專(zhuān)利名稱(chēng)：耐酸中溫α-淀粉酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及耐酸中溫α -淀粉酶及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
α-淀粉酶(a-U-glucanhydrolase EC3. 2. 1. 1)，又稱(chēng)為液化型淀粉酶。它能從淀粉分子的內(nèi)部任意切開(kāi)α-1，4糖苷鍵，產(chǎn)生分子量較小的麥芽糊精、葡萄糖及其它低聚糖。淀粉在α-淀粉酶的作用下，分子迅速降解，粘度下降，即完成液化作用。在淀粉糖加工業(yè)、紡織工業(yè)、造紙工業(yè)、制藥行業(yè)、釀酒行業(yè)及燃料乙醇生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，具有相當(dāng)大的商業(yè)價(jià)值。目前在工業(yè)生產(chǎn)中，α-淀粉酶一般以微生物發(fā)酵法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，這些微生物包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌等。近年來(lái)隨著淀粉原料深加工工業(yè)的發(fā)展，酒精行業(yè)工藝條件的改變，要求酶制劑工業(yè)不斷更新和完善酶的種類(lèi)，以滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。對(duì)于淀粉糖化工業(yè)，一般是采用雙酶法進(jìn)行液化、糖化，即先加α-淀粉酶液化，再加糖化酶來(lái)糖化產(chǎn)生葡萄糖。目前市售的淀粉酶最適PH為6. 0-7. 0，糖化酶的最適ρΗ為4. 5左右，兩者的作用ρΗ值差異較大，而淀粉原料液的天然PH為4. 5-5. 0左右。傳統(tǒng)工藝淀粉液化后需添加酸來(lái)降低ρΗ值后糖化酶才起作用，這樣用酸堿反復(fù)調(diào)節(jié)原料液的ΡΗ，既增加工藝，又引入外源離子，加重了分離的負(fù)擔(dān)。在酒精行業(yè)中，由于廢水的回填，使得原料液的PH值降為4-5，也不適合α-淀粉酶的作用。而在我國(guó)傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)中，由于固態(tài)發(fā)酵不徹底，在酒糟中普遍含有10%以上的淀粉，但酒糟的PH很低，此酸性條件下的淀粉利用就需要開(kāi)發(fā)適合該生產(chǎn)條件的酸性α -淀粉酶。此外，以淀粉質(zhì)為原料的酒精發(fā)酵工業(yè)中，淀粉中低溫液化工藝(75-85°C噴射中溫 α -淀粉酶液化1-2小時(shí)，然后降溫至60°C左右部分糖化后同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)酒精)與傳統(tǒng)的高溫液化糖化(高溫105°C噴射液化，95°C液化1-2小時(shí)，然后降溫至60°C左右部分糖化后發(fā)酵)的工藝相比，具有節(jié)能省耗、可發(fā)酵性糖損失少的優(yōu)點(diǎn)。由于耐酸性的α-淀粉酶能在酸性條件下保持高活性，不僅可以簡(jiǎn)化釀酒發(fā)酵工業(yè)的液化、糖化過(guò)程，降低淀粉深加工的生產(chǎn)成本，而且在消化類(lèi)藥物、酒精糟液利用、一步法生產(chǎn)糖漿等諸多方面顯示出巨大的利用前景。隨著我國(guó)淀粉糖、釀造及發(fā)酵工業(yè)的日益發(fā)展，對(duì)耐酸性淀粉水解酶的需求也將越來(lái)越大。為了適應(yīng)整個(gè)淀粉糖化、食品、紡織、制藥及酒精行業(yè)的需要，簡(jiǎn)化工藝，降低成本、省水節(jié)能，滿足一些在酸性條件下進(jìn)行淀粉原料液化工藝的要求，開(kāi)發(fā)一種耐酸中溫的 α-淀粉酶就勢(shì)在必行。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述情況，本發(fā)明解決了現(xiàn)有α-淀粉酶耐酸性和溫度適應(yīng)性不能同時(shí)兼顧，以致應(yīng)用受到限制的問(wèn)題；采用重組DNA技術(shù)，提供了定點(diǎn)突變前體α -淀粉酶以改善其特性，得到了活力提高的耐酸耐溫α-淀粉酶突變體及其制備方法。本發(fā)明從枯草芽孢桿菌[中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC 10028)]中克隆前體α -淀粉酶基因，對(duì)其141及558位點(diǎn)的氨基酸殘基進(jìn)行突變，并在芽孢桿菌中高效表達(dá)α-淀粉酶突變體。從而為耐酸性α-淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供一條可行途徑。本發(fā)明將分離到的編碼前體α -淀粉酶的基因的141及558位點(diǎn)的氨基酸殘基進(jìn)行突變，以改變其酸穩(wěn)定性和酶活力。并構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌宿主，高效表達(dá)了突變體 α -淀粉酶，突變酶具有良好的酸穩(wěn)定性，有較寬的PH適用范圍，更適于工業(yè)化應(yīng)用。α -淀粉酶突變體，是突變?chǔ)?-淀粉酶編碼DNA序列的表達(dá)產(chǎn)物。α -淀粉酶突變體具有的氨基酸序列是通過(guò)對(duì)SEQ ID Ν0:12所示的前體α-淀粉酶氨基酸序列中R141及 L558的氨基酸位點(diǎn)的替換而得到的。α -淀粉酶突變體的序列是在前體α -淀粉酶原有序列上發(fā)生了氨基酸替換。本發(fā)明涉及了兩對(duì)完全互補(bǔ)的引物，用重組PCR方法將前體α-淀粉酶的141及558位的氨基酸進(jìn)行突變(圖1)，得到經(jīng)過(guò)耐酸性改造的本發(fā)明突變體基因。 編碼α-淀粉酶突變體的基因序列見(jiàn)SEQ ID NO :2。本發(fā)明的α-淀粉酶突變體ρΗ低于 5. 0時(shí)具有酸穩(wěn)定性，且其活力提高為前體α -淀粉酶的3. 5倍。本發(fā)明所用的前體α -淀粉酶來(lái)源是枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌。耐酸α -淀粉酶，包括突變體α -淀粉酶DNA序列的重組表達(dá)載體重組表達(dá)載體除包括編碼突變?chǔ)?-淀粉酶的DNA序列外，還具有表達(dá)該基因所需的調(diào)控元件?？晒┻x擇使用的在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的質(zhì)粒載體有很多。這些載體都帶有完整的閱讀框架，即含有一個(gè)啟動(dòng)子和終止子，或另外帶有其它表達(dá)調(diào)控元件。優(yōu)選的啟動(dòng)子是枯草芽孢桿菌中的 Ρ43啟動(dòng)子。在啟動(dòng)子和終止子之間有一段多克隆位點(diǎn)，這些多克隆位點(diǎn)分別包含有若干單一酶切位點(diǎn)，選用限制酶將載體切成線狀，并用DNA連接酶將突變?chǔ)?淀粉酶基因連接到所選載體上，從而構(gòu)成一個(gè)在啟動(dòng)子和終止子之間含有目的基因的重組分泌型載體。