專利名稱：一種含有ω干擾素的融合蛋白及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種融合蛋白，特別是ー種含有ω干擾素與人免疫球蛋白恒定區(qū)的融合蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
干擾素是ー類天然存在的小分子蛋白質(zhì)和糖蛋白，它們通過大多數(shù)有核細胞對病毒感染以及其他抗原刺激的反應(yīng)而產(chǎn)生和分泌。干擾素使細胞能抵抗病毒感染并對細胞表現(xiàn)出廣泛的作用。它們通過與細胞表面的特異性膜受體結(jié)合而發(fā)揮其活性。干擾素(IFN)分為I型和II型，人I型干擾素主要包括IFN-α和IFN-β，兩者共用一種受體IFN- α/β受體，II型干擾素為IFN- γ。I型干擾素(包括IFN- α，IFN- β 和IFN-ω)的生物活性基本相同，主要包括抗病毒、抗細胞増殖和免疫調(diào)節(jié)作用，臨床上可用于治療病毒性肝炎(包括乙型肝炎、丙型肝炎等)、腫瘤、多發(fā)性硬化癥等；II型干擾素 (IFN-Y)抗細胞増殖和免疫調(diào)節(jié)作用較強，抗病毒能力較弱。臨床上可用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性肉芽腫等疾病。IFN-ω是1985年發(fā)現(xiàn)的I型干擾素，因為具有與IFN- α不同的抗原性和免疫原性，有可能發(fā)展成ー種新的抗病毒藥物，CHO表達的重組人IFN-ω顯示較明顯的抗病毒活性。但是IFN分子量較小，易被腎小球濾過，因而臨床應(yīng)用時，血漿半衰期較短，一般需要大劑量頻繁用藥，如每周2 3次，而IFN治療肝炎、腫瘤、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病吋，治療周期常常長達數(shù)月甚至數(shù)年，這種長期大劑量頻繁用藥不僅増加了病人的痛苦和治療費用，而且易產(chǎn)生毒副反應(yīng)。為了解決普通干擾素在臨床治療上的不足，多家生物制藥公司致力于開發(fā)長效干擾素。其手段是通過對普通干擾素進行聚乙ニ醇修飾。聚乙ニ醇(Poly ethleneglycol, PEG)是ー種無毒、無免疫原性的水溶性高分子物質(zhì)，可以通過共價鍵結(jié)合方式修飾蛋白質(zhì)。 聚乙ニ醇修飾蛋白質(zhì)藥物不僅可以降低免疫原性和毒性、而且能明顯延長血漿半衰期，提高蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性。臨床上，廣泛應(yīng)用的聚乙ニ醇化干擾素包括先靈葆雅公司開發(fā)的聚乙ニ醇化干擾素a_2b(商品名，佩樂能，PegIntron)；羅氏公司開發(fā)的聚乙ニ醇化干擾素α _2a (商品名，派羅欣，Pegasys)，通過與利巴韋林聯(lián)合廣泛用于慢性乙型和丙型肝炎的治療。延長干擾素在動物體內(nèi)半衰期的另ー個方法是使干擾素形成融合蛋白，例如與人血清白蛋白形成融合蛋白，分子量的増加，可以減少腎小球的濾過率，達到延長半衰期的目的。基于良好的抗病毒活性，IFN-ω具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，因此本領(lǐng)域存在著對制備エ藝簡單、高活性并具有較長半衰期的IFN-ω的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的提供ー種有利于エ業(yè)化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用，活性高且能明顯減少用藥次數(shù)的重組人ω干擾素。
基于上述目的，本發(fā)明首先提供了ー種融合蛋白，所述融合蛋白含有ω干擾素與人免疫球蛋白恒定區(qū)部分。在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述人免疫球蛋白為人IgGl。在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述人免疫球蛋白恒定區(qū)部分為Fc片段。在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述ω干擾素與人免疫球蛋白恒定區(qū)之間沒有連接月TU在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述融合蛋白含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了上述融合蛋白的同源ニ聚體，在該ニ聚體中，兩個單體通過ニ硫鍵相連接。