專利名稱：大豆adf基因及其在花器官改造中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個大豆ADF基因GmADFl的應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肌動蛋白(actin)是真核生物細胞中廣泛存在的一種重要的蛋白質(zhì)，構(gòu)成細胞骨架中的微絲系統(tǒng)。肌動蛋白骨架對植物高度特異化的細胞如花粉管、葉毛、根毛和氣孔保衛(wèi)細胞的形態(tài)發(fā)生和功能起著重要作用，同時在高等植物形態(tài)發(fā)生的細胞分裂和伸長過程中發(fā)揮著極為關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用(Kostei al. , 1999; Dong et al. , 2001) ADF (actin depolymerizing factor)作為一種重要的肌動蛋白結(jié)合蛋白，自從1997年Carlier克隆第一個擬南芥ADFl后，越來越多的植物ADF被克隆。眾多研究表明ADF可調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合和解離，參與植物細胞形態(tài)建成，從而起到調(diào)節(jié)植株性狀的作用，為篩選特定性狀的植株提供了理想的候選調(diào)控基因。大豆起源于我國，是重要的糧油兼用作物。大豆作為嚴格自花授粉的作物，其花器較小，花粉粘重，花朵開放時翼瓣和龍骨瓣緊緊包住雄蕊和柱頭，導(dǎo)致花藥和柱頭不能外露，故造成大豆異花傳粉非常困難，同時也使得大豆的雜種優(yōu)勢很難被利用。若能定向改變大豆的花器官結(jié)構(gòu)，使之更利于接受外源花粉，必將大大降低不育系繁殖或雜交制種的成本，使大豆雜交種應(yīng)用于大面積生產(chǎn)得以實現(xiàn)。因此，從分子水平上挖掘能夠影響和控制細胞形態(tài)建成的相關(guān)基因，并應(yīng)用于特定器官的改造，如大豆的花器官，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。本發(fā)明從大豆中克隆了 1個影響花瓣位置和數(shù)目的基因—iF_/，提出了利用該基因進行植物花器官改造的基因工程改良方法。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的旨在公開GmADFl在花器官改造中的基因工程應(yīng)用，該基因可作為目的基因?qū)胫参铮淖冎参锏幕ㄐ?，從而進行植物品種改良。技術(shù)方案
本發(fā)明所提供的大豆ADF基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1，其表達蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。大豆ADF基因GmADFl的基因工程應(yīng)用，包括 1) X^GmADFl 的克隆
搜索大豆EST庫，設(shè)計一對引物如下 上游引物5，-TCAGAACCCTCGATCACTCC-3，，見 SEQ ID NO. 3 ； 下游引物5，-CACACTGGAACAAGCAAAGC-3，，見 SEQ ID N0. 4 ； 提取大豆品種擬899葉的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，進行PCR擴增。PCR 反應(yīng)體系為 25μ L，包含模板 cDNA 1.0 μ L(50ng. μ Γ1) ,IOXTaq 緩沖液 2 μ L，MgCL2 1.2 μ L (25 mmoL. L-1), dNTPsO. 5 μ L (10 mmoL. L-1), Taq 聚合酶 0· 5 μ L (5 U. μ L-1)，上游弓 |物，下游引物各1.0 μ L (lOpmoL. μΓ1)，用ddH20補齊至25 μ L0 PCR反應(yīng)程序為:95°C 預(yù)變性4min，反應(yīng)共30個循環(huán)包括95°C變性50s，56°C退火50s，72°C延伸lmin，最后 72°C保溫10 min0再將PCR產(chǎn)物進行克隆至pGEM-Teasy載體，測序后獲得具有完整編碼區(qū)的大豆 GmADFl 的 cDNA 序列 SEQ ID NO. 1 ；
2)植物表達載體的構(gòu)建
運用Gateway技術(shù)可以快速并高效地將目的序列同時構(gòu)建到多種與(Gateway技術(shù)兼容的載體系統(tǒng)，用于功能分析和蛋白質(zhì)表達研究。其基本過程如下根據(jù)Gateway說明書設(shè)計一對過量表達的特異性引物
