基于Taqman-MGB探針的人MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒和方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于遺傳基因檢測領(lǐng)域，特別涉及基于Taqman-MGB探針的人MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒和方法。本發(fā)明能同時檢測C677T、A1298C兩個SNP位點，結(jié)果容易判讀。本發(fā)明中的MGB探針具有3’端淬滅基團不發(fā)光，背景較低，對單個堿基突變檢測更敏感，且只需根據(jù)Ct值就可判讀不同基因型，比傳統(tǒng)的Taqman探針檢測和HRM檢測等方法結(jié)果判讀更容易。與探針價格較低，檢測成本較低，一個多態(tài)性位點只需要一管qPCR檢測即可完成，操作簡單。且本發(fā)明方法不需要進行PCR產(chǎn)物的后續(xù)分析，在節(jié)省了檢測成本的同時，大大縮短了檢測周期，提高了檢測的效率，另外降低了PCR產(chǎn)物污染引起假陽性的風(fēng)險。
【專利說明】基于Taqman-MGB探針的人MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于遺傳基因檢測領(lǐng)域，特別涉及基于Taqman-MGB探針的人MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)是葉酸代謝系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，催化5，10-亞甲基四氫葉酸還原為甲基供體5-甲基四氫葉酸。5-甲基四氫葉酸一方面可以作為甲基的間接供體參與體內(nèi)嘌呤、嘧啶的合成及DNA、RNA、蛋白質(zhì)的甲基化；另一方面，在甲硫氨酸合成酶的催化下，以維生素B12為輔酶，使血液中同型半胱氨酸再發(fā)生甲基化生產(chǎn)甲硫氨酸，從而維持體內(nèi)正常的同型半胱氨酸水平。MTHFR 基因常見有 C677T (SNP ID:rsl801133)、A1296C (SNP ID:rsl801131)兩種多態(tài)性位點，其中C677T位點是最為常見的突變位點。研究表明，C677T位點C變?yōu)門后，其編碼的丙氨酸被纈氨酸替代，純合突變TT型MTHFR酶活性只有正常的30%，雜合突變CT型有正常酶活性的60%。A1298C純合突變也會引起酶活性的下降，與C677T同時發(fā)生純合突變的幾率較小，二者同時發(fā)生雜合時對酶的活性影響很大，但單獨雜合對酶的活性影響不大。MTHFR基因突變可導(dǎo)致其編碼的葉酸代謝關(guān)鍵酶活性降低，引起葉酸代謝障礙，造成葉酸水平降低及高同型半胱氨酸血癥。近年來發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸水平與心腦血管疾病、出生缺陷、妊娠相關(guān)疾病等多種疾病密切相關(guān)。
[0003]MTHFR基因多態(tài)性位點目前的檢測方法分為四類:測序法，聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)、芯片法、熒光定量PCR法(qPCR)，這四種方法都是基于PCR技術(shù)。
[0004]測序法:先進行PCR擴增，得到含有目的SNP位點的PCR產(chǎn)物，然后純化PCR產(chǎn)物，再對其進行測序，根據(jù)測序峰圖判讀基因型。優(yōu)點:結(jié)果準(zhǔn)確，測序法是基因多態(tài)性位點檢測的金標(biāo)準(zhǔn)；缺點:成本較高，操`作繁瑣，試驗周期長。
[0005]PCR-RFLP技術(shù):先進行PCR擴增，得到含有目的SNP位點的PCR產(chǎn)物，然后對PCR產(chǎn)物進行酶切，電泳檢測酶切條帶，根據(jù)酶切條帶進行判讀。優(yōu)點:成本低，結(jié)果比較直觀；缺點:有的多態(tài)性位點所在位置沒有合適的限制性酶切位點，需要人工引入突變，另外操作繁瑣，試驗周期長。
[0006]芯片法:先進行PCR擴增，得到含有目的SNP位點的PCR產(chǎn)物，然后將PCR產(chǎn)物與突變探針、野生探針雜交，通過比較兩個探針雜交的信號強度判斷樣品基因型。探針固定在尼龍膜、硝酸纖維素膜、玻璃上的稱為固相芯片；探針固定在微小珠子上的為液相芯片，如luminex、biocade檢測平臺。缺點:PCR產(chǎn)物需要進行后續(xù)分析,操作繁瑣；另外結(jié)果不好判讀，容易出現(xiàn)假陽性。
[0007]qPCR法:又分為ARMS-PCR法、HRM法、Taqman探針法。qPCR的優(yōu)點是操作簡單，試驗周期短，PCR產(chǎn)物無需進行后續(xù)分析即可判斷結(jié)果，因全過程在封閉的管內(nèi)進行，減少了交叉污染。
