專利名稱：一種長穗偃麥草e組染色體特異issr-scar標記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種長穗偃麥草E組染色體特異ISSR-SCAR標記，尤其涉及一種檢測小麥E組染色體的試劑盒及其應用。
背景技術(shù)：
偃麥草屬是小麥的一個近緣種屬，它具有普通小麥缺少的許多優(yōu)良性狀，如分蘗能力強，根系發(fā)達，抗寒、抗旱、耐瘠薄、耐鹽堿力強，多花、大穗、多實，籽粒蛋白含量高以及優(yōu)良的烘烤品質(zhì)，抗多種病害能力強，對小麥條銹病、葉銹病、桿銹病、白粉病、黃矮病、條紋花葉病及腥黑穗病高抗至免疫，是小麥遺傳育種的重要親本之一。長穗偃麥草(Agropyron elongatum)是小麥的一個重要近緣種，具有蛋白質(zhì)含量高、抗多種真菌和病毒病害、耐旱、 耐寒、大穗多花等優(yōu)異性狀，是在小麥品種改良中應用最廣泛的野生種之一。在自然界，長穗偃麥草有二倍體、四倍體和十倍體3種倍性類型。其中二倍體長穗偃麥草(Thinopyrum elongatum) E組染色體是組成偃麥草屬(Elytrigia)多倍體物種的基本染色體組，攜帶有對小麥遺傳育種有益的基因，但對于四倍體和十倍體類型的染色體組構(gòu)成，一直沒有一致的結(jié)論。通過遠緣雜交及染色體工程的方法從普通小麥野生近緣種屬轉(zhuǎn)移優(yōu)良基因的方法已被實踐證明是一條卓有成效的途徑。目前，國外從長穗偃麥草中成功轉(zhuǎn)移了 Sr24 (3DL)，Sr26 (6AL)，Sr25 (7DL, 7AL)，Lrl9, Lr24 等基因。國內(nèi)從小麥與長穗偃麥草雜種后代中育成了小偃4號、5號、6號、小偃107等小麥品種。通過雜交和漸滲的方式是將外源染色體的優(yōu)良性狀和優(yōu)異基因?qū)胄←湹囊环N有效的方法，但是，在重組的小麥中，源于小麥-長穗偃麥草雜交后代的外源E組染色質(zhì)或染色體的檢測成為至關(guān)重要的問題，雖然通過農(nóng)學上的重要特性以及生化分析已將有價值的基因繪圖在長穗偃麥草染色體上，但這些實驗的檢測手段是不穩(wěn)定的，而且不適合進行重要的農(nóng)學性狀的檢測。有一些遺傳學手段，如染色體分帶、原位雜交等技術(shù)，已經(jīng)將其用于小麥遺傳背景下外源遺傳物質(zhì)的檢測，但這些技術(shù)費時、費力，對技術(shù)的要求也很高，而且用這些實驗手段進行大規(guī)模的后代快速篩選依然存在一定的局限。所以，迫切要求開發(fā)一種可以在小麥遺傳背景下快速、準確、大規(guī)模的鑒定長穗偃麥草外源染色質(zhì)或染色體的分子標記技術(shù)。隨著分子生物學的發(fā)展，DNA分子標記已經(jīng)廣泛應用于小麥遺傳育種的研究，限制片段長度多態(tài)性(RFLP)是首次被使用的分子標記，在植物遺傳研究中獲得很大的應用價值，但是，RFLP技術(shù)需要大量純化的DNA，而且實驗本身費時，對技術(shù)要求也很高，它不適合進行育種系統(tǒng)的大規(guī)模的篩選，因此，育種學家已經(jīng)開始進行普通PCR的研究，期望在小麥育種系統(tǒng)中找到一種更簡單的方式鑒定外源染色質(zhì)，許多基于PCR的DNA分子標記技術(shù)已經(jīng)被開發(fā),如 RAPD，AFLP，EST, SSR 等。在這些標記中，ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)技術(shù)相對簡單，它是利用重復序列加選擇性堿基為引物，對基因組DNA進行擴增的分子標記體系。目前，ISSR已經(jīng)廣泛應用于分子指紋圖譜、遺傳多樣性分析、外源遺傳物質(zhì)鑒定及系統(tǒng)演化等研究。但它的重復性和穩(wěn)定性卻很差，如果將其轉(zhuǎn)化為SCAR標記，其特
3異性和穩(wěn)定性將大幅度提高，可以更方便快捷地應用于異源染色體或染色質(zhì)的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測植物E組染色體的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括如下引物對所述引物對中的一條引物為序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物對中的另一條引物為序列表中的序列4所示的核苷酸。所述植物為含有長穗偃麥草E組染色質(zhì)或染色體的小麥屬植物，所述含有長穗偃麥草E組染色質(zhì)或染色體的小麥屬植物具體為“中國春”-長穗偃麥草3E 二體附加系和“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系雜交獲得的F1代和/或所述F1代自交得到的F2代。