專利名稱：：一種hcv蛋白酶抑制劑篩選模型的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種HCV蛋白酶抑制劑篩選模型，特別涉及一種HCV蛋白酶抑制劑篩選模型的構建與應用。
背景技術：
：丙型肝炎病毒OfepatitisCVirus,HCV)感染嚴重危害人類生命健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全世界有超過I.7億人受到HCV的慢性感染(SyT，Jamal麗.EpidemiologyofhepatitisCvirus(HCV)infection.IntJMedSci.2006,3(2):41-6)。我國有約4000萬HCV感染患者，HCV感染已成為嚴重的世界公共衛(wèi)生問題之一。HCV感染可轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝?，甚至發(fā)展為肝硬化和肝癌。當前采用的最有效的治療方案是α-干擾素和利巴韋林聯(lián)合治療，但這種治療方法療效低于50%，且費用高，副作用大，因此，研制新的抗HCV藥物是當前重要而且緊迫的任務。HCV屬于黃病毒科(flaviviridae)，其基因組為單股、正鏈RNA。HCV基因組全長約9.6kb，由兩側(cè)非編碼區(qū)(UTR)及位于其間的單一開放閱讀框組成。5'-UTR含有內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)，非常保守，核糖體與其結(jié)合啟動翻譯過程；3'-UTR對與復制起始有關。開放讀碼框編碼大約30103033個氨基酸的多聚蛋白前體。該蛋白前體在宿主信號肽酶和病毒蛋白酶的共同作用下生成4個結(jié)構蛋白和至少6個非結(jié)構(non-structure，NS)蛋白。按順序依次為core-El-E2-P7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B。其中，C2,El,E2，P7為結(jié)構蛋白區(qū)，在宿主細胞信號肽的作用下分別裂解成核蛋白和包膜蛋白；NS2-NS5為非結(jié)構蛋白區(qū)。HCV多聚蛋白前體的加工過程是結(jié)構蛋白core，El,E2和P7被宿主信號肽酶切開，均固定在膜上。NS2的N端也被宿主信號肽酶切開，NS294-217位氨基酸與NS31-180位氨基酸構成NS2/3絲氨酸蛋白酶，在NS2-NS3連接處產(chǎn)生切割(順式切割)，釋放出NS3(NS3181-631位氨基酸是RNA解旋酶)，NS3絲氨酸蛋白酶對其下游的四個連接位點進行切割，釋放出NS4A，NS4B(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錨定蛋白)，NS5A(RNA結(jié)合蛋白)，NS5B(RNA依賴的RNA聚合酶)(LorenzIC,MarcotrigianoJ,DentzerTG,etal.StructureofthecatalyticdomainofthehepatitisCvirusNS2-3protease[J].Nature,2006,442(7104):831-835.)。HCVNS3蛋白是一個具有多功能生物活性的非結(jié)構蛋白，在HCV復制和致病機制中起著非常關鍵的作用(OtsukaM,KatoN,LanK,etal.HepatitisCVirusCoreProteinEnhancesp53FunctionthroughAugmentationofDNABindingAffinityandTranscriptionalAbility[J],JBiolChem.2000Nov3；275(44):34122-30.)。NS3基因位于丙型肝炎病毒全基因組序列約33005200nt區(qū)域，編碼含有630個氨基酸(1027-1656aa)的NS3蛋白。其N末端1/3具有絲氨酸蛋白酶活性，C末端2/3具有三磷酸核苷酶(NTPase)和RNA解旋酶活性。其中，NS3絲氨酸蛋白酶是HCV整個非結(jié)構蛋白加工和成熟過程中的關鍵酶，它必須在NS4A的輔助作用下，二者形成異源二聚體，才能發(fā)揮酶活性，因此又常被稱為NS3/4A蛋白酶(SatohS,TanjiY,HijikataM,etal.TheN-terminalregionofhepatitisCvirusnonstructuralprotein3(NS3)isessentialforstablecomplexformationwithNS4A[J].JVirol,1995,69(7):4255-4260.)。晶體衍射結(jié)構表明，NS4A中間的中央疏水區(qū)(2134aa)與NS3的N末端22個氨基酸形成β片層，是酶發(fā)揮活性的必需結(jié)構要求(KimJL,MorgensternKA,LinC,etal.CrystalstructureofthehepatitisCvirusNS3proteasedomaincomplexedwithasyntheticNS4Acofactorpeptide[J].Cell,1996,87(2):343-355.)。而NS4A(2134aa)可以被合成的多肽所代替，或通過連接子與NS3的N末端ISOaa直接相連為單鏈蛋白，不影響酶活性功能的發(fā)揮。NS3絲氨酸蛋白酶在4個連接區(qū)域切割多聚蛋白前體，以順式方式催化NS3/NS4A裂解(自我剪切)，反式方式催化NS4A/NS4B、NS4B/NS5A和NS5A/NS5B裂解，釋放出多個重要的病毒活性酶(BartenschlagerR,Ahlborn-LaakeL,MousJ,JacobsenH.Nonstructuralprotein3ofthehepatitisCvirusencodesaserine-typeproteinaserequiredforcleavageattheNS3/4andNS4/5junctions[J].JVirol.1993Jul；67(7)3835-44.；Eckart,M.R.,Selby,M.,Masiarz,F.,etal.ThehepatitisCvirusencodesaserineproteaseinvolvedinprocessingoftheputativenonstructuralproteinsfromtheviralpolyproteinprecursor[J].BiochemBiophysResCommun.1993Apr30；192(2):399-406.)。對各位點的切割效率大小比較為NS5A/NS5B>NS4A/NS4B>>NS4B/NS5A(LandroJA,RaybuckSA,LuongYP,etal.MechanisticroleofanNS4ApeptidecofactorwiththetruncatedNS3proteaseofhepatitisCvirus!elucidationoftheNS4Astimulatoryeffectviakineticanalysisandinhibitormapping.Biochemistry[J].1997Aug5；36(31):9340-9348.；SteinkiihlerC,UrbaniA,TomeiL,BiasiolG,etal.ActivityofpurifiedhepatitisCvirusproteaseNS3onpeptidesubstrates[J],JVirol.1996Oct；70(10):6694-700.)。NS3絲氨酸蛋白酶除參與病毒復制成熟的過程外，還可以抑制細胞內(nèi)抗病毒因子IRF_3(IFN調(diào)節(jié)因子3)的活性和下游干擾素誘導的抗病毒效應，從而抑制細胞內(nèi)抗病毒反應(GaleMJr,FoyEM.EvasionofintracellularhostdefencebyhepatitisCvirus[J].Nature.2005,436(7053)939-945.)。也就是說，抑制NS3絲氨酸蛋白酶的活性，不僅可以阻斷病毒復制，還可以提升的宿主抗病毒反應能力。因此，NS3絲氨酸蛋白酶已經(jīng)成為研制抗HCV藥物和疫苗的重要靶點。鑒于蛋白酶抑制劑在治療HIV感染方面已有成功經(jīng)驗，以蛋白酶為靶標尋找特異有效的治療藥物成為HCV防治的研究熱點。許多研究機構與制藥企業(yè)已經(jīng)開始了HCVNS3絲氨酸蛋白酶選擇性抑制劑的研發(fā)。目前進入臨床試驗的候選藥物VX-950，SCH-503034,ACH-806與MK-7009等與PEG-IFNa聯(lián)用雖然都顯著提高了SVR(提高至55-69%)，但是，他們也都具有較嚴重的副反應，包括皮疹、瘙癢、貧血甚至心、腎功能紊亂。因此，繼續(xù)尋找安全有效的NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑十分必要。由于HCV體外復制模型和小動物感染模型尚未建立，目前主要通過評價病毒蛋白酶的活性來進行藥物篩選。由于候選藥物分子最好可在細胞內(nèi)評價，因此，建立一種細胞水平上的酶活性檢測系統(tǒng)，對于高通量篩選抗HCV藥物具有重要意義。一般而言，評價任何酶抑制劑的體系有動物模型、細胞模型和體外酶活性測定系統(tǒng)三個層次。動物模型雖然最接近于人體環(huán)境，但是由于操作繁瑣，費用高昂，它不適合作為初篩特別是高通量篩選使用。而且針對HCV，尚無小動物感染模型。體外酶活性檢測，是以NS3絲氨酸蛋白酶識別序列連接的融合蛋白為底物，純化的NS3/4A融合蛋白作為酶，借助放射免疫檢測、熒光檢測等多種手段進行檢測，雖然適用于高通量篩選，但是樣品需要進行純化，步驟繁瑣而且活性較低，其反應條件也距離生理條件較遠，也不是理想的篩選模型。細胞模型相比前兩者具有諸多優(yōu)勢1、待測分子可以在細胞內(nèi)直接表達，其結(jié)構及活性都接近生理狀態(tài)，同時可避免純化蛋白的過程；2、可以同時測定藥物的細胞毒性；3、可實現(xiàn)高通量篩選；4、有機會篩選到在細胞內(nèi)代謝的藥物，其代謝產(chǎn)物具有生物活性。因此，建立適當?shù)募毎Ｐ褪钱斍案鞣N酶抑制劑篩選的首選任務
