專利名稱：實(shí)時(shí)定量pcr體外檢測(cè)單堿基損傷修復(fù)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA單堿基損傷修復(fù)檢測(cè)技術(shù)，具體地說是一種實(shí)時(shí)定量PCR體外檢測(cè)單堿基損傷修復(fù)技術(shù)。
背景技術(shù)：
由活性氧，烷基化及電離輻射誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)通常通過單堿基切除修復(fù)(base excision r印air，BER)途徑，因此BER在維持基因組完整性方面發(fā)揮重要作用。體外研究細(xì)胞BER的能力對(duì)于我們了解衰老，腫瘤及退行性疾病等機(jī)制具有非常重要的意義。BER包括DNA單鏈斷裂的修復(fù)(SSBR)過程，堿基丟失后AP位點(diǎn)切除，置換損傷核苷酸并再連接。DNA BER不同階段的修復(fù)酶如APEl，OGGl，UNG，DNA聚合酶和連接酶的活性應(yīng)當(dāng)能夠被準(zhǔn)確的檢測(cè)到。之前大多數(shù)BER體外研究都運(yùn)用32P放射性同位素標(biāo)記寡核苷酸做底物，但此方法只能給出半定量結(jié)果，而且放射標(biāo)記方法限制了其在禁止放射性同位素的一般實(shí)驗(yàn)室研究 (以免造成環(huán)境污染及人體傷害)。這里，我們開發(fā)了一個(gè)全新的有關(guān)BER體外檢測(cè)的實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)技術(shù)，并已經(jīng)開發(fā)出相應(yīng)的試劑盒。它完全可以量化檢測(cè)BER所需酶的活性。SSBR試驗(yàn)，DNA連接酶和糖苷酶活力實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在此檢測(cè)BER模型，qPCR結(jié)果的確與其酶活力有很好的線性相關(guān)性。這些研究結(jié)果確立了 qPCR作為體外BER檢測(cè)技術(shù)的可行性，并且具備比現(xiàn)行其它BER 檢測(cè)技術(shù)更多的優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種全新可定量的以PCR為基礎(chǔ)的單堿基損傷修復(fù)檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的另一目的在于提供上述定量PCR體外檢測(cè)單堿基損傷修復(fù)的引物。本發(fā)明的再一目的在于提供上述定量PCR體外檢測(cè)單堿基損傷修復(fù)的探針。本發(fā)明的發(fā)明思路基于下述兩方面的考慮。第一，在生命進(jìn)程中，DNA損傷尤其是DNA氧化損傷與腫瘤發(fā)生，人體衰老和各種疾病的發(fā)展密切相關(guān)。因此，研究DNA的堿基損傷及修復(fù)能力的變化具有重要的意義，是當(dāng)今科學(xué)研究的重點(diǎn)；第二，至今為止，體外研究DNA損傷修復(fù)能力的方法仍以含有特定損傷堿基的同位素標(biāo)記的寡核苷酸為主，然而此方法只能給出半定量結(jié)果，而且放射標(biāo)記方法限制了其在禁止放射性同位素的一般實(shí)驗(yàn)室研究(以免造成環(huán)境污染及人體傷害)。開發(fā)一種新的非同位素的體外分析單堿基損傷修復(fù)能力的方法變得非常重要。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，我們利用兩年時(shí)間建立起了以實(shí)時(shí)定量PCR (qPCR)為基礎(chǔ)的檢測(cè)DNA單堿基損傷修復(fù)的技術(shù)。它的主要技術(shù)特點(diǎn)是以內(nèi)參為基礎(chǔ)的絕對(duì)定量和獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)DNA損傷修復(fù)的超敏定量。本發(fā)明提供了四種用以實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)含損傷堿基的DNA寡核苷酸模板。它可檢測(cè)的損傷堿基包括DNA單鏈斷裂損傷、DNA單堿基缺失損傷和尿嘧啶-DNA糖基化酶活性。
為了達(dá)成本發(fā)明上述目的，本發(fā)明采用如下具體技術(shù)方案
一種實(shí)時(shí)定量PCR體外檢測(cè)單堿基損傷修復(fù)試劑盒，所述試劑盒的組成如下 標(biāo)準(zhǔn)品
IOX檢測(cè)緩沖液
5X低鹽細(xì)胞裂解液
2X細(xì)胞核蛋白或線粒體蛋白提取液
20X檢測(cè)底物
2X qPCR損傷修復(fù)緩沖液
