專利名稱：一個(gè)大豆MADS-box基因及其在花器官改造中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)大豆MADS-box基因GmMADSl的應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人們已經(jīng)從處于不同進(jìn)化地位的整個(gè)龐大的植物各類群中分離得到了大量的 MADS-box基因，MADS-box基因在花發(fā)育中起著重要作用，無論是從營養(yǎng)生長向生殖生長的 轉(zhuǎn)換；還是在生殖生長的初始階段，花分生組織決定基因啟動(dòng)花分生組織的發(fā)育；以及在 生殖生長后期，花器官原基的發(fā)育中都發(fā)揮著重要的作用。大豆作為重要的糧油作物，有關(guān)其花發(fā)育的研究還相對(duì)滯后。大豆花多，花器較 小，花粉粘重，花朵開放時(shí)翼瓣和龍骨瓣緊緊包住雄蕊和柱頭，花藥和柱頭不外露，異花間 的風(fēng)媒傳粉等花器特點(diǎn)造成大豆異花傳粉非常難，也使大豆雜種優(yōu)勢(shì)很難利用，如果能定 向改變大豆的花器結(jié)構(gòu)，使之更利于吸引傳粉昆蟲或有利于風(fēng)媒傳粉，這將大大降低不育 系繁殖或雜交制種的成本，使大豆雜交種應(yīng)用于大面積生產(chǎn)。Feng(2006)通過對(duì)LjCYC2 的遺傳操作，在百脈根中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)花瓣的改造。對(duì)大豆這樣的嚴(yán)格自花授粉作物而言，或 許可以以基因操作為基礎(chǔ)的分子設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)其傳粉方式的改變。因此，弄清花發(fā)育的分子機(jī) 制，進(jìn)而為改造花器官提供基礎(chǔ)，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。本發(fā)明從大豆中克隆了 1個(gè) 與在花瓣位置和數(shù)目的確定性上發(fā)揮了重要的調(diào)控作用的基因GmMADSl，提出了利用該基 因進(jìn)行植物花器官改造的基因工程改良方法。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于公開大豆MADS-box基因GmMADSl在花器官改造中的基因工程 應(yīng)用，該基因可作為目的基因?qū)胫参?，改變植物的花型，以進(jìn)行植物品種改良。技術(shù)方案本發(fā)明所提供的大豆MADS-box基因GmMADSl，其序列為SEQ ID NO. 1。大豆MADS-box基因GmMADSl的基因工程應(yīng)用，包括1)大豆 MADS-box 基因 GmMADSl 的克隆根據(jù)大豆MADS-box基因GmMADSl的全長序列，設(shè)計(jì)兩端引物上游引物5‘ -GAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3 ‘下游引物5‘ -CAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3 ‘取大豆品種Jackson花和花芽的混合物，提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈 后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序如下94°C預(yù)變性4分鐘，94°C變性30s，55°C復(fù)性Imin，72°C延 伸2min，33個(gè)循環(huán)后，72°C IOmin,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆至pMD18_T載體，測(cè)序后獲得具有完 整編碼區(qū)的大豆MADS-box基因GmMADSl的cDNA序列SEQ ID NO. 1 ；2)植物表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)大豆MADS-box基因GmMADSl的cDNA序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游引物上引入BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，下游引物引入SacI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) (單下劃線標(biāo)示的是BamHI的酶切位點(diǎn)；雙下劃線標(biāo)示的是SacI的酶切位點(diǎn))上游引物5-AGGATCCGAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3下游引物5-AGAGCTCCAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3以步驟1)中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將GmMADSl的cDNA克隆至中間載體PMD18-T，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體PBI121 ；3)轉(zhuǎn)基因植株的獲得將步驟2)獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入植物，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR，RT-PCR驗(yàn)證后進(jìn)行植物的表型分析，獲得將步驟2)獲得的表達(dá)載體 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入煙草，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR，RT-PCR驗(yàn)證后 進(jìn)行植物的表型分析，獲得的GmMADSl轉(zhuǎn)基因植株提前開花、矮化，萼片、雄蕊和花瓣的數(shù) 目增加，產(chǎn)生了萼片、雄蕊向花瓣的轉(zhuǎn)變，出現(xiàn)子房狀萼片、開裂的花瓣和彎曲的雄蕊，而且 由于雄蕊彎曲和縮短，導(dǎo)致雄蕊無法觸及雌蕊，而不能正常授粉；此外，GmMADSl轉(zhuǎn)基因植 株的花藥不能正常開裂，花粉的活力降低，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株育性下降甚至完全不育。有益效果GmMADSlmRNA表達(dá)分析表明其有可能參與花瓣和雄蕊的發(fā)育。