專利名稱：一種阿維菌素產(chǎn)生菌及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及阿維菌素產(chǎn)生菌及其制備方法，具體地說是阿維菌素產(chǎn)生菌的變異株及其制備方法。
背景技術(shù)：
阿維菌素(avermectin，AVM)是一類由除蟲鏈霉菌(str印tomycesavermitilis) 經(jīng)液體發(fā)酵產(chǎn)生的一類大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是一種全新的無公害生物農(nóng)獸藥，其具有高效低毒與環(huán)境友好的特點，對蔬菜、果樹、棉花、水稻等多種作物的相關(guān)害蟲有良好防效，是目前世界上最有前途的生物殺蟲殺螨劑。目前除蟲鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的阿維菌素中包括有結(jié)構(gòu)類似的 8 種組分(AVMAlaAVMAlb AVMA2a AVMA2b AVMBla AVMBlb AVMB2a AVMB2b)。其中 B 組分的生物活性優(yōu)于A組分，尤以Bla活性最強。因此如何減低工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)物中的A組分、 提高Bla組分已成為人們研究的重點。例如，天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系李燕霞等人利用紫外線、亞硝基胍并結(jié)合L-異亮氨酸誘變手段對除蟲鏈霉菌進行誘變處理，獲得了可顯著提高Bla組分產(chǎn)量的菌株，發(fā)酵單位比出發(fā)菌株提高12. 86% (工業(yè)微生物2008年第38 卷第一期)。CN200410009639. 2公開了一種利用紫外線和亞硝基胍誘變篩選得到阿維菌素高產(chǎn)菌株的方法；CN200610149617. 5公開了一株僅產(chǎn)生Bla和B2a的新菌株；但上述技術(shù)方案的生產(chǎn)水平仍有待進一步提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一就是要提供一種新的阿維菌素產(chǎn)生菌，以大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)物中阿維菌素Bla組分。本發(fā)明的第二個目的就是要提供該菌株的制備方法。本發(fā)明所提供的阿維菌素產(chǎn)生菌(str印tomyces avermitilis)，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏。保藏名稱為FD6-9，保藏編號CGMCC No. 4341，保藏日期2010年11月12日。中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心建議的分類命名為除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)。本發(fā)明菌株(以下簡稱FD6-9)是發(fā)明人通過對阿維鏈霉菌MF800-6 (以下簡稱初始出發(fā)菌株)經(jīng)過紫外線復(fù)合氯化鋰、亞硝基胍、羥胺、5-溴尿嘧啶誘變劑的依次誘變， 然后再對誘變株進行篩選獲得。該菌株可大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)物中阿維菌素B組分，減少阿維菌素A組分；其應(yīng)用于阿維菌素工業(yè)生產(chǎn)中可提高發(fā)酵單位40%左右，降低生產(chǎn)成本左右。本發(fā)明菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化學(xué)特征如下菌落顏色灰褐色。黑色好氧生長生長。菌體大小/mm :2 6mm。適宜生長溫度27.0- . 5°C。