上游引物5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGCAAACG CAGCATCTGGTATGGC -3，，見 SEQ ID NO. 5 ； 下游引物5，_ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGTTGGCCCGGC TTTTGAACAC -3，，見 SEQ ID NO. 6 ；
將經(jīng)PCR擴增并測序后的目的序列與donor vector進行BP反應(yīng)，得到的entry cLone 再與destination vector (pMDC83)進行LR反應(yīng)，獲得植物表達載體_C83-GmAIWl。
3)轉(zhuǎn)基因植株的獲得
將步驟2)獲得的表達載體經(jīng)過液氮凍融法將其轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105，進一步轉(zhuǎn)化煙草。對獲得的轉(zhuǎn)基因煙草植株進行PCR，RT-PCR驗證后再對陽性植株的表型進行分析。轉(zhuǎn)GmADFl基因煙草植株部分開花提前，花瓣的數(shù)目或增加或減少，并且花瓣的空間分布呈多樣性。此外，有的花出現(xiàn)了融合的現(xiàn)象，即兩朵花共用一套柱頭和雄蕊；有的外圍花瓣數(shù)為5個，但其內(nèi)部卻又長出兩個類花瓣，且以上這兩種類型的花，其柱頭均高過雄蕊， 這樣的位置關(guān)系導(dǎo)致了該類型的花不能正常授粉；有的花柱頭開裂，從正面看呈現(xiàn)三小片且柱頭表面有許多小的突起，而對照的柱頭從正面看則呈兩小半且表面較為光滑，有粘性。有益效果
的組織表達分析表明其參與了大豆根，蓮，莖尖，葉，花和種子的發(fā)育。過量表達 GmADFl的煙草的花器官變化表明GmADFl在花瓣位置和數(shù)目及其空間分布方面可能發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。本發(fā)明公開了該基因進行植物花器官改造的基因工程改良方法。該方法對培育花器官改變的植物品種特別是大豆品種具有一定的作用，可以通過定向地改造植物的花器形態(tài)，為重要的經(jīng)濟農(nóng)作物提高育種效率。利用植物表達載體，將本發(fā)明的―導(dǎo)入植物細胞，可獲得花器官改變的轉(zhuǎn)基因細胞系及轉(zhuǎn)基因植株。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植株進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的選擇性標記基因(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(潮霉素標記物、卡那霉素標記物等)。然而從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，也可不加任何選擇性標記基因，直接以表型篩選轉(zhuǎn)化植株。攜帶有本發(fā)明GmADFl的植物表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成成熟植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、小麥、玉米等單子葉植物，也可以是大豆、黃瓜、番茄、楊樹、苜蓿等雙子葉植物。
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下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明做進一步說明。


圖1 GmADFl基因的組織表達分析
(A) GmADFl在大豆不同組織中的半定量RT-PCR分析；(B) GmADFl在大豆不同組織中的實時熒光定量RT-PCR分析。分別采用半定量RT-PCR和熒光定量RT-PCR技術(shù)對不同大豆組織中GmADFl的表達情況進行研究，內(nèi)參為Actin。圖2過量表達GmADFl引起煙草植株花器形狀和結(jié)構(gòu)異常
A 花藥未開裂的野生型煙草(WT)的花，花瓣為5枚；E 花藥開裂的野生型煙草(WT) 的花，花瓣為5枚1，K 轉(zhuǎn)GmADFl基因煙草的花，花瓣為6枚，分布不對稱；B，F(xiàn) 轉(zhuǎn)GmADFl 基因煙草的花，花瓣為4枚，對稱分布；C，G 轉(zhuǎn)GmADFl基因煙草的花，花瓣為5枚，分布不對稱；D，J 轉(zhuǎn)GmADFl基因煙草的融合花，花瓣總數(shù)仍為5枚，但從中間對分，只有一套雄蕊和柱頭且柱頭高于雄蕊，致不能正常授粉；H 花瓣內(nèi)生；L 柱頭開裂。
具體實施例方式下述實例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例1、大豆ADF基因GmADFl的cDNA克隆與鑒定搜索大豆EST庫，設(shè)計一對引物如下
