專利名稱：豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量定量檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種適用于豬瘟兔化弱毒疫苗株脾淋源及細胞源病毒含量定量檢測的方法及試劑盒。可以用于豬瘟兔化弱毒疫苗生產(chǎn)的實時監(jiān)控和質量檢測。
背景技術：
豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，死亡率高達90%以上，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須通報的動物疫病。目前該病主要流行于亞洲、歐洲、南美洲，在家豬和野豬中傳播廣泛，發(fā)達國家采取捕殺政策消滅豬瘟，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。CSFV與其同屬的牛病毒性腹 寫病病毒和羊邊界病病毒存在一定的抗原交叉性,而 且后兩種病毒也可自然感染豬，因此血清學診斷上不易將CSFV與其他兩種瘟病毒相鑒別，尤其是近年來豬瘟流行方式和發(fā)病特點發(fā)生了很大變化，轉變?yōu)殡[性感染和亞病毒感染，給獸醫(yī)臨床診斷帶來很大困難。目前，疫苗接種是預防控制豬瘟的重要手段，中國豬瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗以其具有的誘發(fā)免疫反應快、無殘余毒力、免疫豬可抵擋豬瘟病毒強毒株攻擊等特點，成為國際上公認的最安全有效的弱毒疫苗，在國內(nèi)外被廣泛應用，對豬瘟的控制起到了重要作用。疫苗效價的高低是疫苗質量合格與否的關鍵指標，HCLV雖然可以在多種細胞上生長，但是病毒增值力相對較弱，不產(chǎn)生細胞病變，病毒滴度低，應用免疫熒光技術也較難檢測到感染細胞中抗原的存在。對豬瘟兔化弱毒疫苗的效力檢驗一直沿用兔體定型熱反應法，但該法存在的突出不足是不能準確定量、測毒結果易受兔體個體差異和天氣條件影響、實驗周期長、費時費力等。因此，如何快速、準確測定疫苗效價是豬瘟疫苗生產(chǎn)中面臨的主要難題之一。近年來發(fā)展起來的實時熒光定量PCR技術以其靈敏度高、速度快、特異性強等優(yōu)點在基因表達水平分析、病原體的定性和定量檢測等方面得到廣泛應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種適用于豬瘟兔化弱毒疫苗脾淋源和細胞源病毒含量定量檢測的方法，該方法只能檢測HCLV，不與BVDV發(fā)生交叉反應；本發(fā)明同時提供用該法制備檢測試劑盒的方法，以及用前述方法制備的試劑盒。本發(fā)明所使用的豬痕病毒特異引物是對GenBank中登錄的Shimen株、HCLV株、Alfort株、Brescia株等25株豬瘟病毒基因組全序列進行比較分析后，在其高度保守的5’端非編碼區(qū)(5’-UTR)設計合成，預期擴增產(chǎn)物245bp，具有高度特異性，熒光定量PCR反應呈現(xiàn)特征性S形擴增動力曲線，熔解曲線分析顯示出現(xiàn)單特異峰，不與BVDV發(fā)生交叉反應。所述豬瘟病毒特異引物有2條，:其中Pl (5’ -GCAGAAGCCCACCTCGAGAT-3’ )為豬瘟病毒特異性上游引物，P2 (5’ -TACACCGGTTCCTCCACTCC-3’ )為豬瘟病毒特異性下游引物，預期擴增產(chǎn)物245bp，熒光定量PCR反應呈現(xiàn)特征性S形擴增動力曲線，熔解曲線分析顯示出現(xiàn)單特異峰。本發(fā)明所使用的檢測模板是以豬瘟病毒全基因組RNA經(jīng)特異性下游引物P2反轉錄而成的cDNA，該模板堿基序列在豬瘟病毒基因組中高度保守且與牛病毒性腹瀉病病毒(BVDV)基因同源性低于3. 5%，尤其是與引物互補結合的3’端基因組具有高度特異性。本發(fā)明使用絕對定量方法，用于繪制標準曲線的標準品是目的片段經(jīng)測序后，與克隆載體PMD18-T連接，構建的陽性重組克隆質粒pMD18-T-HCLV。一種陽性重組克隆質粒，根據(jù)上述豬瘟病毒特異引物在其高度保守的5’端非編碼區(qū)(5’-UTR)擴增的豬瘟病毒特異性核酸擴增片段245bp的陽性重組克隆質粒，測序結果經(jīng)DNAStar分析，與GeneBank登錄的豬瘟病毒序列相似率在99. 6%以上。利用前述檢測引物可制備出豬瘟病毒定量檢測試劑盒。該豬瘟病毒定量檢測試劑盒中含有，上述檢測引物， 上述陽性重組克隆質粒，標準陽性豬瘟病毒基因組，2 X SYBR Green I Real-time PCR Master Mix ；RNA 裂解液；RNA酶抑制劑；突光定量反應液。