一種非診斷目的的hiv抗體免疫檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種非診斷目的的HIV抗體免疫檢測(cè)方法及試劑盒，該方法包括：使HIV抗原特異性地捕獲檢測(cè)樣本中的HIV抗體，然后加入生物素標(biāo)記二抗，孵育形成抗原?抗體?生物素標(biāo)記二抗復(fù)合物；在鏈霉親和素存在的條件下，加入生物素化引物Biotin?I，孵育使所述復(fù)合物與Biotin?I結(jié)合，然后加入生物素化的發(fā)卡鏈Biotin?H1和發(fā)夾鏈H2進(jìn)行雜交反應(yīng)；加入親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶，催化底物液顯色，通過(guò)測(cè)定吸光度進(jìn)行HIV抗體的定量檢測(cè)。本發(fā)明將HCR引入了ELISA，利用HCR進(jìn)行信號(hào)放大，實(shí)現(xiàn)了HIV抗體的超靈敏檢測(cè)，檢測(cè)下限低至9.5pg/mL，比傳統(tǒng)ELISA約提高2個(gè)數(shù)量級(jí)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種非診斷目的的ΗIV抗體免疫檢測(cè)方法及試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，尤其涉及一種非診斷目的的檢測(cè)hiv抗體的方法 及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類(lèi)免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)是引起獲得性免疫缺 陷綜合癥(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)的病原體。HIV抗體是HIV病毒進(jìn) 入人體后由人體免疫應(yīng)答反應(yīng)所產(chǎn)生，這種抗體對(duì)HIV病毒基本無(wú)效，但可一定程度上反應(yīng) HIV的感染狀態(tài)，是人體一項(xiàng)生理指標(biāo)。
[0003] 檢測(cè)血液中的HIV抗體是目前最常用的檢測(cè)艾滋病病毒感染的實(shí)驗(yàn)室方法，一般 要經(jīng)過(guò)兩個(gè)步驟:首先做初篩試驗(yàn)，如果為陽(yáng)性，再做確認(rèn)試驗(yàn)，確認(rèn)試驗(yàn)陽(yáng)性才可診斷為 艾滋病病毒感染。
[0004] 目前，用于HIV抗體篩查試驗(yàn)的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-1 inked immunoadsordent assay，ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)（chemiluminescence immunoassay，CLIA)、明膠顆粒凝集試驗(yàn)（gelatin particles agglutinate experiment， GPAT)、斑點(diǎn)免疫膠體金快速試驗(yàn)等。GPAT和斑點(diǎn)免疫膠體金快速試驗(yàn)等方法通過(guò)肉眼判斷 結(jié)果較為主觀，且價(jià)格昂貴、結(jié)果不易保存。CLIA缺點(diǎn)在于標(biāo)記催化酶或化學(xué)發(fā)光分子的發(fā) 光反應(yīng)不穩(wěn)定，為間斷的、閃爍性發(fā)光，而且在反應(yīng)過(guò)程中易發(fā)生裂變，導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)果不穩(wěn) 定。此外，檢測(cè)時(shí)需對(duì)結(jié)合相、游離相進(jìn)行分離，操作步驟多，測(cè)試成本高。ELISA仍是臨床上 最常用的檢測(cè)HIV抗體的方法，它具有靈敏、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)，然而ELISA的檢測(cè)下限仍具 有局限性，不能滿(mǎn)足感染早期低濃度的HIV抗體水平的檢測(cè)。
[0005] 雜交鏈反應(yīng)(hybridization chain reaction，HCR)是一種新型高效的核酸擴(kuò)增 方法，HCR可以在無(wú)酶的條件下實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)CN103940989A公開(kāi)了一 種基于HCR和單分子計(jì)數(shù)的免疫熒光技術(shù)檢測(cè)TNF-α。已有HIV抗體篩查方法仍存在諸多問(wèn) 題，需要建立檢測(cè)靈敏高、便捷的檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種HIV抗體免疫檢測(cè)方法及試劑盒，以降低 HIV抗體的檢測(cè)下限濃度，提高檢測(cè)靈敏度。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)HCR體系引入ELI SA進(jìn)行信號(hào)放大來(lái)實(shí)現(xiàn)HIV 抗體的檢測(cè)。該方法利用間接法ELISA捕獲血清中的HIV抗體，通過(guò)生物素-親和素系統(tǒng)引入 HCR體系，HCR體系在常溫下進(jìn)行擴(kuò)增，形成DNA雙鏈聚合物。該聚合物標(biāo)記了生物素，可以和 親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合，從而進(jìn)行顯色檢測(cè)。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:一種非診斷目的的HIV抗體免疫檢測(cè) 方法，包括：