適宜生長pH :6. 0-7. 5。菌體外表菌落呈圓形，有褶皺，無光澤，邊沿整齊。革蘭氏染色陽性。光吸收峰/nm :245nm。本發(fā)明所提供的阿維菌素產(chǎn)生菌的制備方法，它包括以下步驟a、紫外線復(fù)合氯化鋰誘變處理(1)孢子懸浮液制備將普通阿維菌素產(chǎn)生菌的孢子制成孢子懸液，調(diào)整孢子濃度為IO6個/毫升，于波長253. 7nm,進行紫外線誘變；(2)誘變處理將紫外線誘變后孢子懸液系列稀釋為ΙΟ^ΚΓ^ΙΟΛ ΟΛΚΓ5、 10_6、10_7，取0. 1毫升各濃度的稀釋液，涂在含氯化鋰的平板培養(yǎng)基上，觀士0. 5°C培養(yǎng)7-9天。b、誘變株的篩選將誘變后培養(yǎng)的單菌落轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，并對應(yīng)點種到另一培養(yǎng)皿培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7天后，取單菌落菌塊，用甲醇浸泡18 M小時，震蕩后，測定各菌株浸取液的效價，留取10%的高效價菌株，用搖瓶發(fā)酵法進行復(fù)篩，最終挑選出最后效價高的菌株作為下一誘變劑誘變處理的出發(fā)菌株I ；C、亞硝基胍誘變、篩選(1)孢子懸浮液制備在含有磷酸緩沖液的新鮮試管斜面內(nèi)，將上述出發(fā)菌株I的孢子制成孢子懸液，調(diào)整孢子濃度為IO6個/毫升，過濾，除去大部分菌絲及培養(yǎng)基；(2)誘變處理將上述孢子懸浮液加入亞硝基胍母液，使亞硝基胍含量為1. Omg/ ml，充分混勻后，于觀士0. 5°C，220rpm振蕩處理40-60分鐘；誘變處理完畢后，終止亞硝基胍誘變，分別吸取0. Iml不同濃度的稀釋液涂平板，觀士0. 5°C培養(yǎng)7-10天；(3)篩選按照b步方法對誘變株進行篩選，終篩挑選出最后效價高的菌株作為下一誘變劑誘變處理的出發(fā)菌株II ；d、硫酸二乙酯誘變、篩選(1)孢子懸浮液制備在含有磷酸緩沖液的新鮮試管斜面內(nèi)，用上述出發(fā)菌株II 的孢子制成孢子懸液，調(diào)整孢子濃度為IO6個/毫升，過濾，除去大部分菌絲及培養(yǎng)基；(2)誘變處理將上述孢子懸浮液與硫酸二乙酯充分混合，使硫酸二乙酯含量為！!^/!(^!!^，于觀士0. 5°C，震蕩處理，誘變處理完畢后，終止硫代硫酸鈉誘變；分別吸取 0. Iml不同濃度的稀釋液涂平板，觀士0. 5°C培養(yǎng)7-10天；(3)篩選按照b步方法對誘變株進行篩選，終篩挑選出最后效價高的菌株作為下一誘變劑誘變處理的出發(fā)菌株III。e、羥胺誘變、篩選(1)孢子懸液的制備取15毫升已滅菌的ph為7. O磷酸緩沖液，倒入一支培養(yǎng)好的III菌株試管斜面內(nèi)，做成孢子濃度為IO6個/毫升的懸浮液。(2)誘變處理將制備好的孢子懸液進行梯度稀釋10人10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、 10_7，取0. Iml各濃度稀釋液，涂在已制備好的含有羥胺的平板上，觀士0. 5°C倒置培養(yǎng)7_9天。(3)篩選按照b步方法對誘變株進行篩選，終篩挑選出最后效價高的菌株作為下一誘變劑誘變處理的出發(fā)菌株IV ；f、5_溴尿嘧啶復(fù)合紫外線誘變、篩選(1)孢子懸浮液制備將出發(fā)菌株IV孢子刮下制成孢子懸液，調(diào)整孢子濃度為IO6 個/ml，過濾，除去大部分菌絲及培養(yǎng)基；(2)誘變處理孢子懸液中加入5-溴尿嘧啶，使5-溴尿嘧啶含量為1. 0-1. 5mg/ ml，于觀士0. 50C，轉(zhuǎn)速220rpm條件下處理5_8小時；將誘變處理過的孢子懸液紫外線照射 35-60 秒。(3)分別吸取處理液進行梯度稀釋，吸取0. Iml各濃度稀釋液涂平板，在 28士0. 5°C培養(yǎng) 7-9 天。(4)篩選按照b步方法對誘變株進行篩選，最終獲得FD6-9菌株。本發(fā)明方法制備的菌株可大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)物中阿維菌素B組分，減少阿維菌素 A組分，且其傳代穩(wěn)定好，菌株連續(xù)傳代15次后，其生長速度、革蘭氏染色結(jié)果、菌體形態(tài)大小、活菌體光譜吸收峰都無明顯變化，表明本發(fā)明菌株完全符合工業(yè)化生產(chǎn)菌種需要。本發(fā)明方法中所用的培養(yǎng)基的配方及制備方法如下單菌落培養(yǎng)基的配方組成及配制(也是阿維菌素常規(guī)培養(yǎng)基)。配方(W/V)牛肉膏0. 1-0. 3 %、酵母膏0. 2-0. 5 %、蛋白胨0. 5-1. 0 %、葡萄糖0. 5-0. 