本發(fā)明還提供了含有上述融合蛋白的藥物制劑。本發(fā)明進ー步提供了含有上述融合蛋白的核苷酸序列。在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述核苷酸序列選自下列序列(I)SEQ ID NO 1 ；(2)與核苷酸序列SEQ ID NO 1至少95%同源性的核苷酸序列；(3)在嚴謹條件下與核苷酸序列SEQ ID NO=I雜交的核苷酸序列；(4)或者與(1)-(3)任何一種核苷酸序列互補的核苷酸序列。上文所述的“互補”，是指核苷酸中兩條單鏈的堿基間通過氫鍵形成的配對關(guān)系， 即，腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)配對，鳥嘌呤-胞嘧啶(G-C)配對。上文所述的嚴謹條件是指雜交反應(yīng)體系中避開非同源性或部分同源性的核酸順序形成雜交體所需要條件的嚴格程度。一般是反應(yīng)溫度高、離子強度低會増加反應(yīng)的嚴謹性(有利于單鏈形成時嚴謹性高)，它適合于堿基配對好、堿基順序完全同源的核酸雜交反應(yīng)，若反應(yīng)溫度低、離子強度高則雜交反應(yīng)嚴謹性低，它適用于堿基配對差、堿基順序不完全同源的核酸反應(yīng)。本發(fā)明所述嚴謹條件為，在0. 5M磷酸鈉，7% SDS，65°C的條件下進行雜交，再用0. 2XSSC,1% SDS，在65°C洗一次或多次。本發(fā)明還提供了含有上述核苷酸序列的載體。在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述載體為pMH3S。本發(fā)明進一歩提供了含有上述載體的細胞?？紤]到人IFN-ω多肽鏈中存在糖基化位點，在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述細胞為哺乳動物細胞，使IFN-ω的糖基化與人體內(nèi)蛋白翻譯后的糖基化過程最接近。在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述細胞為CHO細胞。本發(fā)明另ー個目的提供ー種上述融合蛋白藥物的制備エ藝。基于上述目的，本發(fā)明提供了ー種含有ω干擾素與人免疫球蛋白恒定區(qū)的融合蛋白的制備方法，所述方法包括(1)克隆ω干擾素和人免疫球蛋白恒定區(qū)的編碼基因并融合在一起；(2)構(gòu)建含有上述融合基因的載體；(3)將上述載體轉(zhuǎn)化入宿主細胞中并表達所述融合蛋白；(4)分離和純化所述融合蛋白。在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述載體為pMH3S。在步驟(3)中，表達融合蛋白的宿主可以是酵母、哺乳動物細胞、細菌、動物、植物等。融合蛋白或多肽可以存在于宿主細胞內(nèi)，也可以是從宿主中分泌出來，優(yōu)選從宿主中分泌出來。分泌所用的信號肽，優(yōu)選人組織纖溶酶原的信號肽，天然的鼠源抗體的信號肽，或抗體的通用信號肽，或這三種信號肽的類似物。更優(yōu)選的用人組織纖溶酶原的信號肽，用該信號肽時融合蛋白表達水平較高。可以通過培養(yǎng)含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的宿主，如重組酵母、重組哺乳動物細胞、重組細菌、轉(zhuǎn)基因動植物等，生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白。具體的培養(yǎng)方法，可以用搖瓶或生物反應(yīng)器等，生產(chǎn)時優(yōu)選為生物反應(yīng)器。培養(yǎng)基應(yīng)能提供菌體(或細胞)生長和產(chǎn)物表達所需的物質(zhì)，應(yīng)包含氮源、碳源、PH緩沖成分等，培養(yǎng)基配方一般應(yīng)根據(jù)不同培養(yǎng)對象，通過試驗獲得。培養(yǎng)可分兩個階段，第一階段主要用于菌體(或細胞)的生長，第二階段主要用于合成產(chǎn)物。在步驟(4)中，可以用各種蛋白分離的方法自含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細胞培養(yǎng)物中分離、純化融合蛋白。如鹽析、沉淀、超濾、液相層析等技術(shù)及這些技術(shù)的組合。