專利名稱：哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)SDF-1-Fc的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)人基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1與人免疫球蛋 IgG的Fc段融合基因(SDF-I-Fc)的方法。
背景技術(shù)：
基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-I(SDF-I)又稱為CXCL12，是一種小分子的細(xì)胞因子(約70氨基酸)，屬于趨化因子蛋白家族。其可以高效、高靈敏度地檢測(cè)SDF-I靶蛋白的特異性生物指標(biāo)，用于腫瘤，炎癥和其他的惡性病變臨床診斷。SDF-I在造血、發(fā)育、腫瘤的發(fā)生與遷移、介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)等很多方面具有重要的生物學(xué)功能。SDF-I與其受體CXCR4在胚胎發(fā)育的過(guò)程對(duì)于胚胎的存活至關(guān)重要；在骨髓造血功能的形成，淋巴細(xì)胞生成及心室間隔的形成等過(guò)程也發(fā)揮著重要作用。SDF-I自身可以作為藥物用于與發(fā)育缺陷相關(guān)疾病的治療。另外，SDF-I是一種高效的淋巴細(xì)胞、核細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞的趨化因子，能介導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞緊密粘附并過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)生免疫反應(yīng)。SDF-I還具有抗炎效應(yīng)，可以逆轉(zhuǎn)抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞向炎癥部位的趨化運(yùn)動(dòng)。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜高水平表達(dá)SDF-1，在滑膜內(nèi)表達(dá) CXCR4的記憶T細(xì)胞大量聚集。SDF-I能刺激滑膜遷移，并且抑制激活誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡， 作為一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮抗炎作用。SDF-I蛋白產(chǎn)品作為免疫調(diào)節(jié)和抗炎類藥物是另一有廣闊前景的領(lǐng)域。默克、輝瑞等多家大型跨國(guó)藥物公司已展開(kāi)以SDF-I蛋白作為藥物分子的技術(shù)和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。SDF-I在某些原位腫瘤如宮頸癌病人體內(nèi)表達(dá)明顯升高，SDF-I可作為一種特異性的分子標(biāo)記能夠用于早期的診斷；在對(duì)腫瘤遷移的很多研究中發(fā)現(xiàn)，某些腫瘤如前列腺癌或乳腺癌，SDF-I在某器官的高濃度表達(dá)代表了腫瘤細(xì)胞首先轉(zhuǎn)移的目的地。存在多部位浸潤(rùn)的血液腫瘤患者，其血清中SDF-I的濃度明顯高于未出現(xiàn)浸潤(rùn)患者。因此，將SDF-I 作為腫瘤治療上的新靶點(diǎn)，阻斷SDF-I的產(chǎn)生或其與CXCR4的相互作用，可能有助于阻斷腫瘤細(xì)胞向周圍組織的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。Millipore和R&D system等研究機(jī)構(gòu)和生物技術(shù)公司已在大力研發(fā)以SDF-I作為診斷指標(biāo)用于早期疾病診斷的配套產(chǎn)品。除此之外，SDF-I還與許多疾病，如HIV感染、心肌梗死、移植腎排異、急性缺血性腎損傷等密切相關(guān)。以SDF-1/CXCR4為靶分子的研究將可能為許多疾病的早期診斷和治療提供新的方向，在藥物研究及臨床檢驗(yàn)中具有極大的市場(chǎng)潛力。免疫球蛋白IgG的Fc融合蛋白是指在基因水平將目的基因同IgG的Fc片段基因相連而表達(dá)的重組蛋白，同時(shí)具有目的蛋白及免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)域，從而賦予了重組蛋白獲得許多新的特性，拓展了蛋白在科研、制藥及臨床等方面的應(yīng)用。在重組蛋白表達(dá)的過(guò)程中，F(xiàn)c重組蛋白易于結(jié)合ftOteinA，從而簡(jiǎn)化了蛋白的純化過(guò)程；Fc片段可以方便地進(jìn)行流式、免疫組化和免疫共沉淀等方法檢測(cè)，可用于感興趣的基因研究；體外實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)c融合蛋白可用于拮抗或激活細(xì)胞表面受體用來(lái)研究受體-配體反應(yīng)和信號(hào)通路；此外，F(xiàn)c重組蛋白還能應(yīng)用于噬菌體展示技術(shù)，如作為抗原制備人類全抗體庫(kù)。另外，F(xiàn)c片段還賦予了重組蛋白一些其它特性，增加了其在在制藥和臨床方面的應(yīng)用價(jià)值。融合蛋白中加入重鏈的恒定區(qū)，其半衰期明顯延長(zhǎng)，增加了其在體內(nèi)的作用時(shí)間；Fc段能穿過(guò)胎盤、結(jié)合補(bǔ)體并介導(dǎo)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用等；重組蛋白含有的鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域使其形成二聚體或多聚體，增強(qiáng)了其抗原結(jié)合力。