8 %、硫酸亞鐵0. 001 % (配成0. 1 %母液按比例加入，用時現(xiàn)配)、瓊脂粉 2.0-2.5%、余量為蒸餾水。pH 7. 2-7. 5，培養(yǎng)5-8天。單菌落培養(yǎng)基優(yōu)選的配方為(為便于表述，以下簡稱1號培養(yǎng)基)牛肉粉(膏)0. 1%、酵母膏0.2%、蛋白胨0.5%、葡萄糖0.56%、瓊脂粉2.5%、硫酸亞鐵0. 001%，余量為水。制備方法按照上述配方稱取葡萄糖、牛肉粉(膏)、蛋白胨、酵母膏，用蒸餾水溶解并充分混勻，加入硫酸亞鐵lmL/100mL (提前配制為0. 1 %的溶液)，用蒸餾水定容至配料體積，用10%的稀鹽酸或20%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 2，加入瓊脂粉，液化后分裝入 500mL的三角瓶中，每瓶裝300-400ml，塞好棉塞，用脫脂紗布、牛皮紙依次包好，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在121°C、0. IMPa的條件下滅菌30分鐘。當(dāng)溫度降至50°C 60°C時，將培養(yǎng)基以無菌操作方式倒入同樣滅菌條件滅過菌的培養(yǎng)皿中20ml 25ml的培養(yǎng)基，平放在工作臺上，待其冷卻凝固后備用斜面菌種培養(yǎng)基的配方組成及配制方法配方(W/V)牛肉膏0. 3-0. 5%、蛋白胨0. 2-0. 5%、葡萄糖1.5-2. O %、氯化鈷 0. 001-0. 003%、硫酸鎂 0. 15-0. 025%、磷酸二氫鉀 0. 3-0. 5%、天門冬酰胺 0. 05-0. 07%, 瓊脂2.0-2.5%，余量為蒸餾水。pH 7. 0-7. 4，培養(yǎng)7-10天。斜面菌種培養(yǎng)基優(yōu)選的配方為(為便于表述，以下簡稱2號培養(yǎng)基)牛肉膏0. 5%蛋白胨0. 2%、葡萄糖1. 5%、氯化鈷0. 003%、硫酸鎂0. 15%、磷酸二氫鉀0.5%、天門冬酰胺0.05%、瓊脂2.5%，余量為蒸餾水。pH 7. 0-7. 4，培養(yǎng)7-10天制備方法按照上述配方稱取葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、天門冬酰胺分別用蒸餾水溶解，氯化鈷提前配制為3% (g/ml)的溶液，然后充分混勻，用蒸餾水定容至配料體積，用10 %的稀鹽酸或20 %的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 4，加入瓊脂粉，液化后分裝到 250mL茄瓶中，每瓶70mL 80mL，塞好棉塞，用脫脂紗布、牛皮紙依次包好，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在121°C、0. IMPa的條件下滅菌30分鐘。滅菌完畢待培養(yǎng)基溫度降至50°C 60°C 時，在緩沖間擺好斜面，凝固后放入接種間內(nèi)備用。種子搖瓶培養(yǎng)基的配方組成及配制方法配方(W/V)玉米淀粉2. 0-2. 5%、黃豆餅粉0. 5-1. 0%、花生餅粉0. 8-1. 2%、酵母粉 0. 5% -1. 0%、酵母膏 0. 4-0. 6%、氯化鈷 0. 001% -0. 003%，余量為水。種子搖瓶培養(yǎng)基優(yōu)選的配方為(為便于表述，以下稱為3號培養(yǎng)基)玉米淀粉2. 5%、黃豆餅粉0. 8%、花生餅粉1 %、酵母粉0. 5%、酵母膏0. 4%、氯化鈷0. 003%，余量為水。制備方法按照上述配方稱取玉米淀粉、黃豆餅粉、花生餅粉、酵母粉、酵母膏、氯化鈷溶液(提前配制為3% (g/ml)的溶液)，向玉米淀粉中加入配料體積80%的自來水，將玉米淀粉液化，然后加入其他成分，準(zhǔn)確定容至配料體積。用10%的氫氧化鈉或20%的鹽酸調(diào)PH值至7. 2，定量分裝到250ml三角瓶中，每瓶35ml，用棉塞塞口，紗布、牛皮紙依次包好，放入滅菌鍋內(nèi)在121°C、0. IMPa的條件下滅菌30min。發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基的配方組成及配制方法配方(W/V)玉米淀粉13-15%、黃豆餅粉2. 5-3.0%、酵母粉1-1.5%、硫酸銨 0. 025-0. 05%、碳酸鈣 0. 05% -1. 0%、硫酸猛 0. 