[0009] 使HIV抗原特異性地捕獲檢測(cè)樣本中的HIV抗體，然后加入生物素標(biāo)記二抗，孵育 形成抗原-抗體-生物素標(biāo)記二抗復(fù)合物；
[0010]在鏈霉親和素存在的條件下，加入生物素化引物Biotin-I，孵育使所述復(fù)合物與 Biotin-I結(jié)合，然后加入生物素化的發(fā)卡鏈Biotin-Hl和發(fā)夾鏈H2進(jìn)行雜交反應(yīng)；
[0011] 加入親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶，催化底物液顯色，通過(guò)測(cè)定吸光度進(jìn)行HIV抗 體的定量檢測(cè)；
[0012] 所述Biotin-I堿基序列為5'-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC TTT TTT TTT T-biotin-3,；
[0013] 所述Biotin-Hl堿基序列為5'-GTA GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA CAA AGT TCT CAA GGA CCA CCG CAT-biotin-3'；
[0014] 所述H2的堿基序列為5'-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC ATG CGG TGG TCC TTG AGA ACT TTG-3'。
[0015] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，將HIV抗原包被于酶標(biāo)板上，用封閉液處理后，將含有HIV 抗體的檢測(cè)樣本加入微孔板，36~38 °C溫育，使HIV抗原特異性地捕獲HIV抗體;加入生物素 化羊抗人IgG在36~38°C溫育，在微孔板上形成抗原-抗體-生物素標(biāo)記二抗復(fù)合物。
[0016] 所述生物素標(biāo)記二抗可以為生物素化的羊抗人IgG或生物素化的鼠抗人IgG。
[0017] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，Biotin-Hl和H2先經(jīng)下述預(yù)處理：經(jīng)95~98°C水浴1~ 3min后，立即冰浴。
[0018] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，免疫反應(yīng)之后，向微孔板中加入鏈霉親和素在36~38°C 溫育，甩去孔中液體后拍干，加入Biotin-I在36~38°C溫育，使所述復(fù)合物與Biotin-I結(jié) 合。
[0019] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，加入Biotin-Hl和H2,室溫下反應(yīng)1~3h，使Biotin-Hl和 H2打開(kāi)發(fā)夾結(jié)構(gòu)、交替雜交，形成有缺口的雙鏈DNA聚合物。
[0020] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，加入親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶在36~38°C溫育后倒 出液體，加入底物緩沖液及底物液在36~38°C溫育，再加入終止液，混勻后比色。
[0021 ]本發(fā)明還提供一種HIV抗體免疫檢測(cè)試劑盒，包括：
[0022] HIV抗原、生物素標(biāo)記二抗、鏈霉親和素、生物素化引物Biotin-I、生物素化的發(fā)卡 鏈Biotin-Hl、發(fā)夾鏈H2和親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶；
[0023] 所述Biotin-I堿基序列為5'-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC TTT TTT TTT T-biotin-3,；
[0024] 所述Biotin-Hl堿基序列為5'-GTA GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA CAA AGT TCT CAA GGA CCA CCG CAT-biotin-3'；
