專利名稱：一種簡便快速鑒別甘藍(lán)型油菜小孢子再生的單倍體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物細(xì)胞學(xué)應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種早期、簡便、快速大批量鑒別甘藍(lán)型油菜小孢子再生的單倍體植株的方法。
背景技術(shù)：
自從上世紀(jì)八十年代末甘藍(lán)型油菜小孢子離體培養(yǎng)和植株再生技術(shù)成功建立以來，甘藍(lán)型油菜小孢子再生的雙單倍體(DH)被廣泛地應(yīng)用于快速培育油菜新品種、構(gòu)建遺傳研究群體和進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化以及離體誘變等領(lǐng)域。實踐證明，甘藍(lán)型油菜DH技術(shù)體系是油菜遺傳育種和分子生物學(xué)等研究領(lǐng)域的重要工具。但是，通過小孢子離體培養(yǎng)和雙單倍體誘導(dǎo)后，不同的基因型或不同批次的培養(yǎng)材料再生的植株群體中，雙單倍體株率在30%到 90%以上。即小孢子通過人工染色體加倍后，不是所有基因型的再生植株都是雙單倍體，而是還有約10 70%的植株是不能結(jié)種子的單倍體(Hansen et al, In vitro chromosome doubling potential of colchicine,oryzalin,trifluralin and APM in Brassica napus microspore culture. Euphytica, 1996,88 :159-164)。通過目測，這些無用的單倍體在開花前不能與雙單倍體區(qū)分，尤其是在試管苗階段。研究人員只能將小孢子再生的各種倍性植株同時栽到溫室或者田間，到現(xiàn)蕾或初花期階段，將單倍體植株砍掉不要。或者用秋水仙堿涂抹單倍體植株的頂芽和腋芽進(jìn)行染色體加倍?；蛘甙言撝仓陱耐林型诔鰜?，洗凈根部的泥土，用秋水仙堿溶液浸泡根后，再栽到土中，使之染色體加倍。此時識別和處理單倍體植株必然提高了人工、試劑等費(fèi)用，而且染色體加倍太晚，推遲了成熟期。另外，在我國長江流域，甘藍(lán)型油菜小孢子離體培養(yǎng)后于每年6月份形成完整植株。而此時已不是油菜種植季節(jié)，小孢子再生的植株不能移栽到田間。而且國內(nèi)一般均沒有控溫控濕的自動化溫室，這些植株只能于試管繼代培養(yǎng)到10月中旬以后才能移栽到田間。對大量未能識別的單倍體植株進(jìn)行多次繼代，需要大量試劑和人力，移栽到田間需要一定量的土地和肥料等費(fèi)用(見表2)。在蕾期或初花期，把單倍體植株從土中挖出，經(jīng)秋水仙堿處理后，再栽到田間。一般重栽的植株在10天后才能恢復(fù)生長，延遲成熟期約2周。這不但使DH技術(shù)的應(yīng)用成本提高，而且效率降低。因此，急需一種于甘藍(lán)型油菜小孢子植株發(fā)育早期能簡便、快速準(zhǔn)確鑒別單倍體的方法。在油菜小孢子植株發(fā)育的早期，其倍性鑒別可采用染色體計數(shù)和流式細(xì)胞儀測定核DNA含量的方法。但是要制出全套染色體分散好、不丟失、清晰能記數(shù)目的片子，需要具有嫻熟的染色體制片技巧，而且制片很花費(fèi)時間，不可能快速用于大量植株的倍性鑒別。流式細(xì)胞儀能準(zhǔn)確地測定植株的倍性，但操作程序繁瑣，需要花費(fèi)時間制備核DNA懸浮液和進(jìn)行核DNA染色。而且，該染色劑很貴，且儀器昂貴，需要專門人員操作分析，費(fèi)用很高，也不可能用于大批量植株的倍性檢測。據(jù)前人的研究，植物葉片表皮氣孔的長度和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)與染色體倍性呈正相關(guān)。一般二倍體On)植株的葉片氣孔比單倍體(η)葉片氣孔大，葉綠體數(shù)比單倍體大約多一倍。根據(jù)兩者的顯著差異可以迅速地判別植株的倍性。劉威洪等(劉威洪等，用氣孔保衛(wèi)細(xì)胞周長鑒定甘藍(lán)型油菜植株倍性水平.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2002，18(3) :35-38.)測量了甘藍(lán)型油菜品種Qn)和單倍體(η)植株葉片的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞縱橫直徑長度，采用公式L=1.57x[1.5x(A+B)-VZ^計算了保衛(wèi)細(xì)胞的周長。