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種HCV蛋白酶抑制劑篩選模型，特別涉及一種HCV蛋白酶抑制劑篩選模型的構建與應用。本發(fā)明提供了一種融合蛋白，為如下(a)或(b)(a)自N末端至C末端依次含有如下元件的蛋白質(zhì)E173N片段、特異多肽片段和E173C片段；(b)自N末端至C末端依次含有如下元件的蛋白質(zhì)E173N片段、特異多肽片段、E173C片段、2A片段和識別所述特異多肽片段的蛋白酶；所述(a)中所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第I至173位氨基酸殘基(與序列6自N末端第I至173位氨基酸殘基相同)所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第187至252位氨基酸殘基所示(與序列6自N末端第187至252位氨基酸殘基相同)；所述特異多肽片段由30個以下的氨基酸殘基組成且可被蛋白酶識別。所述(a)中，所述特異多肽片段可為識別短肽NS5A/5B;所述識別短肽NS5A/5B的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第174至186氨基酸殘基(與序列表的序列6自N末端第174至186氨基酸殘基相同)所示。所述(a)具體可為序列表的序列4所示的蛋白質(zhì)。所述(b)中所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第I至173位氨基酸殘基(與序列4自N末端第I至173位氨基酸殘基相同)所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第187至252位氨基酸殘基所示(與序列4自N末端第187至252位氨基酸殘基相同)；所述2A片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第253至279位氨基酸殘基所示；所述特異多肽片段由30個以下的氨基酸殘基組成且可被所述蛋白酶識別。所述(b)中，所述特異多肽片段可為識別短肽NS5A/5B;所述識別短肽NS5A/5B的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第174至186氨基酸殘基(與序列表的序列4自N末端第174至186氨基酸殘基相同)所示；所述蛋白酶的氨基酸序列可如序列表的序列6自N末端第280至479位氨基酸殘基所示(NS3/4A片段)。所述(b)具體可為序列表的序列6所不的蛋白質(zhì)。編碼所述蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述基因可為DNA分子甲或DNA分子乙。所述DNA分子甲自5’末端至3’末端依次含有如下元件E173N片段的編碼基因、特異多肽片段的編碼基因和E173C片段的編碼基因；所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第I至173位氨基酸殘基(與序列6自N末端第I至173位氨基酸殘基相同)所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第187至252位氨基酸殘基所示(與序列6自N末端第187至252位氨基酸殘基相同)；所述特異多肽片段由30個以下的氨基酸殘基組成且可被蛋白酶識別。所述DNA分子甲中，所述特異多肽片段可為識別短肽NS5A/5B;所述識別短肽NS5A/5B的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第174至186氨基酸殘基(與序列表的序列6自N末端第174至186氨基酸殘基相同)所示。所述DNA分子甲中，所述E173N片段的編碼基因可如序列表的序列5自5’末端第I至519位核苷酸(與序列表的序列7自5’末端第I至519位核苷酸相同)所示；所述特異多肽片段的編碼基因可如序列表的序列5自5’末端第520至558位核苷酸(與序列表的序列7自5’末端第520至558位核苷酸相同)所示；所述E173C片段的編碼基因可如序列表的序列5自5’末端第559至756位核苷酸(與序列表的序列7自5’末端第559至756位核苷酸相同)所示。所述DNA分子甲具體可為序列表的序列5所示的DNA。所述DNA分子乙自5’末端至3’末端依次含有如下元件E173N片段的編碼基因、特異多肽片段的編碼基因、E173C片段的編碼基因、2A片段的編碼基因和蛋白酶的編碼基因；所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第I至173位氨基酸殘基(與序列4自N末端第I至173位氨基酸殘基相同)所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第187至252位氨基酸殘基所示(與序列4自N末端第187至252位氨基酸殘基相同)；所述2A片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第253至279位氨基酸殘基所示；所述特異多肽片段由30個以下的氨基酸殘基組成且可被所述蛋白酶識別。所述DNA分子乙中，所述特異多肽片段可為識別短肽NS5A/5B;所述識別短肽NS5A/5B的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第174至186氨基酸殘基(與序列表的序列4自N末端第174至186氨基酸殘基相同)所示；所述蛋白酶的氨基酸序列可如序列表的序列6自N末端第280至479位氨基酸殘基所示(NS3/4A片段)。所述DNA分子乙中，所述E173N片段的編碼基因可如序列表的序列7自5’末端第I至519位核苷酸(與序列表的序列5自5’末端第I至519位核苷酸相同)所示；所述特異多肽片段的編碼基因可如序列表的序列7自5’末端第520至558位核苷酸(與序列表的序列5自5’末端第520至558位核苷酸相同)所示；所述E173C片段的編碼基因可如序列表的序列7自5’末端第559至756位核苷酸(與序列表的序列5自5’末端第559至756位核苷酸相同)所不；所述2A片段的編碼基因可如序列表的序列7自5’末端第757至837位核苷酸所示；所述蛋白酶的編碼基因可如序列表的序列7自5’末端第838至1437位核苷酸所示。所述DNA分子乙具體可為序列表的序列7所不的DNA。含有所述基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組載體可為重組質(zhì)粒pET-28a-E1735AB、重組質(zhì)粒pcDNA3.1_E1735AB或重組質(zhì)粒pcDNA3.1-E1735AB-2A-NS3/4A;所述重組質(zhì)粒pET-28a_E1735AB為將所述DNA分子甲插入pET-28a(+)載體的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒pcDNA3.1_E1735AB為將所述DNA分子甲插入pcDNA3.1(+)載體的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒pcDNA3.1-E1735AB-2A-NS3/4A為將所述DNA分子乙插入pcDNA3.I(+)載體的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒。所述重組菌為含有所述重組載體的宿主菌，所述宿主菌優(yōu)選為大腸桿菌，如大腸桿菌(E.coli)DH5α或大腸桿菌(Ε.coli)BL21(DE3)。本發(fā)明還保護一種蛋白酶抑制劑篩選模型，為如下⑴或(II)(I)轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒甲和重組質(zhì)粒乙的宿主菌；所述重組質(zhì)粒甲含有所述DNA分子甲；所述重組質(zhì)粒乙含有可識別所述特異多肽片段的蛋白酶的編碼基因；(II)轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒丙的哺乳動物細胞；所述重組質(zhì)粒丙含有所述DNA分子乙。