專利名稱：分泌抗β-內酰胺酶單克隆抗體雜交瘤細胞株及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及采用分子生物學、免疫學、細胞生物學等方法獲得能夠穩(wěn)定分泌抗 β -內酰胺酶抗體的細胞株，特別是一種分泌抗β -內酰胺酶單克隆抗體雜交瘤細胞株及其制備方法。
背景技術：
內酰胺類抗生素的抗菌作用強、抗菌譜廣、毒性低，是目前臨床抗感染治療最普遍應用的一類抗生素。這類藥物的廣泛使用(特別是濫用和誤用)以及致病菌的突變， 致使病原菌產生對該藥物嚴重的耐藥性問題。病原菌對內酰胺類抗生素產生耐藥的最重要的機制是質粒介導或染色體突變使病原菌分泌的一種胞外酶-內酰胺酶，該酶可選擇性分解牛奶中殘留的內酰胺類抗生素。微生物活性消失法檢測內酰胺酶， 如待檢菌株產生內酰胺酶，破壞了青霉素，則在劃線兩邊有枯草芽胞菌生長，否則指示菌仍呈很大抑菌環(huán)。β -內酰胺酶破壞β -內酰胺環(huán)，碘與被打開β -內酰胺環(huán)結合，使藍色的淀粉-碘復合物轉變成無色，提示該菌產生內酰胺酶。青霉素被內酶胺酶水解后成青霉素酸，ρΗ值下降6. 8以下，用酚紅指示劑，由紅(紫)色(原液枸櫞酸緩沖液 ΡΗ8. 5)—黃色(ρΗ6. 8以下)。頭孢硝基噻吩(Nitrocefin)的β -內酰胺環(huán)被β -內酰胺酶打開，基質由黃色變成紅色。免疫學分析法是以抗原與抗體的特異性、可逆性結合反應為基礎的分析方法，目前藥物殘留免疫分析技術主要分三大類相對獨立的分析方法、免疫分析技術與常規(guī)理化分析技術聯(lián)用的方法、免疫受體法。1973年荷蘭Van Weeman、Schurrs及瑞典Engvall、Perlmann分別提出酶聯(lián)免疫吸附法，30多年來國內外學者對免疫學方法檢測食品中抗生素進行了大量研究。免疫學分析法快速、靈敏、特異，但前期設備投入、單樣檢測費用高，如果全部采用免疫法測定乳中的抗生素，按保守估算，每噸牛乳至少要增加100 元的檢測費用，乳品廠一年增多幾十至幾百萬檢測費，企業(yè)難以接受，不適合當前我國乳品企業(yè)發(fā)展。各國對內酰胺酶的分析方法按用途、作用和步驟分為篩選法、定量法和確證法三個級別。對原料乳供應者來說，知道是否有內酰胺酶即可判斷該不該出售或收購， 所以適合對大批量乳樣進行初篩的微生物活性消失法和免疫學方法成為近年來的研究熱點ο

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一在于獲得分泌抗體的雜交瘤細胞株，該細胞株特異產生抗 β-內酰胺酶的抗體；本發(fā)明的目的之二在于提供一種上述細胞株的制備方法；本發(fā)明的目的之三在于提供上述細胞株的應用方法。本發(fā)明的目的按照下述方案實現分泌抗β -內酰胺酶單克隆抗體雜交瘤細胞株，命名為雜交瘤細胞I^hw-spZO，該細胞株已提交到中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC N2 C201124，保藏日期2011年4月13日；所述的分泌抗β -內酰胺酶單克隆抗體雜交瘤細胞株由以下元件構成SHV型β內酰胺酶基因；骨髓瘤細胞SP2/0基因；細胞株是雜交瘤細胞株，是用SHV型β內酰胺酶免疫小鼠，用脾細胞中B細胞和 SP2/0細胞融合得出。分泌抗β -內酰胺酶單克隆抗體雜交瘤細胞株的制備方法，包括以下步驟1)通過藥敏分析篩選出產β -內酰胺酶的菌株；2)利用分子生物學手段獲得高產β -內酰胺酶的保守序列；幻將β -內酰胺酶表達在細菌BLR中。4)初步純化表達蛋白作為免疫原，免疫BALB/c小鼠；5)在化學物質PEG作用下，SP2/0細胞和免疫的脾細胞融合；6)篩選、克隆獲得能夠分泌抗β -內酰胺酶抗體雜交瘤細胞株。本發(fā)明利用β -內酰胺酶基因在大腸桿菌中能夠表達特性，將β -內酰胺酶在大腸菌中大量表達，表達產物包涵體直接可以作為免疫原，免疫Balb/c小鼠，當免疫抗體效價達到融合要求時，在融合前3d尾靜脈加強注射免疫原，取免疫的Balb/c小鼠的脾臟與 SP2/0細胞在PEG4000作用下，融合、篩選、克隆獲得3株穩(wěn)定分泌抗β -內酰胺酶單克隆抗體的雜交瘤細胞株。Balb/c小鼠腹腔注射雜交瘤細胞株，收集腹水初步純化，獲3株單克隆抗體，亞類鑒定分屬IgGh和IgM型抗體。


