專利名稱:一種peg化重組豬-人尿酸氧化酶融合蛋白的制備及應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域,具體涉及一種PEG化重組豬-人尿酸氧化酶融合蛋白的制備及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù):
尿酸酶又稱尿酸氧化酶⑴ricase,Urate Oxidase, EC 1. 7. 3. 3,U0),能催化尿酸氧化生成尿囊素、(X)2和H2O2。大多數(shù)脊椎動(dòng)物的肝臟、腎臟等組織中均發(fā)現(xiàn)有此酶的存在, 但人類及一些靈長(zhǎng)類動(dòng)物由于基因突變失去合成有活性尿酸氧化酶的能力[1]。尿酸是人體內(nèi)嘌呤分解代謝的最終產(chǎn)物,由腎臟排泄,隨尿液排出體外。尿酸在體內(nèi)主要以鈉鹽形式存在,自由形式的尿酸極其鈉鹽在水中溶解度很低。如果體內(nèi)嘌呤代謝紊亂產(chǎn)生過(guò)量尿酸,或尿酸排泄受阻,都能使血液中尿酸濃度升高,從而引起高尿酸血癥和痛風(fēng)等疾病。惡性血液疾病和腫瘤化療也會(huì)導(dǎo)致血液尿酸濃度升高。高尿酸血癥和痛風(fēng)不僅能引起關(guān)節(jié)腫脹,還可誘發(fā)和加重脂類代謝紊亂、糖尿病, 增加心腦血管疾病、代謝紊亂綜合癥及腎臟疾病病人的死亡率。近些年來(lái),隨著我國(guó)人民生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的變化,痛風(fēng)病患病者迅速增加,并呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)?;疾÷矢哌_(dá)約 4%,接近歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家水平,已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病。目前,對(duì)于痛風(fēng)病的治療,一般使用促進(jìn)尿酸排泄或抑制尿酸合成的藥物。排尿酸藥有丙磺舒類藥物,通過(guò)抑制腎小管對(duì)尿酸重吸收,增加其排泄。抑制尿酸合成的主要藥物是別嘌呤醇。它是黃嘌呤氧化酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,能抑制黃嘌呤氧化成尿酸,使得尿酸合成減少。但它可造成尿酸的前體物黃嘌呤濃度升高。而黃嘌呤的水溶性比尿酸更低,有些病人會(huì)發(fā)生黃嘌呤腎損傷和沉積。別嘌呤醇和丙磺舒類藥物都有明顯肝腎毒性,且療效都不夠理想[2]。尿酸氧化酶是治療常規(guī)療法無(wú)效的痛風(fēng)病患者的理想藥物。人體內(nèi)尿酸氧化酶基因中存在2處致死性突變,它們分別位于尿酸氧化酶氨基酸序列的第33位和第187位氨基酸殘基,由精氨酸殘基變?yōu)榻K止密碼(CGA —TGA)。為了得到一種適于人類使用的尿酸氧化酶制劑,本發(fā)明使用一段與人類基因比較相似且有較好活力的豬尿酸氧化酶的基因取代人類基因中的無(wú)功能部分,制備出豬-人尿酸氧化酶嵌合基因,使用該基因生產(chǎn)制備可用于臨床的豬-人尿酸氧化酶融合蛋白。臨床觀察顯示,如果蛋白類藥物多次給藥,其藥效往往難以維持。其原因是蛋白質(zhì)本身就是天然抗原,注射到體內(nèi)后會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體,通過(guò)抗原抗體反應(yīng)影響后期的治療效果,嚴(yán)重時(shí)還會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)。解決這一問(wèn)題的有效途徑之一就是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行聚乙二醇化(PEG化)修飾,以達(dá)到降低免疫原性,延長(zhǎng)循環(huán)半衰期的目的。PEG是一種不帶電荷的線性親水分子,它可以與蛋白質(zhì)的非必需基團(tuán)共價(jià)結(jié)合形成空間構(gòu)象上的屏障,避免外源蛋白的抗原決定簇誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體。由于酶的底物多是小分子物質(zhì),可以穿過(guò)PEG屏障與活性部位結(jié)合,因此PEG化不會(huì)顯著降低酶的活性。