所述蛋白酶抑制劑可為NS3-4A蛋白酶抑制劑；所述NS3-4A蛋白酶的氨基酸序列如序列表的序列2所示。所述重組質(zhì)粒乙中，所述蛋白酶可如序列表的序列2所示(NS3/4片段)。所述重組質(zhì)粒乙可為重組質(zhì)粒pET-22b-NS3/4A;所述重組質(zhì)粒pET_22b_NS3/4A為將序列表的序列3所示DNA插入pET-22b(+)載體的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒甲具體可為所述重組質(zhì)粒pET-28a-E1735ffi。所述重組質(zhì)粒丙具體可為所述重組質(zhì)粒pcDNA3.1_E1735AB-2A_NS3/4A。所述宿主菌優(yōu)選為大腸桿菌，如大腸桿菌(E.Coli)DH5a或大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)。所述哺乳動物細胞優(yōu)選為HEK293A或CHO-Kl細胞。所述蛋白酶抑制劑篩選模型可用于篩選蛋白酶抑制劑。所述蛋白酶具體可為序列表的序列2所示的NS3-4A蛋白酶。丙型肝炎病毒感染是慢性肝炎、肝硬化和肝癌的主要致病因素之一，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。目前尚無疫苗和理想的治療藥物。由于尚未建立適用于不同亞型的HCV體外復制模型和小動物感染模型，極大地限制了抗HCV藥物的篩選。因此目前主要通過評價病毒蛋白酶的活性來進行藥物篩選。鑒于候選藥物分子最好可在細胞環(huán)境中評價，因此，建立一種細胞水平上的酶活性檢測系統(tǒng)，對于高通量篩選抗HCV藥物具有重要意義。HCVNS3/4A絲氨酸蛋白酶在病毒加工成熟中起著關鍵的作用，是開發(fā)抗HCV藥物的理想靶點。本發(fā)明以EGFP為報告基因，利用NS3/4A蛋白酶對其底物的特異性識別與切割，在EGFP分子內(nèi)適當位置插入一段含有NS3/4A蛋白酶識別序列的短肽，再將該EGFP分子與NS3/4A蛋白酶共表達，構建NS3/4A蛋白酶抑制劑篩選模型。由于NS3/4A蛋白酶可以識別并切割EGFP分子內(nèi)部插入的短肽，從而將EGFP分為兩段，篩選模型自身不能被激發(fā)出熒光。在篩選模型中加入候選的蛋白酶抑制劑后，如果該抑制劑可以抑制NS3-4A蛋白酶活性，EGFP分子就不會被切斷，則篩選模型可以被激發(fā)出熒光。這樣利用所述篩選模型，通過觀測EGFP分子熒光信號的有無即可判斷NS3-4A蛋白酶活性是否受到抑制，從而可以高通量的從蛋白與多肽文庫以及天然產(chǎn)物中篩選NS3-4A蛋白酶抑制劑，為HCV感染治療提供候選藥物分子。此外，如果選用不同的酶及其相應底物替換NS3/4A蛋白酶及其識別序列，該模型尚可靈活應用于其它多種酶抑制劑的篩選，為今后高通量篩選多種其它蛋白酶抑制劑奠定基礎。圖I為獲得E173N基因片段和E173C基因片段的PCR擴增鑒定電泳圖；M:DL2000；I:E173N基因片段；2:E173C基因片段。圖2為E173N和E173C轉(zhuǎn)化pET_28a_E173N和pET_22b_E173C重組菌重組質(zhì)粒的菌落PCR鑒定電泳圖；ApET-28a-E173N,M為DL2000，1-7:菌落PCR鑒定為陽性克?。籅pET-22b-E173C，M為DL2000，1-7:菌落PCR鑒定為陽性克隆。圖3為E1735AB基因片段構建過程的鑒定電泳圖；A:E173N_5AB基因片段和5AB-E173C基因片段，M為DL2000,1和2為E173N-5AB基因片段，3和4為5AB-E173C基因片段:融合E173N-5AB基因片段和5AB-E173C基因片段獲得了E1735AB基因片段，M為DL2000,1為E1735AB基因片段。圖4為轉(zhuǎn)化pET-28a_E1735AB重組質(zhì)粒的菌落PCR鑒定電泳圖；MDL2000;1_8:菌落PCR鑒定為陽性克隆。圖5為獲得EGFP基因片段的PCR擴增電泳圖；MDL2000plus；1=EGFP基因。圖6為轉(zhuǎn)化pET-28a-EGFP重組質(zhì)粒的菌落PCR鑒定電泳圖；MDL2000plus;1_8菌落PCR鑒定為陽性克隆。圖7為獲得NS3/4A基因片段的PCR擴增電泳圖；A:第一輪PCR擴增，M為DL2000，I為PCR擴增產(chǎn)物；B.:第二輪PCR擴增，M為DL2000plus,I為PCR擴增產(chǎn)物。圖8為pET-22b-NS3/4A重組質(zhì)粒的菌落PCR鑒定電泳圖；MDL2000plus;1_8:菌落PCR鑒定為陽性克隆。圖9為誘導前后重組菌I、II和IV菌液的SDS-PAGE電泳圖；M=ProteinRulerII；I:誘導后的BL21(DE3)；2:誘導前的重組菌I;3:誘導后的重組菌I;4:誘導前的重組菌II；5:誘導后的重組菌II；6:誘導前的重組菌IV；7:誘導后的重組菌IV。圖10為誘導前后重組菌V、VI和VIII菌液的SDS-PAGE電泳圖；M=ProteinRulerII；1:誘導后的BL21(DE3)；2:誘導前的重組菌VIII；3:誘導后的重組菌VIII；4:誘導前的重組菌V;5:誘導后的重組菌V;6:誘導前的重組菌VI；7:誘導后的重組菌VI。圖11為誘導前后重組菌III、VII和VIII菌液的SDS-PAGE電泳圖；MProteinRulerII；1:誘導后的BL21(DE3)；2:誘導前的重組菌VIII；3:誘導后的重組菌VIII；4:誘導前的重組菌III；5:誘導后的重組菌III；6:誘導前的重組菌VII；7:誘導后的重組菌VII。圖12為誘導后重組菌的綠色熒光；A:重組菌I;B:重組菌II；C:重組菌III;重組菌IV。圖13為誘導后重組菌的綠色熒光；A:重組菌V；B:重組菌VI；C:重組菌III;重組菌VII。圖14為pcDNA3.I(+)質(zhì)粒的線性化鑒定電泳圖；MDL2000plus；1pcDNA3.I(+)；2、3:經(jīng)HindIII和XbaI酶切處理的pcDNA3.I(+)。圖15為克隆E1735AB基因片段的PCR擴增和轉(zhuǎn)化至pcDNA3.1_E1735AB重組菌的菌落PCR鑒定電泳圖;A:PCR擴增電泳圖，M為DL2000plus，I為PCR擴增產(chǎn)物；B為菌落PCR電泳圖，M為DL2000plus,1-8:菌落PCR鑒定為陽性克隆。圖16為重疊延伸PCR擴增獲得E173N-2A-E173C基因片段制備過程的電泳圖；AE173N-2A基因片段和2A-E173C基因片段，M為DL2000，I和2為E173N-2A基因片段，3和4為2A-E173C基因片段；BE173N-2A-E173C基因片段，M為DL2000，I為E173N-2A-E173C基因片段。圖17為pcDNA3.1-E173N-2A-E173C重組菌的菌落PCR鑒定電泳圖；MDL2000plus,1-7:菌落PCR鑒定為陽性克隆。圖18為重疊延伸PCR擴增獲得E1735AB-2A-NS3/4A基因片段制備過程的電泳圖；ΑΕ1735ΑΒ-2Α基因片段和2A-NS3/4A基因片段，M為DL2000，I和2為Ε1735ΑΒ_2Α基因片段，3和4為2A-NS3/4A基因片段；B:E1735AB-2A_NS3/4A基因片段，M為DL2000，I為E1735AB-2A-NS3/4A基因片段。圖19為pcDNA3.1_E173MB-2A_NS3/4A重組質(zhì)粒的菌落PCR鑒定電泳圖；MDL2000plus,1-10:菌落PCR鑒定為陽性克隆。圖20為重疊延伸PCR擴增獲得EGFP-2A-NS3/4A基因片段制備過程的電泳圖；AEGFP-2A基因片段和2A-NS3/4A基因片段，M為DL2000，I和2為EGFP-2A基因片段，3和4為2A-NS3/4A基因片段；B:EGFP_2A_NS3/4A基因片段，M為DL2000，I為EGFP-2A-NS3/4A基因片段。圖21為pcDNA3.1-EGFP-2A-NS3/4A重組菌的菌落PCR鑒定電泳圖；MDL2000plus,1-8:菌落PCR鑒定為陽性克隆。圖22為不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細胞的綠色熒光情況；ApcDNA3.I-EGFP；BpcDNA3.1-E1735AB；CpcDNA3.1-E173N-2A-E173C。圖23為不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細胞的綠色熒光情況；甲HEK293A細胞，乙CH0_K1細胞；圖甲和圖乙中ApcDNA3.I-EGFP，BpcDNA3.1-EGFP-2A-NS3/4A，CpcDNA3.1_E1735AB，DpcDNA3.1-E1735AB-2A-NS3/4A。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自試劑供應商購買得到的。ATCC即Americantypeculturecollection的縮寫，網(wǎng)址為www.atcc.org。