[0025] 所述H2的堿基序列為5'-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC ATG CGG TGG TCC TTG AGA ACT TTG-3'。
[0026] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述HIV抗原濃度為80~120ng/mL;
[0027] 所述生物素標(biāo)記二抗?jié)舛葹?.0~2.0yg/mL;
[0028] 所述鏈霉親和素濃度為0.8~1.2yg/mL;
[0029] 所述Biotin-I濃度為4~6nM，配置時(shí)加入SPSC緩沖液；
[0030] 所述Biotin-Hl和H2濃度均為80~120nM，配置時(shí)加入SPSC緩沖液；
[0031]所述親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶濃度為18~22yg/mL。
[0032] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，還包括包被液、封閉液、洗液、底物液、底物緩沖液和終止 液;包被液為含80~120ng/mL HIV抗原的8~12mM PBS緩沖液;封閉液為含鮭魚(yú)精DNA 40~ 60yg/mL的0 · 8~1 · 2 % BSA 溶液。
[0033] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0034] (l)HCR是利用一組互補(bǔ)的、動(dòng)力學(xué)受限的發(fā)夾探針來(lái)實(shí)現(xiàn)雜交的鏈反應(yīng)，它是在 等溫、無(wú)酶的條件下進(jìn)行的，穩(wěn)定而廉價(jià)。本發(fā)明將HCR引入了ELISA，本發(fā)明中抗體與酶是 一對(duì)多的關(guān)系，在利用抗原抗體反應(yīng)保證檢測(cè)特異性的同時(shí)，利用HCR進(jìn)行信號(hào)放大，實(shí)現(xiàn) 了 HIV抗體的超靈敏檢測(cè)，檢測(cè)下限低至9.5pg/mL，比傳統(tǒng)ELISA約提高2個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0035] (2)本方法操作簡(jiǎn)便，無(wú)需特殊儀器，且具有易于自動(dòng)化、穩(wěn)定性強(qiáng)、毒性低等特 點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1是本發(fā)明HCR-ELISA檢測(cè)HIV抗體的原理示意圖；
[0037] 圖2是傳統(tǒng)ELISA和HCR-ELISA定量檢測(cè)不同濃度HIV抗體的結(jié)果對(duì)比；
[0038]圖3是40例臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0039]本發(fā)明所述"室溫"具有本領(lǐng)域公知的含義，具體是指20-30°C，優(yōu)選20-25Γ。
[0040]圖1是本發(fā)明HCR-ELISA檢測(cè)HIV抗體的原理示意圖。HIV抗原包被于微孔板上，特 異性地捕獲血清中的HI V抗體。加入生物素化的羊抗人IgG(免疫球蛋白G)后，在微孔板上形 成了抗原-抗體-生物素羊抗人IgG復(fù)合物。在鏈霉親和素存在的條件下，通過(guò)生物素-親和 素之間的作用，這些復(fù)合物可進(jìn)一步與生物素標(biāo)記的引發(fā)鏈I(Biotin-I)結(jié)合。加入發(fā)夾H1 和H2，引發(fā)鏈可催化H1和H2打開(kāi)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，H1和H2交替雜交，形成有缺口的雙鏈DNA聚合物， 加入SA-HRP，該酶催化底物液顯色，使信號(hào)得以放大顯色。因此利用簡(jiǎn)易的紫外分光光度計(jì) 即可對(duì)血清中的抗體進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0041]在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的一種基于雜交鏈反應(yīng)的HIV抗體免疫檢測(cè)方 法，包括以下步驟：
[0042] (1)間接法ELISA捕獲檢測(cè)樣本中的HIV抗體:將HIV抗原包被于微孔板上，冷藏過(guò) 夜。加入封閉液室溫放置2~4h后棄去封閉液，拍干冷藏備用。將檢測(cè)樣本加入微孔板，36~ 38°C溫育0.5~lh，HIV抗原可特異性地捕獲血清中的HIV抗體。加入生物素化羊抗人IgG 36 ~38°C溫育0.5~lh后，在微孔板上形成抗原-抗體-生物素鼠抗人IgG復(fù)合物。每步反應(yīng)之 后均用PBST洗液洗板，以除去未結(jié)合的試劑；
[0043] (2)基于HCR信號(hào)放大的免疫檢測(cè)技術(shù):免疫反應(yīng)之后，向微孔板中加入的鏈霉親 和素，36~38°C溫育20~40min。甩去孔中液體后拍干，加入Biotin-I，36~38°C溫育20~ 40min后洗板，加入Biotin-Hl和H2,混勻，室溫下放置使其反應(yīng)1~3h。洗板除去未結(jié)合的發(fā) 夾鏈；