00025%、鉬酸鈉 0. 002-0. 005%、氯化鈷 0. 001-0. 003%，余量為水。發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基優(yōu)選的配方為(為便于表述，以下稱為4號培養(yǎng)基)玉米淀粉13 %、黃豆餅粉2. 5 %、酵母粉1 %、硫酸銨0. 025 %、碳酸鈣0. 05 %、硫酸錳0. 00025%、鉬酸鈉0. 002%、氯化鈷0. 001%，余量為水。制備方法按照上述配方稱取玉米淀粉、黃豆餅粉、酵母粉、硫酸銨、碳酸鈣、硫酸錳lml/lOOOml (提前配制為0. 23 %的溶液)、鉬酸鈉lml/1000ml (提前配制為2 %的溶液)、 氯化鈷lml/lOOOml (提前配制為2%的溶液)向淀粉中加入配料體積80%倍的自來水、淀粉重量0. 05%淀粉酶將淀粉液化，然后加入豆粉、酵母粉、硫酸銨、硫酸錳、氯化鈷、鉬酸鈉， 準(zhǔn)確定容至配料體積，用10 %的氫氧化鈉或10 %的鹽酸調(diào)PH值至7. 5，再加入碳酸鈣，定量分裝250ml三角瓶，每瓶40ml (邊分裝邊攪動，防止碳酸鈣沉淀)，用棉墊塞口，用牛皮紙包好，放入滅菌鍋內(nèi)在121°C、0. IMPaMPa的條件下滅菌30min。種子罐的培養(yǎng)基的配方組成及配制方法配比(W/V)玉米淀粉2. 0-2. 5%、黃豆餅粉0. 5-1. 0%、花生餅粉0. 8-1. 2%、酵母粉 0. 5% -1. 0%、酵母膏 0. 4-0. 6%、氯化鈷 0. 001% -0. 003%、余量為水。種子罐的培養(yǎng)基優(yōu)選的配方為(為便于表述，以下簡稱5號培養(yǎng)基)玉米淀粉2. 5%、黃豆餅粉0. 8%、花生餅粉1 %、酵母粉0. 5%、酵母膏0. 4%、氯化鈷0. 003%、泡敵，0. 02%余量為水。制備方法按IOm3種子罐計為例1按配方核查原材料種類是否齊全，數(shù)量是否準(zhǔn)確。用輸水管向種子罐內(nèi)注入7m3 的自來水，開啟攪拌，依次將淀粉、豆餅粉、花生餅粉、酵母膏、泡敵等投入罐內(nèi)并用高壓水槍將罐內(nèi)及罐口沖洗干凈，稱量規(guī)定量的微量元素Cocl2加入罐內(nèi)，稱量一定量的氫氧化鈉加入罐內(nèi)，調(diào)節(jié)PH至7. 0-7. 5。發(fā)酵罐培養(yǎng)基(為便于表述，以下簡稱6號培養(yǎng)基)的配方組成及配制方法
配比(W/V)玉米淀粉12-15%、黃豆餅粉2. 5-3.0%、酵母粉1-1.5%、硫酸銨 0. 025-0. 035%、碳酸 丐 0. 05-1. 5%、硫酸猛 0. 0002-0. 0003%、鉬酸鈉 0. 002-0. 005%、氯化鈷 0. 002-0. 003%、泡敵 0. 02-0. 06%，余量為水。發(fā)酵罐培養(yǎng)基優(yōu)選的配方為(為便于表述，以下簡稱6號培養(yǎng)基)配比(W/V) 玉米淀粉14%、黃豆餅粉2. 5 %、酵母粉1.2%、硫酸銨0. 025 %、碳酸鈣0. 05 %、硫酸錳0. 0002%、鉬酸鈉0. 002%、氯化鈷0. 001-%、泡敵0. 05%，余量為水。制備方法向投料池內(nèi)注入4_5m3水，并開啟攪拌，按以上配方分別將玉米淀粉、黃豆餅粉、酵母粉、泡敵等原料倒入投料池內(nèi)，攪拌成漿液，用泵打至指定發(fā)酵罐內(nèi)，按配方準(zhǔn)確稱取硫酸銨、硫酸錳、鉬酸鈉、氯化鈷等微量元素，直接從發(fā)酵罐接種口加入罐內(nèi)，向發(fā)酵罐內(nèi)補加清水至定容體積，稱量一定量的氫氧化鈉加入罐內(nèi)，調(diào)節(jié)PH至7. 3-7. 8。


圖1是初始出發(fā)菌株(MF800-6)代謝產(chǎn)物液相色譜分析圖譜，圖中所表示的數(shù)據(jù)參數(shù)詳見表1。圖2是FD6-9菌株代謝產(chǎn)物液相色譜分析圖譜，圖中所表示的數(shù)據(jù)參數(shù)詳見表2。圖3是本發(fā)明菌株的菌種制備的流程示意圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步的詳述。