其中液相層析可以用凝膠排阻、親和、離子交換、疏水、反相等層析技木。在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟中的純化方法為層析方法，所述層析方法可以有離子交換、親和層折、疏水層折和分子篩層折。在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述層析方法為以ftOtein A為介質(zhì)的親和層析方法。本發(fā)明所取得的技術(shù)效果主要表現(xiàn)在3個方面1.半衰期長本發(fā)明所提供的重組人干擾素與人免疫球蛋白恒定區(qū)的融合蛋白在體內(nèi)具有更長時間的血液水平，^1正か《ザ(3在新西蘭兔體內(nèi)的半衰期是53.3小時，具有明顯的長效性，而rhIFN-ω的半衰期是1. M小吋。臨床上佩樂能(Peghtron 12K-聚乙ニ醇干擾素 alfa-2b)在人體內(nèi)的半衰期為40小吋，派羅欣(Pegasys，40K聚乙ニ醇干擾素alfa-2a)在人體內(nèi)的半衰期為160小時，長的半衰期可以減少注射次數(shù)而使患者容易接受。2.比活性高本發(fā)明的重組人干擾素與人免疫球蛋白恒定區(qū)的融合蛋白是采用基因工程的方法，使用哺乳動物細胞表達，使干擾素的糖基化與人體內(nèi)蛋白翻譯后的糖基化過程最接近， 糖基化的重組IFN-ω具有比其它細胞例如酵母細胞表達出的干擾素具有更高的抗病毒活性。經(jīng)高密度培養(yǎng)、純化后獲得的融合蛋白具有較高的生物活性，比活性為3. 7X107IU/mg, 臨床上佩樂能的比活性7X 107IU/mg，派羅欣的比活性是1. 4X 107IU/mg。3.制備エ藝簡單本發(fā)明所述的重組人干擾素與人免疫球蛋白恒定區(qū)的融合蛋白不需要復(fù)雜的化學(xué)修飾和再分離，與已經(jīng)上市的聚乙ニ醇修飾的長效產(chǎn)品相比，制備エ藝簡單，通過親和層折一步純化可以獲得純度95 %的樣品，質(zhì)量控制相對容易。


圖1為人IFN-ω基因的克隆；圖2為人IgGlFc基因的克?。粓D3為IFN-GJ-Fc基因的克?。粓D4為pMD-IFN- ω -Fc的酶切鑒定；
圖5為表達質(zhì)粒pMH3S的構(gòu)建流程圖；圖6為表達質(zhì)粒pMH3S-IFN- ω -Fc的酶切鑒定；圖7為表達質(zhì)粒pMH3S-IFN- ω -Fc的構(gòu)建流程圖；圖8為純化的融合蛋白IFN- ω -Fc的SDS-PAGE (非還原條件)分析；圖9為純化的融合蛋白IFN- ω -Fc的SDS-PAGE (還原條件)分析；圖10為純化的融合蛋白IFN-co-Fc的去糖基化分析；圖11為IFN- ω -Fc融合蛋白的抗病毒活性測定；圖12為人IFN-GJ-Fc和人IFN-ω在家兔體內(nèi)的藥物濃度時間曲線。
具體實施例方式實施例1 IFN-ω和人IgGlFc基因的克隆(1) IFN-ω基因的克隆采用高保真的聚合酶(Pyrobest Taq酶，TaKaRa公司，產(chǎn)品目錄號:DR0005A)。使用引物為IFN- ω -up 5~AATGAATTCTCTGGGCTGTGATCTGCCTC~3,以及， IFN- ω -lower 5-AGATGAGCCCAGGTCT CTATC-3 ； (GAATTC 為 Eco RI 的酶切位點， 引物由北京英駿生物技術(shù)公司合成，用純水稀釋成50 μ M的終濃度，引物設(shè)計所依據(jù)的 IFN-ω 基因序列 Genbank 登錄號ΝΜ_002177)。模板的制備無菌抽取正常人血5ml，用Ficoll-Paque Premium細胞分離液(GE公司，產(chǎn)品目錄號17づ442-02/3)分離正常人外周血白細胞，使用Trizol試劑Gnvitrogen 公司，產(chǎn)品目錄號:15596-026)提取總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄(mRNA Selective PCR Kit Verl. 1， TaKaRa公司，產(chǎn)品目錄號DRR025A)，獲得cDNA，作為PCR反應(yīng)的模板。PCR 反應(yīng)體系50μ 1 反應(yīng)體系中含有10 X buffer 5ul ； dNTP (0. 2mM) 4ul ； Pyrobest Taq 酶 0. 25ulIFN_ ω-Up/IFN_ ω-Iower 各 0. 5ul ；2ul cDNA 作模板，用純水補足到 50 μ 1。