以上這些特點(diǎn)拓展了融合蛋白在感染性疾病、自身免疫性疾病及移植排斥反應(yīng)的治療方面的臨床應(yīng)用前景。目前全球僅有少數(shù)幾個(gè)公司采用大腸桿菌或其它表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)SDF-I-Fc重組蛋白，質(zhì)量參差不齊，總體水平不高。蛋白的表達(dá)體系和翻譯后修飾(糖基化程度)低限制了產(chǎn)品的純度和活性，難以滿足臨床診斷和治療的目的。用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)SDF-I-Fc重組蛋白是生產(chǎn)科研和臨床用SDF-I的重要途徑，對(duì)于推動(dòng)臨床診斷環(huán)節(jié)的新型生物技術(shù)發(fā)展和臨床藥物開(kāi)發(fā)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于實(shí)現(xiàn)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的SDF-I-Fc蛋白的方法。在工業(yè)生產(chǎn)中滿足降低生產(chǎn)成本、簡(jiǎn)化工藝流程、提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的總體要求。本發(fā)明提供一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)人基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1與人免疫球蛋 IgG的Fc段融合基因(SDF-I-Fc)的方法，其特性在于該方法通過(guò)如下步驟實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)人基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1與人免疫球蛋IgG的Fc段融合基因(SDF-I-Fc)(1)制備轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒；(2)制備PEI轉(zhuǎn)染溶劑；(3)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(4)進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物收集及純化。用PEI作為轉(zhuǎn)染試劑，其作為“質(zhì)子海綿”可以高效地結(jié)合雙鏈DNA，把其帶入目的細(xì)胞中，蛋白產(chǎn)物可在短暫的時(shí)間(一般可以表達(dá)一周的時(shí)間)內(nèi)獲得一過(guò)性表達(dá)從而獲得大量的蛋白。本發(fā)明所用的CHO細(xì)胞是工業(yè)生產(chǎn)人臨床用蛋白最為常見(jiàn)的一種細(xì)胞。不僅表達(dá)水平高，蛋白翻譯后加工方式如糖基化等與體內(nèi)天然蛋白相似，而且無(wú)潛在的生物危害性， 自身分泌的蛋白很少?gòu)亩?jiǎn)化了后續(xù)的純化過(guò)程，特別適于分泌型細(xì)胞因子或趨化因子等產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)。而且這種細(xì)胞可以通過(guò)馴化在無(wú)血清培養(yǎng)基中生產(chǎn)，對(duì)于降低工業(yè)生產(chǎn)的成本是必需的；細(xì)胞密度能夠提高數(shù)十倍甚至數(shù)千倍，大大提高了蛋白產(chǎn)量。采用本方法，可以通過(guò)普通的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)獲得大量高純度高生物活性的 SDF-I-Fc蛋白。本項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于SDF-I-Fc蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)，能夠明顯降低成本、簡(jiǎn)化工藝流程，提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量。本發(fā)明中Fc重組蛋白易于結(jié)合ftOteinA，從而可簡(jiǎn)化蛋白的純化過(guò)程。本發(fā)明純化得到的高純度SDF-I-Fc的Fc片段還賦予了重組蛋白一些其它特性， 從而可以增加其在在制藥和臨床方面的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例
1、制備轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒用去除內(nèi)毒素的質(zhì)粒大提試劑盒(購(gòu)自Qiagen公司)制備轉(zhuǎn)染所需連有 SDF-I-Fc基因的表達(dá)質(zhì)粒pR-SDF-la-Fc-EGFP。用200 μ 1 TE緩沖液溶解質(zhì)粒，紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度。2、制備PEI轉(zhuǎn)染溶劑(1)在500ml的燒杯中倒入450ml Milli-Q制備的超純水；(2)稱量500mg線性PEI (購(gòu)自Poly Science公司)，加入燒杯中，磁力攪拌器不斷攪動(dòng)；(3)逐滴加入預(yù)先配好的12M濃HCl使其pH < 2. 0，攪動(dòng)PEI溶液約2-3小時(shí)；(5)加入預(yù)先配制的IOM NaOH溶液將pH調(diào)至7. OL用Milli-Q超純水將PEI溶液定容至500ml ；(6)利用0. 22 μ m濾膜過(guò)濾PEI溶液，分裝成Iml/管，于_20°C保存。3、用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(1)在轉(zhuǎn)染前2天將細(xì)胞用無(wú)抗、含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基重懸， 按照1. 