本發(fā)明使用枯草芽孢桿菌表達(dá)載體PWB980，插入本發(fā)明的突變的α -淀粉酶DNA編碼序列以后得到重組表達(dá)載體，它除了攜帶有所述的淀粉酶DNA編碼序列外，還帶有Ρ43啟動(dòng)子、sacB基因信號(hào)肽序列、卡那霉素抗性基因，以及為外源蛋白高效表達(dá)所需的調(diào)控元件。重組體細(xì)胞指的是包含編碼本發(fā)明的α -淀粉酶的DNA的表達(dá)載體的適當(dāng)宿主。 本發(fā)明所適用的宿主細(xì)胞包括任何可表達(dá)本發(fā)明的α-淀粉酶的可轉(zhuǎn)化微生物，即枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌細(xì)胞，優(yōu)選蛋白酶缺陷的枯草芽孢桿菌細(xì)胞。本發(fā)明包括產(chǎn)生α -淀粉酶突變體的方法，包括以下步驟通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)，突變編碼前體α -淀粉酶的DNA序列，得到編碼α -淀粉酶突變體的DNA序列；將上述的突變DNA序列與載體相連接，得到攜帶α _淀粉酶突變體基因的重組表達(dá)載體；將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌株，得到重組體細(xì)胞；將重組體進(jìn)行發(fā)酵制備α-淀粉酶突變體。分離并純化提取耐酸(ρΗ4. 0-6. 0)耐中溫(65-75°C )的淀粉酶突變體。具體操作方法為耐酸中溫α -淀粉酶的制備方法，包括以下步驟步驟Al，前體α-淀粉酶基因的擴(kuò)增提取枯草芽孢桿菌染色體DNA，根據(jù) Genbank中已報(bào)道的枯草芽孢桿菌淀粉酶基因?yàn)橐罁?jù)，設(shè)計(jì)如下引物上游引物Fl 5‘ -GCGCGAATTCGGAAACTGCAAACAAATCGAATGAGGTG-3‘ (SEQ ID NO 1)
下游引物Rl :5，-CGCGAAGCTTATGCGGAAGATAACCATTCAAACCGG-3’ (SEQ ID NO 2)；PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、雙酶切后，連接到同樣經(jīng)雙酶切線性化的pET_22b，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109，得到 pET22-ACN7 ；步驟A2，前體α -淀粉酶的的定點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)含突變氨基酸殘基的互補(bǔ)引物如下引物 1 :5，-TTGGTCGGACGGATGGGACATCACT-3，(SEQ ID NO 4)引物 2 :5，-AGTGATGTCCCATCCGTCCGACCAA-3，(SEQ ID NO 5)引物 3 :5，-GGGCCATAGAAGATACCGGATCATG-3，(SEQ ID NO 6)引物 4 :5，-CATGATCCGGTATCTTCTATGGCCC-3，(SEQ ID NO 7)以重組質(zhì)粒PET22-ACN7為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按以下次序，將各成分在薄壁離心管內(nèi)混合:PCR1 采用 50 μ L 體系，ddH2038. 5 μ L, IOXbuffer 5 μ L, dNTP (2. 5mmol/ L) 2 μ L，引物 1 QO μ mol/L) 2 μ L，弓|物 2 (20 μ mol/L) 2 μ L, DNA 模板 1 μ L, pfu 高保真 DNA 聚合酶 0. 5 μ L。擴(kuò)增條件為:94°C 2min, 1 個(gè)循環(huán)；94°C 40s, 60°C，40s, 72°C，2min, 20 個(gè)循環(huán)；最后 1 個(gè)循環(huán)為 72°C 7min。PCR2 采用 50 μ L 體系，ddH2038. 5M1，IOXbuffer 5 μ L, dNTP (2. 5mmol/L)2y L,引物 3 (20 μ mol/L) 2 μ L，弓 | 物 4 (20 μ mol/L) 2 μ L，DNA 模板 1 μ L, pfu高保真DNA聚合酶0. 5 μ L.擴(kuò)增條件為94°C anin，l個(gè)循環(huán)；94°C 40s, 60 °C, 40s, 72°C，2min，20個(gè)循環(huán)；最后1個(gè)循環(huán)為72°C 7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-10感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆，經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證， 最終得到含有突變?chǔ)?-淀粉酶基因的重組表達(dá)載體PET-ACN7-2 ；步驟A3，突變?chǔ)?-淀粉酶表達(dá)載體的構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)載體采用pWB980，設(shè)計(jì)如下引物上游引物F2 :5，-CGCGGATCCAGGAAACTGCAAACAAATCGAATGAGGTG-3，(SEQ ID NO: 9)；下游引物R2 :5，-CGCGGCATGCATGCGGAAGATAACCATTCAAACCGG-3，(SEQ ID NO 10)；以重組表達(dá)載體pETCN7-2為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按以下次序，將各成分在滅菌薄壁離心管內(nèi)混合采用 50 μ L 擴(kuò)增體系CldH2O 41. 5μ L, IOXbuffer 5 μ L, dNTP(2. 5mmol/ L) 1 μ L，上下游引物 2 (20 μ mol/L)各 0· 5 μ L，DNA 模板 1 μ L，TaqDNA 聚合酶 0. 5 μ L.擴(kuò)增條件為94°C anin，l個(gè)循環(huán)；94°C 40s，58°C，40s，72°C，2min，30個(gè)循環(huán)；最后1個(gè)循環(huán)為 72 °C IOmin ；將所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、純化、雙酶切，然后連接到同樣雙酶切線性化的PWB980載體上在1. 5mL離心管中加入12 μ L純化的DNA，4 μ L線性pWB980 載體，2yL 10X連接酶buffer，lyL T4 DNA連接酶，加水至總體積為20 μ L，16°C連接過(guò)夜；步驟A4，表達(dá)載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，將步驟A3的連接混合物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌 WB600的感受態(tài)細(xì)胞，枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamH I 和Sph I進(jìn)行酶切鑒定，測(cè)序，構(gòu)建了枯草芽孢桿菌重組表達(dá)載體pWB980-ACN7-2。