大腸桿菌(E.coli)DH5a和大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)購自北京天根生物技術有限公司。PIRES2-EGFP載體購自Clontech公司。pET_28a(+)載體和pET_22b(+)載體為Merck公司產(chǎn)品。pcDNA3.I(+)載體為invitrogen公司產(chǎn)品。HEK293A細胞ATCC產(chǎn)品，ATCC編號為CRL-1573。CHO-Kl細胞ATCC產(chǎn)品，ATCC編號為CCL-61。RB2-HCV質(zhì)粒由Sollazo教授惠贈；公眾可以從中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所獲得；參考文獻DimasiN,PasquoA,MartinF,DiMarcoS,SteinkiihlerC,CorteseR,SollazzoM.Engineering,characterizationandphagedisplayofhepatitisCvirusNS3proteaseandNS4Acofactorpeptideasasingle-chainprotein.ProteinEng.1998Dec；11(12):1257-65.實施例I、原核細胞中E1735AB片段對NS3/4A片段的識別作用一、重組質(zhì)粒的構建I、重組質(zhì)粒pET-28a_E173N的構建(1)E173N基因片段的克隆設計正向引物E173N-FP和反向引物E173N-RP。E173N-FP:5’-ATACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3’E173N-RP:5’-AAGGATCCTCATTATTAGCAGCAGACGACGTCCTCGCTAGCCTCGATGTTGTGGCGGAT-3，。正向引物含有NcoI酶切位點；反向引物含有BamHI酶切位點，并引入終止密碼子和NS5A序列(下劃線標注NS5A序列)。靶序列為EGFP基因(序列表的序列I)自5’末端第I至519位核苷酸。以pIRES2-EGFP質(zhì)粒為模板，用E173N-FP和E173N-RP組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(約540bp的E173N基因片段)。PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖I的泳道I。(2)重組質(zhì)粒pET-28a_E173N的構建回收PCR擴增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶NcoI和BamHI雙酶切后連接到進行相同酶切處理的pET-28a(+)載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH5a細胞，用E173N-FP和E173N-RP組成的引物對對菌斑進行菌落PCR鑒定，見圖2A。由圖可見，PCR鑒定全為陽性克隆，且片段大小與預期相同。挑取2個陽性克隆測序，測序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pET-28a_E173N。2、重組質(zhì)粒pET-22b_E173C的構建(1)E173C基因片段的克隆設計正向引物E173C-FP和反向引物E173C-RP。E173C-FP:5’-AACATATGTCGATGTCCTACACAGACGGCAGCGTGCAGCTCGCC-3’；E173C-RP:5’-AAGGATCCTCATTATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’。正向引物含有NdeI酶切位點，并引入NS5B序列(下劃線標注NS5B序列)；反向引物含有BamHI酶切位點，并引入終止密碼子。靶序列為EGFP基因(序列表的序列I)自5’末端第520至717位核苷酸。以pIRES2-EGFP質(zhì)粒為模板，用E173C-FP和E173C-RP組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(約210bp的E173C基因片段)。PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖I的泳道2。(2)重組質(zhì)粒pET-22b_E173C的構建回收PCR擴增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI雙酶切后連接到進行相同酶切處理的pET-22b(+)載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH5a細胞，用E173C-FP和E173C-RP組成的引物對對菌斑進行菌落PCR鑒定，見圖2B。由圖可見，PCR鑒定全為陽性克隆，且片段大小與預期相同。挑取2個陽性克隆測序，測序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pET-22b_E173C。3、重組質(zhì)粒pET-28a_E1735AB的構建(1)E1735AB基因的克隆①E173N-5AB基因片段的克隆擴增E173N-5AB基因片段的引物為正向引物E173N-FP和反向引物E173N-L-RP。E173N-L-RP:5’-TCGAGCAGCAGACGACGTCCTCGCTAGCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTG-3>。反向引物引入NS5A序列(下劃線標注NS5A序列)，作為接頭序列。靶序列為EGFP基因(序列表的序列I)自5’末端第I至519位核苷酸。以pIRES2-EGFP質(zhì)粒為模板，用E173N-FP和E173N-L-RP組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(約550bp的E173N-5AB基因片段)。PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖3A的泳道I和泳道2。②5AB-E173C基因片段的克隆擴增E173N-5AB基因片段的引物為正向引物E173C-L-FP和反向引物E173C-RP。E173C-L-FP:5，-CGTCGTCTGCTGCTCGATGTCCTACACAGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCG-3’。正向引物引入NS5B序列(下劃線標注NS5B序列)，作為接頭序列。靶序列為EGFP基因(序列表的序列I)自5’末端第520至717位核苷酸。以pIRES2-EGFP質(zhì)粒為模板，用E173C-L-FP和E173C-RP組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(約220bp的5AB-E173C基因片段)。PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖3A的泳道3和泳道4。③采用重疊PCR的方法擴增E1735AB基因片段分別回收步驟①和步驟②的PCR擴增產(chǎn)物。同時將步驟①和步驟②的PCR擴增產(chǎn)物作為模板，用E173N-FP和E173C-RP組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(約750bp的E1735AB基因片段)。PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖3B。(2)重組質(zhì)粒pET_28a-EI735iffi的構建回收步驟⑴的PCR擴增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶NcoI和BamHI雙酶切后連接到進行相同酶切處理的pET_28a(+)載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH5a細胞，用用E173N-FP和E173C-RP組成的引物對對菌斑進行菌落PCR鑒定，見圖4。由圖可見，PCR鑒定全為陽性克隆，且片段大小與預期相同。挑取2個陽性克隆測序，測序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pET-28a_E1735AB。重組質(zhì)粒pET-28a-E1735AB:在骨架載體pET_28a(+)的NcoI和BamHI酶切位點之間插入了序列表的序列5所不的DNA(序列5所不DNA編碼序列表的序列4所不的蛋白質(zhì))。序列5所示DNA中，自5’末端第I至519位核苷酸為E173N基因片段，第520至558位核苷酸為識別短肽NS5A/5B的編碼序列(其中第520至543位為NS5A序列，第544至558位為NS5B序列)，第559至756位核苷酸為E173C基因片段。