本發(fā)明涉及一種方法,能最大限度的屏蔽豬-人尿酸氧化酶的抗原性,并能很好的保存其酶活力,也有很高的生物安全性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供PEG化重組豬-人尿酸氧化酶融合蛋白的制備方法,和用PEG 化重組豬-人尿酸氧化酶制備注射液和凍干粉針劑的方法,以及該注射液或粉針劑在降低血尿酸含量中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供重組豬-人尿酸氧化酶的核苷酸序列,包含該核苷酸序列的載體, 及包含該載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的技術(shù)方案一種PEG化的重組豬-人尿酸氧化酶,其特征在于該結(jié)合物包括重組豬-人尿酸氧化酶和PEG的共價(jià)連接物,二者通過(guò)氨基甲酸酯鍵形式共價(jià)連接;所述的重組豬-人尿酸氧化酶可以為四聚體;每個(gè)重組豬-人尿酸氧化酶亞基上共價(jià)連接8-12個(gè)PEG鏈,比較優(yōu)選為9-11個(gè)PEG鏈,更優(yōu)選為9-10個(gè)PEG鏈;所述的PEG可以為線形或分枝形,PEG的分子量可以為2-50KD,比較優(yōu)選為5-20KD,更優(yōu)選為IOKD ;所述的重組豬-人尿酸氧化酶的核苷酸序列可以是序列表1中的序列,其氨基酸序列可以是序列表2中的序列。一種降低血漿尿酸含量的組合物,其特征在于包括所述的重組豬-人尿酸氧化酶與PEG的結(jié)合物和藥學(xué)上可接受的載體。該組合物的給藥途徑包括肌肉注射,靜脈注射,痛風(fēng)紅腫部位或痛風(fēng)石所在部位局部注射等;該組合物可以以注射液或凍干粉針等制劑形式存在。所述的PEG化重組豬-人尿酸氧化酶以及包含該結(jié)合物的藥物組合物可以在制備用于降低血漿尿酸含量的藥物中應(yīng)用,可用于臨床上高尿酸血癥的治療和痛風(fēng)病的全身和局部治療。一種編碼重組豬-人尿酸氧化酶蛋白的核酸分子,其核苷酸序列可以為序列表1 中的序列;一種含有編碼所述的重組豬-人尿酸氧化酶蛋白的質(zhì)粒載體及含有該載體的宿主細(xì)胞;該載體可以為質(zhì)粒載體,宿主細(xì)胞可以為大腸桿菌。下面對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)描述本發(fā)明提供的重組豬-人尿酸氧化酶融合蛋白,尤其是PEG與重組豬-人尿酸氧化酶的結(jié)合物,基本上無(wú)免疫原性,且基本保持尿酸氧化酶活性,優(yōu)選的可保留85%的酶活性,比較優(yōu)選的可保留90%的酶活性,更優(yōu)選的可保留95%,甚至為98%以上的酶活性。本發(fā)明提供的重組豬-人尿酸氧化酶是融合蛋白,自N端起第1-222個(gè)氨基酸殘基由豬尿酸氧化酶基因序列編碼,第223-305個(gè)氨基酸序列由人尿酸氧化酶基因編碼。該融合蛋白的氨基酸全長(zhǎng)序列見(jiàn)序列表2。N端優(yōu)選為豬核苷酸序列N端的X-222核苷酸序列,其中X為1-10,比較優(yōu)選的X為2-9,進(jìn)一步優(yōu)選的X為3-8,更進(jìn)一步優(yōu)選的X為4_7, 最優(yōu)選的X為7。本發(fā)明現(xiàn)用的豬尿酸氧化酶基因序列中,有3個(gè)部位與國(guó)外報(bào)道豬尿酸氧化酶序列有差異。它們分別是第Illbp處由T變?yōu)镃,第456bp處由C變?yōu)門,第669bp處由 T變?yōu)镚。本發(fā)明的豬尿酸氧化酶基因序列為附表3的序列。但其編碼的氨基酸序列沒(méi)有變化。融合蛋白第223-305個(gè)氨基酸序列由人尿酸氧化酶基因編碼。人尿酸氧化酶全長(zhǎng)序列見(jiàn)附表4。優(yōu)選部分人尿酸氧化酶核苷酸序列為人尿酸氧化酶核苷酸序列的第223-305氨基酸殘基的編碼基因序列。為了方便基因操作,在重組豬-人尿酸氧化酶基因的5’端加上ACC使之能用限制性核酸內(nèi)切酶Nco I切下基因片段;在3’端加上限制性核酸內(nèi)切酶Bio I的序列etc gag。豬-人重組尿酸氧化酶基因可采用全基因人工合成的方法,或采用RT-PCR的方法分別從豬和人的肝組織中克隆。如果人的新鮮肝組織不易獲得也可用RT-PCR的方法克隆豬的尿酸氧化酶基因的N端序列,而用人工合成的方法獲得人的尿酸氧化酶基因的C端序列。將N端序列和C端序列連接成重組豬-人尿酸氧化酶嵌合基因。將重組序列插入T載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。從克隆質(zhì)粒載體上獲取重組基因插入到pET28a質(zhì)粒載體中,構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,得到表達(dá)工程菌E. coli BL21/pET28a-PHU0。用發(fā)酵培養(yǎng)的方法生產(chǎn)表達(dá)工程菌,待OD值達(dá)1. 4左右時(shí)加入誘導(dǎo)劑α _乳糖至工作濃度為5-6mmol/L。誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時(shí)。收菌后用超聲波破碎或用高壓均質(zhì)機(jī)破碎至 98%以上菌體破碎。分別用離子交換柱(DEAE Sepharose Fast Flow),疏水柱(Phoenyl Sepharose 6 Fast Flow),凝膠過(guò)濾柱(S^hacryl S 300HR)進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物純化。本申請(qǐng)所述的重組豬-人尿酸氧化酶可以為四聚體。四聚體表面的Lys側(cè)鏈的游離氨基與mPEG-SC分子中帶活性基團(tuán)的PEG鏈進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。本發(fā)明所述的每個(gè)重組豬-人尿酸氧化酶亞基上共價(jià)連接平均為8-12個(gè)PEG鏈,比較優(yōu)選的為9-11個(gè)PEG鏈,更優(yōu)選的為9-10個(gè)PEG鏈;所述的PEG可以為線形或分枝形,PEG的分子量可以為2-50KD,比較優(yōu)選為5-20KD,更優(yōu)選為10KD。每個(gè)豬-人尿酸氧化酶融合蛋白的亞基含有28個(gè)游離賴氨酸殘基,加上末端氨基酸共有四個(gè)游離氨基。修飾12個(gè)賴氨酸殘基以下其酶活性沒(méi)有明顯降低。本發(fā)明還包括一種降低尿酸含量的組合物,其特征在于包括以上所述的PEG化重組豬-人尿酸氧化酶和藥學(xué)上可接受的載體。所述的藥學(xué)上可接受的載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑,賦形劑等。非腸道給藥制劑包括注射劑等,也包括凍干粉針制劑。本發(fā)明比較優(yōu)選劑型為注射劑,最優(yōu)選為的凍干粉針制劑,其中凍干粉針制劑可以通過(guò)注射用水或者特定的溶液復(fù)溶,能保持原結(jié)合物的活性;優(yōu)選的給藥途徑包括肌肉注射,靜脈注射和痛風(fēng)紅腫部位局部注射等。上述各種劑型均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本發(fā)明的結(jié)合物適合在血尿酸含量高于正常值50%以上時(shí)使用,劑量一般控制在2-8單位/公斤體重。在血尿酸含量低于正常值后停止使用。二次給藥的間隔時(shí)間在7天以上。每個(gè)治療周期給藥2-3次。本發(fā)明提供一種編碼所述的重組豬-人尿酸氧化酶蛋白的核酸分子,其核苷酸序列可以為序列表1中的序列。一種含有編碼所述的重組豬-人尿酸氧化酶蛋白的DNA分子載體,包括克隆載體和表達(dá)載體,優(yōu)選載體為質(zhì)粒載體,其中優(yōu)選的克隆載體為PMD 18-T,優(yōu)選的表達(dá)載體為 pET28a。本發(fā)明提供一種包含這些載體的宿主細(xì)胞,包括細(xì)菌,真菌,植物細(xì)胞,動(dòng)物細(xì)胞等,優(yōu)選為大腸桿菌。本發(fā)明提供表達(dá)重組豬-人尿酸氧化酶的核酸分子的制備方法,所述方法包括根據(jù)核酸序列進(jìn)行全基因人工合成方案,RT-PCR擴(kuò)增方案和RT-PCR擴(kuò)增豬尿酸氧化酶基因加人工合成人尿酸氧化酶基因部分片段三種方案。本發(fā)明提供擴(kuò)增重組豬-人尿酸氧化酶的核酸分子的方法,所述方法包括PCR擴(kuò)增方法??刹捎贸R?guī)的PCR擴(kuò)增方法,包括根據(jù)該核酸分子的序列設(shè)計(jì)合成引物。在適量的靶核酸分子以及過(guò)量的核苷酸和聚合酶存在下,加入適量引物,通過(guò)將靶核酸分子反復(fù)變性,與引物退火以及與引物延伸至子鏈的多個(gè)循環(huán),從而將靶核酸分子指數(shù)擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過(guò)電泳回收,連接到載體上,再導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到質(zhì)粒載體上, 按照常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法將該質(zhì)粒載體導(dǎo)入大腸桿菌DH5 α或BL21中。挑選包含重組豬-人尿酸氧化酶的核苷酸序列的轉(zhuǎn)化子,低溫冷凍保存。本發(fā)明提供重組豬-人尿酸氧化酶融合蛋白的制備方法。所述方法包括用含有該蛋白的核酸序列的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞,根據(jù)宿主細(xì)胞和表達(dá)載體的特性,選擇合適的誘導(dǎo)表達(dá)條件,誘導(dǎo)基因高效表達(dá)該蛋白。