專利名稱：雞crbp2基因遺傳變異的檢測方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因變異的檢測方法，具體涉及雞CRBP2基因遺傳變異的檢測方法和應用。
背景技術：
單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotid印olymorphisms，SNPs)主要是指基因組DNA 中某一特定核苷酸位置上發(fā)生轉換、顛換、插入或缺失等變化所引起的DNA序列的多態(tài)性。 SNP標記和其他遺傳標記，如限制性酶切片段長度多態(tài)性(re-striction fragment length polymorphism, RFLP)、微衛(wèi)星標記(microsatellites or short tandem repeats, STRs)等 相比具有兩個顯著特點。一是，SNP在基因組中的分布最為廣泛，有最為豐富的遺傳多樣性， 而且許多SNP和生物性狀的變異相關聯，其本身即是遺傳變異研究的候選基因或位點。所 以，研究SNP有助于解釋不同個體表形性狀的差異，不同群體和個體對疾病、環(huán)境因子等反 應的差異；其二，SNP在基因組中為雙等位基因，在任何群體中其等位基因的頻率都可準確 地估算出來，因而便于高通量的批量檢測，此外，通過比較種間SNP的差異，還可以了解種 間的親緣關系和群體遺傳多樣性等信息。目前對SNP進行檢測的方法較多，而大多數實驗室采用的是成本相對較低、技術 易掌握、檢出率較高、快捷、安全和步驟簡單的PCR-SSCP技術。該方法原理是經PCR擴增 的目的片段在變性劑或低離子濃度下經高溫處理使之解鏈并確保成為DNA單鏈，然后在一 定濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時， DNA單鏈的遷移率除與DNA鏈的長短有關外，更主要的是取決于DNA單鏈所形成的構象。在 非變性條件下，DNA單鏈可自身折疊形成具有一定空間結構的構象，這種構象由DNA單鏈堿 基決定，其穩(wěn)定性靠分子內局部順序的相互作用(主要為氫鍵)來維持。相同長度的DNA 單鏈其順序不同，甚至單個堿基不同，所形成的構象不同，電泳遷移率也不同，PCR產物變性 后，單鏈產物經中性聚丙烯酰胺凝膠電泳，因靶DNA中發(fā)生單堿基置換，或個別堿基插入或 缺失時，因遷移產生變化會出現泳動變位，從而可將變異DNA與正常DNA區(qū)分開。相同長度 的單鏈DNA因其順序不同或單個堿基差異，所形成的構象就會不同，其在凝膠中泳動速度 不一樣，從而顯示出帶型的差異，即多態(tài)型。SNP有非同義cSNP、同義cSNP、內含子區(qū)SNP、調控區(qū)的rSNP幾類，均能從不同角 度影響基因功能，其中非同義cSNP由于改變基因編碼的氨基酸，從而影響基因功能；同義 cSNP可通過改變mRNA的二級結構、翻譯速度等影響基因功能的發(fā)揮；內含子區(qū)SNP可通過 改變剪接位點的活性來影響基因功能；調控區(qū)的rSNP則可通過影響啟動子元件來調節(jié)基 因的功能。CRBP2是一類與維生素A (VA)代謝有關的疏水性小分子，擔任著轉運視黃醇(VA) 的任務，從而參與體內許多生物學過程，如視覺、繁殖、上皮細胞的維持、骨的生長發(fā)育等 [7]。陳詠梅等O000)研究后發(fā)現睪丸支持細胞(Sertoli細胞)可合成CRBP2，且合成量具 有與生精周期相伴的的周期性變化。因此研究CRBP2基因遺傳變異和分子遺傳特征對動物生長發(fā)育、繁殖具有重要理論意義和實踐意義。迄今為止，國內外均未見雞CRBP2基因遺傳變異的研究，由于中國地方雞種CRBP2 基因遺傳變異領域的研究匱乏，該基因位點的功能研究及其遺傳變異與產蛋性狀(如產蛋 量、開產體重、開產蛋重等)關聯的研究仍是空白。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于，采用PCR-SSCP技術檢測雞CRBP2基因的單核苷酸多態(tài)性，并 將其與生產性狀進行關聯分析，以篩選出SNP位點以輔之于育種，加快畜禽育種進程。為了實現上述目的，本發(fā)明采取如下技術方案一種雞CRBP2基因遺傳變異的檢測方法，其特征在于包括提取雞血樣 基因組DNA ；對基因組DNA進行PCR擴增，在PCR擴增時使用的上游引物序列為 ATTTCATTTATGCAGACACTA,下游引物序列為CAGAGATCAGAGCTGTCTAA ；將擴增產物進行凝膠 電泳并拍照，分析電泳結果；。