圖 1 目的基因 PCR 圖；圖中1. DL 2000Marker ；2. PCR 產物。圖2 構建的基因工程菌株質粒酶切圖；圖中1 :DL2000 marker ；2 pET-28a-SHV-12 NdeI and BamHl 酶切產物 3 =PEASY-T1 NdeI and BamHl 酶切產物；4 pET-28a-SHV-12 質粒圖3 純化的蛋白質電泳圖。圖中(a)M 低分子量標準markers ；1，2，3 超聲波破碎菌體上清；彳空載體菌體裂解^力〗？！^· IPTG誘導菌體經裂解液裂解(b)M:低分子量標準markers ；1 包涵體；(c) 1，Nitrocefin ；2 空載體菌體裂解；3 超聲波破碎菌體上清；圖4 包涵體免疫小鼠血清效價圖。圖5 細胞融合后培養(yǎng)的雜交瘤細胞株。
具體實施例方式本發(fā)明是一種分泌抗β -內酰胺酶單克隆抗體雜交瘤細胞株，命名為1^^-印20，該細胞株已提交到中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為 CCTCC Na C201124 ；所述的分泌抗β -內酰胺酶單克隆抗體雜交瘤細胞株由以下元件構成SHV型β內酰胺酶基因；
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骨髓瘤細胞SP2/0基因；細胞株是雜交瘤細胞株，是用SHV型β內酰胺酶免疫小鼠，用脾細胞中B細胞和 SP2/0細胞融合得出。上述細胞株的制備方法實驗材料大腸桿菌DH5 α、BLR(DE3)、DH5 α (pUC19)、質粒pET_28a為本實驗室保藏；限制性核酸內切酶、連接酶購自takara有限公司；BsrG I購自biolab有限公司；DNA回收試劑盒購自Promega公司；其余試劑均為國產純；弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑，RPMI-1640 細胞培養(yǎng)基，HAT、HT培養(yǎng)基為Gibco公司產品；PEG4000為!Iomega公司產品；NTE緩沖液(0. 13MNaCl、0. 05M Tris_Cl、0. OOlM EDTA)配制 1000mL?？捡R斯亮藍 G-250 溶液稱取 CBB-G-250IOOmL溶于50mL乙醇溶液，后加入IOOmL磷酸，加蒸餾水定容至1000mL。標準牛血清白蛋白的配置。羊抗鼠IgGl，IgG^i，IgG^，IgG3，IgM，IgA等免疫血清試劑盒為Sigma 公司產品。實驗步驟1通過藥敏分析篩選出產β -內酰胺酶的菌株。2利用分子生物學手段獲得高產β -內酰胺酶的保守序列2. 1引物的設計和PCR擴增SHV-12ESBLs目的基因以 GenBank 上的(序列號為 EU418910. 1) SHV-12 型 ESBLs 為參考模板，用 Primer ft~emier6.0軟件設計含Nde I和BamH I酶切位的正反向引物，由上海生工生物工程有限公司合成。Forward Primer 5' CCCATATGCGTTTTATTCGCCTGTGTATT3‘Reverse Primer 5' CGGATCCTTAGCGTTGCCAGTGCTCGATC3‘提取產ESBLs大腸桿菌耐藥菌株質粒DNA。