專利名稱：一株單形擬桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株單形擬桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胃腸道是細(xì)菌的“大倉(cāng)庫(kù)”，共生著500 1000種1000萬億個(gè)細(xì)菌(I XlO14)，總重量超過I. 5公斤。胃腸道是口服藥物的必經(jīng)通道，腸道菌可以產(chǎn)生多種藥物代謝酶，這些代謝酶可以催化藥物進(jìn)行水解反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、異構(gòu)化反應(yīng)、酯解反應(yīng)和聚合反應(yīng)等。其中，水解反應(yīng)是腸內(nèi)進(jìn)行的主要生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，是由腸內(nèi)細(xì)菌具有的β_葡萄糖苷酶、β -鼠李糖苷酶、β -葡萄糖醛酸苷酶和硫酸酯酶等催化完成的。本發(fā)明提供的單形擬桿菌(Bacteroides uniformis),分離自人體腸道菌，被證明具有脫葡萄糖糖基的水解反應(yīng)活性，能夠轉(zhuǎn)化亞麻子柏生成苷元開環(huán)異落葉松樹 酯酹(secoisolariciresinol, SEC0)。亞麻子柏富含開環(huán)異落葉樹脂酹二葡萄糖苷(secoisolariciresinol diglucoside, SDG)。SECO可以經(jīng)人體腸道菌可繼續(xù)轉(zhuǎn)化生成腸二醇(enterdiol, END)和腸內(nèi)酯(enterolactone, ENL)。END和ENL為國(guó)際公認(rèn)的活性最強(qiáng)的植物雌激素類成分，具有植物雌激素樣生物學(xué)活性和抑制腫瘤、抗氧化、預(yù)防和治療心血管疾病等多方面藥理活性，對(duì)防治更年期綜合征、骨質(zhì)疏松、心血管疾病、血脂升高、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等癥，具有良好的藥用價(jià)值。本發(fā)明提供的單形擬桿菌(Bacteroides uniformis)對(duì)其他天然產(chǎn)物,如異黃酮苷(大豆苷、染料木苷、黃豆苷)、黃酮苷(異槲皮苷、朝霍苷D)、苯丙素苷(松柏苷)、香豆素苷(瑞香苷七葉苷)、木脂素苷(牛蒡子苷、連翹苷、松脂醇二葡萄糖苷)、蒽醌苷(番瀉苷)和環(huán)烯醚帖苷(京尼平苷和桃葉珊瑚苷)等化合物也具有脫葡萄糖糖基的轉(zhuǎn)化活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株單形擬桿菌及其脫葡萄糖糖基活性的應(yīng)用。本發(fā)明提供的單形擬桿菌(Bacteroides uniformis),分離自中國(guó)人的人體腸道內(nèi)容物，菌株名稱為Strain-I，已于2011年5月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào))，保藏號(hào)為CGMCCNo.4897。本發(fā)明保護(hù)單形擬桿菌(Bacteroidesuniformis) Strain-I CGMCC No. 4897在水解葡萄糖苷類化學(xué)成分而轉(zhuǎn)化產(chǎn)生相應(yīng)次級(jí)苷或苷元中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)單形擬桿菌(Bacteroidesuniformis) Strain-I CGMCC No. 4897對(duì)含有葡萄糖苷類成分的生藥的生物轉(zhuǎn)化而獲取相應(yīng)次級(jí)苷或苷元中的應(yīng)用。所述發(fā)酵單形擬桿菌(Bacteroidesuniformis) Strain-I CGMCC No. 4897 所用的培養(yǎng)基可為在無碳源培養(yǎng)基中加入底物得到的培養(yǎng)基；所述底物為亞麻子、海藻、芝麻子柏、黑麥麩、油菜籽柏、小麥麩、大麥麩、玉米麩、燕麥麩和牛蒡子中的至少一種。所述無碳源培養(yǎng)基可為如下培養(yǎng)基pH 7-8 ;每升含有NaCl 2~4g, NH4ClO. 5-1. 5g, KH2PO4 2-3g, K2HPO4 1-2. 5g，其余為水。所述無碳源培養(yǎng)基具體可為如下培養(yǎng)基ρΗ7· 5 ;每升含有 NaCl 3g，NH4Cl Ig，KH2PO4 2. 