專利名稱：懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造獸用狂犬滅活凍干疫苗工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制造獸用狂犬滅活疫苗的方法，具體來講，涉及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造獸用狂犬滅活凍干疫苗工藝。
背景技術(shù)：
中國狂犬病病人約93%由家犬引起，6%由貓引起，另外還有為數(shù)不多的由豬和老鼠引起，因此實現(xiàn)獸用狂犬滅活疫苗的國產(chǎn)化和家養(yǎng)動物定期注射狂犬滅活疫苗是我國控制與消滅狂犬病的重要途徑。中國目前獸用狂犬滅活疫苗的生產(chǎn)使用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶工藝，工藝繁瑣、抗原含量低，不能滿足質(zhì)量需求，目前市場還沒有供應(yīng)，所有獸用狂犬滅活疫苗完全依賴進(jìn)口，價格高、費用大，農(nóng)村和經(jīng)濟(jì)落后地區(qū)難以推廣使用，不利于動物狂犬病的預(yù)防與控制，所以研發(fā)安全、高效的獸用狂犬滅活疫苗，盡早實現(xiàn)獸用狂犬滅活疫苗的國產(chǎn)化， 降低疫苗成本，才能控制和根除狂犬病。目前，中國國內(nèi)BHK21-C13細(xì)胞生產(chǎn)獸用狂犬疫苗仍使用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝， 批量小、效率低、勞動強(qiáng)度大、占用場地多，即將狂犬病毒株(Flury毒株等)接種單層生長的BHK21-C13細(xì)胞，維持培養(yǎng)4 5日，一次性收獲、凍融，制備成疫苗。因每個轉(zhuǎn)瓶均是獨立的細(xì)胞培養(yǎng)單元，每瓶的細(xì)胞質(zhì)量、病毒產(chǎn)量和滴度都不同，而且操作勞動強(qiáng)度大，導(dǎo)致中國國產(chǎn)狂犬疫苗批間差大，隱性污染引起高內(nèi)毒素等缺點。反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BHK21-C13細(xì)胞生產(chǎn)狂犬病毒工藝是解決上述問題的一個途徑， 但是目前還沒有利用BHK21-C13細(xì)胞懸浮工藝制造獸用狂犬滅活疫苗的成熟方法，具體的工藝條件有待優(yōu)化，以達(dá)到生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)獸用狂犬滅活疫苗的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造獸用狂犬滅活凍干疫苗工藝，以滿足規(guī)模化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)獸用狂犬滅活疫苗的目的。本發(fā)明提供的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造獸用狂犬滅活凍干疫苗工藝，利用細(xì)胞懸浮工藝培養(yǎng)狂犬病毒，將收獲的狂犬病毒液滅活純化后制備獸用滅活狂犬疫苗。其中，所述細(xì)胞通過以下培養(yǎng)方法而制得反應(yīng)器按照0. 2 0. 5 X IO6細(xì)胞/ml接種BHK21-C13細(xì)胞，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)溫度36. 5士0. 5°C, pH 7. 20士0. 1，D0(dissolved oxygen,即溶氧):20% 60%，轉(zhuǎn)速60 IlOrpm;利用BHK21-C13細(xì)胞懸浮工藝培養(yǎng)狂犬病毒的方法為使所述反應(yīng)器內(nèi)的BHK21-C13細(xì)胞培養(yǎng)密度大于2X IO6細(xì)胞/ml，更換培養(yǎng)液以終培養(yǎng)體積的 0. 5 1. 0%接入狂犬病毒生產(chǎn)種毒進(jìn)行培養(yǎng)。設(shè)定狂犬病毒培養(yǎng)溫度34. 0士 1°C，pH 7. 40-7. 60，DO :20% 60%，轉(zhuǎn)速60 llOrpm，累計培養(yǎng) 96 120h，收獲病毒液，-20°C 保存?zhèn)溆?，?. 03ml中病毒含量> 105 5。較佳地，反應(yīng)器接種的0. 2 0. 5X IO6細(xì)胞/ml的BHK21-C13懸浮細(xì)胞通過以下方法獲得從液氮中取出一支凍存的BHK21-C13懸浮細(xì)胞株，貼壁培養(yǎng)1-3代，將貼壁培養(yǎng) BHK21-C13細(xì)胞消化，更換懸浮培養(yǎng)基，使接種密度在0. 