序列4所示蛋白質(zhì)中，自N末端第I至173位氨基酸殘基為E173N片段，第174至186位氨基酸殘基為識別短肽NS5A/5B，第187至252氨基酸殘基為E173C片段。4、重組質(zhì)粒pET-28a_EGFP的構建(I)EGFP基因的克隆以pIRES2-EGFP為模板，用E173N-FP和E173C-RP組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(約710bp的EGFP基因)。PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖5。(2)重組質(zhì)粒pET-28a_EGFP的構建回收PCR擴增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶NcoI和BamHI雙酶切后連接到進行相同酶切處理的pET-28a(+)載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH5a細胞，用E173N-FP和E173C-RP組成的引物對對菌斑進行菌落PCR鑒定，見圖6。由圖可見，PCR鑒定只有一個陽性克隆(泳道I)，長度與理論大小相符。取片段大小相符的陽性克隆測序，結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP。重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP:在骨架載體pET-28a(+)的NcoI和BamHI酶切位點之間插入了序列表的序列I所不的DNA。5、重組質(zhì)粒pET-22b_NS3/4A的構建(1)NS3/4A基因片段的克隆在HCV的基因閱讀框中，NS3基因位于NS4A基因上游。為擴增MAPI-NS4A(21-34aa)-GG-NS3(2_181aa)，在擴增NS3基因的同時，利用引物帶入法將NS4A基因帶入到NS3基因上游。由于NS4A(21-34aa)序列比較長，故采用兩步PCR的方法，通過兩次引物延長，帶入NS4A基因。NS4A(2l_34aa)編碼NS4A蛋白自N末端第21至34位氨基酸殘基。NS3(2-18Iaa)編碼NS3蛋白自N末端第2至181位氨基酸殘基。以RB2-HCV質(zhì)粒為模板，用NS3/4A-FPI和NS3/4A-RP組成的引物對進行第一輪PCR擴增，得到第一輪PCR擴增產(chǎn)物(約590bp)。以第一輪PCR擴增產(chǎn)物為模板，用NS3/4A-FP2和NS3/4A-RP組成的引物對進行第二輪PCR擴增，得到第二輪PCR擴增產(chǎn)物(約600bp的NS3/4A基因片段)。PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖7。NS3/4A-FP1(引入部分NS4A序列)5’-ATCATCGGCCGCTTGCACGTCAACCAGCGAGGTGGCCCCATCACTGCTTATGCCCAGC-3’；NS3/4A-RP(引入BamHI酶切位點):5’-AAGGATCCCTATTAAGACCTTGTAACAACGTCGAGTGTCTCAACGGGGATGAAATC-3’；NS3/4A-FP2(引入整個NS4A序列和NdeI酶切位點):5’-AACATATGGCGCCTATCGGATGCGTTTCCATCATCGGCCGCTTGCAC-3，。(2)重組質(zhì)粒pET-22b_NS3/4A的構建回收PCR擴增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI雙酶切后連接到進行相同酶切處理的pET-22b(+)載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH5a細胞，用NS3/4A-FP2和NS3/4A-RP組成的引物對對菌斑進行菌落PCR鑒定，見圖8。由圖可見，PCR鑒定全為陽性克隆，且除泳道5，其它片段大小均與預期相同。取片段大小相符的陽性克隆測序，結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pET-22b_NS3/4A。重組質(zhì)粒pET-22b-NS3/4A:在骨架載體pET-22b(+)的NdeI和BamHI酶切位點之間插入了序列表的序列3所不的DNA(序列3所不DNA編碼序列表的序列2所不的蛋白質(zhì))。序列3中，自5’末端第I至42位核苷酸為NS4A的編碼序列，第61至600位核苷酸為NS3的編碼序列。二、重組菌的構建I、重組菌I的構建將重組質(zhì)粒pET-28a_E173N轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)的感受態(tài)，涂于含30μg/ml卡那霉素(kan)的平板，得到含有重組質(zhì)粒pET_28a_E173N的大腸桿菌，將其命名為重組菌I。2、重組菌II的構建將重組質(zhì)粒pET-22b-E173C轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)的感受態(tài)，涂于含50μg/ml氨芐青霉素(amp)的平板，得到含有重組質(zhì)粒pET_22b_E173C的大腸桿菌，將其命名為重組菌II。3、重組菌III的構建將重組質(zhì)粒pET-28a_E1735AB轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)的感受態(tài)，涂于含30μg/ml卡那霉素(kan)的平板，得到含有重組質(zhì)粒pET-28a_E1735AB的大腸桿菌，將其命名為重組菌III。4、重組菌IV的構建將重組質(zhì)粒pET-28a_E173N轉(zhuǎn)化重組菌II，涂于含30μg/ml卡那霉素(kan)和50μg/ml氨芐青霉素(amp)的平板，通過雙抗篩選出同時含有重組質(zhì)粒pET_28a_E173N和重組質(zhì)粒pET-22b-E173C的大腸桿菌，將其命名為重組菌IV。5、重組菌V的構建將重組質(zhì)粒pET-28a_EGFP轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)細胞，涂于含30μg/ml卡那霉素(kan)的平板，得到含有重組質(zhì)粒pET_28a_EGFP的大腸桿菌，將其命名為重組菌V。6、重組菌VI的構建將重組質(zhì)粒pET-22b_NS3/4A轉(zhuǎn)化重組菌V，涂于含30μg/ml卡那霉素(kan)和50μg/ml氨芐青霉素(amp)的平板，通過雙抗篩選出同時含有重組質(zhì)粒pET_28a_EGFP和重組質(zhì)粒pET-22b-NS3/4A的大腸桿菌，將其命名為重組菌VI。7、重組菌VII的構建將重組質(zhì)粒pET-22b_NS3/4A轉(zhuǎn)化重組菌III，涂于含30μg/ml卡那霉素(kan)和50μg/ml氨芐青霉素(amp)的平板，通過雙抗篩選出同時含有重組質(zhì)粒pET-28a_E1735AB和重組質(zhì)粒pET-22b-NS3/4A的大腸桿菌，將其命名為重組菌VII。8、重組菌VIII的構建將重組質(zhì)粒pET-22b-NS3/4A轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)細胞，涂于含50μg/ml氨芐青霉素(amp)的平板，得到含有重組質(zhì)粒pET_22b_NS3/4A的大腸桿菌，將其命名為重組菌VIII。三、重組菌的SDS-PAGE電泳和綠色熒光檢測I、重組菌的培養(yǎng)分別將重組菌I、重組菌II、重組菌III、重組菌IV、重組菌VI、重組菌VII和重組菌VIII進行用誘導表達(誘導表達的條件為lmM終濃度的IPTG，30°C誘導4小時)。2、SDS-PAGE電泳誘導前后分別取菌液進行SDS-PAGE電泳(15%的分離膠，5%的積層膠；上樣量Maker8μ1，大腸桿菌BL21(DE3)8μ1，未誘導樣品(_)8μ1，誘導樣品(+)12μI)。重組菌I、II和IV的電泳圖見圖9。誘導后的重組菌I可見大小約為19.8kDa的E173N蛋白條帶，誘導后的重組菌II可見大小約為7.7kDa的E173C蛋白條帶，誘導后的重組菌IV可見大小約為19.8kDa和7.7kDa的兩條清晰的條帶(即實現(xiàn)了E173C和E173N的共表達)。重組菌V、VI和VIII的電泳圖見圖10。誘導后的重組菌VIII可見大小約為22.2kDa的NS3/4A對應蛋白條帶。誘導后的重組菌V中不能看見清晰的理論大小為26.2kDa的EGFP蛋白條帶，可能原因是蛋白表達量過低而未顯示出來，但因之后的顯微鏡下觀察有綠色熒光，所以說明該菌體中還是表達了EGFP蛋白。誘導后的重組菌VI中，可見大小約為22.2kDa的NS3/4A對應蛋白條帶，未見EGFP蛋白條帶，可能原因是EGFP蛋白表達量過低而未顯示出來，因為是將pET-22b-NS3/4A質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有pET-28a-EGFP的BL21(DE3)中，電泳結(jié)果顯示NS3/4A已得以表達，所以可以認為泳道6和泳道7對應的菌體中，同時含有pET-22b-NS3/4A和pET_28a_EGFP兩個質(zhì)粒，即實現(xiàn)了共表達。