他們提出保衛(wèi)細(xì)胞的周長值可以作為鑒定甘藍(lán)型油菜染色體倍性水平的一個指標(biāo)。但是周長的測量和計算方法很繁瑣，用于大量植株的倍性鑒定必定很花時間，不可能用于大量植株的檢測。而且Ho等(Ho.et al,The Use of Stomatal Chloroplast Number for Rapid Determination of Ploidy Level in Maize. Plant Breeding, 1990,105 :203-210)也報道，不同倍性植株之間的葉片氣孔長度差異比它們之間的葉綠體數(shù)差異小，判定倍性的準(zhǔn)確率比葉綠體計數(shù)方法低° Ewald 等(Ewald. et al, Induction of tetraploid poplar and black locust plants using colchicine :chloroplast number as an early marker for selecting polyploids in vitro. Plant Cell Tiss Organ Cult. 2009，99 :353-357.)統(tǒng)計了離體培養(yǎng)的楊樹和洋槐葉片表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)。在已測的所有植株中，四倍體Gn)的葉綠體數(shù)幾乎是二倍體On)的2倍。他們提出，保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)可作為離體誘導(dǎo)的楊樹、洋槐多倍體的早期選擇標(biāo)記。從以上所述可知，在某些植物，使用葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)已可以快速區(qū)分其植株的倍性。但是至今未見使用葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)鑒別甘藍(lán)型油菜小孢子再生的單倍體(n，HP)試管苗的報道。為能在小孢子植株的幼苗階段快速、準(zhǔn)確地識別單倍體，我們采用甘藍(lán)型油菜小孢子試管無菌苗，研究了不同倍性植株的葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)與染色體倍數(shù)的相關(guān)性和不同倍性植株之間保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)的差異顯著性，找到了葉綠體數(shù)與單倍體相關(guān)的實用參數(shù)，建立了使用氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)快速鑒別大批量甘藍(lán)型油菜小孢子單倍體試管苗的技術(shù)，使小孢子再生的單倍體植株能于成苗初期被識別和剔除，或者盡可能早地進(jìn)行染色體加倍，使其盡早形成雙單倍體，解決了盲目地長時間于培養(yǎng)基繼代和在田間栽種單倍體植株的問題，節(jié)約了試劑、人工和土地等費(fèi)用，提高了甘藍(lán)型油菜雙單倍體(DH)技術(shù)體系在油菜遺傳育種等領(lǐng)域的應(yīng)用效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，根據(jù)葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中的葉綠體數(shù)與植株倍性的相關(guān)性，運(yùn)用氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體計數(shù)技術(shù)建立簡便、快速、大批量地鑒別甘藍(lán)型油菜小孢子再生植株倍性的有效方法。實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案和步驟如下1、切取無菌的小孢子再生植株葉片從甘藍(lán)型油菜品種植株的花蕾分離小孢子， 采用石淑穩(wěn)的方法誘導(dǎo)胚狀體(參照石淑穩(wěn)等報道的方法，石淑穩(wěn)，甘藍(lán)型油菜及其種間和屬間雜種小孢子胚狀體的誘導(dǎo)，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1993，12 =544-550)。