所述的前體α -淀粉酶來(lái)源于地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、短芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌等芽孢桿菌屬的菌株；所述的載體適于在枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌中表達(dá)；尤其適于在蛋白酶缺陷的枯草芽孢桿菌中表達(dá)?？墒褂玫娜魏我阎霓D(zhuǎn)化方法，如感受態(tài)法、電轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法等將本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，以實(shí)現(xiàn)α-淀粉酶突變體的表達(dá)。應(yīng)用本發(fā)明獲得的重組體菌株可以進(jìn)行耐酸性α -淀粉酶突變體的工業(yè)化生產(chǎn)， 在有選擇壓力的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組體細(xì)胞，無(wú)需經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，上清用硫酸銨沉淀，沉淀透析除鹽之后加入丙烯葡聚糖凝膠S300凝膠柱，用洗脫液洗脫即可得到所需的耐酸α -淀粉酶突變體。


圖1為α -淀粉酶的編碼基因定點(diǎn)突變示意圖；圖2為α -淀粉酶突變體的PCR擴(kuò)增電泳3為重組質(zhì)粒Pet22_ACN7的構(gòu)建示意圖；圖4為重組質(zhì)粒pWB980-ACN7-2的構(gòu)建示意圖；圖5為α -淀粉酶突變體的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；圖6為α -淀粉酶突變體在不同ρΗ值下的穩(wěn)定性；
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。其具體實(shí)施方案應(yīng)該理解為僅為舉例說(shuō)明，而非任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 前體α -淀粉酶基因的擴(kuò)增提取枯草芽孢桿菌[購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC 10028)]染色體DNA。根據(jù)Genbank中已報(bào)道的枯草芽孢桿菌淀粉酶基因?yàn)橐罁?jù)，設(shè)計(jì)如下引物(引物委托上海生物工程有限公司合成)上游引物Fl 5’ -GCGCGAATTCGGAAACTGCAAACAAATCGAATGAGGTG-3’ (SEQ ID NO 1)下游引物Rl :5，-CGCGAAGCTTATGCGGAAGATAACCATTCAAACCGG-3’ (SEQ ID NO 2)其中上游引物Fl 5’端含有EcoR I酶切位點(diǎn)(下劃線)，下游引物5’端含有Hind III酶切位點(diǎn)(下劃線)。以枯草芽孢桿菌染色體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按以下次序，將各成分在滅菌薄壁離心管內(nèi)混合采用50 μ L擴(kuò)增體系ddH20 41. 5 μ L，10 X buffer 5 μ L， dNTP (2. 5mmol/L) 1 μ L,上下游引物(20 μ mol/L)各 0· 5 μ L，DNA 模板 1 μ L, TaqDNA 聚合酶 0. 5 μ L.擴(kuò)增條件為94°C 2min, 1 個(gè)循環(huán)；94°C 40s, 58°C，40s, 72°C，2min, 30 個(gè)循環(huán)；最后 1個(gè)循環(huán)為720C IOmin。將所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物約為1. 91Λ。結(jié)果如圖2所示，可以看到在約1. 9kb處出現(xiàn)了一條特異性條帶(圖2)，其大小與目的基因片段大小完全吻合。PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒(天根公司)進(jìn)行純化。具體步驟參考DNA產(chǎn)物純化試劑盒說(shuō)明書(shū)。純化的產(chǎn)物按以下方法用EcoR I和Hind III進(jìn)行雙酶切將各成分在薄壁管內(nèi)混合，采用 50μ L 體系，(ΜΗ2013μ L，IOXbuffer 5 μ L，PCR 純化產(chǎn)物 30 μ L，Hind III酶和 EcoRI 酶各1 μ L，混勻，稍離心之后置37°C水浴鍋保溫3-4h，65°C保溫20min滅酶活。
酶切產(chǎn)物加入2. 5倍體積的無(wú)水乙醇，1/10倍體積的3mol/L的醋酸鈉，_20°C冰箱放置20min，12000r/min，4°C離心lOmin，棄上清，沉淀用70 %乙醇洗滌，晾干，用30 μ L IXTE溶解即可得到兩端是粘性末端的α-淀粉酶基因片段。然后連接到同樣經(jīng)雙酶切線性化的pET-22b[購(gòu)自美國(guó)Novagen, Inc.]載體上在1. 5mL離心管中加入6 μ L純化的 DNA, 2 μ L線性pET-22b載體，IyL IOX連接酶buffer，1 μ L T4 DNA連接酶，加水至總體積為101yL，16°C連接過(guò)夜。所得到的連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 [購(gòu)買(mǎi)自自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心]感受態(tài)細(xì)胞。挑選轉(zhuǎn)化子，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證得到PET22-ACN7，其構(gòu)建示意圖如圖3。將其測(cè)序(委托上海生工)可知擴(kuò)增到的前體α-淀粉酶基因的DNA序列(SEQ ID NO 3)。實(shí)施例2 前體α -淀粉酶的的定點(diǎn)突變?chǔ)?淀粉酶的突變示意圖見(jiàn)圖1，設(shè)計(jì)含突變氨基酸殘基的互補(bǔ)引物如下引物 1 :5，-TTGGTCGGACGGATGGGACATCACT-3，(SEQ ID NO 4)引物 2 :5，-AGTGATGTCCCATCCGTCCGACCAA-3，(SEQ ID NO 5)引物 3 :5，-GGGCCATAGAAGATACCGGATCATG-3，(SEQ ID NO 6)引物 4 :5，-CATGATCCGGTATCTTCTATGGCCC-3，(SEQ ID NO 7)引物1和引物2互補(bǔ)，引物3和引物4互補(bǔ)。引物1和2中包含了對(duì)223位氨基酸的突變，而引物3和4中則包含了對(duì)558位氨基酸的突變。以重組質(zhì)粒pET22-ACN7(實(shí)施例1所構(gòu)建)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按以下次序，將各成分在薄壁離心管內(nèi)混合PCR1 采用 50 μ L 體系，ddH2038. 5 μ L, IOXbuffer 5 μ L, dNTP (2. 