實施例1以現(xiàn)有生產(chǎn)阿維菌素的阿維鏈霉菌(簡稱MF800-6)為初始出發(fā)菌株，按照圖3所示流程及以下方法步驟進行a、紫外線復(fù)合氯化鋰誘變處理(1)孢子懸浮液制備取15毫升已滅菌的生理鹽水，倒入一支培養(yǎng)好的新鮮試管斜面內(nèi)(培養(yǎng)基為1號培養(yǎng)基)，用無菌接種針輕輕將MF800-6孢子刮下做成孢子懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子濃度為IO6個/毫升。取IOml孢子懸浮液于Φ 90無菌培養(yǎng)皿， 并加入磁棒，置于紫外誘變箱磁力攪拌器上，于波長253. 7nm,功率30W的紫外燈20厘米處將制備好的孢子懸液進行紫外線誘變，照射時打開皿蓋、磁力攪拌，邊照射邊攪拌，照射時間30-60秒。⑵誘變處理將紫外線誘變后孢子懸液系列稀釋為IO-1UO-2UO-3UO-4UOa 10_6、10_7，取0. 1毫升各濃度的稀釋液，涂在已制備好的含氯化鋰的平板培養(yǎng)基上，用涂布器刮均勻，觀士 0. 5 °C培養(yǎng)7-9天。注氯化鋰平板的制備用1號培養(yǎng)基作平板，準(zhǔn)確稱取氯化鋰，用少量水溶解，當(dāng)滅菌后的培養(yǎng)基溫度降至60-70°C時，將氯化鋰用微孔濾膜過濾加入，至氯化鋰的濃度為 0. 15%，倒平板，冷凝后備用。b、誘變株的篩選將誘變后培養(yǎng)的單菌落編號，轉(zhuǎn)接至2號培養(yǎng)基中，并用滅過菌的牙簽對應(yīng)點種到另一培養(yǎng)皿培養(yǎng)基上二8士0. 5°C培養(yǎng)7天后，用直徑略大于單菌落直徑的打孔器打出菌塊，用甲醇浸泡M小時并震蕩1分鐘，用液相色譜法測定各菌株浸取液的效價，淘汰90%的低效價菌株。相對應(yīng)的較高效價菌株對應(yīng)的斜面用搖瓶發(fā)酵法進行復(fù)篩，用液相色譜測定發(fā)酵液的Bla效價及總效價，經(jīng)過如此初篩、復(fù)篩和最后終篩挑選出最后效價高的菌株作為下一誘變劑誘變處理的出發(fā)菌株(為表述方便，該出發(fā)菌株簡稱菌株I)。C、亞硝基胍誘變、篩選(1)孢子懸浮液制備取15毫升已滅菌的pH 6. 0磷酸緩沖液，倒入一支培養(yǎng)好的新鮮試管斜面內(nèi)，用無菌接種針輕輕將a菌株I的孢子刮下做成孢子懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子濃度為IO6個/毫升。過濾，除去大部分菌絲及培養(yǎng)基。(2)誘變處理取2. 70ml已制備好的孢子懸浮液加入0. 3ml亞硝基胍母液，使亞硝基胍終濃度為1. Omg/ml，充分混勻后，于觀士0. 5°C，220rpm振蕩處理40-60分鐘。誘變處理完畢后，立即取1毫升處理液進行大量稀釋終止亞硝基胍的誘變作用，吸取處理液進行系列稀釋10—1、10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、ΙΟ"7,將每個梯度濃度的稀釋液，分別吸取0. Iml 涂平板并用涂布器刮均勻，放置在觀士0. 5°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)7-10天。注亞硝基胍母液制備精確稱取^ig亞硝基胍，加入2-3滴丙酮(或甲酰胺)溶液，于水浴中充分溶解后，加磷酸緩沖液制成10mg/ml的亞硝基胍母液。(3)篩選按照b步方法對誘變株進行篩選，終篩挑選出最后效價高的菌株作為下一誘變劑誘變處理的出發(fā)菌株，(為表述方便，該出發(fā)菌株簡稱菌株II)。d、硫酸二乙酯誘變、篩選(1)孢子懸浮液制備取20毫升已滅菌的pH 7. O磷酸緩沖液，倒入一支培養(yǎng)好的新鮮試管斜面內(nèi)，用無菌接種針輕輕將菌株II的孢子刮下做成孢子懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子濃度為IO6個/毫升。過濾，除去大部分菌絲及培養(yǎng)基。(2)誘變處理吸取16ml pH 7. O磷酸緩沖液、^il孢子懸浮液、0. 2ml硫酸二乙酯充分混合，使硫酸二乙酯終濃度為1 %，于觀士0. 5°C，轉(zhuǎn)速220rpm條件下震蕩處理30-60 分鐘，結(jié)束后取1毫升處理液加入0. 5毫升硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。吸取1毫升處理液進行梯度稀釋lO—^lO—2、10_3、10_4、10_5、10_6、ΙΟ"7,吸取0. Iml各濃度稀釋液涂平板并用涂布器涂勻，沘士0. 5°C培養(yǎng)7-10天。