本發(fā)明另一個目的是提供一種檢測植物E組染色體的PCR試劑。本發(fā)明提供的PCR試劑，由如下引物對、dNTP、氯化鎂、DNA聚合酶和PCR緩沖液組成所述引物對中的一條引物為序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物對中的另一條引物為序列表中的序列4所示的核苷酸。所述引物對中各引物在所述PCR試劑中的濃度均為0. 5 μ M ；所述dNTP在所述的PCR試劑中的濃度為0. 18mM,所述DNA聚合酶在所述的PCR試劑中的濃度為0. 06υ/μ 1 ；所述氯化鎂在所述的PCR試劑中的濃度為0. ISmM ；所述植物為含有長穗偃麥草E組染色質(zhì)或染色體的小麥屬植物。所述含有長穗偃麥草E組染色質(zhì)或染色體的小麥屬植物為“中國春”-長穗偃麥草 3Ε 二體附加系和“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系雜交獲得的F1代和/或所述F1 代自交得到的F2代。所述的PCR試劑或所述的試劑盒在檢測長穗偃麥草E組染色體中的應用，也是本發(fā)明保護的范圍。PCR緩沖液購自寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品目錄號R10T1。本發(fā)明的第三個目的是提供一種輔助檢測待測植物中是否含有E組染色體的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟用所述試劑盒中的引物對或中所述的PCR試劑對待測植物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；檢測所述PCR擴增產(chǎn)物，若所述PCR擴增產(chǎn)物中含有大小為577bp的片段，則所述待測植物中候選含有E組染色體，若所述PCR擴增產(chǎn)物中不含有大小為577bp的片段，則所述待測植物中候選不含有E組染色體。所述PCR擴增中，以待測植物的基因組DNA為模板；所述PCR擴增的退火溫度為58°C。所述PCR擴增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表序列2自5’末端第77_653位核苷酸。所述檢測PCR擴增產(chǎn)物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明開發(fā)的SCAR分子標記能夠快速、準確地鑒定小麥遺傳背景下的外源長穗偃麥草E組染色質(zhì)或染色體奠定基礎(chǔ)。小麥外源E組染色質(zhì)的檢測是鑒定小麥-長穗偃麥草重組系、漸滲系的關(guān)鍵，大量雜交后代的篩選和鑒定工作非常繁雜，本發(fā)明獲得的E基因組特異ISSR-SCAR分子標記，即SCAR577，將為小麥-長穗偃麥草重組系E組染色質(zhì)的快速檢測和準確鑒定以及分子標記輔助育種提供新的途徑和方法。


圖1為ISSR引物UBC841在普通小麥“中國春”、“中國春”_2C 二體附加系、二倍體長穗偃麥草、四倍體長穗偃麥草中的擴增結(jié)果圖2為ISSR-SCAR577引物在CS-1E-7E 二體附加系，CS-2C 二體附加系，二倍體長穗偃麥草，四倍體長穗偃麥草中的擴增結(jié)果圖3為SCAIi577弓丨物在F1, F2代中的擴增結(jié)果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。供試材料為“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系(Endo TR. Allocation of aGc chromosome of Aegilops cylindrica to wheat homoeologous group 2. Genes GenetSyst, 1996，71 :243-246,公眾可從哈爾濱師范大學獲得。)、二倍體長穗偃麥草(KnottD R. The inheritance of rust resistance.VI. The transfer of stem rustresistance from Agropyron elongatum to common wheat. Canadian Journal of PlantScience, 1961,41 :108-123，公眾可從哈爾濱師范大學獲得。)、“中國春”-長穗偃麥草二體附力口系(1E-7E) (Dvorak J, Knott DR. Disemic and diteleosomicadditions of diploid Agropyron elongatum chromosomes to Triticum aestivum[J]. Can J Genet Cytol，1974，16 :399-417,公眾可從哈爾濱師范大學獲得。)