專利名稱：一種肝素寡糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肝素寡糖的制備方法。
背景技術(shù)：
肝素寡糖與普通肝素相比，同等劑量下，抗凝作用小于肝素，抗血栓作用卻明顯強于肝素，其分子量小，生物利用度高，血漿半衰期長，不與肝素結(jié)合蛋白結(jié)合，有更穩(wěn)定的量效關(guān)系，較少與血小板結(jié)合，不易引起血小板減少。所以，肝素寡糖既能有效防止血栓形成， 又能減少出血等不良反應(yīng)，是一種安全有效的抗血栓藥物，可作肝素替代物。不同聚合度的肝素寡糖能和不同蛋白因子作用，從而呈現(xiàn)不同的生物學作用。所以，肝素寡糖的生產(chǎn)具有重要意義?，F(xiàn)有技術(shù)有化學裂解法和酶解法，化學裂解法肝素反應(yīng)劇烈，工藝復(fù)雜，肝素活性功能不同程度被破壞。酶解法反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)率高，對環(huán)境無毒性，操作簡便，易控制， 成為當前生物學研究的熱點，國內(nèi)外作了一些相關(guān)研究，但目前尚未出現(xiàn)一種成本比較低的酶解法生產(chǎn)工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題在于提供一種肝素酶的制備方法。一種肝素寡糖的制備方法，包括如下步驟1)肝素的酶法降解取肝素20mg，溶解于Iml反應(yīng)液Digestion Buffer (25mM醋酸銨，25yMCaC12，0. 25μ g/ml BSA, ρΗ7· 4)中，加入肝素酶 I、II、III 各 500uL，37°C恒溫振蕩反應(yīng)72小時，其中每12小時補充一次肝素酶，反應(yīng)結(jié)束后，100°C水浴加熱15min，并在 12000rpm下高速離心lOmin，取上清備用。2)肝素寡糖的分級純化將步驟1得到的寡糖片段經(jīng)過Bio-gel P2柱進行分級純化，收集凍干，即成成品。經(jīng)過降解的肝素寡糖片段，在鏈端具有不飽和雙鍵，因此在232nm可測得明顯的紫外吸收值。收集分級后的流出組分，通過測定紫外吸收，可以確定寡糖片段的出峰位置。本發(fā)明工藝簡單，操作方便，可實現(xiàn)較高產(chǎn)率。


圖1是肝素寡糖分級示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明一種實施例，一種肝素寡糖的制備方法，包括如下步驟1)肝素的酶法降解取肝素20mg，溶解于Iml反應(yīng)液Digestion Buffer (25mM醋酸銨，25yMCaC12，0. 25μ g/ml BSA, ρΗ7· 4)中，加入肝素酶 I、II、III 各 500uL，37°C恒溫振蕩反應(yīng)72小時，其中每12小時補充一次肝素酶，反應(yīng)結(jié)束后，100°C水浴加熱15min，并在 12000rpm下高速離心lOmin，取上清備用。
2)肝素寡糖的分級純化將步驟1得到的寡糖片段經(jīng)過Bio-gel P2柱進行分級純化，收集凍干，即成成品。經(jīng)過降解的肝素寡糖片段，在鏈端具有不飽和雙鍵，因此在232nm可測得明顯的紫外吸收值。收集分級后的流出組分，通過測定紫外吸收，可以確定寡糖片段的出峰位置。 如圖1所示，dp2為二糖峰，收集凍干，即為二糖樣。與發(fā)明類似的同類方法的等效變換，均落入本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1. 一種肝素寡糖的制備方法，包括如下步驟1)肝素的酶法降解取肝素20mg，溶解于Iml反應(yīng)液DigestionBuffer中，加入肝素酶I、II、III各500uL，37°C恒溫振蕩反應(yīng)72小時，其中每12小時補充一次肝素酶，反應(yīng)結(jié)束后，100°C水浴加熱15min，并在12000rpm下高速離心lOmin，取上清備用；2)肝素寡糖的分級純化將步驟1得到的寡糖片段經(jīng)過Bio-gelP2柱進行分級純化， 收集凍干，即得成品。
全文摘要
一種肝素寡糖的制備方法，包括如下步驟1)肝素的酶法降解取肝素20mg，溶解于1ml反應(yīng)液Digestion Buffer中，加入肝素酶I、II、III各500uL，37℃恒溫振蕩反應(yīng)72小時，其中每12小時補充一次肝素酶，反應(yīng)結(jié)束后，100℃水浴加熱15min，并在12000rpm下高速離心10min，取上清備用；2)肝素寡糖的分級純化將步驟1得到的寡糖片段經(jīng)過Bio-gelP2柱進行分級純化，收集凍干，即得成品。
文檔編號C12P19/00GK102206690SQ201110064518
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月13日
發(fā)明者李海生, 王香 申請人:廣元市海鵬生物科技有限公司