專利名稱：：一種轉(zhuǎn)糖基化大豆異黃酮糖苷的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)糖基化大豆異黃酮糖苷的制備方法，尤其是指利用ー種麥芽糖淀粉酶催化大豆異黃酮糖苷與糖基供體之間發(fā)生轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，制備轉(zhuǎn)糖基化大豆異黃酮糖苷。
背景技術(shù)：
：異黃酮是大豆等豆科植物中存在的ー類多酚類化合物，對(duì)人體具有較弱的雌激素活性，可以防止骨質(zhì)疏松癥、阿爾茨海默氏癥、動(dòng)脈硬化以及乳腺癌、前列腺癌等腫瘤疾病，減輕婦女更年期不適癥及降低冠心病的發(fā)病率。大豆等植物是日常飲食的主要異黃酮來(lái)源，然而由于ロ感風(fēng)味組織形態(tài)的原因，相當(dāng)一部分人不喜歡吃大豆食品。并且由于大豆中的異黃酮含量不高，加工貯藏過(guò)程中的損失，使得大豆食品遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能提供60-100mg異黃酮苷元/人/天的推薦攝入量。近年來(lái)，大豆異黃酮類保健食品已經(jīng)被ー些國(guó)家大量生產(chǎn)，主要作為替代療法，用于補(bǔ)充絕經(jīng)期婦女體內(nèi)的雌激素。然而，異黃酮苷元通常只聯(lián)有ー個(gè)葡萄糖殘基，是極度疏水的分子，這限制了其在食品藥品中的添加與使用?，F(xiàn)在的大豆異黃酮類保健食品主要是ー些膠囊片劑，攝入人體后的吸收率低，并且品種單一，口味很差。異黃酮的低溶解度，也使得液態(tài)大豆食品中異黃酮濃度較低。最近的調(diào)查研究表明，大豆奶制品中的異黃酮濃度僅有1.26-21.13mg/100go解決這些不利的措施就是在食品中添加異黃酮。然而由于大豆異黃酮的水溶性很差，至今仍不能將異黃酮提取物廣泛作為功能性食品添加剤。使用環(huán)糊精來(lái)螯合異黃酮分子，這是至今為止能エ業(yè)化生產(chǎn)提高溶解度的最有效的方法。所得到的螯合異黃酮，溶解度能増加5-6倍。然而由于環(huán)糊精能引起溶液混蝕，并且能束縛風(fēng)味物質(zhì)，所以這種產(chǎn)品的應(yīng)用也是有限的。也有通過(guò)額外加入一些增溶物質(zhì)而提高異黃酮溶解度的方法，但是增溶物質(zhì)常常會(huì)影響所添加食品的感官品質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明采用麥芽糖淀粉酶，催化糖基供體與大豆異黃酮糖苷間的轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)，從而合成高水溶性的轉(zhuǎn)糖基化大豆異黃酮糖苷(圖1)。本項(xiàng)發(fā)明所使用的大豆異黃酮糖苷類化合物，包括但不僅限于大豆異黃酮的染料木苷、大豆黃苷、黃豆黃苷。本項(xiàng)發(fā)明所使用的糖基供體是由三個(gè)及以上葡萄糖基構(gòu)成、具有α葡萄糖苷鍵的環(huán)糊精、麥芽寡糖、淀粉、糖元等。本項(xiàng)發(fā)明所涉及的麥芽糖淀粉酶(EC3.2.1.133)，屬于碳水化合物活性酶GH13家族，不但有水解活性，而且還有轉(zhuǎn)糖基化活性，也就是具有將糖基供體的α葡萄糖苷鍵水解，然后將產(chǎn)生的葡萄糖基或麥芽寡糖基，與糖基受體形成新的α葡萄糖苷鍵的轉(zhuǎn)糖基化作用。麥芽糖淀粉酶的制備、純化和活性測(cè)定的方法為文獻(xiàn)“XiaoleiLietal.Cnaracterizationoiarecombinantamylolvticenzymeοιhypertnermophi11c3archaeonThermofilumpendenswitnextremelythermostablemaltogenicamylaseactivity.AppliedMicrobiologyandBiotechnology.2010,85:1821-1830.”中所報(bào)道的方法。本發(fā)明所涉及的轉(zhuǎn)糖基化異黃酮的制備方法，包括以下步驟(1)將ー種大豆異黃酮糖苷和ー種糖基供體加入到pH值為3-7的緩沖液中，混勻，使ニ種底物的濃度分別為0.1-1%(w/v)和0.1-10%(w/v)；(2)將上述底物溶液在50-100°C預(yù)熱5min-lhr；(3)加入酶活カ為0.05-50U/mg糖基供體的麥芽糖淀粉酶，混勻；(4)繼續(xù)在50-100°C保溫10min-2hr，然后冷卻至室溫。這種酶法轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)(圖1)，具有反應(yīng)條件溫和，專ー性強(qiáng)，異黃酮不易變性等優(yōu)點(diǎn)；在上述反應(yīng)液中，所形成的轉(zhuǎn)糖基化大豆異黃酮糖苷，其分子是由天然大豆異黃酮糖苷的葡萄糖基以-C-O-C-糖苷鍵再額外連接多個(gè)α葡萄糖基所構(gòu)成，容易被人體的淀粉酶所水解，所以在人體內(nèi)的代謝方式和生物活性與天然異黃酮糖苷一致。