[0044] (3)顯色及信號(hào)檢測(cè)：加入親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶，36~38°C溫育20~ 40min，洗板后充分拍干，加入底物緩沖液及底物液，36~38 °C溫育20~40分鐘。加入終止 液，混勻后比色。
[0045] 其中，HIV抗原濃度為80~120ng/mL;生物素標(biāo)記二抗?jié)舛葹?.0~2. Oyg/mL;鏈霉 親和素（SA)濃度為0.8~1.2以8/11^;8丨〇^11-1濃度為4~61^，配置時(shí)加入3?3(：緩沖液； Biotin-Hl和H2濃度為80~120nM，配置時(shí)加入SPSC緩沖液;親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶 (SA-HRP)的濃度為 18 ~2 2yg/mL。
[0046] 所述生物素化引物(Biotin-I)的堿基序列為5'-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC TTT TTT TTT T-biotin-3'，如SEQ ID N0.1 所示；
[0047] 所述生物素化的發(fā)卡鏈HI (Biotin-Hl)的堿基序列為5'-GTA GAG ATG CGG TGG TCCTTGAGACAAAGTTCTCAAGGACCACCGCAT-biotinHnSEQIDN0.2m*;
[0048] 所述發(fā)夾鏈H2的堿基序列為5'-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC ATG CGG TGGTCCTTGAGAACTTTGHnSEQIDN0.3K*。
[0049] 步驟（2)中Biotin-Hl和H2需如下預(yù)處理：經(jīng)95~98°C沸水浴1~3min后，立即冰 浴，冷藏保存?zhèn)溆谩Ｖ蠓锌墒拱l(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)成為單鏈DNA。
[0050] 下面結(jié)合附圖和一個(gè)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0051 ] 實(shí)施例1
[0052] 實(shí)施例中用到的各種溶液配方如下：
[0053] 磷酸鈉-氯化鈉緩沖溶液（sodium phosphate-sodium chloride buffer solution，SPSC)(50mM Na2HP〇4/1.0M NaCl):17.9g的Na2HP〇4· 12H20,58.5g的NaCl加少許 超純水溶解，用鹽酸調(diào)pH至7.5，定容至100mL。
[0054] 10mM磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS)(pH=7.4) :8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HP〇4· 12H20、0.24g KH2P〇4溶解到1L超純水中，用鹽酸調(diào)節(jié)ρΗ=7·4,高壓滅 菌后4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0055] Biotin-I的配制：將按已知序列合成的3.3nmol Biotin-I用33μ1超純水溶解至 1〇〇μΜ，并用SPSC緩沖液稀釋至5ηΜ。分裝，_20°C冷凍保存?zhèn)溆茫褂们氨苊夥磸?fù)凍融。
[0056] Biotin-Hl和H2的配制：將按已知序列合成的2.1nmol H1用21μ1超純水溶解， 2.2nmol Η2用21μ1超純水溶解，用SPSC緩沖液稀釋至100恤。-20°(：冷凍保存?zhèn)溆茫褂们氨?免反復(fù)凍融。
[0057]所用到的洗液、底物緩沖液、底物液和終止液，為ELI SA的常用試劑。
[0058]本實(shí)施例的基于雜交鏈反應(yīng)的HIV抗體免疫檢測(cè)方法，具體步驟如下：
[0059](一）間接法ELISA捕獲檢測(cè)樣本中的HIV抗體：
[0060] (l)Biotin-Hl 和 H2 預(yù)處理：100nM 的 Biotin-Hl 和 H2 經(jīng) 98°C 沸水浴 2min 后，立即冰 浴，保存在4°C備用；
[0061 ] (2)將100ng/mL的HIV抗原溶液(含有HIV抗原100ng/mL的10mM PBS溶液)注入96孔 聚苯乙烯微孔板中，每孔200yL，4°C過(guò)夜；甩去包被液，每孔加入封閉液(含鮭魚(yú)精DNA 50μ g/mL的1 % BSA溶液)200yL，室溫放置2h后棄去封閉液，拍干4 °C冷藏備用；
[0062] (3)將100yL含有不同濃度的HIV抗體的樣本加入微孔板，37°C水浴箱溫育lh;
[0063] (4)甩去孔中液體后，PBST洗板1次，浸泡60 s，拍干，加入100yL 1 · 5yg/mL (1:4000) 生物素化羊抗人IgG溶液，37 °C水浴箱溫育lh;
[0064] (二)基于HCR信號(hào)放大的免疫檢測(cè)技術(shù)：