上游引物5，-TCAGAACCCTCGATCACTCC-3’ 下游引物5，-CACACTGGAACAAGCAAAGC-3’
應(yīng)用RT-PCR方法，從大豆品種N2899 (公知公用，國家大豆改良中心可購買)中克隆了基因。取大豆六復(fù)葉期的葉片，于玻璃研缽內(nèi)加入液氮迅速研磨成粉末，然后
加入裂解液進一步研磨制成勻漿。再移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzoL Reagents, Invitrogen, USA)。抽提完畢用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，然后利用分光光度計測定RNA的含量。以獲得的總RNA為模板，按照TaKaRa公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。再進行PCR擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為25 μ L， 包含模板 cDNA 1. 0 μ L(50ng. μ Γ1)，IOXTaq 緩沖液 2 μ L, MgCL2 1. 2 μ L (25 mmoL. Γ1)，dNTPsO. 5 μ L (10 mmoL. Γ1)，Taq聚合酶0. 5 μ L (5 U. μ Γ1)，上游引物，下游引物各 1.0 μ L (lOpmoL. μΓ1)，用 ddH20補齊至 25 yL。PCR反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性 4 min，反應(yīng)共30個循環(huán)包括95°C變性50s，56°C退火50s，72°C延伸lmin，最后72°C保溫10 min。 將693 bp的PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-Teasy載體，測序后獲得具有完整編碼區(qū)的大豆GmADFl 的 cDNA 序列 SEQ ID NO. 1 ；
實施例2、極GmADFl基因在不同組織中的表達特征
大豆品種N2899于正常季節(jié)播種于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)網(wǎng)室中。取大豆六復(fù)葉期的根、莖、莖尖和葉，大豆盛花期(Rl)的花，開花后15、20、30、40、45天種子的混合物，以上樣品采集后均立即于液氮速凍后存于_80°C備用?？俁NA的提取同實施例1。以大豆組成型表達的Jcii/ 基因(GenBank accession No. V00450)為內(nèi)部參照，以來自大豆不同組織的總RNA為模板，進行RT-PCR分析。RT-PCR 分析結(jié)果表明—iF·/在根、莖、莖尖、葉、花和種子中都有較強的表達，且以根和花中的表達量最高。推測—可能參與了這些組織的細胞形態(tài)建成和生長發(fā)育過程，尤其是在具有頂端生長優(yōu)勢的器官中更加明顯。實施例3、GmADFl的基因工程應(yīng)用
搜索大豆EST庫，設(shè)計擴增出完整編碼閱讀框的引物 上游引物5，-TCAGAACCCTCGATCACTCC-3’ 下游引物5，-CACACTGGAACAAGCAAAGC-3’
以1)中獲得的PCR擴增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴增后，將的cDNA克隆至 pGEM-Teasy載體，進一步克隆到植物表達載體pMDC83 ；通過凍融法將此表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，并對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行表型分析，發(fā)現(xiàn) GmADFl的異位表達促使煙草植株的花瓣數(shù)目或增加或減少，并且花瓣的空間分布呈多樣性。此外，有的花出現(xiàn)了融合的現(xiàn)象，即兩朵花共用一套柱頭和雄蕊；有的外圍花瓣數(shù)為5 個，但其內(nèi)部卻又長出兩個類花瓣，且以上這兩種類型的花，其柱頭均高過雄蕊，這樣的位置關(guān)系導(dǎo)致了該類型的花不能正常授粉；有的花柱頭開裂，從正面看呈現(xiàn)三小片且柱頭表面有許多小的突起，而對照的柱頭從正面看則呈兩小半且表面較為光滑，有粘性。綜合以上結(jié)果，我們認為―在花瓣位置和數(shù)目及其空間分布方面可能發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。該方法對培育花器官改變的植物品種特別是大豆品種具有一定的作用，可以通過定向地改造植物的花器形態(tài)，為重要的經(jīng)濟農(nóng)作物提高育種效率。利用