5mmol/L) 2 μ L，引物 1 QO μ mol/ L)2y L，引物 2(20μπιο1/υ2μ L，DNA 模板 1 μ L，pfu 高保真 DNA 聚合酶 0. 5 μ L。擴(kuò)增條件為94 °C anin，l 個(gè)循環(huán)；94°C 40s, 60 °C, 40s, 72 °C, 2min, 20 個(gè)循環(huán)；最后 1 個(gè)循環(huán)為 72 °C 7min。PCR2 采用 50 μ L 體系，ddH2038. 5M1, IOXbuffer 5μ L，dNTP(2. 5mmol/L)2y L, 引物;^20ymol/L)2y L，引物 Μ20μπιο1/υ2μ L，DNA 模板 1 μ L，pfu 高保真 DNA 聚合酶 0. 5 μ L.擴(kuò)增條件為:94°C 2min, 1 個(gè)循環(huán)；94°C 40s, 60°C，40s, 72°C，2min, 20 個(gè)循環(huán)；最后 1個(gè)循環(huán)為720C 7min。PCR產(chǎn)物用實(shí)施例1中的DNA純化方法純化后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-IO感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆，經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，最終得到含有突變?chǔ)?-淀粉酶基因的重組表達(dá)載體 PET-ACN7-2(SEQ ID NO 8)。編碼α -淀粉酶的突變體的DNA序列(SEQ ID NO 8)；gaaactgcaaacaaatcgaatgaggtgaccgattcatcggtcaaaaacgggaccatccttcatgcatgg aattggtcattcaatacgttaacacaaaatatgaaagagattcgtgatgcgggttatgcagccattcagacgtctcc gattaaccaagtaaaggaagggaaccaaggagataaaagcatgtcgaactggtactggctctatcagccgacatcgt accaaatcggcaaccgttacttaggcactgaacaagaatttaaggacatgtgtgcagccgcggaaaagtatggcgta aaagtcattgtcgatgcggttgtcaatcataccaccagcgattatggcgcgatttctgatgagattaagcgtattcc aaactggacccatggaaacacacaaattaaaaattggtcggacggatgggacatcactcaaaatgcattgcttgggc tgtatgattggaatactcagaatactgaggtgcaagcctacctgaaaggtttcttggaaagagcattgaatgacgga gcagacgggttccgctatgatgccgccaagcatatagagcttccggatgatgggaattacggcagccaattttggcc gaatatcacaaatacatcggcggagttccaatacggagaaatcctgcaagacagcgcgtccagagatactgcttatgcgaattatatgaatgtgacggcttctaactatgggcattccatcagatccgctttaaagaatcgtaatctgagtgtg tcgaatatctcccattatgcatctgatgtgtctgcggacaagttagtcacatgggtggaatcacatgatacgtatgc caatgatgatgaagagtccacatggatgagtgatgacgatattcgtttaggctgggcagtgattggttcccgctcag gaagcacgcctcttttcttttccagacctgagggcggaggaaatggtgtaagatttcccggaaaaagtcaaatagga gatcgcgggagcgccttatttaaagaccaggcgatcactgcggtcaatcaatttcacaatgaaatggccgggcagcc tgaggaactctcaaatccgaatggcaacaatcaaatatttatgaatcagcgcggctcaaaaggcgttgtgctggcaa atgcaggatcgtcttctgtcaccatcaatacttcaacgaaattacctgacggcaggtatgataatagggccggcgcc ggttcatttcaagtagcgaacggcaaactgacaggtacgatcaatgccagatccgcggctgttctttatcctgatga tattggaaatgcgcctcatgtctttcttgagaattaccaaacagaggcagtccattctttcaatgatcagctgacgg tcaccctgcgtgcaaatgcgaaaacaacaaaagccgtttaccaaatcaataatgggcagcagacagcatttaaggat ggagaccgattaacgatcgggaaagaagatccaatcggcacgacatacaacattaaattaaccggaacgaacggcga gggtgcagcgagaacccaagaatacacgtttgtcaaaaaagacccgtcccaaaccaacatcattgggtatcaaaatc cggatcattggggacaggtaaatgcttatatctataaacatgatggaggcggggccatagaagataccggatcatgg ccggggaaagccatgaccaagaatgcagatggaatgtacacgctgacgctgcctgagaatgcggatacggccgacgc caaagtgatttttaacaatggcagcgcccaagtgcccggccagaaccagcccggctttgattatgtgcagaatggtt tgtataacaactccggtttgaatggttatcttccgcat實(shí)施例3 突變?chǔ)?-淀粉酶表達(dá)載體的構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)載體采用pWB980[購(gòu)自 American Biogenetic Sciences, Inc], 設(shè)計(jì)如下引物上游引物F2 5’ -CGCGGATCCAGGAAACTGCAAACAAATCGAATGAGGTG-3’ (SEQ ID NO 9)下游引物R2 :5，-CGCGGCATGCATGCGGAAGATAACCATTCAAACCGG-3，(SEQ ID NO 10)其中上游引物F25’端含有BamH I酶切位點(diǎn)(下劃線)，下游引物5’端含有Sph I酶切位點(diǎn)(下劃線)。以重組表達(dá)載體PETCN7-2為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按以下次序，將各成分在滅菌薄壁離心管內(nèi)混合采用50 μ L擴(kuò)增體系ddH20 41. 5 μ L，10 X buffer 5 μ L， dNTP (2. 5mmol/L) 1 μ L,上下游引物 2 (20 μ mol/L)各 0· 5 μ L，DNA 模板 1 μ L, TaqDNA 聚合酶 0. 5 μ L.擴(kuò)增條件為94°C 2min, 1 個(gè)循環(huán):94V 40s, 58°C，40s, 72°C，2min, 30 個(gè)循環(huán)；最后 1個(gè)循環(huán)為720C IOmin。