6g, K2HPO4 1.85g，其余為水。所述發(fā)酵單形擬桿菌(Bacteroidesuniformis) Strain-I CGMCC No. 4897 所用的培養(yǎng)基還可為在庖肉培養(yǎng)基中加入底物得到的培養(yǎng)基；所述底物為亞麻子、海藻、芝麻子柏、黑麥麩、油菜籽柏、小麥麩、大麥麩、玉米麩、燕麥麩和牛蒡子中的至少一種。所述發(fā)酵單形擬桿菌(Bacteroidesuniformis) Strain-I CGMCC No. 4897所用的培養(yǎng)基中，所述底物的濃度具體可為5-60mg/mL。所述發(fā)酵單形擬桿菌(Bacteroidesuniformis) Strain-I CGMCC No. 4897可在缺氧條件下進(jìn)行。所述發(fā)酵單形擬桿菌(Bacteroides uniformis) Strain-I CGMCC No. 4897具體可在氧分壓3. 03975-10. 1325kPa的條件下進(jìn)行。所述發(fā)酵單形擬桿菌(Bacteroidesuniformis) Strain-I CGMCC No. 4897 也可在有氧條件下進(jìn)行。本發(fā)明提供的單形擬桿菌(Bacteroidesuniformis) Strain-I CGMCC No. 4897可用于生物轉(zhuǎn)化葡萄糖苷類成分生產(chǎn)次基苷或苷元，而現(xiàn)有技術(shù)中，還未見利用單形擬桿菌進(jìn)行水解反應(yīng)的報(bào)道，本發(fā)明為從葡萄糖苷類成分或富含葡萄糖苷類成分生藥中生產(chǎn)有活性的苷元類物質(zhì)一種廉價(jià)、環(huán)保、高效的新方法，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。


圖I為不同培養(yǎng)時(shí)間混合腸道菌轉(zhuǎn)化亞麻子柏培養(yǎng)液的HPLC圖。圖2為稀釋菌液在厭氧平板上菌落生長(zhǎng)情況。圖3為四種典型菌落轉(zhuǎn)化亞麻子柏的培養(yǎng)液HPLC圖。圖4為菌株Strain-I及相關(guān)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖5為不同培養(yǎng)時(shí)間Strain-I轉(zhuǎn)化SDG的培養(yǎng)液HPLC色譜圖。圖6為可作為底物的不同葡萄糖苷類分子結(jié)構(gòu)式圖。圖7為Strain-I亞麻子柏培養(yǎng)液(5mL)中SECO的量-時(shí)變化曲線。圖8為Strain-I亞麻子柏培養(yǎng)液(2L)中SECO的量-時(shí)變化曲線。圖9為不同培養(yǎng)時(shí)間Strain-I厭氧培養(yǎng)和有氧培養(yǎng)的培養(yǎng)液HPLC色譜圖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。實(shí)施例均設(shè)三次重復(fù)試驗(yàn)，定量結(jié)果取平均值。以下實(shí)施例中所用的無碳源培養(yǎng)基的配制方法如下磷酸緩沖液(PhosphateBuffered Saline, PBS, pH 7. 4)制備方法稱取KH2P0426g和K2HP0418. 5g溶于I升蒸餾水中，保存于4°C冰箱。無碳源培養(yǎng)基的的配制方法稱取NaCl 3g、NH4Cl lg、磷酸緩沖液IOOmL,混合,蒸餾水定容至I升；調(diào)pH為7. 5。實(shí)施例I、單形擬桿菌(Strain-I)的分離及鑒定研究背景亞麻子(flaxseed ；Lini Semen)為亞麻科植物亞麻(Linumusitatissimum L.)的干燥成熟種子。性甘味平，歸肺、肝、大腸經(jīng)。具有潤(rùn)腸通便、養(yǎng)血祛風(fēng)的功效，臨床用于治療腸燥便秘、皮膚干燥、瘙癢和脫發(fā)等癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明亞麻子具有抗腫瘤(乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤)、抗氧化、降血糖、降血脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等活性。亞麻子含有豐富的油脂(a-Iinolenic acid含量為57% )，為重要的油料作物，脫脂后的植物殘?jiān)鼇喡樽影刂懈缓局仡惓煞郑許DG-3-羥基-3-甲基戊二酸低聚體的含量最高(達(dá)1% 4% )。