基因獲得的花器官發(fā)生變異的新材料可應(yīng)用于重要的經(jīng)濟農(nóng)作物和觀賞園藝植物的育種工作。
權(quán)利要求
1.一種大豆ADF基因，其特征在于其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
2.一種大豆ADF基因在花器官改造中的應(yīng)用，其特征在于按如下步驟實現(xiàn)1)大豆ADF基因的克隆設(shè)計一對引物如下上游引物5，-TCAGAACCCTCGATCACTCC-3’下游引物5，-CACACTGGAACAAGCAAAGC-3’提取大豆品種擬899葉的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，進行PCR擴增；其中 PCR 反應(yīng)體系為 25 μ L，包含模板 1. 0 μ LcDNA 50ng. μ Γ1, 2 yL IOXTaq 緩沖液，1.2 μ LMgCL2 25 mmoL.171，0. 5 μ L dNTPs 10 mmoL. L-1, 0. 5 μ L Taq 聚合酶 5 U. μ L-1，1.0 μ L上游引物 IOpmoL. μ Γ1,1.0 μ L下游引物 IOpmoL. μ Γ1，用 ddH20補齊至 25 yL;PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性4 min，反應(yīng)共30個循環(huán)包括95°C變性50s，56°C退火50s，72°C 延伸lmin，最后72°C保溫10 min ；再將PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-Teasy載體，測序后獲得具有完整編碼區(qū)的大豆的cDNA序列SEQ ID NO. 1 ；2)植物表達載體的構(gòu)建設(shè)計一對過量表達的特異性引物上游引物5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGCAAACGCAGCATCTGGTATGGC -3’下游引物5，_ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGTTGGCCCGGCTTTTGAACAC -3，將經(jīng)PCR擴增并測序后的目的序列與donor vector進行BP反應(yīng)，得到的entryclone再與destination vector pMDC83進行LR反應(yīng)，獲得植物表達載體； 3)轉(zhuǎn)基因植株的獲得將步驟2)獲得的表達載體經(jīng)液氮凍融法將其轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105，進一步轉(zhuǎn)化煙草；對獲得的轉(zhuǎn)基因煙草植株進行PCR，RT-PCR驗證后再對陽性植株的表型進行分析； 轉(zhuǎn)基因煙草植株部分開花提前，花瓣的數(shù)目或增加或減少，并且花瓣的空間分布呈多樣性； 此外，有的花出現(xiàn)了融合的現(xiàn)象，即共用一套柱頭和雄蕊；有的外圍花瓣數(shù)為5個，但其內(nèi)部卻又長出兩個類花瓣，且以上這兩種類型的花，其柱頭均高過雄蕊，這樣的位置關(guān)系導(dǎo)致了該類型的花不能正常授粉；有的花柱頭開裂，從正面看呈現(xiàn)三小片且柱頭表面有許多小的突起，而對照的柱頭從正面看則呈兩小半且表面較為光滑，有粘性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個大豆ADF基因及其在花器官改造中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。一種大豆ADF基因，其特征在于其核苷酸序列為SEQ ID NO.1。轉(zhuǎn)基因煙草植株的花出現(xiàn)了融合的現(xiàn)象，即兩朵花共用一套柱頭和雄蕊；有的外圍花瓣數(shù)為5個，但其內(nèi)部卻又長出兩個類花瓣，形成花中有花的有趣現(xiàn)象，且以上這兩種類型的花，其柱頭均高過雄蕊，因此這樣的空間分布導(dǎo)致了該表型的花不能正常授粉；有的花柱頭開裂，從正面看呈現(xiàn)三小片且柱頭表面有許多小的突起，而對照的柱頭從正面看呈兩小半且表面較為光滑，有粘性。利用大豆ADF基因獲得變異的花器官新材料可應(yīng)用于重要的經(jīng)濟農(nóng)作物和觀賞性園藝植物的育種工作。
文檔編號C12N15/29GK102154312SQ20111000299
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月10日
發(fā)明者何慧, 喻德躍, 黃方 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)