所述的豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量定量檢測試劑盒可用于檢測豬瘟病毒含量和豬痕兔化弱毒疫苗病毒含量。本發(fā)明與傳統(tǒng)兔體定型熱反應法及同類產(chǎn)品相比具有以下優(yōu)點I、準確度高本發(fā)明試劑盒中的引物是豬瘟病毒特異性引物，與BVDV沒有交叉反應，具有高度特異性，能真實準確地診斷豬瘟病毒含量。2、靈敏度高、特異性強、重復性好本發(fā)明所使用的檢測模板是cDNA，不與其他豬源病毒發(fā)生交叉反應，有效克服了兔子個體反應性差異帶來的誤差，不但能快速對收獲疫苗進行準確定量，而且能及時監(jiān)控疫苗生產(chǎn)中細胞產(chǎn)毒情況、淘汰不合格批次。3、成本較低熒光定量檢測所需樣品量和試劑量較少，這相應的降低了疫苗的生產(chǎn)成本，也大大減少了對家兔等生物資源的浪費。4、檢測速度快所需時間短。整個過程只需兩個半小時左右。5、方法簡便不需后續(xù)處理，沒有電泳、照相、顯色等過程，PCR反應閉管完成，勿需開蓋，沒有污染。6、本發(fā)明所使用的熒光染料是SYBR Green I，該染料可嵌合于DNA雙鏈結構的小溝中，當其處于游離狀態(tài)時，檢測不到熒光信號，當其結合于雙鏈DNA后熒光強度明顯增強，可被熒光探測系統(tǒng)檢測到，而且具有方法簡便、成本較低等優(yōu)勢。本發(fā)明檢測試劑盒通過出現(xiàn)S形擴增動力曲線及單特異峰的樣品可確診為豬瘟病毒感染，克服了動物實驗過程中測毒周期長、成本高、定量不準確等缺點。


圖I引物在豬瘟兔化弱毒疫苗株基因組中的位置。圖2熒光定量PCR擴增結果電泳檢測圖譜。其中1. DL2000 DNA分子量對照；2.弱毒疫苗cDNA ；3.空白對照.
圖3熒光定量PCR擴增動力曲線圖譜。其中1.弱毒疫苗cDNA ；2.空白對照.。圖4特異性實驗動力曲線圖譜。其中1·弱毒疫苗株cDNA 陽照；2. BVDV ；3. PPV ；4. PCV ；5. PRV ；6. PRRSV. 7.空白對照。圖5敏感性實驗動力曲線圖譜。其中1、4·14X107 拷貝 /L ;2、4· 14X I O6 拷貝 /L ;3、4· 14X IO5 拷貝 /L ;4、
4.14X IO4 拷貝 /L ;5、4· 14X IO3 拷貝 /L ;6、41· 4 拷貝 /L ;7、4· 14 拷貝 /L ；8.空白對照·圖6標準曲線。
具體實施例方式首先，應用生物學軟件DNAstar比對GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的CSFV Shimen株、HCLV株、Alfort株、Brescia株等25株豬瘟病毒基因組全序列及BVDV序列，選擇CSFV最保守的核苷酸序列，應用生物學軟件Primer Premier 5. O設計出2條豬痕病毒特異引物PI C -GCAGAAGCCCACCTCGAGAT-3 ')為豬瘟病毒特異性上游引物，P2(5/ -TACACCGGTTCCTCCACTCC-3;)為豬瘟病毒特異性下游引物，擴增產(chǎn)物245 bp，熒光定量PCR反應呈現(xiàn)特征性S形擴增動力曲線，熔解曲線分析顯示出現(xiàn)單特異峰。經(jīng)特異性實驗、敏感性實驗、重復性實驗后最終建立能夠定量檢測豬瘟疫苗病毒含量的實時熒光定量PCR檢測方法。其次，病毒RNA的提取和反轉錄cDNA的合成用TRIzol試劑參照使用說明書提取樣品總RNA，用反轉錄酶M-MuLV參照使用說明書反轉錄合成cDNA。從疫苗樣品原液中提取病毒總RNA，反轉錄合成模板cDNA，用上述引物進行熒光定量PCR反應，選擇最優(yōu)的PCR反應條件及程序?；厥?45bp的目的片端，與克隆載體PMD18-T連接，轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α，挑取陽性單克隆菌株，用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后提取質粒，經(jīng)PCR及BamH I和HindIII雙酶切鑒定后對陽性質粒進行測序，構建重組克隆質粒PMD18-T-HCLV。該質粒用紫外分光光度計測定OD26tl后，計算拷貝數(shù)，經(jīng)熒光定量PCR檢測后選擇具有良好線性范圍的質粒樣品作為用于絕對定量的標準品。最后，將豬瘟兔化弱毒脾淋苗和細胞苗按瓶簽注明頭份配制成I頭份/mL的原液，同時進行熒光定量PCR檢測和兔體定型熱反應，比較兩種實驗結果，找出兩者的相關性。熒光定量PCR檢測25 μ L反應體系的組成組成成分體積