將所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物約為1. 91Λ。PCR 產(chǎn)物用DNA純化試劑盒(天根公司)進(jìn)行純化。具體步驟參考DNA產(chǎn)物純化試劑盒說(shuō)明書(shū)。純化的產(chǎn)物經(jīng)限制酶BamH I和Sph I雙酶切，雙酶切步驟如下按以下次序， 將各成分在薄壁管內(nèi)混合采用50yL體系，ddH2013 μ L,10Xbuffer 5yL，PCR純化產(chǎn)物30 μ L，BamH I和Sph I酶各1 μ L，混勻，稍離心之后置37°C水浴鍋保溫3_4h，65°C保溫20min滅酶活。酶切產(chǎn)物加入2. 5倍體積的無(wú)水乙醇，1/10倍體積的3mol/L的醋酸鈉，-20°C冰箱放置20min，12000r/min，4°C離心lOmin，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌，晾干，用30yL IXTE溶解即可得到兩端是粘性末端的α-淀粉酶基因片段。然后連接到同樣雙酶切線性化的PWB980載體上在1.5mL離心管中加入12 μ L純化的DNA，4 μ L線性 冊(cè)980載體，2 4 1^ IOX連接酶buffer，lyL T4 DNA連接酶，加水至總體積為20 μ L，16°C 連接過(guò)夜。實(shí)施例4 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌
按下述方法制備枯草芽孢桿菌WB600 [購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)高校工業(yè)微生物資源資源和信息中心(CICIMB 0132)]的感受態(tài)細(xì)胞。1)將菌種接種在LB平板上37°C培養(yǎng)過(guò)夜。2)用接種環(huán)接一環(huán)菌苔于5mL GM I溶液，在30°C慢搖床(125r/min)振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。3)次日取 2mL 轉(zhuǎn)接至Ij 18mL GM I 中，37°C快搖床(250r/min)培養(yǎng) 3. 5h。4)再取IOmL上一步驟的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到90mL GM II中，37°C慢搖床培養(yǎng)90min后 5，000g, IOmin離心收集菌體。5)用IOmL原培養(yǎng)液上清液輕輕懸浮菌體，懸浮后的菌體即為感受態(tài)細(xì)胞可以直接用來(lái)轉(zhuǎn)化。6)感受態(tài)細(xì)胞的保存加30%的滅菌甘油至終濃度為10%，混勻后分裝到離心管中(0. 5mL/tube)，隨即放到_70°C保存。7)轉(zhuǎn)化時(shí)取出離心管，放在45°C水浴中溶化，然后在0.5mL菌液中加入適量 DNA( lug/ml)。8)于37°C振蕩(200r/min)保溫30min后涂布相應(yīng)抗性平板，再在37 °C培養(yǎng)過(guò)夜， 次日檢查和驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子?？莶輻U菌普通化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞制備用試劑[1]10X 最低鹽溶液=K2HPO4 70g,KH2PO4 30g, (MM)2SO4 10g，(Na3C6H5O7 '2H20)5g, MgSO4 · 7H20 lg，在蒸餾水中依次溶解，加水至500mL。[2]氨基酸溶液(根據(jù)不同菌株的基因缺陷型準(zhǔn)備)10mg/mL，貯于棕色瓶?jī)?nèi)， 113°C滅菌30min，用黑紙包裹。[3]GM I溶液1X最低鹽溶液95. 6mL，20%葡萄糖2. 5mL，5%水解酪蛋白0. 4mL， 10% 酵母汁 lmL，10mg/mL 氨基酸溶液 0. 5mL (50 μ g/mL)。[4]GM I溶液1X最低鹽溶液96.98mL，20%葡萄糖2. 5mL，5%水解酪蛋白 0. 08mL, 10%酵母汁0. 04mL, IM MgC120. 25mL(2. 5mM)，IM CaC120. 05mL(0. 5mM)，lOmg/mL氨基酸溶液 0. ImL (5 μ g/mL) 0將實(shí)施例3的連接混合物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600的感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法如下 取出-70°C低溫冰箱保存的裝有感受態(tài)的離心管，放在45°C水浴中溶化，然后在0. 5mL菌液中加入連接混合物，于37°C振蕩(200r/min)保溫30min后涂布卡那霉素抗性平板，再在 37 0C培養(yǎng)過(guò)夜，次日檢查和驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子?？莶菅挎邨U菌轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒的提取和檢測(cè)如下接種轉(zhuǎn)化子一環(huán)于5mL含5 μ g/mL 卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)16h)。12000r/min離心 Imin 收集菌體，用 180yL 的 TET 溶液(ΤΕΤ 配方50Mm Tri s_HCL，pH8. 0，IMmNa2EDTA, 0. 1% 的Triton-100)懸浮細(xì)胞，加入20 μ L用TET溶液配制的溶菌酶(濃度為40mg/Ml)，37°C 保溫lh。4000r/min離心IOmin收集菌體，棄上清，沉淀用質(zhì)粒DNA提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提，具體步驟參考質(zhì)粒提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)。提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sph I 進(jìn)行酶切鑒定，測(cè)序。構(gòu)建了枯草芽孢桿菌重組表達(dá)載體PWB980-ACN7-2，構(gòu)建示意圖如圖 4。其序列見(jiàn) SEQ ID NO =Ilo枯草芽孢桿菌重組表達(dá)載體pWB980-ACN7-2DNA序列(SEQ ID NO: 11)