[0008]ARMS-PCR 法:ARMS-PCR (amplification refractory mutation system)又叫等位基因特異PCR，TaqDNA聚合酶缺少外切酶活性，在一定條件下PCR引物3'末端的錯配導(dǎo)致產(chǎn)物的急劇減少，針對不同的已知突變，分別設(shè)計突變引物、野生引物，2個引物主要是3'末端堿基不同，通過qPCR方法直接達到區(qū)分突變型和野生型基因的目的。缺點:一個樣品要分2管PCR檢測，才能檢測出一個SNP位點基因型檢測，操作麻煩。
[0009]HRM法:高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(High Resolution Melting, HRM)，有染料法和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)雙探針法等。染料法對熒光染料、PCR儀器要求較高，臨床檢測比較少用。FRET (fluorescence resonance energy transfer, FRET)探針比較常用，羅氏專利的FRET探針又稱為雙雜交探針。在SNP位點設(shè)計兩條FRET探針，當(dāng)兩條探針和模版互補、且相鄰的特異探針組成，上游探針的3'端標(biāo)記供體熒光基團，相鄰下游探針的5'端標(biāo)記Red640受體熒光基團。當(dāng)復(fù)性時，兩探針同時結(jié)合在模板上，供體基團和Red640受體基團緊密相鄰，激發(fā)供體產(chǎn)生的熒光能量被Red640基團吸收，使得檢測探頭可以檢測到Red640發(fā)出波長為640的熒光。當(dāng)變性時，兩探針游離，兩基團距離遠，不能檢測到640波長的熒光。FRET探針檢測的信號是退火時的實時信號，每次檢測信號始終嚴(yán)格對應(yīng)模版的數(shù)量，非累積信號，可以用于做Tm曲線進行SNP檢測。優(yōu)點:一個SNP位點基因型，只需要一管PCR完成檢測；缺點:根據(jù)HRM溶解曲線Tm值差異不容易判讀，不同基因型溶解曲線峰圖差異不明顯。
[0010]Taqman探針法=Taqman探針是一種經(jīng)典的定量PCR技術(shù),現(xiàn)階段得到廣泛應(yīng)用，在PCR反應(yīng)體系中加入一對引物的和一個特異性熒光探針，探針只與兩條引物之間特異性模板結(jié)合，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR過程。探針的5,端連接報告熒光，3'端連接淬滅熒光，隨后進行實時定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交，則在PCR用引物延伸時，TaqDNA聚合酶5'到3'端`的外切酶活性會將探針序列上5'端的報告熒光切下，淬滅熒光不再能對報告熒光進行抑制，使得報告熒光發(fā)光。針對SNP位點分別設(shè)計兩個不同熒光標(biāo)記突變探針、野生探針，根據(jù)突變探針、野生探針熒光信號強度進行SNP位點基因型判讀。優(yōu)點:一個SNP位點，只需要一管PCR完成基因型檢測。
[0011]目前Taqman探針法存在以下缺點:不同基因型結(jié)果差異不明顯，每次做qPCR檢測必須設(shè)置三個基因型對照，另外TaqMan探針熒光淬滅不徹底，背景較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺點，提供一種基于Taqman-MGB探針的人MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒和方法，不僅可以對C677T、A1298C兩個SNP位點同時檢測，還適用于一般熒光PCR儀，操作簡單、特異性和敏感性好，能夠快速靈敏地檢測待測位點基因類型，從而準(zhǔn)確對人MTHFR基因多態(tài)性進行基因分型。
[0013]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:基于Taqman-MGB探針的人MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒，試劑盒中包括以下兩對引物序列及其對應(yīng)的探針序列:
(I)用于MTHFR基因C677T SNP位點檢測的引物和探針:
上游引物 MTHFR 677F: 5’-TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’ ；
下游引物 MTHFR 677R: 5’ -TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’ ；突變探針MTHFR 677T:5’ -熒光基團-TCATGGCATTTCTCA-淬滅基團；