在體內(nèi)SDG可被人體腸道菌轉(zhuǎn)化為SEC0，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化產(chǎn)生END和ENL。由于亞麻子中的SDG以低聚體形式存在，用常規(guī)化學(xué)方法提取SDG或SECO的工藝中將首先需要加入酸或堿水解，工業(yè)化生產(chǎn)將污染環(huán)境。因此，本研究嘗試了采用腸道菌微生物轉(zhuǎn)化的方法來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)方法進(jìn)行獲取SECO的發(fā)酵工藝研究。
一、亞麻子柏中SDG的含量測(cè)定I、實(shí)驗(yàn)方法精密稱取Ig亞麻子柏粉末，加入15mL50%乙醇溶液，超聲提取30min(功率400W，溫度40°C )，提取后3000r/min離心15min，取上清液。提取2次，合并兩次的提取液，加入Iml 2mol/L NaOH溶液，使其NaOH的濃度為O. 25mol/L,室溫水解3h，然后用6mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH，使pH值在4 6之間。將溶液加入50mL容量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度，經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過濾后，進(jìn)液相檢測(cè)，進(jìn)樣量為20 μ L。平行測(cè)定三份。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果亞麻子柏中SDG的含量為6. 7mg/g。二、腸道菌混合菌種培養(yǎng)I、培養(yǎng)方法(I)增菌配制5mL庖肉培養(yǎng)基(液體)，加入ImL液體石蠟，121°C高壓滅菌30分鐘。另取凍存的人體腸道菌樣本O. 5mL(該樣本分離自中國(guó)人的人體腸道內(nèi)容物)，接種于庖肉培養(yǎng)基中，厭氧條件下37°C增菌24小時(shí)。(2)接種配制5mL無碳源培養(yǎng)基，加入亞麻子柏O. 5g作為底物，用Iml液體石臘覆蓋，121°C高壓滅菌30分鐘。接種增菌后的菌液O. 5mL于無碳源培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)。(3)樣本檢測(cè)每隔24h取200 μ L培養(yǎng)液,加入400 μ L水飽和正丁醇萃取，5000rpm/min離心10分鐘，取上清液320 μ L于離心管中，氮?dú)獯蹈?加入200 μ L色譜甲醇，12500rpm/min離心3分鐘，取上清液20 μ L，HPLC檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示培養(yǎng)液在24h可轉(zhuǎn)化產(chǎn)生SEC0，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，發(fā)酵液中SECO的含量增加(檢測(cè)至第8天)(圖I)。三、活性菌的篩選I、腸道菌混合菌種分離單菌采用稀釋涂平板方法從腸道菌混合菌種中挑選單菌。具體方法如下(I)增菌配制5mL庖肉培養(yǎng)基，加入ImL液體石蠟，121°C高壓滅菌30分鐘。另取腸道菌混合菌種菌液O. 5mL，接種于庖肉培養(yǎng)基中，厭氧條件下37°C增菌24小時(shí)。(2)挑選單克隆菌落
吸取增菌后菌液10 μ L，加入90 μ L0. 9%生理鹽水10倍梯度稀釋，得到101、IO2. .. IO6倍稀釋菌液。吸取IO5UO6倍稀釋液各10 μ L，接種環(huán)均勻涂布到厭氧瓊脂平板上，將平板置于厭氧罐中，37°C培養(yǎng)48h后觀察。培養(yǎng)結(jié)果表明接種IO6稀釋菌液的厭氧瓊脂平板上菌落生長(zhǎng)較好，可分清單個(gè)菌落，菌落大小不一，表面觀光滑，圓形，濕潤(rùn)，邊緣整齊(圖2)。根據(jù)形態(tài)可分為大、中、小、最小四種不同菌落,分別編號(hào)為Strain-I、Strain-II、Strain-Ill、Strain-IV0挑取四種典型的菌落接種到庖肉培養(yǎng)基中，37°C增菌48h。吸取增菌液500 μ L接種到含亞麻子柏的無碳源培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)72h，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。可見Strain-I能轉(zhuǎn)化產(chǎn)生SEC0，而其它菌落未見任何轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，因此Strain-I即為SECO活性菌(圖3)。3、Strain-I菌的菌種鑒定(I)形態(tài)鑒定