PCR 反應(yīng)參數(shù)-MV 5min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin20s ；25 循環(huán)。72°C 5min。 PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠并用BBI公司的回收試劑盒回收DNA片段，PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖1。圖1中，M泳道為分子量標記，1泳道為IFN-ω片段。(2)Fc的克隆及回收純化采用高保真的聚合酶(Pyrobest Taq酶，TaKaRa公司， 產(chǎn)品目錄號DR0005A)。使用引物為ι F N - ω - F C 5 -
權(quán)利要求
1.ー種融合蛋白，其特征在干，所述融合蛋白含有ω干擾素與人免疫球蛋白恒定區(qū)部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在干，所述人免疫球蛋白為IgGl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在干，所述人免疫球蛋白恒定區(qū)部分為Fc 片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其特征在干，所述ω干擾素與人免疫球蛋白恒定區(qū)之間沒有連接肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在干，所述融合蛋白含有SEQID Ν0:2所示的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的融合蛋白的同源ニ聚體。
7.ー種含有權(quán)利要求1-5任一所述的融合蛋白的藥物制劑。
8.ー種編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核苷酸序列，其特征在干，所述核苷酸序列選自下列序列(1)SEQID NO 1 ；(2)與核苷酸序列SEQID NO 1至少95%同源性的核苷酸序列；(3)在嚴謹條件下與核苷酸序列SEQID NO 1雜交的核苷酸序列；(4)或者與(1)-03)任何一種核苷酸序列互補的核苷酸序列。
10.ー種含有權(quán)利要求8或9所述核苷酸序列的載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的載體，其特征在干，所述載體為PMH3S。
12.—種含有權(quán)利要求11所述載體的細胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的細胞，其特征在干，所述細胞為哺乳動物細胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的哺乳動物細胞，其特征在干，所述細胞為CHO細胞。
15.ー種含有ω干擾素與人免疫球蛋白恒定區(qū)的融合蛋白的制備方法，所述方法包括(1)克隆ω干擾素和人免疫球蛋白恒定區(qū)的編碼基因并融合在一起；(2)構(gòu)建含有上述融合基因的載體；(3)將上述載體轉(zhuǎn)化入宿主細胞中并表達所述融合蛋白；(4)回收和純化所述融合蛋白。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在干，所述載體為PMH3S。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在干，步驟中的純化方法為層析方法。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在干，所述層析方法為以ftOteinA為介質(zhì)的親和層析方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種融合蛋白，特別是含有重組人ω干擾素與人免疫球蛋白恒定區(qū)的融合蛋白及其制備方法，所述融合蛋白在人體中具有較長的半衰期，能夠明顯減少用藥次數(shù)。
文檔編號C12N5/10GK102585013SQ20111000213
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月7日
發(fā)明者于長明, 付玲, 侯利華, 張金龍, 李冰, 李建民, 陳薇 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所