重組菌III、VII和VIII的電泳圖見圖11。誘導后的重組菌VIII可見大小約為22.2kDa的NS3/4A對應蛋白條帶。誘導后的重組菌III中不能看見理論大小為27.5kDa的EGFP5ab蛋白條帶，可能原因是蛋白表達量過低，但因之后的顯微鏡下觀察有綠色熒光，所以說明該菌體中還是表達了EGFP5ab蛋白。誘導后的重組菌VII中，可見大小約為22.2kDa的NS3/4A對應蛋白條帶，未見EGFP5ab蛋白條帶，可能原因是EGFP5ab蛋白表達量過低，因為是將pET-22b-NS3/4A質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有pET_28a_EGFP5AB的BL21(DE3)中，電泳結(jié)果顯示NS3/4A已得以表達，所以可以認為Iane4對應的菌體中，同時含有pET_22b_NS3/4A和pET-28a-EGFP5AB兩個質(zhì)粒，即實現(xiàn)了共表達。三、綠色熒光檢測誘導前后分別取重組菌I、II、III、IV、V、VI和VII的菌液在熒光顯微鏡下觀察(目鏡10X，物鏡20X，藍光激發(fā)，曝光時間2s)。重組菌I、II、III和IV的結(jié)果見圖12。重組菌I和重組菌II不能被激發(fā)出綠色熒光，即EGFP在173位氨基酸處被切開形成的單獨N端、C端不能被激發(fā)出綠色熒光。重組菌III被激發(fā)出綠色熒光，即E1735AB基因片段編碼的蛋白可以被激發(fā)出綠色熒光，說明在EGFP的173位氨基酸處插入NS5A/5B，仍能維持其空間結(jié)構。重組菌IV不被激發(fā)出或只被激發(fā)出強度很弱的綠色熒光，說明EGFP在173位氨基酸處切分開的單獨N端，C端兩個蛋白相互作用很弱，很難重新形成接近野生型的EGFP的空間結(jié)構，從而無法被激發(fā)出強烈的綠色熒光。重組菌III、V、VI和VII的結(jié)果見圖13。重組菌V中，EGFP單獨表達時可以被激發(fā)出強烈的綠色熒光。重組菌VI中，EGFP和NS3/4A共表達時，可以被激發(fā)出強烈的綠色熒光，說明NS3絲氨酸蛋白酶對EGFP的空間結(jié)構未產(chǎn)生顯著影響，熒光強度比EGFP組輕微減弱，可能是由于質(zhì)粒共表達的菌體中對熒光蛋白的表達量會減少。重組菌III中，EGFP5ab可以被激發(fā)出綠色熒光，但強度比重組菌V弱。重組菌VII中，EGFP5ab和NS3/4A共表達時，只有極微弱的綠色熒光，說明EGFP5ab的可發(fā)熒光的空間結(jié)構被破壞。實施例2、真核細胞中E1735AB片段對NS3/4A片段的識別作用2A(2A肽)發(fā)現(xiàn)于小核糖體核酸病毒，有不同的亞型，一般由18_22個氨基酸組成，其中包括一個高度保守的基序D(V/I)EXNPGP(DoroninaVA,etal.Site-specificreleaseofnascentchainsfromribosomesatasensecodon[J]·MolCellBiol.2008Jul；28(13):4227-39.)。2A具有如下優(yōu)點可以實現(xiàn)同一個開放讀框中多順反子的表達；可以實現(xiàn)上下游蛋白等量表達(FangJ,QianJJ,YiS,HardingTC,TuGH,etal.Stableantibodyexpressionattherapeuticlevelsusingthe2Apeptide[J].NatBiotechnol.2005May；23(5):584-90；SzymczakAL,WorkmanCJ,WangY,etal.Correctionofmulti-genedeficiencyinvivousingasingle‘self-cleaving’2Apeptide-basedretroviralvector[J].NatBiotechnol.2004May；22(5):589-94.),可以在多種細胞類型中表達(Hasegawa,K.,Cowan,A.B.,Nakatsuji’N.&Suemori，Η·Efficientmulticistronicexpressionofatransgeneinhumanembryonicstemcells[J].StemCells.2007Jul；25(7)1707-12.；SzymczakAL,WorkmanCJ,WangY.etal.Correctionofmulti-genedeficiencyinvivousingasingle^seIf-cleaving^Apeptide-basedretrovifalvector[J].NatureBiotechnol.2004May；22(5):589-94.)。本實施例所用的2A序列來自口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)，簡寫為F2A，序列為5’-AAAATTGTCGCTCCTGTCAAACAAACTCTTAACTTTGATTTACTCAAACTGGCTGGGGATGTAGAAAGCAATCCAGGTCCA-3，，編碼蛋白KIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP。一、重組質(zhì)粒的構建I、pcDNA3.I(+)質(zhì)粒載體的雙酶切處理用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI雙酶切pcDNA3.I(+)質(zhì)粒，回收載體骨架。酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖14。環(huán)形pcDNA3.I(+)質(zhì)粒被切下大小約為SObp的小片段和清晰單一的大片段條帶(載體骨架)。2、重組質(zhì)粒pcDNA3.1_E1735AB的構建設計正向引物ZE173N-FP和反向引物zE173C_RP。zE173N-FP:5，-CCCAAGCTTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3，；zE173C-RP:5’-GCTCTAGATCATTATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’。正向引物含有HindIII酶切位點；反向引物含有XbaI酶切位點并引入終止密碼子。以重組質(zhì)粒pET-28a-E1735AB為模板，用zE173N_FP和zE173C_RP組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(約750bp的E1735AB基因片段)，電泳圖見圖15A?；厥誔CR擴增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI雙酶切后連接到步驟I得到的載體骨架上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH5α細胞，用zE173N_FP和zE173C_RP組成的引物對對菌斑進行菌落PCR鑒定，見圖15B。由圖可見，PCR鑒定基本全為陽性克隆，且片段大小與預期相同。取片段大小相符的陽性克隆測序，結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pcDNA3.1_E1735AB。3、重組質(zhì)粒pcDNA3.1-E173N-2A-E173C的構建(I)El73N-2A-El73C基因的克隆(重疊PCR)以重組質(zhì)粒pET-28a-E1735AB為模板，用zE173N_FP和zE173N_L_RP組成的引物對進行第一輪PCR擴增，得到第一輪PCR擴增產(chǎn)物-I(約590bp的E173N-2A基因片段)。以重組質(zhì)粒pET-28a-E1735AB為模板，用zE173C_L_FP和zE173C_RP組成的引物對進行第一輪PCR擴增，得到第一輪PCR擴增產(chǎn)物-2(約260bp的2A-E173C基因片段)。同時以第一輪PCR擴增產(chǎn)物-I和第一輪PCR擴增產(chǎn)物-2為模板，用ZE173N-FP和zE173C_RP組成的引物對進行PCR擴增，得到第二輪PCR擴增產(chǎn)物(約830bp的E173N-2A-E173C基因片段)。PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖16。ZE173N-L-RP:5，-AGTTTGAGTAAATCAAAGTTAAGAGTTTGTTTGACAGGAGCGACAATTTTGCAGCAGACGACGTCCTCGCTAGC-3’；下劃線標記引入的部分2A序列。ZE173C-L-FP:5’-ACTTTGATTTACTCAAACTGGCTGGGGATGTAGAAAGCAATCCAGGTCCATCGATGTCCTACACAGACGGCAGC-3’；下劃線標記引入的部分2A序列。