產(chǎn)生的胚狀體接禾中在含有 B5 培養(yǎng)基(Gamborg et al, Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research，1968，50 :151-158)的三角瓶中培育成植株。在超凈工作臺上，將滅菌的醫(yī)用剪刀伸進(jìn)瓶中，剪下小植株基部往上數(shù)的第5片平展葉，并放入小塑料袋中，寫上與該三角瓶相同的株號，隨后，將三角瓶用原紙帽封住，置于培養(yǎng)室。2、葉片下表皮組織制片在細(xì)胞學(xué)實驗室，用刀片切取步驟(1)所述的葉片中間組織，置于載玻片上，然后用鑷子將其上表皮和葉肉細(xì)胞輕輕夾碎去掉，僅留下表皮組織。加一滴碘-碘化鉀染色液在下表皮組織，蓋上蓋玻片，染色約2分鐘。3、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中的葉綠體計數(shù)把步驟( 所述的制片放在光學(xué)顯微鏡的載物臺上，用16倍目鏡和40倍物鏡頭觀察氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中的葉綠體，每株觀察一片葉，每片葉統(tǒng)計10個氣孔的葉綠體數(shù)(即，每張制片記錄10個氣孔)。4 用葉綠體參數(shù)判定試管苗植株倍性根據(jù)步驟3所得葉綠體參數(shù)鑒定試管苗植株群體中的單倍體、雙單倍體和四倍體。即在顯微鏡下記錄每個氣孔的葉綠體數(shù)，每張制片 (即每片葉)有7個以上(包括7個，下同)氣孔具有6-8個葉綠體，判定為單倍體(HP)， 具有10-13個葉綠體的判定為雙單倍體(DH)，具有15-M個葉綠體的判定為四倍體(TP)。 詳見表3和圖1-3。本發(fā)明染色液的組分及其配制方法如下將碘0. 5g倒入小燒杯中，加40ml蒸餾水，進(jìn)行溶解；溶解后，再加入碘化鉀1. Og, 用蒸餾水定容到50ml，倒入棕色試劑瓶中保存，備用。本發(fā)明的實施效果1、提高了 DH技術(shù)的應(yīng)用效率和降低了應(yīng)用成本當(dāng)小孢子再生的胚狀體于試管剛發(fā)育成完整植株時，使用本發(fā)明建立的葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中的葉綠體計數(shù)法準(zhǔn)確地把不能結(jié)籽的單倍體鑒別出來，盡早丟棄，不再使用大量藥品于試管進(jìn)行多次繼代培養(yǎng)，每一萬株苗節(jié)約費(fèi)用16513元。也不再盲目地移栽到田間，浪費(fèi)土地，花費(fèi)人力進(jìn)行管理，節(jié)約成本 2570元(表幻。如果需要把鑒定出的單倍體人工加倍成雙單倍體，此時可以在試管中用秋水仙堿或在移栽前進(jìn)行染色體加倍，以免在移栽后加倍延遲開花結(jié)果，影響DH植株的使用。2、能快速地鑒別大批量的植株倍性采用本發(fā)明建立的葉綠體計數(shù)方法，用約5分鐘時間可以完成一株試管苗的倍性鑒定，可以快速鑒定大批量的植株倍性。用流式細(xì)胞儀 (Flow Cytometry)分析法鑒定倍性，其操作流程復(fù)雜，必須用檸檬酸和土溫20等試劑處理葉片組織，用染色劑DAPI染色DNA，并通過過濾制備核DNA懸浮液，才能用于倍性分析，花費(fèi)時間較長。而且分析費(fèi)用非常高，一般分析一株需要50元人民幣，一萬株就要五十萬元 (表1)，不可能用于大量植株倍性的鑒定。3、程序簡便、易操作、費(fèi)用低本發(fā)明建立的葉綠體計數(shù)測定植株倍性的技術(shù)，流程簡便，易于操作，沒有系統(tǒng)學(xué)過細(xì)胞學(xué)的工人也能勝任本工作，而且染色劑相當(dāng)便宜，鑒定一萬株苗的費(fèi)用為8227元。而采用染色體計數(shù)法，則需要相當(dāng)熟練的制片技術(shù)，沒有一定細(xì)胞學(xué)知識的一般工作人員難以完成該試驗。其需要經(jīng)費(fèi)19888元(表1)。


圖1.單倍體葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體及數(shù)量。
圖2.雙單倍體葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體及數(shù)量。
圖3.四倍體葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體及數(shù)量。
圖4.用流式細(xì)胞儀檢測的四倍體的DNA含量峰值。