野生探針MTHFR 677C:5’ -熒光基團-TCATGGCAGTTCTCA-淬滅基團；
(2)用于MTHFR基因A1298C SNP位點檢測的引物和探針:
上游引物 MTHFR 1298F: 5’ - AGCTGAAGGACTACTACCTCTTCTACC-3’ ；
下游引物 MTHFR 1298R: 5，- AGCATCACTCACTTTGTGACCATT-3，；
突變探針MTHFR 1298C:5’ -熒光基團-CCAGTGAAGCAAGTG -淬滅基團；
野生探針MTHFR 1298A:5’ -熒光基團-CCAGTGAAGAAAGTG -淬滅基團。
[0014]所述MTHFR基因遺傳多態(tài)性檢測劑盒還包括含Mg2+的PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP混合物、Taq酶和ddH20。
[0015]所述探針5’端的熒光基團為FAM、TET、VIC、HEX或ROX中的一種，3’端的淬滅基團為NFQ。
[0016]基于Taqman-MGB探針的人MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟:
(1)提取待測人的基因組DNA;
(2)將驟(I)得到的DNA加入到人MTHFR基因C677T多態(tài)性位點的PCR反應(yīng)液中進行PCR擴增，測出野生型探針的Ct值和突變型探針的Ct值，野生型探針的Ct值減去突變型探針的Ct值，大于等于3為TT型純合子，小于等于-3為CC野生型，在-1到+1之間為CT雜合子；
(3)將驟(I)得到的DNA加入到人MTHFR基因A286C多態(tài)性位點的PCR反應(yīng)液中進行PCR擴增，測出野生型探針的C t值和突變型探針的Ct值，野生型探針的Ct值減去突變型探針的Ct值，大于等于3為CC型純合子，小于等于-3為AA野生型，在-1到+1之間為AC
雜合子。
[0017]本發(fā)明的有益效果包括以下三個方面:
一.本發(fā)明能同時檢測C677T、A1298C兩個SNP位點，結(jié)果容易判讀。本發(fā)明中的MGB探針具有3’端淬滅基團不發(fā)光，背景較低，對單個堿基突變檢測更敏感，且只需根據(jù)Ct值就可判讀不同基因型，比傳統(tǒng)的Taqman探針檢測和HRM檢測等方法結(jié)果判讀更容易。
[0018]二、本發(fā)明技術(shù)方案中的檢測引物與探針價格較低，檢測成本較低，一個多態(tài)性位點只需要一管qPCR檢測即可完成，操作簡單。且本發(fā)明方法不需要進行PCR產(chǎn)物的后續(xù)分析，不需PCR產(chǎn)物純化、電泳、酶切、雜交等,在節(jié)省了檢測成本的同時,大大縮短了檢測周期，提高了檢測的效率，另外降低了 PCR產(chǎn)物污染引起假陽性的風(fēng)險。
[0019]三、本發(fā)明技術(shù)方案中的檢測引物與Taqman MGB探針，采用實時熒光PCR技術(shù)平臺，相對測序法、PCR-RFLP、芯片法更容易實現(xiàn)高通量檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]附圖1是3個樣品MTHFR基因C677T位點突變探針熒光定量PCR曲線圖； 附圖2是3個樣品MTHFR基因C677T位點野生探針熒光定量PCR曲線圖；
附圖3是I號野生型樣品MTHFR基因C677T位點測序圖；
附圖4是2號純合突變樣品MTHFR基因C677T位點測序圖；
附圖5是3號雜合突變樣品MTHFR基因C677T位點測序圖；附圖6是3個樣品MTHFR基因A1298C位點突變探針熒光定量PCR曲線圖；
附圖7是3個樣品MTHFR基因A1298C位點野生探針熒光定量PCR曲線圖；
附圖8是4號野生型樣品MTHFR基因A1298C位點測序圖；
附圖9是5號純合突變樣品MTHFR基因A1298C位點測序圖；
附圖10是6號雜合突變樣品MTHFR基因A1298C位點測序圖。
【具體實施方式】
[0021]下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。
[0022]基于Taqman-MGB探針的人MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒，試劑盒中包括以下兩對引物序列及其對應(yīng)的探針序列:
(1)用于MTHFR基因C677TSNP位點檢測的引物和探針:
上游引物 MTHFR 677F: 5’-TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’ ；
下游引物 MTHFR 677R: 5’ -TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’ ；
突變探針MTHFR 677T:5’ -熒光基團-TCATGGCATTTCTCA-淬滅基團；
野生探針MTHFR 677C:5’ -熒光基團-TCATGGCAGTTCTCA-淬滅基團；