所述qPCR損傷修復(fù)緩沖液包括taq酶、dNTP探針和引物。所述檢測(cè)底物為DNA單鏈斷裂損傷修復(fù)能力檢測(cè)底物，該底物包括模板A和模板 D ；所述模板A包括SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2及SEQ ID No. 5 ；所述模板D包括SEQ ID No. 6 及 SEQ ID No. 7。 所述檢測(cè)底物為單堿基缺失損傷修復(fù)能力檢測(cè)底物，該底物包括模板B和模板D ； 所述模板 B 包括 SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 2 及 SEQ ID No. 5 ；所述模板 D 包括 SEQ ID No. 6 及 SEQ ID No. 7。所述檢測(cè)底物為尿嘧啶-DNA糖基化酶活性檢測(cè)檢測(cè)底物，該底物包括模板C和模板D，所述模板C包括SEQ ID No. 4及SEQ ID No. 5 ；所述模板D包括SEQ ID No. 6及SEQ ID No. 7。所述引物為SEQ ID No. 8 Forward-S CGGGGCTCTCCAGAACATC SEQ ID No. 9 Reverse-AS ATGACCTTGCCCACAGCCT
所述探針為 SEQ ID No. 10 Probe 1 FAM-CAATTCCCGGACGTCTAAACCAAACCACTTTC-TAMRA SEQ ID No. 11 Probe 2 !"et-CCGGGACCTGACTGACTACCTCATGA-FAMRA。一種實(shí)時(shí)定量PCR體外檢測(cè)單堿基損傷修復(fù)用引物，所述引物序列為SEQ ID No. 8 及 SEQ ID No. 9 所示。一種實(shí)時(shí)定量PCR體外檢測(cè)單堿基損傷修復(fù)用探針，所述探針序列為SEQ ID No. 10 及 SEQ ID No. 11 所示。一種實(shí)時(shí)定量PCR體外檢測(cè)單堿基損傷修復(fù)用檢測(cè)底物，所述底物包括序列表 SEQ ID No. 1 至 SEQ ID No. 4 中的至少一個(gè)寡核苷酸，及 SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6 和 SEQ ID No. 7。所述檢測(cè)底物為SEQ ID No. 1、2、5 或 SEQ ID No. 3、2、5 或 SEQ ID No. 4、5，及 SEQ ID NO. 6、7。本發(fā)明為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)底物的不同可以制備成DNA單鏈斷裂損傷修復(fù)能力檢測(cè)試劑盒、單堿基缺失損傷修復(fù)能力檢測(cè)試劑盒及尿嘧啶-DNA糖基化酶活性檢測(cè)檢測(cè)試劑盒。 本發(fā)明主要用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明所述體外損傷修復(fù)模板如圖1 A、B、C、D所示。從圖1可以看出，本發(fā)明的四大特點(diǎn)決定了該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)及實(shí)用性
第一由于擴(kuò)增內(nèi)參和損傷堿基qPCR模板的引物相同，因此可由內(nèi)參的量算出損傷堿基修復(fù)的量。
第二 由于互補(bǔ)模板僅有14個(gè)堿基與引物2互補(bǔ)，因此在qPCR過程中不能與引物 2產(chǎn)生退火，保證了損傷修復(fù)檢測(cè)的特異性。第三互補(bǔ)模板的3 ‘_末端為雙脫氧寡核苷酸，防止了自身的延伸。第四檢測(cè)損傷模板的探針和檢測(cè)內(nèi)參模板的探針標(biāo)有不同的熒光基團(tuán)，因此可在同一個(gè)qPCR體系中檢測(cè)來實(shí)現(xiàn)損傷模板修復(fù)的絕對(duì)定量。


圖1為qPCR單堿基損傷修復(fù)檢測(cè)模式圖。圖2為qPCR檢測(cè)單堿基損傷修復(fù)連接酶和聚合酶活性的分析結(jié)果。圖3為qPCR檢測(cè)單堿基損傷修復(fù)敏感性和特異性分析結(jié)果。圖4為qPCR檢測(cè)單堿基損傷修復(fù)尿嘧啶糖苷酶活性的特異性和敏感性分析結(jié)^ ο圖5為qPCR檢測(cè)細(xì)胞核提取蛋白的單堿基損傷修復(fù)連接酶的活性。圖6為利用細(xì)胞蛋白提取物對(duì)傳統(tǒng)同位素法與qPCR法所得DNA單鏈斷裂修復(fù)結(jié)果進(jìn)行比較分析。圖7為利用細(xì)胞蛋白提取物對(duì)傳統(tǒng)同位素法與qPCR法所得尿嘧啶單堿基損傷復(fù)活結(jié)果進(jìn)行比較分析。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)時(shí)定量PCR體外檢測(cè)單堿基損傷修復(fù)試劑盒的具體實(shí)驗(yàn)方法步驟為 實(shí)施例1
第一模板退火
分別取200 pmol SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 7所示的寡核苷酸(Primerl-7)，依據(jù)表1組合并分別加入到四個(gè)EP管中。表1為模板A、B、C、D。模板A由I^rimerl (SEQ ID No. l)、Primer2 (SEQ ID No. 2)及 Primer5 (SEQ ID No. 5)組成；模板 B 由 Primer3 (SEQ ID No. 3)、Primer2 (SEQ ID No. 2)及 Primer5 (SEQ ID No. 5)組成；模板 C 由 Primer4 (SEQ ID No. 4)及 Primer5 (SEQ ID No. 5)組成；模板 D 由 Primer6 (SEQ ID No. 6)及 Primer7 (SEQ ID No. 7)組成。在四個(gè)EP管中加入20ul IOx退火緩沖液(250mM NaCl ；20 mM Tris-Cl,pH=8. 0 ;10mM EDTA)，用水補(bǔ)到200ul后72°C退火10分鐘，然后逐漸降到室溫。 儲(chǔ)存_20°C備用。表1模板A、B、C、D組合