圖5.單倍體結(jié)角特征。
圖6.雙單倍體結(jié)角特征。
圖7.四倍體結(jié)角特征。
具體實施例方式實施例11、切取甘藍(lán)型油菜小孢子離體再生的無菌苗葉片采用石淑穩(wěn)等報道的方法(石淑穩(wěn)等，甘藍(lán)型油菜及其種間和屬間雜種小孢子胚狀體的誘導(dǎo)，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1993，12 =544-550)將甘藍(lán)型油菜品種華雙4號、華雙2 號、華油8號、華雙1號和華黃一號(上述品種來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜研究室培育的品種， 已在中國廣泛推廣和應(yīng)用)的小孢子離體培養(yǎng)獲得胚狀體，將所述的再生的胚狀體分別接種在pH為6. 0的B5培養(yǎng)基上(B5培養(yǎng)基來源Gamborg等，Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.Experimental Cell Research,1968,50 151-158)的150ml三角瓶中，培養(yǎng)至有根和莖葉的完整小植株(培養(yǎng)溫度為M-26°C，光照每天12h，光強(qiáng)為ISOOlux)。在含有小植株的瓶子上分別編寫其株號，然后在超凈工作臺上上，用滅菌的醫(yī)用剪刀剪下培養(yǎng)瓶內(nèi)小植株的第5片(從其基部向上數(shù))平展葉片，將剪切的葉片置于小塑料袋中，寫上與該三角瓶相同的株號。隨后，將三角瓶用原紙帽封住，放回到培養(yǎng)室。2、葉片下表皮組織制片和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體計數(shù)在細(xì)胞學(xué)實驗室，取出上述步驟1的塑料袋中華雙4號、華雙2號、華油8號、華雙 1號和華黃一號等5個品種的葉片(來自82株試管苗)，用薄刀片切下葉片中間的一塊組織，放在載玻片上。然后用鑷子輕輕夾碎其上表皮和葉肉細(xì)胞，僅留下表皮組織。用滴管滴一滴配制好的染色液在該下表皮組織上，蓋上蓋玻片。染色約2分鐘后將載玻片放在光學(xué)顯微鏡(購自O(shè)lympus公司)的載物臺上，用16倍目鏡和40倍的物鏡頭觀察葉綠體。每張制片(來自同一片葉)隨機(jī)統(tǒng)計10個氣孔(每個氣孔有一對保衛(wèi)細(xì)胞)的葉綠體數(shù)，重復(fù)操作前述步驟一次，每片葉片共觀察統(tǒng)計20個氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)，采用最小顯著差數(shù)法(LSD法)進(jìn)行各倍性之間的差異顯著性分析。染色液配制方法用干分之一的天平稱取碘0. 5g，倒入小燒杯中，加入大約40ml蒸餾水進(jìn)行溶解。 溶解后，再加入碘化鉀l.og，然后轉(zhuǎn)入量筒中，并加蒸餾水定容到50ml，在棕色試劑瓶避光下保存，備用。3、小孢子再生的試管苗植株的倍性判定將步驟2記錄過的華雙4號、華雙2號、華油8號、華雙1號和華黃1號的葉綠體數(shù)的共82株試管苗移栽到田間。在開花初期觀察這些植株花器特征和結(jié)角結(jié)籽狀況。在上述5個群體中，單倍體(HP)每一葉片有70%以上(包括70%，下同)的氣孔(兩次重復(fù)， 下同)分別具有6-8個葉綠體。雙單倍體植株(DH)有70%以上的氣孔均具有10-13個葉綠體，凡是長有特大蕾和大花瓣，花粉多，但結(jié)角少，且多是蘿卜角，結(jié)少量大籽的植株，其 70%以上氣孔分別具有15-M個葉綠體(見表幻。用流式細(xì)胞儀(FCM)分析這些大蕾大花瓣植株葉片的核DNA含量，證明是四倍體(TP)(見圖4)。經(jīng)過LSD測驗證明，單倍體、雙單倍體和四倍體之間的平均葉綠體數(shù)差異極顯著(見表3)。以上采用花器特征和結(jié)角結(jié)籽特性以及流式細(xì)胞儀驗證的結(jié)果證明，所觀察的一片葉(來自一單株)下表皮的10個氣孔(一次重復(fù))中有7個以上(包括7個，下同)分別具有6-8個葉綠體，判定為單倍體，具有10-13個葉綠體的判定為雙單倍體，具有15-M 個葉綠體的判定為四倍體(圖1- 。該葉綠體數(shù)值可以直接用于判定甘藍(lán)型油菜小孢子再生的試管苗植株的倍性，不必再用其它方法進(jìn)行驗證。