本發(fā)明的一個實施方式中，PCR擴增步驟包括30 40個循環(huán)的變性、退火、延伸步驟。本發(fā)明的一個實施方式中，PCR擴增為對包括雞CRBP2基因第90 位點的基因片 段進行擴增。本發(fā)明的一個實施方式中，PCR擴增片段長度為237bp。本發(fā)明的一個實施方式中，在于還包括對擴增的基因片段進行測序。本發(fā)明還涉及一種或一對PCR擴增引物，其序列為ATTTCATTTATGCAGACACTA和/ 或 CAGAGATCAGAGCTGTCTAA。本發(fā)明還涉及雞CRBP2基因第90 位點T/C多態(tài)性在畜禽育種中的應用。本發(fā)明還涉及將所述的檢測方法在雞育種中的應用。本發(fā)明的一個實施方式中，所述的應用是指篩選產蛋率高的雞。本發(fā)明還涉及將所述的PCR擴增引物在雞CRBP2基因第90 位點T/C多態(tài)性檢 測中的應用。本發(fā)明根據CRBP2基因的序列設計引物，分別以2個雞品種/系的基因組DNA為 模板，進行PCR擴增，并對PCR產物進行測序，測序后得到的雞的CRBP2基因的部分序列與 NCBI公布的原雞的序列進行比較發(fā)現在編碼區(qū)第90 位存在SNP多態(tài)性。針對上述第90 位的SNP多態(tài)性，本發(fā)明還公開了其篩查和檢測方法，通過設計 特定的引物PCR擴增包含SNP位點的基因片段，然后進行高溫變性再進行聚丙烯酰胺凝膠 電泳鑒定，能夠簡單、快速、成本低、精確的檢測其單核苷酸的多態(tài)性。本發(fā)明對2個雞品種/系的SNP基因型進行了檢測和基因頻率分析，對上述SNP 位點與雞產蛋性狀(開產體重、300日齡產蛋量、開產蛋重、平均產蛋間隔)進行關聯分析， 該SNP位點的CC基因型可以做為一個提高雞300日齡產蛋量的候選分子遺傳標記。


圖IPCR擴增產物的凝膠電泳結果；圖2PCR擴增產物的測序驗證；
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。(1)特定引物的設計針對雞CRBP2基因第90 位點錯義密碼子突變 可能產生編碼蛋白組成發(fā)生變化的單核苷酸多態(tài)性，以NCBI公布的原雞序列 (NC_006096. 2REGI0N :6957813. · 6968779)為參考，利用 Primer5. 0 設計能夠擴增包含 雞CRBP2基因第三外顯子(8932 9033)區(qū)域的PCR引物，其引物序列M為上游引物 ATTTCATTTATGCAGACACTA(8917 8937)，下游引物CAGAGATCAGAGCTGTCTAA (9134 9153)。 擴增片段長度為237bp。對不同品系和個體的血樣混合成DNA池后以該對引物進行擴增， 得到與目的片段大小一致的片段，經雙向測序鑒定后，與NCBI公布的序列進行比較發(fā)現在 90 位點存在T/C多態(tài)性。(2)雞樣本的采集以3個雞品種/系作為檢測對象，具體采集樣本見表1。
O ΛΧ,樣樣樣品采品數品名稱來源樣方式二郎山山地 雞02品系(SD02)188血四川 農業(yè)大學 科研雞場翅 下靜脈 ^Ja-二郎山山地 雞03品系(SD03)161樣(3)雞血樣基因組DNA的提取①冷凍血液在室溫融化以后，取10 μ L移至離心管中，加入500 μ LSTE緩沖液， IOyL SDS，加入IOyL蛋白酶Κ(濃度為10 μ g/uL)，混合，上下充分搖動，37°C搖床水浴2 小時，然后55°C水浴過夜。②將溶液冷卻至室溫，加入等體積苯酚，輕搖離心管20分鐘，直至兩相混合形成 乳濁液，4°C，12000r/min離心10分鐘。③取上清，再加入等體積苯酚，輕搖離心管10分鐘，4°C，12000r/min離心10分鐘。④取上清，加入等體積酚氯仿異戊醇混合液04 23 1)，緩慢顛倒離心管 10 分鐘，4°C，12000r/min 離心 10 分鐘。⑤取上清，加入等體積氯仿，緩慢顛倒離心管10分鐘，4°C，12000r/min離心10分鐘。⑥取上清，加入2倍體積的預冷-20°C冰乙醇沉淀DNA，緩慢的轉動離心管，可見白 色DNA沉淀。⑦4°C，12000r/min離心10分鐘，去上清，然后加4°C預冷的70%乙醇快速沖洗兩 次，12000r/min離心10分鐘，去上清。