進(jìn)一步的過量表達(dá) GmMADSl的煙草的花器官變化表明GmMADSl在花瓣位置和數(shù)目的確定以及雄性器官發(fā)育方 面可能發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。本發(fā)明公開了該基因進(jìn)行植物花器官改造的基因工程改良 方法。該方法對(duì)培育花器官改變的植物品種特別是大豆品種具有一定的作用，可以通過定 向地改造作物的花器形態(tài)，為農(nóng)作物提高制種效率服務(wù)，進(jìn)而為提高農(nóng)作物特別是大豆的 產(chǎn)量服務(wù)。利用植物表達(dá)載體，將本發(fā)明的GmMADSl導(dǎo)入植物細(xì)胞，可獲得花器官改變的轉(zhuǎn) 基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。使用GmMADSl構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng) 型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用 植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因(⑶S基因、螢光素酶基 因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)。從轉(zhuǎn)基因植物 的安全性考慮，也可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以表型篩選轉(zhuǎn)化植株。攜帶有本發(fā)明GmMADSl的植物表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載 體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并 將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、小麥、玉米等單子葉植 物，也可以是大豆、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜蓿等雙子葉植物。下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


圖IGmMADSl基因的組織表達(dá)分析。采用半定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行不同大豆組織GmMADSl的組織表達(dá)研究，Actinl基 因的表達(dá)為內(nèi)參圖2 335S =GmMADSl轉(zhuǎn)基因煙草萼片、花瓣和雄蕊的數(shù)目增加。A，D，F(xiàn)表示野生型煙草(WT)的花瓣、雄蕊和萼片均為5枚；B，C，E，G表示野生型煙草的花瓣、雄蕊和萼片均為6枚；D-E中標(biāo)尺代表Imm圖3 35S =GmMADSl轉(zhuǎn)基因煙草異常的花器官。(A)WT的花型；(B)35S =GmMADSl轉(zhuǎn)基因煙草萼片開裂；(C) 35S=GmMADSl轉(zhuǎn)基因煙 草花瓣開裂；(D) 35S =GmMADSl轉(zhuǎn)基因煙草萼片轉(zhuǎn)變?yōu)榛ò辏?E-G) 35S =GmMADSl轉(zhuǎn)基因煙 草雄蕊轉(zhuǎn)變?yōu)榛ò辍D4 35S =GmMADSl轉(zhuǎn)基因煙草的花絲變短卷曲。(A)WT的花型；⑶WT的花絲；(C)WT花絲外表皮掃描電鏡圖片；(D) 35S =GmMADSl 轉(zhuǎn)基因煙草的花型；(E) 35S =GmMADSl轉(zhuǎn)基因煙草的花絲；(F) 35S =GmMADSl轉(zhuǎn)基因煙草的 花絲外表皮掃描電鏡圖片；A. B. D. E中標(biāo)尺代表1mm，C中標(biāo)尺代表3 μ m，F(xiàn)中標(biāo)尺代表 5 μ m。圖535S =GmMADSl轉(zhuǎn)基因煙草的花藥不開裂、花粉萌發(fā)活力下降。(A-B)WT 的花藥；(C-D) 35S =GmMADSl 轉(zhuǎn)基因煙草的花藥；(E) WT 和 35S =GmMADSl 在顯微鏡下1個(gè)視野內(nèi)花粉數(shù)目的平均值(η = 10) ； (F)WT和35S =GmMADSl在顯微鏡下1 個(gè)視野內(nèi)花粉萌發(fā)率的平均值(η = 10) ； (A)中標(biāo)尺代表100 μ m,⑶中標(biāo)尺代表100 μ m， (C)中標(biāo)尺代表100 μ m，(D)中標(biāo)尺代表50 μ m。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、大豆MADS-box基因GmMADSl的cDNA克隆與鑒定根據(jù)GmMADSl的全長序列設(shè)計(jì)引物，上游引物5‘ -GAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3 ‘下游引物5‘ -CAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3 ‘應(yīng)用RT-PCR方法，從大豆品種Jackson (公知公用，國家大豆改良中心可購買) 中克隆了 GmM舒暢ADSl基因。取大豆花和花芽的混合物，用研缽研碎，加入盛有裂解液 的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總 RNA(TRIzol Reagents, Invitrogen，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分 光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量。以獲得的總RNA為模板，按照美國Promega公司提供的反轉(zhuǎn)錄 試劑盒的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR程序如下94°C 預(yù)變性4分鐘，94°C變性30s，55°C復(fù)性lmin，72°C延伸2min，33個(gè)循環(huán)后，72°C IOminJf 931bp的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆至pMD18-T載體，測(cè)序后獲得具有完整編碼區(qū)的大豆MADS-box 基因 GmMADSl 的 cDNA 序列 SEQ ID NO. 1 ；實(shí)施例2、大豆GmMADSl基因在不同組織中的表達(dá)特征大豆品種Jackson于正常季節(jié)種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)網(wǎng)室中。