特異整合性慢病毒載體及制備方法，授權(quán)專利號(hào)ZL200810037440. 9).分別設(shè)計(jì)合成編碼CCR5基因及TAT/REV shRNA的一對(duì)特異互補(bǔ)DNA寡核苷酸，退火形成雙鏈DNA寡核苷酸，應(yīng)用Gateway技術(shù)克隆入線性入門(mén)載體；在LR克隆酶II的催化下，pENTRTM/U6入門(mén)載體的U6 RNAi盒通過(guò)LR重組反應(yīng)重組入FattbC3 IUGff目的載體，形成FattbC3 IUGWshRNA表達(dá)載體。FattbC3IUGffshRNA 病毒制備將 FattbC3IUGWshRNA 質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒 VSVG 和包裝結(jié)構(gòu)質(zhì)粒CMV A8. 9-. D64N/D116N.質(zhì)粒混合，混合范圍為I. 5-10 :1. 1-4. 8- 1 ;即形成攜帶了多個(gè)特定RNAi核苷酸片段的重組慢病毒系統(tǒng)。CCR5表達(dá)水平檢測(cè)=HIV-I感染所必需的受體⑶4和輔助受體CCR5/CXCR4細(xì)胞株TZM-bl源于美國(guó)AIDS參考和試劑部門(mén)。細(xì)胞培養(yǎng)于添加了 10%的胎牛血清，0.2 mg/ml G418，0. I mg/ml的潮霉素B，I. 0 ug/ml的嘌呤霉素的 Dulbecco’ s modified Eagle’s medium (DMEM)。轉(zhuǎn)染前 24h 細(xì)胞以 5105 cells/well的密度種于2. 5 cm的孔內(nèi)。FattbC3IUGWshRNA病毒MOI=I感染細(xì)胞株TZM-bl?；旌衔锛尤爰?xì)胞后調(diào)整體積到700微升，之后細(xì)胞與轉(zhuǎn)染混合物在37° C孵育6h后加油預(yù)熱的含有10%胎牛血清的DMEM。隔兩天再轉(zhuǎn)染一次。轉(zhuǎn)染72h后，用流式細(xì)胞儀和QRT-PCR分別檢測(cè)證實(shí)CCR5的下調(diào)表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，CCR5/TAT-REV RNAi具有強(qiáng)的CCR5敲除能力
細(xì)胞下調(diào)表達(dá)CCR5之后的抗病毒能力檢測(cè)TZM-bl因?yàn)楸磉_(dá)輔助受體CCR5而對(duì)R5-tropic HIV-I BaL-I具有易感性。為了驗(yàn)證細(xì)胞下調(diào)表達(dá)CCR5之后的抗病毒能力，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)siRNA之后用病毒感染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)72h之后，去除培養(yǎng)用MOI為0. 01的病毒感染細(xì)胞同時(shí)凝聚胺的濃度為4ug/ml。病毒和細(xì)胞37° C作用2h之后用PBS洗兩次，然后加入2ml DMEM完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)基因的巨噬細(xì)胞也進(jìn)行同樣的操作。病毒感染兩天后收集細(xì)胞上清，用ELISA檢測(cè)p24抗原。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞病毒抗原水平減少了 9倍.