滅菌去離子水10.5 μL
引物 Ρ1(10μΜ)0.5 μ
引物 Ρ2(10μΜ)0.5 μ
模板 cDNAI μ
2xSYBR Green I Realtime PCR 12.5 μL Master Mix
Total25 μ
熒光定量PCR反應程序為94°C預變性3min ;94°C變性30s、59°C退火30s、72°C延伸30s，86°C 30s 40個循環(huán)；86°C時收集熒光。結果判定對豬瘟細胞苗而言，其疫苗半成品豬瘟病毒RNA在IO8拷貝/mL以上的疫苗原液兔檢結果為++或+_，可直接用來制造疫苗；其疫苗成品豬瘟病毒RNA在IO8拷貝/mL以上的疫苗原液兔檢結果為++或+_，表明疫苗效力檢驗合格；對豬瘟脾淋苗而言，其疫苗半成品豬瘟病毒RNA在IO6 IO7拷貝/mL ;兩只兔子均產(chǎn)生定型熱反應，兔檢結果為++，其疫苗半成品豬瘟病毒RNA為IO6拷貝/mL的疫苗原液兔檢結果為+_。豬瘟脾淋苗病毒RNA在IO6 IO7拷貝/mL以上；可直接用來制造疫苗；其疫苗成品豬瘟病毒RNA在IO7拷貝/mL以上的疫苗原液兔檢結果為++或+_，表明疫苗效力檢驗合格；本發(fā)明中的試劑盒效果良好，可在實際生產(chǎn)中應用。疫苗樣品用熒光定量RT-PCR檢測與標準檢驗方法兔體反應熱法比較，兩者有良
好的相關性。
疫苗樣品兔體定型熱熒光定量PCR
權利要求
1.一種適用于豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株脾淋源和細胞源病毒含量定量檢測的豬瘟病毒特異引物，其特征是以豬瘟病毒(CSFV)基因組高度保守且與牛病毒性腹瀉病病毒(BVDV)基因同源性低于3. 5%的保守區(qū)設計而成，且與引物互補結合的3’端基因組具有高度特異性。
2.根據(jù)權利要求I所述的豬瘟病毒特異引物，其特征在于所述引物有2條其中Pl (5 ^ -GCAGAAGCCCACCTCGAGAT-3 ')為豬瘟病毒特異性上游引物，P2(5/ -TACACCGGTTCCTCCACTCC-3')為豬瘟病毒特異性下游引物，預期擴增產(chǎn)物245 bp,熒光定量PCR反應呈現(xiàn)特征性S形擴增動力曲線，熔解曲線分析顯示出現(xiàn)單特異峰。
3.—種陽性重組克隆質粒，其特征是根據(jù)權利要求2在其高度保守的5’端非編碼區(qū)(5，-UTR)擴增的豬瘟病毒特異性核酸擴增片段245bp，測序結果經(jīng)DNAStar分析，與GeneBank登錄的豬瘟病毒序列相似率在99. 6%以上。
4.一種豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量定量檢測試劑盒,其特征是檢測試劑盒中含有 (1)權利要求I或2所述的檢測引物； (2)權利要求3所述的陽性標準品； (3)標準陽性豬瘟病毒基因組；(4)2X SYBR Green I Real-time PCR Master Mix ； (5)RNA裂解液； (6)RNA酶抑制劑； (7)熒光定量反應液。
5.根據(jù)權利要求4所述的豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量定量檢測試劑盒在檢測豬瘟病毒含量和豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量上的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種適用于豬瘟病毒C株弱毒疫苗脾淋源和細胞源病毒含量定量檢測的熒光定量PCR快速診斷試劑盒及其制備方法。102拷貝/μL的總RNA即能得到特異性擴增，在107～102拷貝/μL線性范圍內(nèi)有良好的擴增曲線，適用于豬瘟弱毒疫苗成品及半成品的效價估測。本發(fā)明所使用的豬瘟病毒特異引物是在其高度保守的5’端非編碼區(qū)(5’-UTR)設計合成的2條引物P1(5′-GCAGAAGCCCACCTCGAGAT-3′)為豬瘟病毒特異性上游引物，P2(5′-TACACCGGTTCCTCCACTCC-3′)為豬瘟病毒特異性下游引物，預期擴增產(chǎn)物245 bp，熒光定量PCR反應呈現(xiàn)特征性S形擴增動力曲線，熔解曲線分析顯示出現(xiàn)單特異峰。該方法只能檢測CSFV，不與BVDV發(fā)生交叉反應。
文檔編號C12Q1/68GK102816863SQ20111015252
公開日2012年12月12日 申請日期2011年6月8日 優(yōu)先權日2011年6月8日
發(fā)明者沈志強, 李安, 謝金文, 王金良, 郭顯坡 申請人:山東綠都生物科技有限公司