實施例2 (應(yīng)用實施例利用實施例1的方法識別和丟棄不結(jié)籽的小孢子單倍體植株)將油菜品種中油821(來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，中國大面積推廣品種)、華雙3號和華雙5號(來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜研究室培育的品種，已在中國廣泛推廣和應(yīng)用)的小孢子再生為胚狀體(方法參照石淑穩(wěn)等，甘藍(lán)型油菜及其種間和屬間雜種小孢子胚狀體的誘導(dǎo)，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1993，12 :544-550)。將獲得的胚狀體接種于含B5 培養(yǎng)基(PH6.0)的三角瓶中，培育成小植株(培養(yǎng)溫度為M_26°C，光照每天12h，光強(qiáng)為 ISOOlux)。按實施例1的方法切下第5片葉，進(jìn)行下表皮組織制片。在光學(xué)顯微鏡(購自 Olympus公司)的目鏡16倍和物鏡40倍下觀察和計數(shù)這些植株的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)。每張制片(來自一單株的一片葉)統(tǒng)計10個氣孔的葉綠體數(shù)。在每張制片中凡是有7 個以上(包括7個，下同)均具有6-8個葉綠體，其植株判定為單倍體，均從三角瓶中丟掉， 不再繼代培養(yǎng)保存。凡具有10-13個或更多的葉綠體的，其植株判定為雙單倍體或四倍體， 均保留，進(jìn)行繼代培養(yǎng)(繼代培養(yǎng)基為B5，pH6. 0)，作為下一步的遺傳育種研究的材料。本發(fā)明的實施效果見表1-3.表1三種方法鑒定甘藍(lán)型油菜小孢子植株倍性的費(fèi)用的成本核算(人民幣元/
萬株)
權(quán)利要求
1. 一種早期快速鑒定甘藍(lán)型油菜小孢子試管苗單倍體的方法，其特征在于，它包含下列步驟1)在無菌條件下取離體培養(yǎng)獲得的甘藍(lán)型油菜小孢子試管苗基部往上的第5片平展葉，用刀片切取葉片中間組織，置于載玻片上，然后用鑷子將其上表皮和葉肉細(xì)胞輕輕夾碎去掉，僅留下表皮組織，向所述的下表皮組織加一滴染色液，蓋上蓋玻片，染色2min，每片葉制成一張玻片，得到鑒定用的玻片；2)將步驟1)的鑒定用的玻片置于光學(xué)顯微鏡的載物臺上，用16倍目鏡和40倍物鏡頭觀察氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中的葉綠體，每張鑒定用的玻片記錄10個氣孔的葉綠體數(shù)，即每株觀察一片葉，每片葉統(tǒng)計10個氣孔的葉綠體數(shù)；3)根據(jù)步驟2所得葉綠體參數(shù)鑒定試管苗植株群體中的單倍體，雙單倍體和四倍體； 染色液的配制方法如下所示將0. 5g的碘倒入小燒杯中，加40ml蒸餾水進(jìn)行溶解，溶解后再加入碘化鉀1. Og ；用蒸餾水定容至50ml。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物細(xì)胞學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種使用葉綠體計數(shù)法，在早期簡便快速、大批量鑒別甘藍(lán)型油菜小孢子再生的單倍體的方法。特征是，將離體小孢子培養(yǎng)成的胚狀體接種在B5培養(yǎng)基。在胚狀體剛發(fā)育成完整植株時，無菌切取第5片平展葉。用碘-碘化鉀染色該葉片中間部位的下表皮組織。用光學(xué)顯微鏡觀察氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體。每張制片(即一片葉)記錄10個氣孔的葉綠體數(shù)。之中，有7個以上氣孔均具有6-8個葉綠體，其植株為單倍體。本方法解決了單倍體長時間繼代培養(yǎng)問題，一萬株可節(jié)約試劑、土地和人工費(fèi)用19083元。本發(fā)明程序簡便，易操作，僅用5分鐘時間鑒別一株苗，費(fèi)用低，可用于鑒別大量的植株倍性，提高了雙單倍體(DH)技術(shù)的應(yīng)用效率。
文檔編號C12Q1/68GK102304561SQ201110003029
公開日2012年1月4日 申請日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月6日
發(fā)明者吳江生, 孫秀麗, 汪頻, 王晨, 石淑穩(wěn), 陳琳 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)