2 0. 5X IO6細(xì)胞/ml，懸浮培養(yǎng)1-3代，擴(kuò)增至反應(yīng)器所需體積和密度。較佳地，所述狂犬病毒生產(chǎn)種毒利用BHK21-C13細(xì)胞懸浮培養(yǎng)狂犬貼壁生產(chǎn)種毒并連續(xù)傳1 3代而得。具體地講，取長勢良好的懸浮BHK21-C13細(xì)胞，更換培養(yǎng)液以終培養(yǎng)體積的 0. 5-1%接入狂犬貼壁生產(chǎn)種毒，設(shè)定病毒培養(yǎng)的pH值為7. 40-7. 60，DO :20% 60%，轉(zhuǎn)速60 llOrpm，溫度34.0±1°C ；累計懸浮培養(yǎng)96_120h，待細(xì)胞密度< IX IO6細(xì)胞/ml 時收獲病毒液，取樣檢測LD5tl，連續(xù)傳1-3代做為生產(chǎn)種毒，_20°C保存?zhèn)溆?，?. 03ml中病
毒含量彡IO5 50較佳地，所述狂犬種毒為Flury-LEP毒株。較佳地，滅活純化狂犬病毒液包括澄清、超濾濃縮、滅活、純化和除菌步驟。所述超濾濃縮可以通過750K的中空纖維超濾系統(tǒng)進(jìn)行。所述滅活純化的方法為按病毒液總量(總體積)的1/4000加入β-丙內(nèi)酯，混合均勻；用kpharose 4FF柱層析系統(tǒng)純化，用0. 2um的除菌濾器過濾。較佳地，該方法中用到的培養(yǎng)基為低血清培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基。利用本發(fā)明提供的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造獸用狂犬滅活凍干疫苗工藝，作為狂犬病毒宿主細(xì)胞的BHK21-C13細(xì)胞懸浮培養(yǎng)非常成功，培養(yǎng)體積已達(dá)1000L ；細(xì)胞密度達(dá)4_8X IO6 細(xì)胞/ml。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)病毒大量增殖，大大提高病毒滴度與抗原產(chǎn)量，實現(xiàn)工藝自動化， 提高疫苗的質(zhì)量。解決了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)BHK21-C13細(xì)胞生產(chǎn)狂犬病毒產(chǎn)量和滴度都非常低，疫苗效力低，免疫劑量大等技術(shù)難題。本發(fā)明不僅能提高BHK21-C13細(xì)胞密度，自動監(jiān)控細(xì)胞生長或病毒繁殖的最適生化條件，提高病毒滴度，而且工藝規(guī)模放大相對容易，疫苗質(zhì)量穩(wěn)定、批間差小。該發(fā)明將改變目前國產(chǎn)獸用狂犬疫苗價廉質(zhì)低的形象。


圖1為本發(fā)明的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造獸用狂犬滅活凍干疫苗工藝的技術(shù)流程示意圖。
具體實施例方式如圖1所示，主要技術(shù)流程包括以下6個步驟1、實驗室搖瓶細(xì)胞培養(yǎng)，2、5L、50L、 500L反應(yīng)器BHK21-C13細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，3、生產(chǎn)規(guī)?？袢《九囵B(yǎng)，5、濃縮、滅活、純化，6分
裝、凍干。實施例一實驗室搖瓶培養(yǎng)BHK21-C13細(xì)胞1、種細(xì)胞復(fù)蘇從液氮中取出一支凍存的BHK21-C13懸浮細(xì)胞株，37°C快速融化，IOOOrpm離心5 分鐘。棄上清液，加入適量MEM營養(yǎng)液(含10%新生牛血清)重懸，轉(zhuǎn)至75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中補MEM營養(yǎng)液液至30ml，37°C靜置貼壁培養(yǎng)。2、細(xì)胞傳代細(xì)胞培養(yǎng)48-72小時后棄去營養(yǎng)液，加入IOml消化液(0. 02% EDTA-0. 25%胰蛋白酶溶液)，消化約2分鐘后，棄去消化液，靜置3-5分鐘，補加MEM營養(yǎng)液90ml，分裝至3 個新的培養(yǎng)瓶中，每瓶裝量約30ml，37°C靜置培養(yǎng)。
