專利名稱：脂肪酶基因突變庫高通量篩選方法和脂肪酶突變基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及ー種脂肪酶基因突變庫高通量篩選方法及由此篩選得到的新的脂肪酶突變基因。
背景技術(shù)：
脂肪酶(E. C. 3. I. I. 3)亦稱?；视退饷福签`類具有多種催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其它ー些水不溶性酯類的水解、還可以用于催化酯交換反應(yīng)、醇解反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)，以及生物表面活性劑的合成、催化旋光異構(gòu)體的拆分和手性藥物的合成等。脂肪酶在糧油生產(chǎn)、食品エ業(yè)、日用化學(xué)エ業(yè)、油脂化學(xué)エ業(yè)、農(nóng)業(yè)化學(xué)エ業(yè)、造紙エ業(yè)、洗滌劑エ業(yè)、以及藥物合成等許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在油脂生產(chǎn)和油脂化工方面，脂肪酶具有巨大應(yīng)用潛力。利用其專ー性催化性能，改變脂肪酸鏈在甘油酯中的
位置或替換上I個(gè)或多個(gè)新的脂肪酸來修飾酷，將廉價(jià)的油脂原料加工成昂貴的結(jié)構(gòu)脂，如可可脂、0P0,單苷脂和苷ニ脂等。提高脂肪酶的催化比活力，是降低脂肪酶生產(chǎn)成本的有效的途徑之一。本發(fā)明以具有I，3專ー性的米黑根毛霉脂肪酶為研究對象，首先采用易錯(cuò)PCR方法(ep-PCR)，在大腸桿菌中建立脂肪酶突變庫，通過新的高通量篩選方法，對突變庫進(jìn)行篩選，獲得了比活力提高的RML突變脂肪酶和相應(yīng)的突變基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種分離的多肽，所述多肽選自(I)SEQ ID NO :4、6、8、10 或 12 所示氨基酸序列；和(2)在(I)所述的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，但至少保留以SEQ ID NO :2的氨基酸序列編號計(jì)第57位氨基酸殘基為Val，且具有脂肪酶活性的由(I)衍生的多肽。在一具體實(shí)施例中，以SEQ ID NO 2的氨基酸序列編號計(jì)，上述⑵所述的多肽至少還保留ー個(gè)或多個(gè)以下位置上的殘基第67位的Ala、第111位的Thr、第168位的Pro和第65位的Ala。本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸選自(I)編碼本發(fā)明所述多肽的多核苷酸；和(2)與(I)所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。在一具體實(shí)施例中，該多核苷酸編碼如SEQ ID N0:4、6、8、10或12所示的多肽。在一具體實(shí)施例中，該多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO :3、5、7、9或11所示。本發(fā)明提供ー種載體，它含有本發(fā)明所述的多核苷酸。本發(fā)明提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有本發(fā)明所述的載體或多核苷酸。本發(fā)明提供一種篩選脂肪酶的方法，所述方法包括以甘油三酯作為待篩選脂肪酶的底物進(jìn)行酶解并根據(jù)PH指示劑產(chǎn)生的顏色變化篩選出比活力提高的脂肪酶的步驟。在一具體實(shí)施例中，所述方法包括以下步驟(I)提供待篩選的脂肪酶；(2)提供含有pH指示劑和低級烷基羧酸鹽的溶液；(3)將甘油三酯加到步驟⑵的溶液中，得到混合液；(4)將脂肪酶加到步驟(3)所得的混合液中；和(5)觀察混合液顔色的變化，根據(jù)pH指示劑所產(chǎn)生的顏色變化篩選出比活力提高的脂肪酶。在一具體實(shí)施例中，所述甘油三酯為脂肪酸碳鏈長度為12-22的甘油三酷。在一具體實(shí)施例中，所述低級烷基羧酸鹽為長2-6個(gè)碳原子烷基羧酸的IIA族金·屬鹽。在一具體實(shí)施例中，所述pH指示劑選自溴百里酚藍(lán)、苯酚紅、亞甲藍(lán)、中性紅、甲基紅、溴甲酚綠、甲基橙、溴酚藍(lán)、剛果紅或其組合。在一具體實(shí)施例中，所述方法還包括使用野生型脂肪酶作為對照，通過對比待篩選脂肪酶產(chǎn)生的顔色與對照產(chǎn)生的顔色篩選出比活力提高的脂肪酶。在一具體實(shí)施例中，所述方法是使用多孔板進(jìn)行篩選。在一具體實(shí)施例中，所述方法還包括建立脂肪酶突變文庫；表達(dá)突變脂肪酶。