；四倍體長穗偃麥草(Heneen W K, Runemark H. Cytology of Elym us (Agropyron)elongatacomplex. Hereditas,1972, 70(2) :155-164,公眾可從哈爾濱師范大學獲得。)；普通小麥“中國春”(Miller IE, Hutchinson J, Chapman V Investigation of apreferentially transmitted Aegilops sharonesis chromosome in wheat. Theor ApplGenet, 1982,61 :27-33. ^AnTZAfjB/Ki^W 范大學獲得。)、“中國春”-長穗偃麥草3E 二體附加系(Dvorak J,Knott DR. Disomic and diteleosomic additions ofdiploid Agropyron elongatum chromosomes to Triticum aestivum[J]. Can J GenetCytol，1974，16 :399_417，公眾可從哈爾濱師范大學獲得。)與 “中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系雜交獲得的F1I2代來自于哈爾濱師范大學分子細胞遺傳與遺傳育種重點實驗室。實施例1、長穗偃麥草E組染色體特異ISSR-SCAR標記UBC841的獲得1、長穗偃麥草E組染色體特異ISSR-SCAR標記UBC841的篩選與克隆利用33條ISSR引物，對普通小麥“中國春”、“中國春” _殺配子染色體2C 二體附加系、二倍體長穗偃麥草、四倍體長穗偃麥草等材料進行擴增篩選，分離和克隆E基因組特異擴增片段。PCR擴增體系Template DNA50ngIOx buffer2. 5 μ 11. 5mM MgCl22. 5 μ 1
5
dNTP Mix (2. 5mM)1· 5 μ 1ISSR Primer (10 μ Μ)1 μ 1r Taq polymerase(5U/μ 1) 0.25 μ 1_Distilled sterile water up to 20 μ 1PCR反應程序94°C預變性4分鐘，42個循環(huán)包括94°C變性1分鐘，52°C退火1分鐘，72 °C延伸2分鐘，42個循環(huán)后72°C延伸7分鐘。4°C保存。ISSR擴增產(chǎn)物均在含有l(wèi)mg/ml EB的1. 2%瓊脂糖上電泳檢測，在紫外成像系統(tǒng) (Gel Doc-2000, Bio-Rad, USA)下觀察并照相記錄結(jié)果。PCR擴增結(jié)果如圖1所示，其中1.為普通小麥“中國春”CS ;2.為“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系(CS-2C) ；3.為二倍體長穗偃麥草；4.為四倍體長穗偃麥草;M.為 DL2000marker，從圖中看出，引物 UBC8415’-GAGAGAGAGAGAGAGAGC-3’(序列 1)在二倍體長穗偃麥草、四倍體長穗偃麥草中能擴增出一條700bp左右的片段，此產(chǎn)物在普通小麥“中國春”中沒有出現(xiàn)，在中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系(CS-2C)中沒有出現(xiàn)目的片段； 表明這個片段是長穗偃麥草E基因組所特有的?；厥諒亩扼w長穗偃麥草中得到的特異片段，送去測序。經(jīng)測序結(jié)果可知，該PCR 產(chǎn)物具有序列表中序列2的核苷酸序列，序列表的序列2由701個核苷酸組成，將PCR產(chǎn)物命名為 UBC8417tll。在GeneBank中將其進行Blast同源性搜索，結(jié)果顯示它與小麥染色體3B-特異 BAC序列(genbank號FN564430. 1)具有一定程度的同源性，同源性達83%。也可人工合成序列2。2、長穗偃麥草E組染色體特異ISSR-SCAR標記的建立與定位根據(jù)序列表中序列2的序列，利用Primer Premier 5. 0軟件，設(shè)計了 1對SCAR引物。SCAR577 上游引物5，-CGGAGAGGCACCAATAAGGAT-3，(序列 3)SCAR577 下游引物5，-CCGACCCCAGATACGCTC-3，(序列 4)PCR擴增體系Template DNA30ngIOx PCR buffer2. 5 μ 11. 5mM MgCl2 (終濃度為 0. 18mM)2. 5 μ 1dNTP Mix (2. 5mM,終濃度為 0. 18mM)1· 5 μ 1SCAR577 上游引物(10 μ Μ,終濃度為 0. 5 μ Μ)1 μ 1SCAR577 下游引物(10 μ Μ,終濃度為 0· 5 μ Μ)1 μ 1