(2)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-E173N-2A-E173C的構建回收PCR擴增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI雙酶切后連接到步驟I得到的載體骨架上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH5a細胞，用zE173N_FP和zE173C_RP組成的引物對對菌斑進行菌落PCR鑒定，見圖17。由圖可見，泳道1、6、7的片段大小與理論值相同。取片段大小相符的陽性克隆測序，結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pcDNA3.1-E173N-2A-E173C。4、重組質(zhì)粒pcDNA3.1_E1735AB-2A_NS3/4A的構建(1)E1735AB-2A-NS3/4A基因的克隆(重疊PCR)以重組質(zhì)粒pET-28a-E1735AB為模板，用zE173N-FP和zE173C-2A-L-RP組成的引物對進行第一輪PCR擴增，得到第一輪PCR擴增產(chǎn)物-I(約800bp的E1735AB_2A基因片段)。以重組質(zhì)粒pET-22b-NS3/4A為模板，用NS3/4A-2A-L-FP和NS3/4A-2A-RP組成的引物對進行第一輪PCR擴增，得到第一輪PCR擴增產(chǎn)物-2(約650bp的2A-NS3/4A基因片段)。同時以第一輪PCR擴增產(chǎn)物-I和第一輪PCR擴增產(chǎn)物-2為模板，用ZE173N-FP和NS3/4A-2A-RP組成的引物對進行PCR擴增，得到第二輪PCR擴增產(chǎn)物(約1390bp的E1735AB_2A_NS3/4A基因片段)。PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖18。ZE173C-2A-L-RP:5’-AGTTTGAGTAAATCAAAGTTAAGAGTTTGTTTGACAGGAGCGACAATTTTCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA-3’；下劃線標記引入的部分2A序列。NS3/4A-2A-L-FP5，-ACTTTGATTTACTCAAACTGGCTGGGGATGTAGAAAGCAATCCAGGTCCAATGGCGCCTATCGGATGCGTTTCC-3’；下劃線標記引入的部分2A序列。NS3/4A-2A-RP:5’-GCTCTAGATCATTATTAAGACCTTGTAACAACGTCGAGTGT-3’。(2)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-E1735AB-2A_NS3/4A的構建回收PCR擴增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI雙酶切后連接到步驟I得到的載體骨架上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH5a細胞，用zE173N_FP和NS3/4A-2A-RP組成的引物對對菌斑進行菌落PCR鑒定，見圖19。由圖可見，除泳道4，其他克隆出的片段大小均與理論相符。取片段大小相符的陽性克隆測序，結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pcDNA3.1-E1735AB-2A_NS3/4A。重組質(zhì)粒pcDNA3.1-E1735AB-2A_NS3/4A:在骨架載體pcDNA3.I(+)的HindIII和XbaI酶切位點之間插入了序列表的序列7所示的DNA(序列7所不DNA編碼序列表的序列6所不的蛋白質(zhì))。序列7所示DNA中，自5’末端第I至519位核苷酸為E173N基因片段，第520至558位核苷酸為識別短肽NS5A/5B的編碼序列，第559至756位核苷酸為E173C基因片段，第757至837位核苷酸為2A基因序列，第838至1437位核苷酸為NS3/4A的編碼序列。序列6所示蛋白質(zhì)中，自N末端第I至173位氨基酸殘基為E173N片段，第174至186位氨基酸殘基為識別短肽NS5A/5B，第187至252位氨基酸殘基為E173C片段，第253至279位氨基酸殘基為2A片段，第280至479位氨基酸殘基為NS3/4A片段。5、重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-2A-NS3/4A的構建(I)EGFP-2A-NS3/4A基因的克隆(重疊PCR)以重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP為模板，用zE173N_FP和zE173C_2A_L-RP組成的引物對進行第一輪PCR擴增，得到第一輪PCR擴增產(chǎn)物-I(約760bp的EGFP基因片段)。以重組質(zhì)粒pET-22b-NS3/4A為模板，用NS3/4A-2A-L-FP和NS3/4A-2A-RP組成的引物對進行第一輪PCR擴增，得到第一輪PCR擴增產(chǎn)物-2(約650bp的2A-NS3/4A基因片段)。同時以第一輪PCR擴增產(chǎn)物-I和第一輪PCR擴增產(chǎn)物-2為模板，用ZE173N-FP和NS3/4A-2A-RP組成的引物對進行PCR擴增，得到第二輪PCR擴增產(chǎn)物(約1430bp的EGFP-2A-NS3/4A基因片段)。PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖20。(2)重組質(zhì)粒pcDNA3·1-EGFP-2A-NS3/4A的構建回收PCR擴增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI雙酶切后連接到步驟I得到的載體骨架上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH5α細胞，用zE173N_FP和NS3/4A-2A-RP組成的引物對對菌斑進行菌落PCR鑒定，見圖21。由圖可見，泳道3和泳道5克隆片段大小正確。取片段大小相符的陽性克隆測序，結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-2A-NS3/4A。6、重組質(zhì)粒pcDNA3.I-EGFP的構建以重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP為模板，用zE173N_FP和zE173C_RP組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(約760bp的EGFP基因片段)?；厥誔CR擴增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI雙酶切后連接到步驟I得到的載體骨架上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH5α細胞，得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP。二、綠色熒光現(xiàn)象將HEK293A細胞(或CHO-Kl細胞)用胰酶消化后，按I.2_2XIO5個細胞的密度接種于24孔板中，用lipo2000進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染設有五個組第一組轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.I-EGFP；第二組轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1_E1735AB；第三組轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-E173N-2A-E173C；第四組轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-2A-NS3/4A；第五組轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1_E1735AB-2A_NS3/4A。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞48h后，用熒光顯微鏡觀察(目鏡10X，物鏡10X，藍光激發(fā)，曝光時間2s)。第一組、第二組和第三組的照片見圖22。第一組可以被激發(fā)出強烈的綠色熒光，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。第二組中細胞呈綠色，熒光強度與第一組相比較偏弱，不過仍可說明E1735AB可以被激發(fā)出綠色熒光。第三組基本無熒光，說明在2A的作用下，E173N和E173C基因片段分別表達，這兩部分不能相互作用形成一個完整的桶狀的EGFP結(jié)構，因此不能被激發(fā)產(chǎn)生突光。