根據設計引物進行PCR擴增目的基因，PCR反應條件為預變性95°C 5min，95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 45s，共30個循環(huán)，再延伸 72°C IOmin0 PCR產物1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。2. 2 SHV-12克隆載體的構建切膠回收目的條帶，將回收產物與pEASY-Tl載體按3 1進行15min、25°C快速連接，轉化于DH5 α感受態(tài)細胞中，菌落PCR和質粒酶切鑒定后送上海生工生物工程有限公司測序。3將β -內酰胺酶表達在細菌BLR中3. 1 SHV-12ESBLs表達載體的構建和表達采用Nde I和BamH I雙酶切SHV-12片段和pET_28a (+)質粒，切膠回收目的片段 876bp和載體片段53^bp，按3 1的分子數用T4連接酶16°C連接汕，轉化于DH5 α感受態(tài)細胞中，菌落PCR和質粒酶切鑒定，鑒定正確命名為pET-28a-SHV-12。將上述重組質粒轉化與BL21(DE!3)感受態(tài)細胞中，挑取單菌落培養(yǎng)1 后，取Iml菌液轉接于IOOmlTM培養(yǎng)基中，37°C、250r/min震蕩至為A600時0. 6 0. 8。向其中加入IPTG至終濃度分別為0. 5mM、 ImMU. 5mM0 溫度分別為 、33°C、37°C培養(yǎng) 4h，6000r/min 離心 lOmin，棄上清。菌體 20°C 凍存。以超聲破碎菌體法和細胞裂解液法破碎細胞后加等量的2X蛋白上樣液煮沸5min 進行12% SDS-PAGE電泳。同時用Nitrocefin試劑測試裂解上清，能使Nitrocefin由黃色變?yōu)檠t色為有活性力的ESBLs。3. 2表達產物包涵體的提取菌體沉淀重懸于5ml的50mmol/L Tris · HCL-2mmol/LEDTA中，加入溶菌酶至終濃度 100ug/ml，再加入 0. 5ml 1 % TritonX-100，30°C溫育 15min，超聲波處理 lOmin，然后 12000r/min離心15min，收集的沉淀物即為包涵體粗提物。將該包涵體重溶于20ml的生理鹽水中，超聲破碎5min，然后IOOOOrpm離心15min，收集沉淀，重溶于2ml生理鹽水中，用紫外分光光度計波長A280測定蛋白質含量，SDS-PAGE電泳，分裝凍存。4初步純化表達蛋白作為免疫原，免疫BALB/c小鼠4. 1表達產物免疫Balb/c小鼠第一周取包涵體100 μ g加等量的弗氏完全佐劑乳化后皮下多點注射；第二周取包涵體100 μ g加等量的弗氏不完全佐劑乳化肌肉注射；第三周取包涵體100 μ g腹腔注射， 間接ELISA法測定免疫效價；第四周取包涵體100 μ g尾靜脈注射加強免疫。4. 2檢測SHV-12ESBLs的間接ELISA方法的建立4.2.1間接ELISA方法的操作程序(1)抗原包被用SHV-12ESBLs最佳包被量包被板，100 μ 1/孔加入，4°C過夜。(2)洗滌傾去孔內的液體，用洗滌液注滿各孔(約300μ 1)，放置;3min，然后去盡洗滌液，如此反復3次，最后一次在吸水紙上拍干。(3)封閉將5%牛血清PBS封閉液加入酶聯(lián)板中，每孔200 μ 1，37°C封閉濁后， 然后倒掉封閉液，在吸水紙上拍干。(4)洗滌同⑵。(5)加血清或抗體每孔IOOul，37°C反應60min。(6)洗滌同(2)。(7)加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG 每孔IOOul (10000倍稀釋)，37°C反應 60mino(8)洗滌同⑵。(9)加底物每孔加入新配制的底物溶液ΙΟΟμ 1，37°C顯色15min。(10)終止反應每孔加入2mol/LH2S04終止液50 μ 1終止反應。