r Taq polymerase (5U/ μ 1，終濃度為 0. 06U/ μ 1)0. 25 μ 1_Distilled sterile waterup to 20 μ 1IOx PCR buffer購自寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品目錄號RlOTl。PCR反應程序94°C預變性5分鐘，35個循環(huán)包括94°C變性30秒，58°C退火30秒， 72°C延伸1分鐘，35循環(huán)后72°C延伸10分鐘。4°C保存。
分別以二倍體長穗偃麥草、四倍體長穗偃麥草、普通小麥“中國春”和“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。結(jié)果如圖2所示，其中，1-7分別為“中國春”-長穗偃麥草二體附加系(1E-7E) 1.為CS-IE 二體附加系；2.為CS-2E 二體附加系；3.為CS-3E 二體附加系；4.為CS-4E 二體附加系；5.為CS-5E 二體附加系；6.為CS-6E 二體附加系；7.為CS-7E 二體附加系；8.為普通小麥“中國春”(⑶)；9.為二倍體長穗偃麥草；10.為四倍體長穗偃麥草；11.為“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系(CS-2C) ；M.為DL2000marker。從圖中看出，在“中國春”-長穗偃麥草二體附加系(1E-7E)、二倍體長穗偃麥草、四倍體長穗偃麥草中都能擴增出 577bp的片段，而在“中國春”、“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系中沒有此片段。測序577bp的片段，結(jié)果為該片段具有序列表序列2自5’末端第77-653位核苷酸，表明該片段為長穗偃麥草E基因組所特有。同時還利用一套“中國春”-長穗偃麥草二體附加系(1E-7E)將該對SCAR引物進行初步定位分析，結(jié)果顯示，SCAR577標記分布于長穗偃麥草E基因組所有染色體上。實施例2、長穗偃麥草E組染色體特異ISSR-SCAR標記的應用用SCAIi577上游引物和SCAIi577下游引物對“中國春”-長穗偃麥草3E 二體附加系與 “中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系雜交后代F1和自交F2代進行了鑒定。以普通小麥 “中國春”、“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系、二倍體長穗偃麥草、四倍體長穗偃麥草為對照。結(jié)果如圖3所示，其中1-9.為“中國春”-長穗偃麥草二體附加系和“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系雜交獲得的F1代；10-19.為&代自交獲得的&代；20.為普通小麥“中國春”;21.為“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系；22.為二倍體長穗偃麥草； 23.為四倍體長穗偃麥草；M.為DL2000marker ；從圖中看出，SCAR577標記在F1代均表現(xiàn)為陽性結(jié)果(得到577bp的片段)，為了在后代中進行易位系的初步篩選和鑒定，選取了 152株 2n = 42的F2代進行上述PCR鑒定，結(jié)果為陰性、陽性結(jié)果同時存在，有8株后代在SCAR577 標記中出現(xiàn)了陽性結(jié)果(得到577bp的片段)，所以可以初步判斷這些植株為易位系，易位的幾率約為5. %。(殺配子染色體2C是一種可以誘導染色體產(chǎn)生畸變的特殊染色體，它可以使不含有它的配子產(chǎn)生致死或半致死的效應，半致死的效應就包括如染色體的易位、 缺失等染色體畸變，達到要創(chuàng)制易位系或缺失系的目的，這是一種誘導染色體產(chǎn)生畸變的一種方式，但2C產(chǎn)生的這些畸變行為完全是隨機的。目前有實驗證明證明了此種誘導染色體產(chǎn)生畸變的頻率一般在5% 10%左右，因此本發(fā)明的易位的幾率在理論值范圍內(nèi)。)利用SCAR577分子標記能夠快速、準確地鑒定小麥遺傳背景下的外源長穗偃麥草E 組染色質(zhì)或染色體，這樣可以大大提高育種速度，縮短育種周期，實現(xiàn)了利用分子標記輔助選擇育種的目的。
權(quán)利要求