在一具體實(shí)施例中，所述方法還包括采用堿滴定法對所篩選得到的脂肪酶進(jìn)行復(fù)篩，篩選出比活力提高的脂肪酶。本發(fā)明提供ー種用于篩選脂肪酶的反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系含有(I)甘油三酯；和(2) pH 指示劑。在一具體實(shí)施例中，所述反應(yīng)體系還含有低級烷基羧酸鹽。在一具體實(shí)施例中，姆200 ii I所述反應(yīng)體系計(jì),所述反應(yīng)體系含有15 25 ill的PH指示劑溶液、50 70 ill的0. I 0. 3M低級烷基羧酸鹽的Tris緩沖溶液、和80 120 u I甘油三酯溶液，其中，所述pH指示劑溶液為pH指示劑以0. 3 I. 5mg/L的濃度溶解于Tris緩沖液，所述甘油三酯溶液為甘油三酯以I :4 6的體積比溶于有機(jī)溶劑而獲得的溶液。在一具體實(shí)施例中，所述反應(yīng)體系的pH在4. 0 9. 0的范圍內(nèi)。在一具體實(shí)施例中，所述反應(yīng)體系的pH在5. 0 9. 0的范圍內(nèi)。在其它具體實(shí)施例中,所述反應(yīng)體系的pH在4. 0 7. 0的范圍內(nèi)。在其它具體實(shí)施例中，所述反應(yīng)體系的pH在7. 0 9. 0的范圍內(nèi)。在一具體實(shí)施例中，所述甘油三酯為脂肪酸碳鏈長度為12-22的甘油三酷。在一具體實(shí)施例中，所述低級烷基羧酸鹽為長2-6個(gè)碳原子烷基羧酸的IIA族金屬鹽。在一具體實(shí)施例中，所述pH指示劑選自溴百里酚藍(lán)、苯酚紅、亞甲藍(lán)、中性紅、甲基紅、溴甲酚綠、甲基橙、溴酚藍(lán)、剛果紅或其組合。


圖I顯示篩選方法靈敏性驗(yàn)證結(jié)果。圖2顯示采用本發(fā)明方法和已知方法對脂肪酶催化活性進(jìn)行篩選的結(jié)果。圖3顯示脂肪酶基因的PCR結(jié)果。I號泳道為用于克隆至pET30a載體的PCR片段，2號泳道為用于克隆至pET32a載體的PCR片段，3號泳道為用于克隆至pET22b載體的PCR片段。圖4顯示陽性克隆鑒定。其中，A圖顯示pET30a_脂肪酶的陽性克隆鑒定，B圖顯示pET32a-脂肪酶的陽性克隆鑒定，C圖顯示pET 22b-脂肪酶的陽性克隆鑒定，箭頭所指為脂肪酶基因的條帶，出現(xiàn)箭頭所示的目標(biāo)條帶的克隆即為陽性克隆。圖5顯示重組子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行的SDS-PAGE電泳結(jié)果。M:蛋白質(zhì)電泳Marker ；C :未誘導(dǎo)的菌體超聲破碎后作對照；1 :以pET32a為載體，表達(dá)的蛋白大小大約為50kD ；2 :以pET30a為載體，表達(dá)的蛋白大小約為38kD ；3 :以pET22b為載體，表達(dá)的蛋白大小約為38kD。箭頭所指為重組脂肪酶蛋白條帶。圖6顯示易錯(cuò)PCR結(jié)果。圖7顯示脂肪酶經(jīng)過定向進(jìn)化和定點(diǎn)改造后比活力的變化趨勢。圖8顯示考馬斯亮藍(lán)測蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖9顯示本發(fā)明采用的酸堿滴定法的具體流程。
具體實(shí)施例方式如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的多肽”或“分離的脂肪酶”是指脂肪酶基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化脂肪酶。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、絲狀真菌、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。在本發(fā)明中，術(shù)語“脂肪酶”包括具有脂肪酶活性的SEQ ID NO :4、6、8、10或12所示的多肽。該術(shù)語還包括具有脂肪酶功能的、SEQ ID NO :4、6、8、10或12的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)ー個(gè)或多個(gè)(例如1-10個(gè)，最佳地1-5個(gè)，更佳地，1-3個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失ー個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。優(yōu)選所述變異形式包括ー個(gè)或多個(gè)(例如1-10個(gè)，最佳地1-5個(gè)，更佳地，1-3個(gè))保守性取代?！氨Ｊ匦匀〈笔抢镁哂邢嗨苽?cè)鏈的一種氨基酸殘基替代另一種氨基酸殘基。