[0065] (5)甩去微孔中液體后，TOST洗板1次，浸泡60s，拍干，加入100yL lyg/mL的SA，37 °C水浴箱溫育30min;
[0066] (6)甩去孔中液體后拍干，加入100yL 5nM的Biotin-I，37°C溫育30min;
[0067] (7)甩去孔中液體后，常規(guī)洗液洗一遍，浸泡60s，拍干，加入40nM的Biotin-Hl和H2 各50yL，混勻，室溫下放置使其反應(yīng)lh;
[0068] (三）顯色及信號(hào)檢測(cè)：
[0069] (8)甩去孔中液體后，PBST洗板1次，浸泡60s，拍干，加入100yL 20yg/mL的SA-HRP， 37°C溫育30min后倒出液體；
[0070] (9)將含2%的Tween 20的PBS洗液注滿(mǎn)各孔，靜置60s后棄去孔內(nèi)洗液，重復(fù)5次后 拍干即可；
[0071 ] (10)加入底物緩沖液(含過(guò)氧化脲的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液)及底物液(含TMB的溶 液)各50yL，輕輕振蕩混勻，置37 °C水浴箱溫育30分鐘。再加入終止液(2mo 1 /L硫酸溶液)50μ L，混勾后比色；
[0072] (11)反應(yīng)溶液450nm處的吸光度值(0D)使用RT 6100微孔板分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。 室溫下利用UV-2450紫外可見(jiàn)吸收分光光度計(jì)測(cè)量溶液300-700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜。
[0073] 對(duì)該實(shí)施例所建立方法進(jìn)行檢測(cè)性能考察，結(jié)果如下：
[0074]配制不同濃度的HIV抗體樣本，使?jié)舛确謩e為0、10-n、10-1Q、10- 9、10-8g/mL，檢測(cè)方 法同實(shí)施例1，考察450nm處0D值與HIV抗體濃度之間的關(guān)系。結(jié)果表明，當(dāng)HIV抗體濃度在 10_ng/mL至l(T8g/mL的范圍時(shí)，HIV抗體濃度與450nm處吸光度的吸光度值呈擬線(xiàn)性關(guān)系（附 圖2)。若將空白對(duì)照的三倍標(biāo)準(zhǔn)差定義為檢測(cè)下限，該方法檢測(cè)HIV抗體的下限為9.5pg/ mL。對(duì)HIV抗體濃度分別為10- ng/mL、10-1Qg/mL、10-9g/m和10-8g/mL的血清進(jìn)行3次平行測(cè) 定，450nm處吸光度值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1 · 1 %、5 · 3 %、4 · 3 %和4 · 7 %。因此，HCR-ELISA法定量檢測(cè)HI V抗體具有較高的靈敏度和可重復(fù)性。
[0075]采用本發(fā)明實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)40例臨床患者血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與商品化 的HIV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒(珠海麗珠試劑股份有限公司）進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如附圖3所示，兩 種方法檢測(cè)結(jié)果基本一致，說(shuō)明本發(fā)明檢測(cè)HIV抗體具有較好的準(zhǔn)確性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種非診斷目的的HIV抗體免疫檢測(cè)方法，其特征在于包括： 使HIV抗原特異性地捕獲檢測(cè)樣本中的HI V抗體，然后加入生物素標(biāo)記二抗，孵育形成 抗原-抗體-生物素標(biāo)記二抗復(fù)合物； 在鏈霉親和素存在的條件下，加入生物素化引物Biotin-I，孵育使所述復(fù)合物與 Biotin-I結(jié)合，然后加入生物素化的發(fā)卡鏈Biotin-Hl和發(fā)夾鏈H2進(jìn)行雜交反應(yīng)； 加入親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶，催化底物液顯色，通過(guò)測(cè)定吸光度進(jìn)行HIV抗體的 定量檢測(cè)； 所述Biotin-I堿基序列為5'-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC TTT TTT TTT T-biotin-3'； 所述Biotin-Hl堿基序列為5'-GTA GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA CAA AGT TCT CAA GGA CCA CCG CAT-biotin-3'； 所述H2的堿基序列為5'-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC ATG CGG TGG TCC TTG AGA ACT TTG-3,。