1.一種檢測植物E組染色體的試劑盒，包括如下引物對所述引物對中的一條引物為序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物對中的另一條引物為序列表中的序列4所示的核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述植物為含有長穗偃麥草E組染色質(zhì)或染色體的小麥屬植物，所述含有長穗偃麥草 E組染色質(zhì)或染色體的小麥屬植物具體為“中國春”-長穗偃麥草3E 二體附加系和“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系雜交獲得的F1代和/或所述F1代自交得到的F2代。
3.一種檢測植物E組染色體的PCR試劑，由如下引物對、dNTP、氯化鎂、DNA聚合酶和 PCR緩沖液組成所述引物對中的一條引物為序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物對中的另一條引物為序列表中的序列4所示的核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的PCR試劑，其特征在于所述引物對中各引物在所述PCR試劑中的濃度均為0. 5μΜ ；所述dNTP在所述的PCR試劑中的濃度為0. 18mM,所述DNA聚合酶在所述的PCR試劑中的濃度為0. 06U/y 1 ；所述氯化鎂在所述的PCR試劑中的濃度為0. ISmM ；所述植物為含有長穗偃麥草E組染色質(zhì)或染色體的小麥屬植物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的PCR試劑，其特征在于所述含有長穗偃麥草E組染色質(zhì)或染色體的小麥屬植物為“中國春”-長穗偃麥草3Ε 二體附加系和“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系雜交獲得的F1代和/或所述F1代自交得到的F2代。
6.權(quán)利要求1或2所述試劑盒或權(quán)利要求3-5中任一所述的PCR試劑在檢測長穗偃麥草E組染色體中的應用。
7.一種輔助檢測待測植物中是否含有E組染色體的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求1 或2所述試劑盒中的引物對或權(quán)利要求3或4中所述的PCR試劑對待測植物進行PCR擴增， 得到PCR擴增產(chǎn)物；檢測所述PCR擴增產(chǎn)物，若所述PCR擴增產(chǎn)物中含有大小為577bp的片段，則所述待測植物中候選含有E組染色體，若所述PCR擴增產(chǎn)物中不含有大小為577bp的片段，則所述待測植物中候選不含有E組染色體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述PCR擴增中，以待測植物的基因組DNA為模板；所述PCR擴增的退火溫度為58°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述PCR擴增產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表序列2自5’末端第77-653位核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述檢測PCR擴增產(chǎn)物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種長穗偃麥草E組染色體特異ISSR-SCAR標記。本發(fā)明提供了一種檢測長穗偃麥草E組染色體的試劑盒，包括如下引物對所述引物對中的一條引物為序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物對中的另一條引物為序列表中的序列4所示的核苷酸。二倍體長穗偃麥草E組染色體是組成偃麥草屬多倍體物種的基本染色體組，攜帶有對小麥遺傳育種有益的基因，小麥中外源E染色質(zhì)的檢測是鑒定小麥-長穗偃麥草重組系、漸滲系的關(guān)鍵，大量雜交后代的篩選和鑒定工作非常繁雜，本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明開發(fā)的ISSR-SCAR分子標記能夠為快速、準確地鑒定小麥遺傳背景下的外源長穗偃麥草E組染色質(zhì)或染色體奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/68GK102154459SQ20111000267
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月7日
發(fā)明者司亮, 徐國輝, 束永俊, 王曉萍, 郭長虹 申請人:哈爾濱師范大學