agaacctaaaaagaacgaatttgaactaactcataaccgagaggtaaaaaaagaacgaagtcgagatca gggaatgagtttataaaataaaaaaagcacctgaaaaggtgtctttttttgatggttttgaacttgttctttcttat cttgatacatatagaaataacgtcatttttattttagttgctgaaaggtgcgttgaagtgttggtatgtatgtgttt taaagtattgaaaacccttaaaattggttgcacagaaaaaccccatctgttaaagttataagtgactaaacaaataa ctaaatagatgggggtttcttttaatattatgtgtcctaatagtagcatttattcagatgaaaaatcaagggtttta gtggacaagacaaaaagtggaaaagtgagaccatggagagaaaagaaaatcgctaatgttgattactttgaacttct gcatattcttgaatttaaaaaggctgaaagagtaaaagattgtgctgaaatattagagtataaacaaaatcgtgaaa caggcgaaagaaagttgtatcgagtgtggttttgtaaatccaggctttgtccaatgtgcaactggaggagagcaatg aaacatggcattcagtcacaaaaggttgttgctgaagttattaaacaaaagccaacagttcgttggttgtttctcac attaacagttaaaaatgtttatgatggcgaagaattaaataagagtttgtcagatatggctcaaggatttcgccgaa tgatgcaatataaaaaaattaataaaaatcttgttggttttatgcgtgcaacggaagtgacaataaataataaagat aattcttataatcagcacatgcatgtattggtatgtgtggaaccaacttattttaagaatacagaaaactacgtgaa tcaaaaacaatggattcaattttggaaaaaggcaatgaaattagactatgatccaaatgtaaaagttcaaatgattc gaccgaaaaataaatataaatcggatatacaatcggcaattgacgaaactgcaaaatatcctgtaaaggatacggat tttatgaccgatgatgaagaaaagaatttgaaacgtttgtctgatttggaggaaggtttacaccgtaaaaggttaat ctcctatggtggtttgttaaaagaaatacataaaaaattaaaccttgatgacacagaagaaggcgatttgattcata cagatgatgacgaaaaagccgatgaagatggattttctattattgcaatgtggaattgggaacggaaaaattatttt attaaagagtagttcaacaaacgggccagtttgttgaagattagatgctataattgttattaaaaggattgaaggat gcttaggaagacgagttattaatagctgaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaa aattatctgaaaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaagaatgaagattgttcat gaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgttaaggctattggtgtttatggctctcttggtcgtca gactgatgggccctattcggatattgagatgatgtgtgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatgga caaccggtgagtggaaggtggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcaggtggaatca gattggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgattcaggtggatacttagagaaagtgta tcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttccacgatgcgatttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaat atgcaggcaaatggcgtaatattcgtgtgcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatg gcaggtgccatgttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtcttaactgaagcagttaa gcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcgtaatgtctggtcaactttccgactctgagaaac ttctggaatcgctagagaatttctggaatgggattcaggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtca aaacgcataccattttgaacgatgacctctaataattgttaatcatgttggttacgtatttattaacttctcctagt attagtaattatcatggctgtcatggcgcattaacggaataaagggtgtgcttaaatcgggccattttgcgtaataa gaaaaaggattaattatgagcgaattgaattaataataaggtaatagatttacattagaaaatgaaaggggatttta tgcgtgagaatgttacagtctatcccggcattgccagtcggggatattaaaaagagtataggtttttattgcgataa actaggtttcactttggttcaccatgaagatggattcgcagttctaatgtgtaatgaggttcggattcatctatggg aggcaagtgatgaaggctggcgctctcgtagtaatgattcaccggtttgtacaggtgcggagtcgtttattgctggt actgctagttgccgcattgaagtagagggaattgatgaattatatcaacatattaagcctttgggcattttgcaccc caatacatcattaaaagatcagtggtgggatgaacgagactttgcagtaattgatcccgacaacaatttgattagct tttttcaacaaataaaaagctaaaatctattattaatctgttcagcaatcgggcgcgattgctgaataaaagatacg agagacctctcttgtatcttttttattttgagtggttttgtccgttacactagaaaaccgaaagacaataaaaattttattcttgctgagtctggctttcggtaagctagacaaaacggacaaaataaaaattggcaagggtttaaaggtgga gattttttgagtgatcttctcaaaaaatactacctgtcccttgctgatttttaaacgagcacgagagcaaaaccccc ctttgctgaggtggcagagggcaggtttttttgtttcttttttctcgtaaaaaaaagaaaggtcttaaaggttttat ggttttggtcggcactgaattcgagctcagcattattgagtggatgattatattccttttgataggtggtatgtttt cgcttgaacttttaaatacagccattgaacatacggttgatttaataactgacaaacatcaccctcttgctaaagcg