(3)篩選按照b步方法對誘變株進行篩選，終篩挑選出最后效價高的菌株作為下一誘變劑誘變處理的出發(fā)菌株，(為表述方便，該出發(fā)菌株簡稱菌株III)。e、羥胺誘變、篩選(1)孢子懸液的制備取15毫升已滅菌的ph為7. O磷酸緩沖液，倒入一支培養(yǎng)好的III菌株試管斜面內(nèi)，用無菌接種針輕輕將孢子刮下做成孢子懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)， 調(diào)整孢子濃度為IO6個/毫升。過濾，除去大部分菌絲及培養(yǎng)基。(2)誘變處理將制備好的孢子懸液進行梯度稀釋IO-1UO-2UO-3UO-4UO-5UOA 10_7，取0. Iml各濃度稀釋液，涂在已制備好的含有羥胺的平板上，觀士0. 5°C培養(yǎng)7_9天。注含有羥胺平板的制備待滅菌后的單菌落培養(yǎng)基溫度降至60-70°C時加入適量羥胺，使羥胺濃度為0. 01% -0. 015% (g/ml)，搖勻，倒平板，冷凝后備用。(3)篩選按照b步方法對誘變株進行篩選，終篩挑選出最后效價高的菌株作為下一誘變劑誘變處理的出發(fā)菌株，(為表述方便，該出發(fā)菌株簡稱菌株IV)。f、5_溴尿嘧啶復(fù)合紫外線誘變、篩選
(1)孢子懸浮液制備將菌株IV的孢子刮下做成孢子懸液，用15ml生理鹽水做成菌懸液，孢子濃度為IO6個/ml，過濾，除去大部分菌絲及培養(yǎng)基。(2)誘變處理孢子懸液中加入5-溴尿嘧啶，使5-溴尿嘧啶含量為1. 0-1. 5mg/ ml，于觀士0. 5°C，轉(zhuǎn)速220rpm條件下處理5小時；將經(jīng)5-溴尿嘧啶誘變處理過的孢子懸液在波長253. 7nm，功率30W的紫外燈下20厘米處進行紫外線誘變，照射時打開皿蓋、開磁力攪拌，邊照射邊攪拌，進行紫外誘變處理，照射時間45秒。5.3.3、分別吸取處理液進行梯度稀釋 10—1、10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7，吸取 0. Iml各濃度稀釋液涂平板并用涂布器刮勻二8士0. 5°C培養(yǎng)7_9天。(3)篩選按照b步方法對誘變株進行篩選，最終獲得FD6-9菌株。所得FD6-9菌株經(jīng)效價檢測，該菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的Bla效價(搖瓶發(fā)酵)達到 9000ug/ml左右，與現(xiàn)有的普通阿維菌素生產(chǎn)菌相比較，Bla的含量提高了 50%左右，Bh的含量提高了 80-90% ；無效組分Ala、Ah分別降低90-94%和90-94%的突變株。與已在專利文獻中CN200410009639. 2公開的菌株AVHF-66相比BIa效價提高72%。實施例2搖瓶發(fā)酵法復(fù)篩高效價菌株a、搖瓶菌種的制備按照3號培養(yǎng)基的配比及配置過程配制種子搖瓶培養(yǎng)基，取培養(yǎng)好的高效價菌株斜面上Icm3左右菌塊，無菌操作接種于種子搖瓶內(nèi)，用棉塞封口，2層紗布包好后放入 200-220r/min 搖床上，28°C 士0. 5°C培養(yǎng) 40 50 小時。b、發(fā)酵搖瓶制備與接種按照4號培養(yǎng)基的配比及配置過程配制發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基，將以上制備好的種子無菌操作向每個發(fā)酵搖瓶中移入5-8%的種子液，棉墊封口后，放入200-220r/min搖床上， 280C 士0. 5°C培養(yǎng)10-11天，放瓶按照實施例5液相色譜測定Bla效價。實施例3種子罐的種子擴大培養(yǎng)孢子懸浮液的制備取1-4瓶FD6-9菌株斜面試管，加入50-100毫升無菌蒸餾水，在超凈工作臺上用無菌接種針輕輕刮下斜面孢子，塞上接種針頭，用12層紗布及牛皮紙包好，放入4°C冰箱備用。b、按照5號培養(yǎng)基的配比配制種子培養(yǎng)基，滅菌前用氫氧化鈉調(diào)pH7. 0-7. 5，蒸汽滅菌在121°C、0. IMPa的條件下滅菌30min，待溫度降至?xí)r，用壓差法將孢子接入種子罐內(nèi)，密封，培養(yǎng)。培養(yǎng)條件通氣比1 0.6-1.2、溫度觀士0.51，攪拌轉(zhuǎn)速為 150-300rpm.