所述方法包括采用本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)提取純化蛋白的方法提取純化該蛋白。優(yōu)選采用色譜技術(shù)純化蛋白。本發(fā)明提供獨(dú)特的重組豬-人尿酸氧化酶的沉淀方法。本發(fā)明提供制備PEG化重組豬-人尿酸氧化酶結(jié)合物的方法。將純化重組豬-人尿酸氧化酶用北京凱正生物工程發(fā)展有限責(zé)任公司生產(chǎn)的活化PEG產(chǎn)品(mPEG-SC,分子量10K)進(jìn)行修飾。待重組豬-人尿酸氧化酶與PEG連接完成后用凝膠過(guò)濾層析方法或者超濾的方法,將PEG化重組豬-人尿酸氧化酶與其它小分子物質(zhì)分離。本發(fā)明提供PEG化重組豬-人尿酸氧化酶注射劑和凍干粉針劑的制備方法。將純化后的PEG化重組豬-人尿酸氧化酶用藥物學(xué)上常規(guī)的蛋白類藥物制劑的制備方法,制備成注射劑和凍干粉針劑。
圖1純化蛋白SDS-PAGE1 :1、2、3、4、泳道為純化蛋白的4個(gè)取樣管分別命名為①②③④,上樣的蛋白量為10 μ g ;第5泳道為蛋白Marker ;第6、7、8泳道,為③號(hào)取樣管純化蛋白,上樣量分別為 10μ g、20y g、30y g0圖2純化豬-人尿酸氧化酶高效液相色譜純度檢測(cè)
權(quán)利要求
1.一種重組豬-人尿酸氧化酶融合蛋白,其特征在于該融合蛋白的N端第1-222個(gè)氨基酸殘基由豬尿酸氧化酶基因序列編碼,第223-305個(gè)氨基酸序列由人尿酸氧化酶基因編碼。將該融合蛋白與聚乙二醇(PEG)共價(jià)連接形成結(jié)合物,即PEG化重組豬-人尿酸氧化酶。
2.權(quán)利要求1所述的結(jié)合物,其特征在于重組豬-人尿酸氧化酶與單甲氧基聚乙二醇甲酸琥珀酰亞胺酯反應(yīng),mPEG上活化的PEG與重組豬-人尿酸氧化酶融合蛋白分子中的部分游離氨基通過(guò)共價(jià)鍵連接,形成PEG化重組豬-人尿酸氧化酶。
3.權(quán)利要求2所述的結(jié)合物,其特征在于每個(gè)重組豬-人尿酸氧化酶亞基上共價(jià)連接8-12個(gè)PEG鏈,PEG的平均分子量為2-50KD,PEG為線形或分枝形。
4.權(quán)利要求3所述的結(jié)合物,其特征在于每個(gè)重組豬-人尿酸氧化酶亞基上共價(jià)連接9-11個(gè)PEG鏈,PEG的平均分子量為5-20KD,PEG為線形或分枝形。
5.權(quán)利要求4所述的結(jié)合物,其特征在于每個(gè)重組豬-人尿酸氧化酶亞基上共價(jià)連接 9-10個(gè)PEG鏈,PEG的平均分子量為10KD,PEG為線形或分枝形。
6.權(quán)利要求2所述的結(jié)合物,其特征在于重組豬-人尿酸氧化酶為四聚體,核苷酸序列見(jiàn)序列表1,氨基酸序列見(jiàn)序列表2。
7.—種核酸分子,編碼權(quán)利要求1所述的重組豬-人尿酸氧化酶。
8.質(zhì)粒載體,含有權(quán)利要求7所述的核苷酸序列。
9.宿主細(xì)胞,含有權(quán)利要求8所述的質(zhì)粒載體,為大腸桿菌BL21,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為CCTCC M2011161。
10.一種降低人和動(dòng)物血液尿酸含量的組合物,其特征在于包括權(quán)利要求1所述的PEG 化重組豬-人尿酸氧化酶和藥學(xué)上可接受的載體。
11.權(quán)利要求10所述的組合物,其特征在于該組合物以注射液或凍干粉針制劑形式存在。
12.權(quán)利要求1-11所述的結(jié)合物在制備用于降低人和動(dòng)物血液尿酸含量的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了PEG化重組豬-人尿酸氧化酶融合蛋白的制備方法,用PEG化重組豬-人尿酸氧化酶制備注射液和凍干粉針劑的方法,及其降低血尿酸含量的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了重組豬-人尿酸氧化酶的核苷酸序列,包含核苷酸序列的載體,及包含該載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明提供的PEG化重組豬-人尿酸氧化酶融合蛋白基本上無(wú)免疫原性,且基本保持尿酸氧化酶PEG化之前的活性,具有較好的降低血液中尿酸含量的治療效果。
文檔編號(hào)C12N11/08GK102260653SQ20111018144
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者匡紅艷, 孫中杰, 榮俊 申請(qǐng)人:北京盛宏生物技術(shù)有限公司