具有相似側(cè)鏈的家族在本領(lǐng)域已有明確定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β -分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。應(yīng)理解，對于本發(fā)明SEQ ID NO :4、6、8、10和12的變異形式，優(yōu)選的是它們保留了本發(fā)明所特別指出的突變位點(diǎn)上的突變?！氨Ａ簟痹诒疚闹兄副景l(fā)明多肽的變異形式除具有本發(fā)明所特別指出的突變位點(diǎn)上的突變外，還含有其它變異，例如在其它ー個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選I 5個(gè)，更優(yōu)選I 3個(gè))位點(diǎn)上發(fā)生如前文所述的插入、缺失或突變。例如，本發(fā)明多肽的變異形式至少保留第57位殘基為Val。在其它實(shí)施例中，所述變異形式至少保留第57位殘基為Val和第168位為Pro。在其它實(shí)施例中，所述變異形式至少保留第57位殘基為Val和第111位為Thr。在其它實(shí)施例中，所述變異形式至少保留第57位殘基為Val和第67位為Ala。在其它實(shí)施例中，所述變異形式至少保留第57位殘基為Val、第67位為Ala和第111位為Thr。在其它實(shí)施例中，所述變異形式至少保留第57位殘基為Val、第67位 為Ala、第111位為Thr和第168位為Pro。在其它實(shí)施例中，所述變異形式至少保留第57位殘基為Val、第65位為Ala、第67位為Ala、第111位為Thr和第168位為Pro。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在基因克隆操作中，常常需要設(shè)計(jì)合適的酶切位點(diǎn)，這勢必在所表達(dá)的蛋白末端引入了一個(gè)或多個(gè)不相干的殘基，而這并不影響目的蛋白的活性。又如為了構(gòu)建融合蛋白、促進(jìn)重組蛋白的表達(dá)、獲得自動分泌到宿主細(xì)胞外的重組蛋白、或利于重組蛋白的純化，常常需要將ー些氨基酸添加至重組蛋白的N-末端、C-末端或該蛋白內(nèi)的其它合適區(qū)域內(nèi)，例如，包括但不限于，適合的接頭肽、信號肽、前導(dǎo)肽、末端延伸等。本發(fā)明的脂肪酶的氨基端或羧基端還可含有ー個(gè)或多個(gè)多肽片段，作為蛋白標(biāo)簽。任何合適的標(biāo)簽都可以用于本發(fā)明。例如，所述的標(biāo)簽可以是？1^，撤，撤1，(^7(^017-!^，Poly-Arg, Str印-TagII，AUl，EE, Τ7，4Α6，ε，B，gE以及Tyl0這些標(biāo)簽可用于對蛋白進(jìn)行純化。下表列出了其中的一些標(biāo)簽及其序列。
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，其特征在于，所述多肽選自 (1)SEQID NO :4、6、8、10或12所示氨基酸序列;和 (2)在(I)所述的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，但至少保留以SEQ ID NO :2的氨基酸序列編號計(jì)第57位氨基酸殘基為Val，且具有脂肪酶活性的由(I)衍生的多肽。
2.如權(quán)利要求I所述的多肽，其特征在于，以SEQID NO :2的氨基酸序列編號計(jì)，(2)所述的多肽至少還保留一個(gè)或多個(gè)以下位置上的殘基第67位的Ala、第111位的Thr、第168位的Pro和第65位的Ala。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述分離的多核苷酸選自 (1)編碼權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的多肽的多核苷酸；和 (2)與(I)所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼如SEQIDNO :4、6、8、10或12所示的多肽。
5.如權(quán)利要求3或4所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO :3、5、7、9 或 11 所示。
6.—種載體,其特征在于,它含有權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求6所述的載體，或含有權(quán)利要求3-4中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