培養(yǎng)至40-60小時，鏡檢菌絲粗壯分枝多，染色均勻，無雜菌，可轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中。實施例4發(fā)酵罐培養(yǎng)按照6號培養(yǎng)基的配比配制發(fā)酵罐培養(yǎng)基，滅菌前用氫氧化鈉調(diào)pH7. 3-7. 8，蒸汽滅菌在121°C、0. IMPa的條件下滅菌30min，待溫度降至?xí)r，將種子罐種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件罐壓0.03-0. 07 ；通氣比1-14小時1 0.6-1. 2、14_放罐 1 0.3-0.6:；溫度27-28. 5°C，攪拌轉(zhuǎn)速為IOOrpm左右.周期觀0-330小時，在菌絲自容PH上升前放罐，過程中每8小時檢測Bla效價、總糖、還原糖、pH、菌濃、濾速、鏡檢雜菌。 發(fā)酵結(jié)束后升溫放罐，進入提取過程。
實施例5不同阿維菌素產(chǎn)生菌發(fā)酵液中阿維菌素Bla效價檢測儀器設(shè)備高效液相色譜議(具有可變性波長紫外檢測器)；漩渦混合器；IOml具塞離心管；離心機；50ul微量進樣器；色譜數(shù)據(jù)處理機(工作站)；色譜柱150m mX4. 6m m(id)不銹鋼柱 C18、5um。試劑丙酮、乙酸乙酯、無水甲醇高效液相色譜操作條件流動相色譜甲醇+水=(80-85) % +(10-15) 流量:1. Oml/min ；柱溫室溫；檢測波長:245nm ；操作步驟a、樣品制備用IOml移液管準(zhǔn)確吸取發(fā)酵液5ml，置于IOml離心管中，離心(3500-4500轉(zhuǎn)/ 分)分離10-15分鐘，倒掉上層清液，用2ml移液管向菌絲體沉降物加入2ml丙酮，于振蕩器上振蕩1-2分鐘，停機10分鐘，如此反復(fù)振蕩45分鐘(注意振蕩時應(yīng)避免管中溶液流出)，用5ml移液管加3ml乙酸乙酯后再振蕩二次，每次約一分鐘，然后靜置以使上清液澄清，離心。用微量進樣器吸取上清液50ul于一離心管中，加入2. Oml色譜甲醇，振蕩搖勻。b、標(biāo)樣的制備準(zhǔn)確稱取阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品0. 04克(精確至0. 0002克)溶于50毫升容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。用移液管轉(zhuǎn)移1毫升到10毫升容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，備用。在上述條件下，待儀器穩(wěn)定后，注入標(biāo)樣溶液，待連續(xù)兩針阿維菌素(BlA)峰面積相對變化小于1. 5%后，再把制備的樣品溶液注入儀器，進行檢測。計算方法
SXfX2. 05X 1. 11X20X 10 “ 6
Bla效價=-
0. 05式中S---B1 a峰面積；f-—校正因子；2. 05-—樣品加入2毫升甲醇的體積； 0. 05—吸取樣品的毫升數(shù)。經(jīng)液相色譜議效價檢測，實施例1所制備的FD6-9菌株發(fā)酵代謝產(chǎn)物與出發(fā)菌株MF800-6相比較具有顯著的差異。詳見圖1、圖2，表1、表2、表3、表4、表5。表1 出發(fā)菌株MF800-6代謝產(chǎn)物液相分析含量表。
1權(quán)利要求
1.阿維菌素產(chǎn)生菌(str印tomycesavermitilis)，保藏名稱為FT26-9，保藏編號 CGMCC No. 4341，保藏日期 2010 年 11 月 12 日。
2.—種阿維菌素產(chǎn)生菌的制備方法，其特征在于它包括以下步驟a、紫外線復(fù)合氯化鋰誘變處理(1)孢子懸浮液制備將普通阿維菌素產(chǎn)生菌的孢子制成孢子懸液，調(diào)整孢子濃度為 IO6個/毫升，于波長253. 7nm,進行紫外線誘變；(2)誘變處理將紫外線誘變后孢子懸液系列稀釋為10人10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、 10_7，取0. 1毫升各濃度的稀釋液，涂在含氯化鋰的平板培養(yǎng)基上，觀士0. 5°C培養(yǎng)7-9天；b、誘變株的篩選將誘變后培養(yǎng)的單菌落轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，并對應(yīng)點種到另一培養(yǎng)皿培養(yǎng)基上， 觀士0. 