本發(fā)明的制備方法中，克隆序列可以采用PCR，人工合成，酶切等方法實(shí)現(xiàn)，拼接序列則可能采用酶切、退火、連接粘性末端等方法實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的制備方法中，采用混合質(zhì)量比可以是5 :4 :3或者4 :3 :2。質(zhì)粒FattbC3 IUGffshRNA, pCMV A 8. 9- D64N/D116N,及VSVG三部分共轉(zhuǎn)染時(shí)，三者質(zhì)量比可以為 2 :1. 5 :1 ;如三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 IOOCM 培養(yǎng)皿，F(xiàn)attbC3IUGffshRNA, pCMV. A 8. 9-D64/Dl 16N及VSVG所需量可以是lOug，7. 5ug和5ug。共轉(zhuǎn)染方法可以通過(guò)脂質(zhì)體，磷酸鈣，PEI
坐寸o本發(fā)明中，所適用宿主包括各種真核生物。本發(fā)明中，攜帯了多個(gè)特定RNAi核苷酸片段的重組慢病毒系統(tǒng)應(yīng)用的宿主細(xì)胞可以是靜止細(xì)胞或者分裂細(xì)胞。其中，靜止細(xì)胞可以是神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞或者成體干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。本發(fā)明中，靜止期細(xì)胞也可以是原代細(xì)胞。本發(fā)明的攜帯了多個(gè)特定RNAi核苷酸片段的重組慢病毒，不僅在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中證實(shí)了該載體系統(tǒng)具有感染神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞和各種干細(xì)胞等在內(nèi)的多種非分裂或靜止期細(xì)胞能力，而且，病毒載體攜帶的針對(duì)艾滋病特定 RNAi核苷酸片段在C31整合酶介導(dǎo)下可穩(wěn)定整合在基因組假attP位點(diǎn)上，可有效穩(wěn)定降解細(xì)胞CCR5受體表達(dá)，具有抑制HIV感染作用。本發(fā)明的重組慢病毒載體系統(tǒng)可以用于抑制細(xì)胞中CCR5的表達(dá)。
本發(fā)明提供了一種攜帶多靶點(diǎn)RNAi的慢病毒制備系統(tǒng)，由FattbC3IUGWshRNA質(zhì)粒、CMV A 8. 9-D64N/D116N和包膜質(zhì)粒VSVG組成(其結(jié)構(gòu)示意圖分別如圖1、2和3所示)。一方面，包裝載體CMV A 8. 9-D64N/D116N是由CMV A 8. 9中pol基因編碼HIV整合酶D64N和D116N雙突變而成，使其僅有包裝功能而未整合作用。另ー方面，F(xiàn)attbC3IUGWshRNA質(zhì)粒是由attB位點(diǎn)序列和位點(diǎn)特異整合酶基因phi C31 (其NCBI登陸號(hào)AX816372)序列克隆到FUGW載體的PACI酶切點(diǎn)而得到，賦予了該載體位點(diǎn)特異整合的功能。本發(fā)明的慢病毒制備系統(tǒng)針對(duì)多個(gè)HIV-I靶標(biāo)結(jié)合進(jìn)行RNAi，可以使特定的目標(biāo)基因表達(dá)量降低甚至不表達(dá)。經(jīng)測(cè)試，與對(duì)照相比，siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞病毒抗原水平減少了 9倍。因此，本發(fā)明可以應(yīng)用于艾滋病的基因治療，為患者提供新的安全有效的治療途徑。


圖I. FattbC3IUGWshRNA 載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖2. VSVG載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖3. pCMV. A 8. 9-D64N/D116N 結(jié)構(gòu)示意圖。圖4 FattbC3IUGffshRNA感染細(xì)胞CCR5表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果示意圖。圖5. FattbC31UGW載體結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I攜帯了多個(gè)特定RNAi核苷酸片段的重組慢病毒制備方法 PENTRTM/U6來(lái)源于Invitrogen公司，慢病毒載體源于前期我們發(fā)明了ー種新型慢病