3、細(xì)胞搖瓶培養(yǎng)細(xì)胞貼壁培養(yǎng)48-72小時后棄去營養(yǎng)液，加入IOml消化液，(0. 02% EDTA-0. 25% 胰蛋白酶溶液)，消化約2分鐘后，棄去消化液，靜置3-5分鐘，加入約IOOml懸浮營養(yǎng)液，調(diào)節(jié)接種密度在0. 2-0. 5 X IO6細(xì)胞/ml，將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至250ml或500ml搖瓶中，將搖瓶放在 37°C搖床中，80-120rpm培養(yǎng)。培養(yǎng)4 后取樣計數(shù)，若細(xì)胞密度彡2. OX IO6細(xì)胞/ml時進(jìn)行細(xì)胞傳代，否則繼續(xù)培養(yǎng)。取需要傳代的細(xì)胞，加入懸浮營養(yǎng)液約900ml，將細(xì)胞液稀釋至0. 2-0. 5X IO6細(xì)胞/ml，將稀釋好的細(xì)胞液分裝至8_10個搖瓶中懸浮培養(yǎng)1_3代，擴(kuò)增至反應(yīng)器所需體積和密度。實施例二 5L及生產(chǎn)規(guī)模反應(yīng)器BHK21-C13細(xì)胞懸浮培養(yǎng)1、5L反應(yīng)器BHK21-C13細(xì)胞懸浮培養(yǎng)將培養(yǎng)好的搖瓶細(xì)胞(細(xì)胞密度彡？^父^^細(xì)胞/！^，活率大于卯1^^。。-^^。!^ 混合在專用接種瓶內(nèi)，取樣計數(shù)、無菌檢驗。將接種瓶內(nèi)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至5L反應(yīng)器中，加入懸浮營養(yǎng)液約4000ml，稀釋至0. 2-0. 5X IO6細(xì)胞/ml，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)溫度36. 5士0. 5°C，pH 7. 20士0. 1，DO 20% -60%，轉(zhuǎn)速隨著細(xì)胞密度、培養(yǎng)體積、攪拌方式的不同而不同，一般在 60-1 IOrpm0細(xì)胞培養(yǎng)4 后取樣計數(shù)，當(dāng)細(xì)胞密度> 2. OX IO6細(xì)胞/ml時將細(xì)胞液轉(zhuǎn)至 50L反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，否則繼續(xù)培養(yǎng)至所需細(xì)胞密度。2、50L反應(yīng)器BHK21-C13細(xì)胞懸浮培養(yǎng)加入懸浮營養(yǎng)液約45L，將細(xì)胞液稀釋至0. 2-0. 5 X IO6細(xì)胞/ml，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)溫度36. 5 士 0. 5°C、pH :7. 20 士 0. 1、DO :20% -60%、轉(zhuǎn)速隨著細(xì)胞密度、培養(yǎng)體積、攪拌方式的不同而不同，一般在110-140rpm。細(xì)胞培養(yǎng)4 后取樣計數(shù)，當(dāng)細(xì)胞密度> 2. OX IO6細(xì)胞/ml時將細(xì)胞液轉(zhuǎn)至500L反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，否則繼續(xù)培養(yǎng)至所需細(xì)胞密度。3、500L反應(yīng)器BHK21-C13細(xì)胞懸浮培養(yǎng)加入懸浮營養(yǎng)液約450L，將細(xì)胞液稀釋至0. 2-0. 5X IO6細(xì)胞/ml，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)溫度36. 5士0. 5°C、pH 7. 20士0. 1、DO 20% -60%、轉(zhuǎn)速隨著細(xì)胞密度、培養(yǎng)體積、攪拌方式的不同而不同，一般在110-140rpm。細(xì)胞培養(yǎng)4 后取樣計數(shù)，當(dāng)細(xì)胞密度> 2. OX IO6 細(xì)胞/ml時進(jìn)行病毒培養(yǎng)，否則繼續(xù)培養(yǎng)至所需細(xì)胞密度。表一 5L反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)的密度和活率
權(quán)利要求
1.懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造獸用狂犬滅活凍干疫苗工藝，該方法利用懸浮培養(yǎng)的高密度細(xì)胞，接種狂犬病毒，將收獲的狂犬病毒液滅活純化后制備獸用懸浮狂犬滅活疫苗。其特征在于，所述高密度懸浮細(xì)胞通過以下培養(yǎng)方法而制得反應(yīng)器按照0. 2 0. 5 X IO6細(xì)胞/ml接種 BHK21-C13 細(xì)胞，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)溫度:36. 5士0. 5°C，pH :7. 20士0. 