8.一種篩選脂肪酶的方法，其特征在于，所述方法包括以甘油三酯作為待篩選脂肪酶的底物進(jìn)行酶解并根據(jù)PH指示劑產(chǎn)生的顏色變化篩選出比活力提高的脂肪酶的步驟。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 (1)提供待篩選的脂肪酶； (2)提供含有pH指示劑和低級烷基羧酸鹽的溶液； (3)將甘油三酯加到步驟(2)的溶液中，得到混合液； (4)將脂肪酶加到步驟(3)所得的混合液中；和 (5)觀察混合液顏色的變化，根據(jù)pH指示劑所產(chǎn)生的顏色變化篩選出比活力提高的脂肪酶。
10.如權(quán)利要求8-9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述甘油三酯為脂肪酸碳鏈長度為12-22的甘油三酯。
11.如權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述低級烷基羧酸鹽為長2-6個(gè)碳原子烷基羧酸的IIA族金屬鹽。
12.如權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述pH指示劑選自溴百里酚藍(lán)、苯酚紅、亞甲藍(lán)、中性紅、甲基紅、溴甲酚綠、甲基橙、溴酚藍(lán)、剛果紅或其組合。
13.如權(quán)利要求8-12中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括使用野生型脂肪酶作為對照，通過對比待篩選脂肪酶產(chǎn)生的顏色與對照產(chǎn)生的顏色篩選出比活力提高的脂肪酶。
14.如權(quán)利要求8-13中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法是使用多孔板進(jìn)行篩選。
15.如權(quán)利要求8-14中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括建立脂肪酶突變文庫； 表達(dá)突變脂肪酶。
16.如權(quán)利要求8-15中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括采用堿滴定法對所篩選得到的脂肪酶進(jìn)行復(fù)篩，篩選出比活力提高的脂肪酶。
17.一種用于篩選脂肪酶的反應(yīng)體系，其特征在于，所述反應(yīng)體系含有 (1)甘油三酯；和 (2)pH指示劑。
18.如權(quán)利要求17所述的反應(yīng)體系，其特征在于，所述反應(yīng)體系還含有低級烷基羧酸 鹽。
19.如權(quán)利要求17-18中任一項(xiàng)所述的反應(yīng)體系，其特征在于，每200μ I所述反應(yīng)體系計(jì)，所述反應(yīng)體系含有15 25μ I的pH指示劑溶液、50 70 μ I的O. I O. 3Μ低級烷基羧酸鹽的Tris緩沖溶液、和80 120 μ I甘油三酯溶液，其中，所述pH指示劑溶液為pH指示劑以O(shè). 3 I. 5mg/L的濃度溶解于Tris緩沖液，所述甘油三酯溶液為甘油三酯以I :4 6的體積比溶于有機(jī)溶劑而獲得的溶液。
20.如權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)所述的反應(yīng)體系，其特征在于，所述反應(yīng)體系的pH為4.O 9. O。
21.如權(quán)利要求17-20中任一項(xiàng)所述的反應(yīng)體系，其特征在于，所述甘油三酯為脂肪酸碳鏈長度為12-22的甘油三酯。
22.如權(quán)利要求17-21中任一項(xiàng)所述的反應(yīng)體系，其特征在于，所述低級烷基羧酸鹽為長2-6個(gè)碳原子烷基羧酸的IIA族金屬鹽。
23.如權(quán)利要求17-22中任一項(xiàng)所述的反應(yīng)體系，其特征在于，所述pH指示劑選自溴百里酚藍(lán)、苯酚紅、亞甲藍(lán)、中性紅、甲基紅、溴甲酚綠、甲基橙、溴酚藍(lán)、剛果紅或其組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及脂肪酶基因突變庫高通量篩選方法和采用該方法篩選得到的脂肪酶突變基因及其編碼脂肪酶。采用本發(fā)明的方法與現(xiàn)有的方法相比，靈敏度更高。本發(fā)明的突變脂肪酶相比野生型具有更高的比活力。本發(fā)明還涉及一種用于篩選脂肪酶的反應(yīng)體系。
文檔編號C12N15/55GK102851263SQ20111018330
公開日2013年1月2日 申請日期2011年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月1日
發(fā)明者于洪巍, 毛愛軍, 王玨, 王丹, 宣姚吉 申請人:豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司