毒載體系統(tǒng)即位點(diǎn)特異整合性慢病毒載體系統(tǒng)FattbC31UGW (—種位點(diǎn)特異整合性慢病毒載體及制備方法，授權(quán)專利號(hào)ZL200810037440. 9).分別設(shè)計(jì)合成編碼CCR5基因及TAT/REV shRNA的ー對(duì)特異互補(bǔ)DNA寡核苷酸，退火形成雙鏈DNA寡核苷酸，應(yīng)用Gateway技術(shù)克隆入線性入門(mén)載體；在LR克隆酶II的催化下，pENTRTM/U6入門(mén)載體的U6 RNAi盒通過(guò)LR重組反應(yīng)重組入FattbC31UGW目的載體，形成FattbC3 IUGWshRNA表達(dá)載體。
實(shí)施例2被質(zhì)粒CMV A8.9-D64N/D64N包裝的位點(diǎn)特異整合性慢病毒制備將FattbC3IUGWshRNA載體，與包裝結(jié)構(gòu)質(zhì)粒CMV A 8. 9-D64N/D64N和包膜質(zhì)粒(VSVG)以2 I I質(zhì)量比例混合。利用脂質(zhì)體LipofectamineTM在293T細(xì)胞上進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24^48 h后在熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)大量熒光后收集病毒上清，收集的病毒上清濃縮后分裝備用或立即使用.重組慢病毒活性測(cè)定時(shí)，將濃縮后的病毒貯存液作不同比例稀釋，感染細(xì)胞48 h后在熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光計(jì)數(shù)，確定滴度。FUGW載體作為對(duì)照。結(jié)果顯示，F(xiàn)attbC3IUGWshRNA 慢病毒滴度為 6. 8*10づ TU/ml。
實(shí)施例3 CCR5表達(dá)水平檢測(cè)
HIV-I感染所必需的受體⑶4和輔助受體CCR5/CXCR4細(xì)胞株TZM-bl源于美國(guó)AIDS參考和試劑部門(mén)獲得。細(xì)胞培養(yǎng)液添加了 10%的胎牛血清，0. 2 mg/ml G418，0. I mg/ml的潮霉素 B, I. 0 ug/ml 的嘌呤霉素的 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)。轉(zhuǎn)染前24h 細(xì)胞以 5 105 cells/well 的密度種于 2. 5 cm 的孔內(nèi)。FattbC3IUGWshRNA 病毒 MOI=I感染細(xì)胞株TZM-bl，之后細(xì)胞與轉(zhuǎn)染混合物在37° C孵育6h后加油預(yù)熱的含有10%胎牛血清的DMEM。隔兩天再轉(zhuǎn)染一次。轉(zhuǎn)染72h后，用流式細(xì)胞儀和QRT-PCR分別檢測(cè)證實(shí)CCR5的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，CCR5的表達(dá)確實(shí)大幅下調(diào)，詳見(jiàn)圖4。
實(shí)施例4位點(diǎn)特異整合性慢病毒系統(tǒng)感染細(xì)胞分析
細(xì)胞下調(diào)表達(dá)CCR5之后的抗病毒能力檢測(cè)TZM-bl因?yàn)楸磉_(dá)輔助受體CCR5而對(duì)R5-tropic HIV-I BaL-I具有易感性。為了驗(yàn)證細(xì)胞下調(diào)表達(dá)CCR5之后的抗病毒能力，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)siRNA之后用病毒感染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)72h之后，去除培養(yǎng)用MOI為0. 01的病毒感染細(xì)胞同時(shí)凝聚胺的濃度為4ug/ml。病毒和細(xì)胞37° C作用2h之后用PBS洗兩次，然后加入2ml DMEM完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)基因的巨噬細(xì)胞也進(jìn)行同樣的操作。病毒感染兩天后收集細(xì)胞上清，用ELISA檢測(cè)p24抗原。數(shù)據(jù)通過(guò)三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞病毒抗原水平減少了 9倍。
權(quán)利要求
1.一種攜帶了特定RNAi核苷酸片段的重組慢病毒表達(dá)載體，其特征在于，重組慢病毒載體FattbC3 IUGWshRNA表達(dá)載體是在FattbC31UGW載體中加入對(duì)重組慢病毒外殼內(nèi)包囊攜帶的特定RNAi核苷酸片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控元件構(gòu)成。