(2)用于MTHFR基因A1298CSNP`位點檢測的引物和探針:
上游引物 MTHFR 1298F: 5’ - AGCTGAAGGACTACTACCTCTTCTACC-3’ ；
下游引物 MTHFR 1298R: 5，- AGCATCACTCACTTTGTGACCATT-3，；
突變探針MTHFR 1298C:5’ -熒光基團-CCAGTGAAGCAAGTG -淬滅基團；
野生探針MTHFR 1298A:5’ -熒光基團-CCAGTGAAGAAAGTG -淬滅基團。
[0023]所述MTHFR基因遺傳多態(tài)性檢測劑盒還包括含Mg2+的PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP混合物、Taq酶和ddH20。
[0024]所述探針5’端的熒光基團為FAM、TET、VIC、HEX或ROX中的一種，3’端的淬滅基團為NFQ。
[0025]基于Taqman-MGB探針的人MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟:
(1)提取待測人的基因組DNA;
(2)將驟(I)得到的DNA加入到人MTHFR基因C677T多態(tài)性位點的PCR反應(yīng)液中進行PCR擴增，測出野生型探針的Ct值和突變型探針的Ct值，野生型探針的Ct值減去突變型探針的Ct值，大于等于3為TT型純合子，小于等于-3為CC野生型，在-1到+1之間為CT雜合子；
(3)將驟(I)得到的DNA加入到人MTHFR基因A286C多態(tài)性位點的PCR反應(yīng)液中進行PCR擴增，測出野生型探針的C t值和突變型探針的Ct值，野生型探針的Ct值減去突變型探針的Ct值，大于等于3為CC型純合子，小于等于-3為AA野生型，在-1到+1之間為AC
雜合子。
[0026]實施例1:試劑盒中的PCR反應(yīng)液配置
分別配置檢測人MTHFR基因C677T、A286C多態(tài)性位點的PCR反應(yīng)液，其中PCR反應(yīng)液包含引物及其對應(yīng)的Taqman-MGB探針、Taq酶、dNTP混合液、MgC12溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、ddH20。
[0027]每個PCR擴增的反應(yīng)體系為20ul，包含10XPCR反應(yīng)緩沖液2.0μ 1、2.4μ125mMMgC12 溶液、2.5mM 的 dNTP 混合液 1.6 μ l、5U/ul Taq 酶 0.1 μ 1、DNA 模板 I μ I (50ng左右)、20uM上下游引物各0.5 μ IUOuM突變野生探針各0.5 μ 1，ddH20 12.7 μ I
MTHFR C677T反應(yīng)液中的引物、Taqman-MGB探針:
上游引物 MTHFR 677F: 5’ -TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’ ；
下游引物 MTHFR 677R: 5’ -TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’ ；
突變探針 MTHFR 677Τ:5’ -FAM- TCATGGCATTTCTCA -NFQ ；
野生探針 MTHFR 677C:5’ -VIC- TCATGGCAGTTCTCA -NFQ ；
MTHFRA1298C反應(yīng)液中的引物、Taqman-MGB探針:
上游引物 MTHFR 1298F: 5’- AGCTGAAGGACTACTACCTCTTCTACC -3’ ；
下游引物 MTHFR 1298R: 5，- AGCATCACTCACTTTGTGACCATT -3，；
突變探針 MTHFR 1298C:5’ -FAM- CCAGTGAAGCAAGTG -NFQ ；
野生探針 MTHFR 1298A:5’ -VIC- CCAGTGAAGAAAGTG -NFQ ；
實施例2:檢測試劑盒的使用
1、抽提DNA模板
人血液DNA提取，采用天根生化生物技術(shù)公司全血DNA提取試劑盒，從血液中提取基因組DNA。
[0028]2、PCR反應(yīng)體系配置
使用實施例1中配置PCR反應(yīng)液進行檢測，一個樣品，同時進行2管PCR檢測。取19ulMTHFR C677T PCR反應(yīng)液到一個PCR反應(yīng)管中、取19ul MTHFR A286C PCR反應(yīng)液到另外一個PCR反應(yīng)管中，分別向2個PCR反應(yīng)管中加入同一個步驟I中提取的DNA lul( l(Tl00ng)。
[0029]3、熒光PCR檢測
將配置好的PCR體系放入熒光PCR儀器中，進行熒光PCR擴增檢測；反應(yīng)條件為:94°C3分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，62°C 30秒退火，72°C 30分鐘延長，循環(huán)45次。