⑧將DNA置于室溫下自然風干干燥(注意不能太干燥)，根據沉淀的量加入 適量(100-200 μ L) TE (pH8.0)緩沖液溶解，置4°C冰箱溶解過夜；溶解后的DNA可貯于4°C、-20°C、-70°C 中備用。注意在抽吸上清液時，盡量小心勿將中間的蛋白質層抽出。(4) PCR 擴增PCR 反應體系 QXTaq PCR MasterMix 5 μ L、ddH20 3.4yL、引物(10pmol/yL) 各0. 4μ L、模板DNA(50ng/mL)0. 8μ L)采用的是混合法，即先把引物、酶、ddH20比擴增量多 一點的份數混勻后分裝，最后加入模板短暫離心后進行PCR擴增，擴增程序為94°C預變性 5min — (94°C變性 30s — 53. 3°C退火 30s — 72°C 30s) X35cycle — 72°C延伸 IOmin.(5)電泳及基因型判定將擴增產物99°C變性5min后于10%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，電泳完畢后 進行硝酸銀染色拍照。根據電泳結果直接判定個體基因型，四條帶的為雜合型，上面兩條帶 的為CC純合型，下邊兩條帶的為TT純合型，具體見附圖1。(6)不同基因型個體PCR產物的測序驗證對不同基因型個體各5個50 μ 1大體系擴增，經瓊脂糖凝膠檢測有目的條帶后直 接送華大公司純化測序，結果見附圖2，雙峰為雜合型個體。(7)雞CRBP2基因SNP位點的基因和基因型頻率統(tǒng)計分析①基因型頻率指一個群體中某一性狀的各種基因型之間的比率。由于PCR-SSCP 方法的檢測結果為共顯性等位基因，因此，表型頻率即為基因型頻率?；蛐皖l率=基因型個數/檢測群體總數②等位基因頻率記為Pi，表示在一個群體中某一等位基因的數量與占據同一基 因座位的全部等位基因總數的比例，取值0-1之間。Pi = [2(ii) + (ijl) + (ij2)+......(ijn)]/2NPi 第i個等位基因的頻率i 純合復等位基因jl、j2、……jn:與i共顯的第1到第η個等位基因雞CRBP2基因第90 位SNP基因頻率分布表
權利要求
1.一種雞CRBP2基因遺傳變異的檢測方法，其特征在于包括提取雞血樣基因組DNA ；對 基因組DNA進行PCR擴增，在PCR擴增時使用的上游引物序列為ATTTCATTTATGCAGACACTA， 下游引物序列為CAGAGATCAGAGCTGTCTAA ；將擴增產物進行凝膠電泳并拍照，分析電泳結果。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其中PCR擴增步驟包括30 40個循環(huán)的變性、退 火、延伸步驟。
3.根據權利要求1所述的檢測方法，其中PCR擴增為對包括雞CRBP2基因第90 位點 的基因片段進行擴增。
4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于PCR擴增片段長度為237bp。
5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于還包括對擴增的基因片段進行測序。
6.一種或一對PCR擴增引物，其序列為ATTTCATTTATGCAGACACTA和/或 CAGAGATCAGAGCTGTCTAA。
7.雞CRBP2基因第90 位點T/C多態(tài)性在畜禽育種中的應用。
8.權利要求1-5任意一項所述的檢測方法在雞育種中的應用。
9.根據權利要求7的應用，其特征是篩選產蛋率高的雞。
10.權利要求6所述的PCR擴增引物在雞CRBP2基因第90 位點T/C多態(tài)性檢測中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雞CRBP2基因遺傳變異的檢測方法，其特征在于包括提取雞血樣基因組DNA；對基因組DNA進行PCR擴增，在PCR擴增時使用的上游引物序列為ATTTCATTTATGCAGACACTA，下游引物序列為CAGAGATCAGAGCTGTCTAA；將擴增產物進行凝膠電泳并拍照，分析電泳結果。其中雞基因組第9028位點T/C多態(tài)性與產蛋性狀(如產蛋量、開產體重、開產蛋重等)相關，選出的單核苷酸多態(tài)性位點以輔之于育種，可以加快畜禽育種進程。
文檔編號C12Q1/68GK102134607SQ201110003340
公開日2011年7月27日 申請日期2011年1月10日 優(yōu)先權日2011年1月10日
發(fā)明者劉益平, 朱慶, 肖禮華, 趙小玲 申請人:四川農業(yè)大學