gccaaggacgctgccgccggggctgtttgcgtttttgccgtgatttcgtgtatcattggtttacttatttttttgcc aaagctgtaatggctgaaaattcttacatttattttacatttttagaaatgggcgtgaaaaaaagcgcgcgattatg taaaatataaagtgatagcggtaccaggagggctggaagaagcagaccgctaacacagtacataaaaaaggagacat gaacgatgaacatcaaaaagtttgcaaaacaagcaacagtattaacctttactaccgcactgctggcaggaggcgca actcaagcttttgcctcgagctcggtacccggggatccaggaaactgcaaacaaatcgaatgaggtgaccgattcat cggtcaaaaacgggaccatccttcatgcatggaattggtcattcaatacgttaacacaaaatatgaaagagattcgt gatgcgggttatgcagccattcagacgtctccgattaaccaagtaaaggaagggaaccaaggagataaaagcatgtc gaactggtactggctctatcagccgacatcgtaccaaatcggcaaccgttacttaggcactgaacaagaatttaagg acatgtgtgcagccgcggaaaagtatggcgtaaaagtcattgtcgatgcggttgtcaatcataccaccagcgattat ggcgcgatttctgatgagattaagcgtattccaaactggacccatggaaacacacaaattaaaaattggtcggacgg atgggacatcactcaaaatgcattgcttgggctgtatgattggaatactcagaatactgaggtgcaagcctacctga aaggtttcttggaaagagcattgaatgacggagcagacgggttccgctatgatgccgccaagcatatagagcttccg gatgatgggaattacggcagccaattttggccgaatatcacaaatacatcggcggagttccaatacggagaaatcct gcaagacagcgcgtccagagatactgcttatgcgaattatatgaatgtgacggcttctaactatgggcattccatca gatccgctttaaagaatcgtaatctgagtgtgtcgaatatctcccattatgcatctgatgtgtctgcggacaagtta gtcacatgggtggaatcacatgatacgtatgccaatgatgatgaagagtccacatggatgagtgatgacgatattcg tttaggctgggcagtgattggttcccgctcaggaagcacgcctcttttcttttccagacctgagggcggaggaaatg gtgtaagatttcccggaaaaagtcaaataggagatcgcgggagcgccttatttaaagaccaggcgatcactgcggtc aatcaatttcacaatgaaatggccgggcagcctgaggaactctcaaatccgaatggcaacaatcaaatatttatgaa tcagcgcggctcaaaaggcgttgtgctggcaaatgcaggatcgtcttctgtcaccatcaatacttcaacgaaattac ctgacggcaggtatgataatagggccggcgccggttcatttcaagtagcgaacggcaaactgacaggtacgatcaat gccagatccgcggctgttctttatcctgatgatattggaaatgcgcctcatgtctttcttgagaattaccaaacaga ggcagtccattctttcaatgatcagctgacggtcaccctgcgtgcaaatgcgaaaacaacaaaagccgtttaccaaa tcaataatgggcagcagacagcatttaaggatggagaccgattaacgatcgggaaagaagatccaatcggcacgaca tacaacattaaattaaccggaacgaacggcgagggtgcagcgagaacccaagaatacacgtttgtcaaaaaagaccc gtcccaaaccaacatcattgggtatcaaaatccggatcattggggacaggtaaatgcttatatctataaacatgatg gaggcggggccatagaagataccggatcatggccggggaaagccatgaccaagaatgcagatggaatgtacacgctg acgctgcctgagaatgcggatacggccgacgccaaagtgatttttaacaatggcagcgcccaagtgcccggccagaa ccagcccggctttgattatgtgcagaatggtttgtataacaactccggtttgaatggttatcttccgcatgcatgca agctagcttcagcacaattccaagaaagacacgattt實(shí)施例5 枯草芽孢桿菌重組菌株中α -淀粉酶基因的表達(dá)及純化α -淀粉酶突變體接種一環(huán)重組枯草芽孢桿菌于5mL含5 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。接種ImL菌液于IOOmL含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)30h。表達(dá)產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖見(jiàn)圖5。分泌的α-淀粉酶用以下方法純化上清邊攪拌邊加入硫酸銨至1. 3M，4°C冰箱靜置lh，8000r/min，4°C離心收集沉淀，沉淀用0. IM Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH6. 0溶解，裝入透析袋，在20mM的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中進(jìn)行透析除鹽，之后加入丙烯葡聚糖凝膠S300凝膠柱，用洗脫液洗脫即可得到所需的耐酸 α -淀粉酶突變體。α -淀粉酶突變體性能測(cè)定1)測(cè)定α -淀粉酶突變體最適ρΗ值重組菌株表達(dá)之后，12000r/min離心IOmin去除細(xì)胞，收集上清液，然后按實(shí)施例 5的方法純化酶液，得到的純酶液達(dá)到90%以上的純度，用于測(cè)定酶活力。酶活單位定義 在相應(yīng)反應(yīng)條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化等價(jià)于1 μ mol葡萄糖的還原糖所需的酶量。以IU表示。測(cè)定方法如下將500 μ L ρΗ 6.0檸檬酸緩沖液配制的0. lg/L的可溶性淀粉置于65°C水浴保溫5min，加入10 μ L純酶液反應(yīng)5min，DNS法測(cè)定生成還原糖的量表 權(quán)利要求