5°C培養(yǎng)7天后，取單菌落菌塊，用甲醇浸泡18 M小時，震蕩后，測定各菌株浸取液的效價，留取10%的高效價菌株，用搖瓶發(fā)酵法進行復(fù)篩，最終挑選出最后效價高的菌株作為下一誘變劑誘變處理的出發(fā)菌株I ；C、亞硝基胍誘變、篩選(1)孢子懸浮液制備在含有磷酸緩沖液的新鮮試管斜面內(nèi)，將上述出發(fā)菌株I的孢子制成孢子懸液，調(diào)整孢子濃度為IO6個/毫升，過濾，除去大部分菌絲及培養(yǎng)基；(2)誘變處理將上述孢子懸浮液加入亞硝基胍母液，使亞硝基胍含量為1.0mg/ml，充分混勻后，于觀士0. 5°C，220rpm振蕩處理40-60分鐘；誘變處理完畢后，終止亞硝基胍誘變，分別吸取0. Iml不同濃度的稀釋液涂平板，觀士0. 5°C培養(yǎng)7-10天；(3)篩選按照b步方法對誘變株進行篩選，終篩挑選出最后效價高的菌株作為下一誘變劑誘變處理的出發(fā)菌株II ；d、硫酸二乙酯誘變、篩選(1)孢子懸浮液制備在含有磷酸緩沖液的新鮮試管斜面內(nèi)，用上述出發(fā)菌株II的孢子制成孢子懸液，調(diào)整孢子濃度為IO6個/毫升，過濾，除去大部分菌絲及培養(yǎng)基；(2)誘變處理將上述孢子懸浮液與硫酸二乙酯充分混合，使硫酸二乙酯含量為 !!^/! ( ，于觀士?！唬?，震蕩處理，誘變處理完畢后，終止硫代硫酸鈉誘變；分別吸取 0. Iml不同濃度的稀釋液涂平板，觀士0. 5°C培養(yǎng)7-10天；(3)篩選按照b步方法對誘變株進行篩選，終篩挑選出最后效價高的菌株作為下一誘變劑誘變處理的出發(fā)菌株III ；e、羥胺誘變、篩選(1)孢子懸液的制備取15毫升已滅菌的ph為7.0磷酸緩沖液，倒入一支培養(yǎng)好的III 菌株試管斜面內(nèi)，用無菌接種針輕輕將孢子刮下做成孢子懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子濃度為IO6個/毫升。過濾，除去大部分菌絲及培養(yǎng)基；(2)誘變處理將制備好的孢子懸液進行梯度稀釋10人10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7， 取0. Iml各濃度稀釋液，涂在已制備好的含有羥胺的平板上二8士0. 5°C培養(yǎng)7_9天；(3)篩選按照b步方法對誘變株進行篩選，終篩挑選出最后效價高的菌株作為下一誘變劑誘變處理的出發(fā)菌株IV ；f、5_溴尿嘧啶復(fù)合紫外線誘變、篩選(1)孢子懸浮液制備將出發(fā)菌株IV孢子刮下制成孢子懸液，調(diào)整孢子濃度為IO6個/ml，過濾，除去大部分菌絲及培養(yǎng)基；(2)誘變處理孢子懸液中加入5-溴尿嘧啶，使5-溴尿嘧啶含量為1.0-1. 5mg/ml，于觀士0. 5°C，轉(zhuǎn)速220rpm條件下處理5_8小時；將誘變處理過的孢子懸液紫外線照射35-60 秒；(3)分別吸取處理液進行梯度稀釋，吸取0.Iml各濃度稀釋液涂平板，在觀士0. 5°C培養(yǎng)7-9天；(4)篩選按照b步方法對誘變株進行篩選，最終獲得FD6-9菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種阿維菌素產(chǎn)生菌及其制備方法，該菌株保藏名稱為FT26-9，保藏編號CGMCC No.4341，保藏日期2010年11月12日。其制備方法為對出發(fā)菌株進行紫外線復(fù)合氯化鋰誘變處理；誘變株的篩選；亞硝基胍誘變、篩選；硫酸二乙酯誘變、篩選；羥胺誘變、篩選；5-溴尿嘧啶復(fù)合紫外線誘變、篩選；最終獲得FT26-9菌株，該菌株可大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)物中阿維菌素B組分，減少阿維菌素A組分；其應(yīng)用于阿維菌素工業(yè)生產(chǎn)中可提高發(fā)酵單位40％左右，降低生產(chǎn)成本35％左右。
文檔編號C12N13/00GK102154168SQ201110003059
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月7日
發(fā)明者王琳慧, 范令濤, 高建輝 申請人:石家莊市興柏生物工程有限公司