并且這種轉(zhuǎn)糖基化大豆異黃酮糖苷穩(wěn)定性強(qiáng)、水溶性高，克服了天然大豆異黃酮糖苷水溶性低、在人體內(nèi)的吸收率低、治療效果不明顯等缺點(diǎn)，可以作為ー種新型的功能性食品添加剤，具有廣闊的應(yīng)用前景。圖1是麥芽糖淀粉酶催化大豆異黃酮糖苷和beta-環(huán)糊精轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)生成轉(zhuǎn)糖基化大豆異黃酮糖苷的示意圖。在圖1中，大豆異黃酮糖苷分子結(jié)構(gòu)中Rl和R2為氫時(shí)，則表示異黃酮的苷元是大豆黃素；大豆異黃酮糖苷分子結(jié)構(gòu)中Rl為羥基和R2為氫吋，則表示異黃酮的苷元是染料木素；大豆異黃酮糖苷分子結(jié)構(gòu)中Rl為氫和R2為甲氧基吋，則表示異黃酮的苷元是黃豆黃素；轉(zhuǎn)糖基化大豆異黃酮糖苷分子結(jié)構(gòu)中的η為大于1的整數(shù)，η個(gè)葡萄糖之間均以α葡萄糖苷鍵相連。圖2是麥芽糖淀粉酶TfMA催化染料木苷轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)溶液中異黃酮高效液相色譜圖OMnm)。在圖2中，保留時(shí)間為19.041min的色譜峰是未完全反應(yīng)的染料木苷，保留時(shí)間為13.889min、ll.816min和8.308min的色譜峰是三種不同結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)糖基化染料木苷，分別由染料木苷的葡萄糖基以-C-O-C-糖苷鍵再額外連接三個(gè)、ニ個(gè)和ー個(gè)α葡萄糖基所構(gòu)成。具體實(shí)施例方式將Img染料木苷和30mgbeta-環(huán)糊精加入到1.5mL的微量離心管中，再加入950μLρΗ5.5的乙酸鈉鹽緩沖液，混合后，放到90°C的水浴里預(yù)熱5min；然后加入50μL活力為40U的古細(xì)菌Thermofilumpendens麥芽糖淀粉酶TfMA，在其最適催化溫度90°C和最適催化PH5.5，反應(yīng)Ihr后，冷卻至室溫；將反應(yīng)液用0.45μM孔徑的微孔膜過(guò)濾后，進(jìn)行高效液相色譜分析，即可檢測(cè)到轉(zhuǎn)糖基化染料木苷(圖2)。權(quán)利要求1.一種轉(zhuǎn)糖基化大豆異黃酮糖苷的制備方法，其特征在于采用以下步驟(1)將ー種大豆異黃酮糖苷和ー種糖基供體加入到PH值為3-7的緩沖液中，混勻，使ニ種底物的濃度分別為0.1-1%(w/v)和0.1-10%(w/v)；(2)將上述底物溶液在50-100°C預(yù)熱5min-lhr；(3)加入酶活力為0.05-50U/mg糖基供體的麥芽糖淀粉酶，混勻；(4)繼續(xù)在50-100°C保溫10min-2hr，然后冷卻至室溫。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種轉(zhuǎn)糖基化大豆異黃酮糖苷的制備方法，其特征在于所使用的酶是古細(xì)菌Thermofilumpendens麥芽糖淀粉酶。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種轉(zhuǎn)糖基化大豆異黃酮糖苷的制備方法，其特征在于所使用的糖基供體是環(huán)糊精、麥芽寡糖、淀粉或糖元。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種轉(zhuǎn)糖基化大豆異黃酮糖苷的制備方法，其特征在于所使用的大豆異黃酮糖苷是染料木苷、大豆黃苷或黃豆黃苷。全文摘要本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)糖基化大豆異黃酮糖苷的制備方法。該方法以麥芽糖淀粉酶催化大豆異黃酮糖苷與糖基供體(環(huán)糊精、麥芽寡糖、淀粉或糖元)之間發(fā)生轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)，制備轉(zhuǎn)糖基化大豆異黃酮糖苷。這種酶法轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)，具有反應(yīng)條件溫和，專一性強(qiáng)，異黃酮不易變性等優(yōu)點(diǎn)；所得到的轉(zhuǎn)糖基化大豆異黃酮糖苷，穩(wěn)定性強(qiáng)、水溶性高，并且完全保留天然大豆異黃酮的生物活性，克服了天然大豆異黃酮糖苷水溶性低，在人體內(nèi)的吸收率低，治療效果不明顯等缺點(diǎn)。這種轉(zhuǎn)糖基化大豆異黃酮糖苷可以作為一種新型的功能性食品添加劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12P19/60GK102586365SQ201110006479公開(kāi)日2012年7月18日申請(qǐng)日期2011年1月13日優(yōu)先權(quán)日2011年1月13日發(fā)明者李丹,李曉磊申請(qǐng)人:李丹,李曉磊,長(zhǎng)春大學(xué)