1.耐酸中溫α-淀粉酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟步驟Al，前體α-淀粉酶基因的擴(kuò)增提取枯草芽孢桿菌染色體DNA，根據(jù)Genbank中已報(bào)道的枯草芽孢桿菌淀粉酶基因?yàn)橐罁?jù)，設(shè)計(jì)如下引物上游引物 Fl :5，-GCGCGAATTCGGAAACTGCAAACAAATCGAATGAGGTG-3> (SEQ ID NO 1) 下游引物 Rl :5，-CGCGAAGCTTATGCGGAAGATAACCATTCAAACCGG-3’ (SEQ ID NO 2)； PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、雙酶切后，連接到同樣經(jīng)雙酶切線性化的pET-22b，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109，得到 pET22-ACN7 ；步驟A2，前體α-淀粉酶的的定點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)含突變氨基酸殘基的互補(bǔ)引物如下 引物 1 :5，-TTGGTCGGACGGATGGGACATCACT-3，(SEQ ID NO 4) 引物 2 :5，-AGTGATGTCCCATCCGTCCGACCAA-3，(SEQ ID NO 5) 引物 3 :5，-GGGCCATAGAAGATACCGGATCATG-3，(SEQ ID NO 6) 引物 4 :5，-CATGATCCGGTATCTTCTATGGCCC-3，(SEQ ID NO 7)以重組質(zhì)粒PET22-ACN7為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按以下次序，將各成分在薄壁離心管內(nèi)混合PCR1 采用 50μ L 體系，ddH2038. 5 μ L, IOXbuffer 5 μ L, dNTP (2. 5mmol/L) 2 μ L， 引物 l(20ymol/L)2y L，引物 2(20ymol/L)2y L，DNA 模板 1 μ L，pfu 高保真 DNA 聚合 Bl 0. 5 μ L0 擴(kuò)增條件為:94°C 2min，l 個(gè)循環(huán)；94 °C 40s, 60 °C, 40s, 72 °C, 2min, 20 個(gè)循環(huán)；最后 1 個(gè)循環(huán)為 72°C 7min。PCR2 采用 50 μ L 體系，ddH2038. 5M1，IOXbuffer 5 μ L, dNTP (2. 5mmol/L)2y L,引物 3 (20 μ mol/L) 2 μ L，弓| 物 4 (20 μ mol/L) 2 μ L，DNA 模板 1 μ L, pfu高保真DNA聚合酶0. 5 μ L.擴(kuò)增條件為94°C anin，l個(gè)循環(huán)；94°C 40s, 60 °C, 40s, 72°C，2min，20個(gè)循環(huán)；最后1個(gè)循環(huán)為72°C 7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-10感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆，經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，最終得到含有突變?chǔ)?-淀粉酶基因的重組表達(dá)載體PET-ACN7-2 ；步驟A3，突變?chǔ)?-淀粉酶表達(dá)載體的構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)載體采用PWB980，設(shè)計(jì)如下引物上游引物 F2 :5，-CGCGGATCCAGGAAACTGCAAACAAATCGAATGAGGTG-3，(SEQ ID NO 9)； 下游引物 R2 :5，-CGCGGCATGCATGCGGAAGATAACCATTCAAACCGG-3，(SEQ ID NO 10)； 以重組表達(dá)載體PETCN7-2為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按以下次序，將各成分在滅菌薄壁離心管內(nèi)混合采用 50μ L 擴(kuò)增體系ddH20 41. 5 μ L, IOXbuffer 5 μ L, dNTP (2. 5mmol/ L) 1 μ L，上下游引物 2 (20 μ mol/L)各 0· 5 μ L，DNA 模板 1 μ L，TaqDNA 聚合酶 0. 5 μ L.擴(kuò)增條件為94°C anin，l個(gè)循環(huán)；94°C 40s，58°C，40s，72°C，2min，30個(gè)循環(huán)；最后1個(gè)循環(huán)為 72 °C IOmin ；將所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、純化、雙酶切，然后連接到同樣雙酶切線性化的pWB980載體上在1. 5mL離心管中加入12 μ L純化的DNA，4 μ L線性pWB980載體， 2 μ L IOX連接酶buffer，1 μ L T4 DNA連接酶，加水至總體積為20 μ L，16°C連接過(guò)夜；步驟A4，表達(dá)載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，將步驟A3的連接混合物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌 WB600的感受態(tài)細(xì)胞，枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamH I 和Sph I進(jìn)行酶切鑒定，測(cè)序，構(gòu)建了枯草芽孢桿菌重組表達(dá)載體pWB980-ACN7-2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法得到的耐酸中溫α-淀粉酶，其特征在于，編碼耐酸中溫α -淀粉酶的突變體的DNA序列為SEQ ID NO :8。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了耐酸中溫α-淀粉酶及其制備方法，包括以下步驟步驟A1，前體α-淀粉酶基因的擴(kuò)增步驟A2，前體α-淀粉酶的的定點(diǎn)突變；步驟A3，突變?chǔ)?淀粉酶表達(dá)載體的構(gòu)建；步驟A4，表達(dá)載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌。應(yīng)用本發(fā)明獲得的重組體菌株可以進(jìn)行耐酸性α-淀粉酶突變體的工業(yè)化生產(chǎn)，在有選擇壓力的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組體細(xì)胞，無(wú)需經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，上清用硫酸銨沉淀，沉淀透析除鹽之后加入丙烯葡聚糖凝膠S300凝膠柱，用洗脫液洗脫即可得到所需的耐酸α-淀粉酶突變體。
文檔編號(hào)C12N15/56GK102260694SQ20111018224
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月1日
發(fā)明者廖思明, 朱婧, 王成華, 王青艷, 申乃坤, 秦艷, 謝能中, 陳東, 黃日波, 黎貞崇 申請(qǐng)人:廣西科學(xué)院