1，D0:20% 60%，轉(zhuǎn)速60 IlOrpm ；利用BHK21-C13細(xì)胞懸浮工藝培養(yǎng)狂犬病毒的方法為使所述反應(yīng)器內(nèi)的BHK21-C13細(xì)胞培養(yǎng)密度大于2X IO6細(xì)胞/ml，更換培養(yǎng)液以終培養(yǎng)體積的0. 5 1. 0% 接入狂犬病毒生產(chǎn)種毒進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)定狂犬病毒培養(yǎng)溫度34. 0士 1°C，pH 7. 40-7. 60, DO 20% 60%，轉(zhuǎn)速60 llOrpm，累計培養(yǎng)96 120h，收獲病毒液，_20°C保存?zhèn)溆茫?0. 03ml中病毒含量> IO5 50
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造獸用狂犬滅活凍干疫苗工藝，其特征在于，反應(yīng)器接種的0. 2 0. 5X IO6細(xì)胞/ml的BHK21-C13懸浮細(xì)胞通過以下方法獲得從液氮中取出一支凍存的BHK21-C13懸浮細(xì)胞株，貼壁培養(yǎng)1-3代，將貼壁培養(yǎng)BHK21-C13細(xì)胞消化，更換懸浮培養(yǎng)基，使接種密度在0. 2 0. 5 X IO6細(xì)胞/ml，懸浮培養(yǎng)1_3代，擴(kuò)增至反應(yīng)器所需體積和密度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造獸用狂犬滅活凍干疫苗工藝，其特征在于，所述狂犬種毒為Flury-LEP毒株。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造獸用狂犬滅活凍干疫苗工藝，其特征在于，所述狂犬病毒生產(chǎn)種毒利用BHK21-C13細(xì)胞懸浮培養(yǎng)狂犬貼壁生產(chǎn)種毒并連續(xù)傳1 3代而得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造獸用狂犬滅活凍干疫苗工藝，其特征在于，所述狂犬病毒生產(chǎn)種毒的制備方法為取長勢良好的懸浮BHK21-C13細(xì)胞，更換培養(yǎng)液以終培養(yǎng)體積的0. 5-1 %接入狂犬貼壁生產(chǎn)種毒，設(shè)定病毒培養(yǎng)的pH值為7. 40-7. 60， DO :20% 60%，轉(zhuǎn)速60 llOrpm，溫度34. O士 1°C ；累計懸浮培養(yǎng)96_120h，待細(xì)胞密度 < IXlO6細(xì)胞/ml時收獲病毒液，取樣檢測LD5tl，連續(xù)傳1_3代做為生產(chǎn)種毒，_20°C保存?zhèn)溆茫?. 03ml中病毒含量彡IO5 50
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造獸用狂犬滅活凍干疫苗工藝，其特征在于，滅活純化狂犬病毒液包括澄清、超濾濃縮、滅活、純化和除菌步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造獸用狂犬滅活凍干疫苗工藝，其特征在于，所述超濾濃縮通過750K的中空纖維超濾系統(tǒng)進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造獸用狂犬滅活凍干疫苗工藝，其特征在于，所述滅活純化的方法為按病毒液總量的1/4000加入β-丙內(nèi)酯，混合均勻；用 Sepharose 4FF柱層析系統(tǒng)純化，用0. 2um的除菌濾器過濾。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造獸用狂犬滅活凍干疫苗工藝，其特征在于，該方法中用到的培養(yǎng)基為低血清培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制造獸用狂犬滅活疫苗的新型工藝，具體為，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造獸用狂犬滅活凍干疫苗工藝。該方法的核心是利用生物反應(yīng)器大規(guī)模懸浮培養(yǎng)BHK21-C13細(xì)胞并接種狂犬種毒，通過流加、灌流技術(shù)使狂犬病毒大量繁殖，從而獲得高濃度及高滴度的狂犬抗原，經(jīng)濃縮滅活純化后制備獸用狂犬滅活疫苗，克服了目前工藝繁瑣、抗原含量低，效力低，劑量大、批間差大等技術(shù)難題。
文檔編號C12N7/00GK102228686SQ20111018212
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者劉國英, 薛清, 譙曉燕, 趙麗霞, 郝鵬 申請人:金宇保靈生物藥品有限公司