(11)用酶聯(lián)儀讀出0D490nm值。(12)檢測結果的判0D490nm值彡2. 1時判為陽性；否判為陰性。5在化學物質PEG作用下，SP2/0細胞和免疫的脾細胞融合5. 1抗SHV-12ESBLs單抗雜交瘤細胞株的建立5. 1. 1飼養(yǎng)細胞的制備在融合前12h，取一只沒有免疫的健康BALB/c小鼠，拉頸處死，浸入75%的酒精中消毒lOmin，取出，移入超凈工作臺，無菌剪開腹部皮膚，暴露腹膜，用IOml玻璃注射器注入腹腔IOml完全RPMI-1640培養(yǎng)基，按摩腹部后將液體重新吸回注射器，用5ml完全 RPMI-1640培養(yǎng)基重復一次，合并兩次吸出的液體，將合并液體補加到15ml并充分混勻細胞，將飼養(yǎng)細胞滴入3塊96孔培養(yǎng)板，每孔50 μ 1。放入37°C 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5. 1. 2免疫脾細胞的制備將免疫好的小鼠眼球采血后放入75%酒清中IOmin后無菌取脾。在無菌櫥內將小鼠放入平皿內，用滅過菌的外科器械將脾取出，除去脂肪和結締組織，用洗液沖洗，放在無菌銅網上，用無菌的注射器內芯碾磨，碾磨完后靜置2min，以使未碾碎的組織塊沉淀。吸出上清IOOOrpm離心lOmin，去上清后即為制備好的免疫脾細胞。5. 1.3細胞融合將已制備好的骨髓瘤細胞與脾細胞的混合(兩種細胞比例為脾細胞sp2/0細胞是5 1)懸液900rpm離心lOmin。倒去上清液，用力振動離心瓶，振散細胞，立起離心瓶， 在Imin內滴加0. 5ml 50 % PEG,邊加邊搖動，加完后靜置90秒，在^iiin內滴加2ml無血清1640培養(yǎng)液，在aiiin內加細1無血清1640培養(yǎng)液，補充液體至30ml，靜置IOmin后， IOOOrpm離心lOmin，倒去上清液輕輕振散細胞，加入15ml含20%新生牛血清的HAT1640 培養(yǎng)液混合成細胞懸液。然后將融合細胞逐孔加入含有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，在 370C 5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在第4、6、8、10天每孔吸去50 μ 1培養(yǎng)液上清，加入50 μ 1 HAT培養(yǎng)液，第11天改換含20%新生牛血清的ΗΤ1640培養(yǎng)液。6篩選、克隆獲得能夠分泌抗β -內酰胺酶抗體雜交瘤細胞株6.1陽性孔細胞克隆化經間接ELISA法檢測為陽性的孔，將細胞吹打成細胞懸液，進行細胞計數，然后按照1.5、3個/孔兩個稀釋度稀釋細胞懸液，加入96孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時間后對有細胞克隆生長的培養(yǎng)孔，待其生長至一個視野的1/2以上時即可按抗體陽性孔檢測的方法進行檢測。檢測為陽性的孔再次按同樣的方法進行克隆、篩選，直至克隆細胞生長的細胞孔全部都為陽性為止，挑選生長良好且陽性較強細胞孔的細胞移入12孔板、6孔板、5ml培養(yǎng)瓶、IOml培養(yǎng)瓶、50ml培養(yǎng)瓶逐步擴大培養(yǎng)，換液時收集培養(yǎng)上清凍存?zhèn)溆谩?. 2細胞的凍存與復蘇將新生牛血清與二甲基亞砜(DMSO)按9 1的比例混合配制凍存液。將克隆擴大培養(yǎng)且處于對數生長期的雜交瘤細胞倒掉上清培養(yǎng)液，用1640洗液將其吹散，完全懸浮于液體中。將細胞放入離心瓶，SOOrpm離心lOmin，倒掉上清，按每瓶細胞(IOml培養(yǎng)瓶)加入Iml凍存液，與細胞混勻后分裝于Iml凍存管中，并作好標記。