5 X 105/mL鋪入T15tl培養(yǎng)瓶中，每瓶加入30mL，5% C02，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；(2)轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將所需的Opti MEM培養(yǎng)基(或磷酸鹽緩沖液)預(yù)熱到25° _37°C， 溶解連接SDF-I-Fc基因的表達(dá)質(zhì)粒和PEI ；(3)在 5mL Ep 管中加入!ML Opti MEM/PBS,加入 60 μ g 連有 SDF-la-Fc 基因的質(zhì)粒DNA pR-SDF-Ia-Fc-EGFP (紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度后，加入Elution Buffer調(diào)整濃度至1 μ g/ μ L)，在振蕩器上輕輕渦旋；(4)加入120L lmg/mL的PEI，立即在振蕩器上振蕩3次，每次3秒鐘；室溫下將混合液孵育15分鐘；(5)取出預(yù)先鋪入培養(yǎng)瓶的細(xì)胞，將DNA/PEI混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，將瓶體豎起，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶混勻；將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果見(jiàn)附

圖1。4、表達(dá)產(chǎn)物收集及純化(I)CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染6hr后，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶完全中培養(yǎng)基吸出，加入30mL無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)。同時(shí)加入2mM谷氨酰胺和ImM丙酮酸鈉后繼續(xù)培養(yǎng)；(2)轉(zhuǎn)染后M小時(shí)后就可用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；2天、4天和6天分別收集細(xì)胞上清(注意不要把細(xì)胞去掉)，并且加入新鮮的SFM及谷氨酰胺和ImM丙酮酸鈉 (6天除外)；收集的上清4000rpm/min離心IOmin去死細(xì)胞和細(xì)胞碎片；(3)將上清吸入透析袋中，用PEG 20，000進(jìn)行濃縮，使其體積縮小至IOmL左右； 與此同時(shí)，用20mL超純水洗滌2mL Protein A的預(yù)裝柱；(4)洗滌后，20mL PBS (pH 7. 3)平衡柱子；(5)將濃縮后的細(xì)胞上清上柱，并收集流下的液體，將其重新上柱；重復(fù)兩次；(6)用 20mLPBS (pH 7. 3)洗柱；(7)最后用8X0. 5ml IOOmM檸檬酸緩沖液(pH 3. 0)洗脫蛋白產(chǎn)物，用預(yù)先加入 170 μ 1 IMTris pH 9. 0的1. 5mL離心管收集液體并中和。紫外分光光度計(jì)及SDS-PAGE測(cè)蛋白濃度及純度。SDF-Ia-Fc重組蛋白的純化結(jié)果見(jiàn)附圖2。
權(quán)利要求
1. 一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)人基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1與人免疫球蛋IgG的Fc段融合基因(SDF-I-Fc)的方法，其特性在于該方法通過(guò)如下步驟實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)人基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1與人免疫球蛋IgG的Fc段融合基因(SDF-I-Fc)(1)制備轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒；(2)制備PEI轉(zhuǎn)染溶劑；(3)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(4)進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物收集及純化。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)人基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1與人免疫球蛋IgG的Fc段融合基因(SDF-1-Fc)的方法。采用本方法，可以通過(guò)普通的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)獲得大量高純度高生物活性的SDF-1-Fc蛋白。在工業(yè)生產(chǎn)中滿足降低生產(chǎn)成本、簡(jiǎn)化工藝流程、提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的總體要求。Figure 1轉(zhuǎn)染72h后細(xì)胞照片(×100)Figure 2 SDS-PAGE鑒定純化后的SDF-1a-Fc重組蛋白(Lane 1SDF-1a-Fc；2Prestained Marker；3SDF-1a-Fcwith DTT)
文檔編號(hào)C12N15/85GK102154346SQ20111000658
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月13日
發(fā)明者吳咪佳, 周慧芳, 朱月珍, 楊宣武, 柴笑梅, 江永海 申請(qǐng)人:江蘇普羅賽生物技術(shù)有限公司