在37°C、氧分壓3. 03975-10. 1325kPa的缺氧條件下，Strain-I在厭氧瓊脂平板培 養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，呈淺黃色菌落，鏡檢為革蘭陰性菌，無芽胞。(2)生化鑒定Strain-I可以發(fā)酵乳糖和麥芽糖，并產(chǎn)酸產(chǎn)氣。(3) 16S rRNA 測(cè)序分析將Strain-I進(jìn)行16S rRNA測(cè)序分析，與Strain-I相似度較高的腸道菌的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系樹如圖4所示。與所測(cè)菌株Strain-I的16S rRNA基因匹配程度最高的為 Bacteroides uniformis mat-344,與 Strain-I 匹配度 100 % ;匹配程度為 99 % 的有 Bacteroides uniformis JCM 5828、Bacteroides uniformis 23-18、Bacteroidesuniformis NB-14、Bacteroides umiformis NB-13。因此，Strain-I 初步鑒定為Bacteroides uniformis。實(shí)施例2、Strain-I對(duì)SDG的轉(zhuǎn)化作用一、實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確稱取SDG 5.011^加入251^庖肉液體培養(yǎng)基中，1211高壓蒸汽滅菌301^11。接入2mL Strain-I增菌液，37°C恒溫培養(yǎng)。開始24h內(nèi)每3小時(shí)取樣檢測(cè)，之后每6小時(shí)取樣分析。平行進(jìn)行三份實(shí)驗(yàn)。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果培養(yǎng)至12h時(shí)，培養(yǎng)液中檢測(cè)到SDG脫去一分子葡萄糖的中間代謝產(chǎn)物S。在15h的時(shí)候，培養(yǎng)液中有SECO產(chǎn)生。隨著培養(yǎng)的繼續(xù)進(jìn)行，培養(yǎng)液中SECO的量逐漸增加，在36h時(shí)，培養(yǎng)液中的SDG完全轉(zhuǎn)化為SEC0，同時(shí)中間代謝產(chǎn)物S也檢測(cè)不到。最后SDG的轉(zhuǎn)化率為 82. 3±3. 4%，見圖 5。實(shí)施例3、Strain-I對(duì)不同葡萄糖苷類成分的轉(zhuǎn)化活性一、不同葡萄糖苷類底物選擇大豆苷、染料木苷、異槲皮苷、虎杖苷、牛蒡子苷、連翹苷、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，HPLC檢測(cè)純度90%以上。瑞香苷由中國(guó)藥科大學(xué)植物化學(xué)教研室提供，HPLC檢測(cè)其純度為90%以上。七葉苷購(gòu)買自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，HPLC檢測(cè)其純度為80%以上。番瀉苷購(gòu)買自成都曼思特生物制品有限公司，HPLC檢測(cè)其純度為98%以上。桃葉珊瑚苷購(gòu)自上海順勃生物工程技術(shù)有限公司，HPLC檢測(cè)其純度為98%以上。黃豆苷分離自大豆提取物，為大豆經(jīng)丙酮提取和無水乙醇結(jié)晶后，用S^hadexLH-20分離得到，HPLC檢測(cè)純度90%以上。朝霍苷D分離自朝鮮淫羊藿地上部分提取物，經(jīng)溶劑法、色譜法獲得HPLC檢測(cè)純度為90%以上。松柏苷分離自筒鞘蛇菰提取物，經(jīng)溶劑法、色譜法獲得，HPLC檢測(cè)純度為90%以上。不同葡萄糖苷類分子結(jié)構(gòu)式見圖6。二、實(shí)驗(yàn)方法I、增菌配制500mL體系的庖肉培養(yǎng)基，覆蓋50mL液體石蠟，121°C高壓滅菌30分 鐘。