[0030]熒光PCR儀器:羅氏LightCycIer@480型實時熒光定量PCR儀。
[0031]4、基因分型
本領(lǐng)域技術(shù)人員通過熒光定量PCR儀上顯示的FAM和VIC探針的Ct值，確定所檢測的SNP位點的基因型。C677T位點基因型判讀，為其的野生型探針的Ct值減去突變型探針的Ct值，如果大于等于3為TT型純合突變，小于等于-3為CC野生型，如果在-1到+1之間為CT雜合突變；A1298C位點基因型判讀同C677T。
[0032]附圖1是3個樣品MTHFR基因C677T位點突變探針熒光定量PCR曲線圖，附圖2
是與附圖1相同的3個樣品MTHFR基因C677T位點野生探針熒光定量PCR曲線圖，這3個
樣品的野生型探針的Ct值減去突變型探針的Ct值分別為:-5.02、7.87、-0.53，說明I號樣
品為野生型、2號樣品為純合突變，3號樣品為雜合突變，如下表所示:
【權(quán)利要求】
1.基于Taqman-MGB探針的人MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒中包括兩對引物及其對應(yīng)的探針，引物及探針的序列如下: (1)用于MTHFR基因C677TSNP位點檢測的引物和探針: 上游引物 MTHFR 677F: 5’-TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’ ； 下游引物 MTHFR 677R: 5’ -TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’ ； 突變探針MTHFR 677T:5’ -熒光基團-TCATGGCATTTCTCA-淬滅基團； 野生探針MTHFR 677C:5’ -熒光基團-TCATGGCAGTTCTCA-淬滅基團； (2)用于MTHFR基因A1298CSNP位點檢測的引物和探針: 上游引物 MTHFR 1298F: 5’ - AGCTGAAGGACTACTACCTCTTCTACC-3’ ； 下游引物 MTHFR 1298R: 5，- AGCATCACTCACTTTGTGACCATT-3，； 突變探針MTHFR 1298C:5’ -熒光基團-CCAGTGAAGCAAGTG -淬滅基團； 野生探針MTHFR 1298A:5’ -熒光基團-CCAGTGAAGAAAGTG -淬滅基團。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于Taqman-MGB探針的人MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于:所述MTHFR基因多態(tài)性檢測劑盒還包括含Mg2+的PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP混合物、Taq 酶和 ddH20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于Taqman-MGB探針的人MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于:所述各探針5’端的熒光基團為FAM、TET、VIC、HEX或ROX中的一種，3’端的淬滅基團為NFQ。
4.利用權(quán)利要求1、2或3所述的基于Taqman-MGB探針的人MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒進行檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)、取待測人的基因組DNA; (2)、將驟(I)得到的DNA分別加入到人MTHFR基因C677T多態(tài)性位點的PCR反應(yīng)液和人MTHFR基因A286C多態(tài)性位點的PCR反應(yīng)液中進行PCR擴增，分別測出兩種反應(yīng)體系野生型探針的Ct值和突變型探針的Ct值，并計算出差值，之后根據(jù)差值判斷基因型，判斷標(biāo)準(zhǔn)為:
在人MTHFR基因C677T多態(tài)性位點的PCR反應(yīng)液的反應(yīng)體系中，野生型探針的Ct值減去突變型探針的Ct值，大于等于3為TT型純合子，小于等于-3為CC野生型，在-1到+1之間為CT雜合子；
在人MTHFR基因A286C多態(tài)性位點的PCR反應(yīng)液的反應(yīng)體系中，野生型探針的Ct值減去突變型探針的Ct值，大于等于3為CC型純合子，小于等于-3為AA野生型，在-1到+1之間為AC雜合子。
【文檔編號】C12Q1/68GK103757106SQ201410006991
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月7日
【發(fā)明者】楊曦 申請人:河南科技大學(xué)