用10層厚度的紗布將標記好的細胞包好，按4°C 30min, -20°C 2h，-80°C 2h，最后放入液氮中的順序凍存細胞。復蘇細胞時，將細胞從液氮中取出，迅速放入37°C水浴中融化lmin，然后IOOOrpm 離心lOmin，無菌條件下打開凍存管，用完全1640培養(yǎng)基5ml將細胞移入5ml細胞培養(yǎng)瓶中，1 后待細胞貼壁后，換液一次。6. 3抗SHV-12ESBLs單克隆抗體生產取成年BALB/c雌性小鼠，提前一周每只腹腔注射0. 5ml石蠟油。另取處在對數生長期的雜交瘤細胞，倒掉培養(yǎng)上清，用無血清1640培養(yǎng)液懸浮細胞，進行計數，并調整細胞數到6X105個/ml。將其注入經石蠟油處理過的小鼠腹腔內，每只注入0.5ml。待小鼠腹腔明顯脹大后，用75%酒精消毒皮膚，用注射器刺入腹腔下部，采集腹水，三天后再采一次。 收集到的腹水置37°C溫箱2h，4000rpm離心lOmin。吸取上清液，56°C水浴滅活30min后， 用間接ELISA法測其效價。6. 4抗SHV-12ESBLs單克隆抗體IgG的提純以硫酸鈉鹽法粗提抗體球蛋白。取單抗腹水3000rpm離心30min，棄沉淀物；上清
7液用0. Sum濾膜過濾；取濾液加入等量36%的硫酸鈉溶液，混合均勻后，37°C水浴2h，并不斷搖動，3000rpm室溫離心30min ；棄上清，沉淀用去離子水溶解，再加入等量32%的硫酸鈉溶液，室溫作用lh，并不斷搖動，3000rpm離心30min ；沉淀溶于去離子水中，加入等量的硫酸鈉溶液，室溫作用lh，并不斷搖動，3000rpm離心25min ；沉淀溶于一定量的重蒸水中，4 °C透析Mh，用紫外法測定含量后，分裝，-80 0C保存?zhèn)溆谩?br> 權利要求
1.分泌抗β-內酰胺酶單克隆抗體雜交瘤細胞株，命名為 ^^- φ20，該細胞株已提交到中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No C201124o
2.如權利要求1所述的分泌抗β-內酰胺酶單克隆抗體雜交瘤細胞株，其特征在于它由以下元件構成SHV型β內酰胺酶基因； 骨髓瘤細胞SP2/0基因；細胞株是雜交瘤細胞株，是用SHV型β內酰胺酶免疫小鼠，用脾細胞中B細胞和SP2/0 細胞融合得出。
3.分泌抗β-內酰胺酶單克隆抗體雜交瘤細胞株的制備方法，包括以下步驟1)通過藥敏分析篩選出產β-內酰胺酶的菌株；2)利用分子生物學手段獲得高產內酰胺酶的保守序列；3)將β-內酰胺酶表達在細菌BLR中；4)初步純化表達蛋白作為免疫原，免疫BALB/c小鼠；5)在化學物質PEG作用下，SP2/0細胞和免疫的脾細胞融合；6)篩選、克隆獲得能夠分泌抗β-內酰胺酶抗體雜交瘤細胞株。
全文摘要
一種分泌抗β-內酰胺酶單克隆抗體雜交瘤細胞株，命名為Pshw-sp20，該細胞株已提交到中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC№C201124。其制備方法1)通過藥敏分析篩選出產β-內酰胺酶的菌株；2)利用分子生物學手段獲得高產β-內酰胺酶的保守序列；3)將β-內酰胺酶表達在細菌BLR中；4)初步純化表達蛋白作為免疫原，免疫BALB/c小鼠；5)在化學物質PEG作用下，SP2/0細胞和免疫的脾細胞融合；6)篩選、克隆獲得能夠分泌抗β-內酰胺酶抗體雜交瘤細胞株。
文檔編號C12R1/91GK102268408SQ20111013916
公開日2011年12月7日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權日2011年5月27日
發(fā)明者吳彥虎, 周學章, 徐薇薇 申請人:吳彥虎, 周學章, 寧夏回族自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所, 徐薇薇