2.如權(quán)利要求I所述的重組慢病毒表達(dá)載體，其特征在于，重對(duì)重組慢病毒外殼內(nèi)包囊攜帶的特定RNAi核苷酸片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控元件結(jié)構(gòu)是在U6 snRNA或HiRNA啟動(dòng)子控制下的可形成雙個(gè)shRNA產(chǎn)物的重組慢病毒載體。
3.如權(quán)利要求I所述的重組慢病毒表達(dá)載體，其特征在于，重組慢病毒載體所攜帶特定RNAi核苷酸片段是針對(duì)CCR5的RNAi核苷酸片段。
4.如權(quán)利要求3所述的重組慢病毒表達(dá)載體，其特征在于，針對(duì)CCR5的RNAi核苷酸片段是 sense siRNA-GAGCAAGCTCAGUUUACACC-loop-UUGUCCGAC-antisenses i RNA-G ⑶⑶ AAACUGAGCUUGCUC-UU3。
5.如權(quán)利要求I所述的重組慢病毒表達(dá)載體，其特征在于，重組慢病毒載體所攜帶特定RNAi核苷酸片段是針對(duì)Tat/Rev的RNAi核苷酸片段。
6.如權(quán)利要求5所述的重組慢病毒表達(dá)載體，其特征在于，針對(duì)Tat/Rev的RNAi核苷酸片段是 Tat/Rev: sense siRNA- GCUCUUCGUCGCU⑶CUCCGC-loop-UUGUCCGAC-antisense siRNA- GCGGAGACAGCGACGC -UU3。
7.一種攜帶了特定RNAi核苷酸片段的重組慢病毒載體系統(tǒng)，其特征在于，該重組慢病毒載體系統(tǒng)包括重組慢病毒載體FattbC3IUGWshRNA表達(dá)載體、重組慢病毒包裝結(jié)構(gòu)質(zhì)粒CMV8. 9-. D64N/D116N 和包膜質(zhì)粒 VSVG。
8.權(quán)利要求I所述的重組慢病毒表達(dá)載體的制備方法，其特征在于，分別設(shè)計(jì)合成特定RNAi核苷酸片段對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)DNA寡核苷酸，退火形成雙鏈DNA寡核苷酸，應(yīng)用Gateway技術(shù)克隆入線性入門(mén)載體；在LR克隆酶II的催化下，pENTRTM/U6入門(mén)載體的U6 RNAi盒通過(guò)LR重組反應(yīng)重組入FattbC31UGW目的載體，形成FattbC3 IUGWshRNA表達(dá)載體。
9.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述的特定RNAi核苷酸片段對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)DNA寡核苷酸是針對(duì)編碼CCR5基因及TAT/REV shRNA的一對(duì)特異互補(bǔ)DNA寡核苷酸。
10.權(quán)利要求I所述的重組慢病毒載體系統(tǒng)在抑制細(xì)胞中CCR5表達(dá)的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥及基因工程領(lǐng)域，涉及一種攜帶與HIV病毒生活周期相關(guān)基因的多靶點(diǎn)RNAi的慢病毒及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種攜帶了特定RNAi核苷酸片段的重組慢病毒表達(dá)載體FattbC31UGWshRNA表達(dá)載體，是在FattbC31UGW載體中加入對(duì)重組慢病毒外殼內(nèi)包囊攜帶的特定RNAi核苷酸片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控元件構(gòu)成。本發(fā)明還提供了在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的重組慢病毒載體系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的慢病毒制備系統(tǒng)針對(duì)多個(gè)HIV-1靶標(biāo)結(jié)合進(jìn)行RNAi，可以使特定的目標(biāo)基因表達(dá)量降低甚至不表達(dá)。因此，本發(fā)明可以應(yīng)用于艾滋病的基因治療，為患者提供新的安全有效的治療途徑。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102851317SQ20111018278
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者朱煥章, 周鑫, 曲喜英, 王鵬飛 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)