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的HIV抗體免疫檢測(cè)方法，其特征在于將HIV抗原包被于酶標(biāo)板 上，用封閉液處理后，將含有HI V抗體的檢測(cè)樣本加入微孔板，36~38 °C溫育，使HIV抗原特 異性地捕獲HIV抗體;加入生物素標(biāo)記二抗在36~38 °C溫育，在微孔板上形成抗原-抗體-生 物素標(biāo)記二抗復(fù)合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的HIV抗體免疫檢測(cè)方法，其特征在于所述生物素標(biāo)記二抗 為生物素化的羊抗人IgG或生物素化的鼠抗人IgG。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的HIV抗體免疫檢測(cè)方法，其特征在于Biotin-Hl和H2先經(jīng)下述 預(yù)處理:經(jīng)95~98 °C水浴1~3min后，立即冰浴。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的HIV抗體免疫檢測(cè)方法，其特征在于免疫反應(yīng)之后，向微孔板 中加入鏈霉親和素在36~38 °C溫育，甩去孔中液體后拍干，加入Biotin-I在36~38°C溫育， 使所述復(fù)合物與Biotin-I結(jié)合。6. 根據(jù)權(quán)利要求1、2、4或5所述的HIV抗體免疫檢測(cè)方法，其特征在于加入Biotin-Hl和 H2,室溫下反應(yīng)1~3h，使Biotin-Hl和H2打開(kāi)發(fā)夾結(jié)構(gòu)、交替雜交，形成有缺口的雙鏈DNA聚 合物。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的HIV抗體免疫檢測(cè)方法，其特征在于加入親和素標(biāo)記的辣根過(guò) 氧化物酶在36~38°C溫育后倒出液體，加入底物緩沖液及底物液在36~38°C溫育，再加入 終止液，混勾后比色。8. -種HIV抗體免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括： HIV抗原、生物素標(biāo)記二抗、鏈霉親和素、生物素化引物Biotin-I、生物素化的發(fā)卡鏈 Biotin-Hl、發(fā)夾鏈H2和親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶； 所述Biotin-I堿基序列為5'-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC TTT TTT TTT T-biotin-3'； 所述Biotin-Hl堿基序列為5'-GTA GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA CAA AGT TCT CAA GGA CCA CCG CAT-biotin-3'； 所述H2的堿基序列為5'-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC ATG CGG TGG TCC TTG AGA ACT TTG-3,。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的HIV抗體免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于： 所述HIV抗原濃度為80~120ng/mL; 所述生物素標(biāo)記二抗?jié)舛葹?.0~2. Oyg/mL; 所述鏈霉親和素濃度為〇. 8~1.2yg/mL; 所述Biotin-I濃度為4~6nM，配置時(shí)加入SPSC緩沖液； 所述Biotin-Hl和H2濃度均為80~120nM，配置時(shí)加入SPSC緩沖液； 所述親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶濃度為18~22yg/mL。10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的HIV抗體免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于還包括包被液、封 閉液、洗液、底物液、底物緩沖液和終止液;包被液為含80~120ng/mL HIV抗原的8~12mM PBS緩沖液;封閉液為含鮭魚(yú)精DNA40~60yg/mL的0.8~1.2 % BSA溶液。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK106018805SQ201610562684
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月15日
【發(fā)明人】聶新民, 桂嶸, 董彩霞, 黃蓉, 賀思涵
【申請(qǐng)人】中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院