取凍存的Strain-I樣本lmL，接種于庖肉培養(yǎng)基中，厭氧條件下37°C增菌24小時(shí)。2、接種在無碳源培養(yǎng)基(2L)中分別加入不同的底物(20mg/mL)，用液體石蠟覆蓋，121°C高壓滅菌30分鐘；以體積比I : 10分別接種增菌后的Strain-I菌液，37°C培養(yǎng)。3、檢測(cè)每隔24h取200 μ L培養(yǎng)液,加入400 μ L水飽和正丁醇萃取，5000rpm/min離心10分鐘，取上清液320 μ L于離心管中，氮?dú)獯蹈?加入200 μ L色譜甲醇，12500rpm/min離心3分鐘，取上清液20 μ L，HPLC檢測(cè)。三、檢測(cè)結(jié)果不同底物的12_48hr培養(yǎng)液中均可檢測(cè)到苷元(見表I)。表I不同時(shí)間點(diǎn)不同底物培養(yǎng)液中苷兀的HPLC峰面積
權(quán)利要求
1.單形擬桿菌Bacteroidesubiformis Strain-I (CGMCC No. 4897)脫葡萄糖糖基水解反應(yīng)活性的應(yīng)用。
2.單形擬桿菌Bacteroidesuniformis Strain-I (CGMCC No. 4897)轉(zhuǎn)化葡萄糖苷類成分產(chǎn)生相應(yīng)苷元的應(yīng)用。
3.單形擬桿菌Bacteroidesuniformis Strain-I (CGMCC No. 4897)轉(zhuǎn)化含葡萄糖苷類成分的生藥而產(chǎn)生相應(yīng)苷元的應(yīng)用。
4.單形擬桿菌Bacteroidesuniformis Strain-I (CGMCC No. 4897)轉(zhuǎn)化含葡萄糖苷類成分的粗提物而產(chǎn)生相應(yīng)苷元的應(yīng)用。
5.利用單形擬桿菌Bacteroidesuniformis Strain-I (CGMCC No. 4897)的水解反應(yīng)活性發(fā)酵脫脂亞麻子而獲得開環(huán)異落葉松樹脂酚的應(yīng)用。
6.利用單形擬桿菌Bacteroidesuniformis Strain-I (CGMCC No. 4897)的水解反應(yīng)活性發(fā)酵開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷(SDG)粗提物而獲得開環(huán)異落葉松樹脂酚的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵單形擬桿菌Bacteroidesuniformis Strain-I所用的底物包括開環(huán)異落葉松樹脂酹二葡萄糖苷(SDG)、大豆苷、染料木苷、黃豆苷、異槲皮苷、朝霍苷D、虎杖苷、松柏苷、瑞香苷、七葉苷、牛蒡子苷、連翹苷、松脂醇二葡萄糖苷、番瀉苷、京尼平苷和桃葉珊瑚苷中的任何一種。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵單形擬桿菌Bacteroidesuniformis Strain-I (CGMCC No. 4897)所用的底物包括含權(quán)利要求7中所述底物的生藥中的任何一種。
9.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵單形擬桿菌Bacteroidesuniformis Strain-I所用的底物包括含權(quán)利要求7中所述底物生藥的任何一種粗提物。
10.如權(quán)利要求I至9中任一所述的方法,其特征在于所述單形擬桿菌Bacteroidesuniformis Strain-I是在有氧或缺氧條件下進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株單形擬桿菌(Bacteroides uniformis Strain-I)及其脫葡萄糖糖基的水解反應(yīng)活性。本發(fā)明提供的單形擬桿菌可水解葡萄糖苷類化學(xué)成分而產(chǎn)生相應(yīng)的苷元，可應(yīng)用于活性苷元的制備。本發(fā)明為從葡萄糖苷類成分、含葡萄糖苷類成分生藥及含葡萄糖苷類成分的粗提物中生物轉(zhuǎn)化有活性的苷元類物質(zhì)提供了一種高效、環(huán)保、成本低廉的方法。
文檔編號(hào)C12P17/06GK102796676SQ201110137980
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月26日
發(fā)明者楊東輝, 劉樹林, 朱紅云, 李淼鑫, 蔡少青, 庫(kù)寶善 申請(qǐng)人:北京大學(xué)