權(quán)利要求
1.一種實(shí)時(shí)定量PCR體外檢測(cè)單堿基損傷修復(fù)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的組成如下標(biāo)準(zhǔn)品IOX檢測(cè)緩沖液5X低鹽細(xì)胞裂解液2X細(xì)胞核蛋白或線粒體蛋白提取液20X檢測(cè)底物2X qPCR損傷修復(fù)緩沖液所述qPCR損傷修復(fù)緩沖液包括taq酶、dNTP探針和引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)底物為DNA單鏈斷裂損傷修復(fù)能力檢測(cè)底物，該底物包括模板A和模板D ；所述模板A包括SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2 及 SEQ ID No. 5 ；所述模板 D 包括 SEQ ID No. 6 及 SEQ ID No. 7。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)底物為單堿基缺失損傷修復(fù)能力檢測(cè)底物，該底物包括模板B和模板D ；所述模板B包括SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 2及 SEQ ID No. 5 ；所述模板 D 包括 SEQ ID No. 6 及 SEQ ID No. 7。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)底物為尿嘧啶-DNA糖基化酶活性檢測(cè)檢測(cè)底物，該底物包括模板C和模板D，所述模板C包括SEQ ID No. 4及SEQ ID No. 5 ；所述模板 D 包括 SEQ ID No. 6 及 SEQ ID No. 7。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述引物為SEQID No. 8 及 SEQ ID No. 9 所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述探針為SEQID No. 10及SEQ ID No. 11所示。
7.一種實(shí)時(shí)定量PCR體外檢測(cè)單堿基損傷修復(fù)用引物，其特征在于，所述引物序列為 SEQ ID No. 8 及 SEQ ID No. 9 所示。
8.一種實(shí)時(shí)定量PCR體外檢測(cè)單堿基損傷修復(fù)用探針，其特征在于，所述探針序列為 SEQ ID No. 10 及 SEQ ID No. 11 所示。
9.一種實(shí)時(shí)定量PCR體外檢測(cè)單堿基損傷修復(fù)用檢測(cè)底物，其特征在于，所述底物包括序列表SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 4中的至少一個(gè)寡核苷酸，及SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6 和 SEQ ID No. 7。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)底物，其特征在于，所述檢測(cè)底物為SEQID No. 1,2,5 或 SEQ ID No. 3、2、5 或 SEQ ID No. 4、5，及 SEQ ID NO. 6、7。
全文摘要
一種實(shí)時(shí)定量PCR體外檢測(cè)單堿基損傷修復(fù)試劑盒，所述試劑盒的組成如下10X檢測(cè)緩沖液、5X低鹽細(xì)胞裂解液、2X細(xì)胞核蛋白或線粒體蛋白提取液、20X檢測(cè)底物、2XqPCR損傷修復(fù)緩沖液，所述修復(fù)緩沖液包括taq酶、dNTP、探針和引物。本發(fā)明由于擴(kuò)增內(nèi)參和損傷堿基qPCR模板的引物相同，因此可由內(nèi)參的量算出損傷堿基修復(fù)的量。由于互補(bǔ)模板僅有14個(gè)堿基與引物2互補(bǔ)，因此在qPCR過程中不能與引物2產(chǎn)生退火，保證了損傷修復(fù)檢測(cè)的特異性?；パa(bǔ)模板的3′末端為雙脫氧寡核苷酸，防止了自身的延伸。檢測(cè)損傷模板的探針和檢測(cè)內(nèi)參模板的探針標(biāo)有不同的熒光基團(tuán)，因此可在同一個(gè)qPCR體系中檢測(cè)來實(shí)現(xiàn)損傷模板修復(fù)的絕對(duì)定量。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102181528SQ201110064338
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月9日
發(fā)明者孫玉, 張洪海, 張玉林, 李寧, 石英, 金榮華, 陳德喜, 魏飛力 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院