第一組、第二組、第四組和第五組的照片見圖23。第一組可以被激發(fā)出強烈的綠色熒光，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。第二組細胞也呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光現(xiàn)象，說明E1735AB在真核細胞中仍能維持其空間結(jié)構。第四組細胞也呈現(xiàn)出較明顯的綠色熒光現(xiàn)象，即EGFP-2A-NS3/4A在2A的作用下，實現(xiàn)了EGFP和NS3/4A絲氨酸蛋白酶的共表達，仍然能被激發(fā)出綠色熒光，說明NS3/4A絲氨酸蛋白酶未顯著破壞EGFP的結(jié)構。第五組中基本無熒光，E1735AB-2A-NS3/4A在2A的作用下，實現(xiàn)了E173MB和NS3/4A絲氨酸蛋白酶的共表達，綠色熒光消失，說明NS3/4A絲氨酸蛋白酶破壞了E1735AB的結(jié)構。權利要求1.ー種蛋白質(zhì)，為如下(a)或(b)(a)自N末端至C末端依次含有如下元件的蛋白質(zhì)E173N片段、特異多肽片段和E173C片段；(b)自N末端至C末端依次含有如下元件的蛋白質(zhì)E173N片段、特異多肽片段、E173C片段、2A片段和蛋白酶；所述(a)中所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第I至173位氨基酸殘基所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第187至252位氨基酸殘基所示；所述特異多肽片段由30個以下的氨基酸殘基組成且可被蛋白酶識別；所述(b)中所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第I至173位氨基酸殘基所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第187至252位氨基酸殘基所示；所述2A片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第253至279位氨基酸殘基所示；所述特異多肽片段由30個以下的氨基酸殘基組成且可被所述蛋白酶識別。2.如權利要求I所述的蛋白質(zhì)，其特征在干所述(a)中，所述特異多肽片段為識別短肽NS5A/5B;所述識別短肽NS5A/5B的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第174至186氨基酸殘基所示；所述(b)中，所述特異多肽片段為識別短肽NS5A/5B;所述識別短肽NS5A/5B的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第174至186氨基酸殘基所示；所述蛋白酶的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第280至479位氣基酸殘基所不。3.如權利要求2所述的蛋白質(zhì),其特征在于所述蛋白質(zhì)的氣基酸序列如序列表的序列4或序列表的序列6所示。4.編碼權利要求I所述蛋白的基因，為DNA分子甲或DNA分子こ；所述DNA分子甲自5’末端至3’末端依次含有如下元件E173N片段的編碼基因、特異多肽片段的編碼基因和E173C片段的編碼基因；所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第I至173位氨基酸殘基所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第187至252位氨基酸殘基所示；所述特異多肽片段由30個以下的氨基酸殘基組成且可被蛋白酶識別；所述DNA分子こ自5’末端至3’末端依次含有如下元件E173N片段的編碼基因、特異多肽片段的編碼基因、E173C片段的編碼基因、2A片段的編碼基因和蛋白酶的編碼基因；所述E173N片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第I至173位氨基酸殘基所示；所述E173C片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第187至252位氨基酸殘基所示；所述2A片段的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第253至279位氨基酸殘基所示；所述特異多肽片段由30個以下的氨基酸殘基組成且可被所述蛋白酶識別。5.如權利要求4所述的基因，其特征在干所述DNA分子甲中，所述特異多肽片段為識別短肽NS5A/5B;所述識別短肽NS5A/5B的氨基酸序列如序列表的序列4自N末端第174至186氨基酸殘基所示；所述DNA分子こ中，所述特異多肽片段為識別短肽NS5A/5B;所述識別短肽NS5A/5B的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第174至186氨基酸殘基所示；所述蛋白酶的氨基酸序列如序列表的序列6自N末端第280至479位氨基酸殘基所示。6.如權利要求5所述的基因，其特征在于所述DNA分子甲中，所述E173N片段的編碼基因如序列表的序列5自5’末端第I至519位核苷酸所示；所述特異多肽片段的編碼基因如序列表的序列5自5’末端第520至558位核苷酸所示；所述E173C片段的編碼基因如序列表的序列5自5’末端第559至756位核苷酸所示；所述DNA分子こ中，所述E173N片段的編碼基因如序列表的序列7自5’末端第I至519位核苷酸所示；所述特異多肽片段的編碼基因如序列表的序列7自5’末端第520至558位核苷酸所示；所述E173C片段的編碼基因如序列表的序列7自5’末端第559至756位核苷酸所示；所述2A片段的編碼基因如序列表的序列7自5’末端第757至837位核苷酸所示；所述NS3/4A片段的編碼基因如序列表的序列7自5’末端第838至1437位核苷酸所示。7.含有權利要求4或5或6所述基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。8.如權利要求7所述的重組載體或重組菌，其特征在于所述重組載體為重組質(zhì)粒pET-28a-E1735AB、重組質(zhì)粒pcDNA3.I-E1735AB或重組質(zhì)粒pcDNA3.1-E1735AB-2A-NS3/4A;所述重組質(zhì)粒pET_28a_E1735AB為將所述DNA分子甲插入pET-28a(+)載體的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒pcDNA3.1_E1735AB為將所述DNA分子甲插入pcDNA3.1(+)載體的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒pcDNA3.1-E1735AB-2A-NS3/4A為將所述DNA分子こ插入pcDNA3.I(+)載體的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒。所述重組菌為含有所述重組載體的宿主菌，所述宿主菌優(yōu)選為大腸桿菌。9.蛋白酶抑制劑篩選模型，為如下(I)或(II)(I)轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒甲和重組質(zhì)粒こ的宿主菌；所述重組質(zhì)粒甲含有權利要求4至6中任一所述的DNA分子甲；所述重組質(zhì)粒こ含有可識別所述特異多肽片段的蛋白酶的編碼基因；(II)轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒丙的哺乳動物細胞；所述重組質(zhì)粒丙含有權利要求4至6中任一所述的DNA分子こ。10.權利要求9所述模型在篩選蛋白酶抑制劑中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種HCV蛋白酶抑制劑篩選模型。本發(fā)明提供了融合蛋白(a)或(b)(a)自N端至C端依次含E173N片段、特異多肽片段和E173C片段；(b)自N端至C端依次含E173N片段、特異多肽片段、E173C片段、2A片段和NS3/4A片段；E173N片段如序列4第1至173位所示；E173C片段如序列4自第187至252位所示；特異多肽片段由30個以下的氨基酸殘基組成且可被蛋白酶識別；2A片段如序列6第253至279位所示；NS3/4A片段如序列6第280至479位所示。利用上述融合蛋白可從蛋白、多肽文庫以及天然產(chǎn)物中篩選NS3-4A蛋白酶抑制劑，為HCV感染治療提供候選藥物分子，并為高通量篩選多種蛋白酶抑制劑奠定基礎。文檔編號C12N1/15GK102649819SQ20111004341公開日2012年8月29日申請日期2011年2月23日優(yōu)先權日2011年2月23日發(fā)明者師明磊,張彥,王洋,趙志虎,閆興,陳娜申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所