取大豆六復(fù)葉期的 根、莖和葉，大豆盛花期(Rl)取花和花芽的混合物，大豆初莢期(R3)的莢，開花后20天幼 嫩的種子，液氮速凍存于-80°C備用。大豆盛花期取完整的花無菌分割成萼片、花瓣、雄蕊、 雌蕊，液氮速凍存于-80°C備用?？俁NA的提取同實(shí)施例1。以大豆組成型表達(dá)的Actin基因(GenBank accessionNo. V00450)為內(nèi)部參照，以來自大豆不同組織的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR分 析。RT-PCR分析表明GmMADSl在包括花、種子和莢等生殖器官表達(dá)，在營養(yǎng)器官(根、莖和 葉)不表達(dá)，在莖生長點(diǎn)中表達(dá)(圖1)，說明該基因在調(diào)節(jié)該組織細(xì)胞增殖上可能也起到一定的作用。進(jìn)一步我們分析了 GmMADSl在花瓣、雄蕊、心皮和萼片中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示 該基因在四輪花器官中都表達(dá)，但花瓣和雄蕊中表達(dá)量較大(圖1)，說明該基因最有可能 參與花瓣和雄蕊的發(fā)育。實(shí)施例3、GmMADSl的基因工程應(yīng)用根據(jù)GmMADSl的cDNA序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游引物上引入BamH I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，下游引物引入SacI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)上游引物5-AGGATCCGAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3下游引物5-AGAGCTCCAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3以1)中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將GmMADSl的cDNA克隆至中 間載體PMD18-T，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體pBI121 ；用凍融法將獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng) 桿菌菌株LBA4404，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型和細(xì)胞學(xué)分 析，發(fā)現(xiàn)GmMADSl的異位表達(dá)促使煙草提前開花、矮化，增加了萼片、雄蕊和花瓣的數(shù)目(圖 2)，產(chǎn)生了萼片、雄蕊向花瓣的轉(zhuǎn)變，出現(xiàn)子房狀萼片、開裂的花瓣和彎曲的雄蕊等(圖3)， 而且由于雄蕊彎曲和縮短，導(dǎo)致雄蕊無法觸及雌蕊(圖4)；此外，GmMADSl轉(zhuǎn)基因植株的花 藥不能正常開裂，花粉的活力降低，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株育性下降甚至完全不育(圖5)。因 此我們認(rèn)為GmMADSl在花瓣位置和數(shù)目的確定以及雄性器官發(fā)育方面發(fā)揮了重要的調(diào)控 作用。利用GmMADSl基因獲得的花器官發(fā)生變異的新材料可用于農(nóng)作物和觀賞園藝植物的 育種應(yīng)用。
權(quán)利要求
大豆MADS-box基因GmMADS1，其序列為SEQ ID NO.1。
2 權(quán)利要求1所述大豆MADS-box基因GmMADSl的基因工程應(yīng)用，包括1)大豆MADS-box基因GmMADSl的克隆根據(jù)大豆MADS-box基因GmMADSl的全長序列，設(shè)計(jì)兩端引物 上游引物5 ‘ -GAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3 ‘下游引物5 ‘ -CAAGGAAGAGGCTA GCTAGG-3 ‘取大豆品種Jackson花和花芽的混合物，提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序如下94°C預(yù)變性4分鐘，94°C變性30s，55°C復(fù)性lmin，72°C延伸 2min, 33個(gè)循環(huán)后，72°C IOmin,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆至pMD18_T載體，測(cè)序后獲得具有完整 編碼區(qū)的大豆MADS-box基因GmMADSl的cDNA序列SEQ ID NO. 1 ；2)植物表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)大豆MADS-box基因GmMADSl的cDNA序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并 在上游引物上引入BamH I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，下游引物引入SacI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)上游引物5-AGGATCCGAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3下游引物-c^-A GAGCTC CAAGGAA GAGGCTAGCTAGG-3以步驟1)中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將GmMADSl的cDNA克隆至中 間載體PMD18-T，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體pBI121 ；3)轉(zhuǎn)基因植株的獲得將步驟2)獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入煙草，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基 因植株進(jìn)行PCR，RT-PCR驗(yàn)證后進(jìn)行植物的表型分析，獲得的GmMADSl轉(zhuǎn)基因植株提前開 花、矮化，萼片、雄蕊和花瓣的數(shù)目增加，產(chǎn)生了萼片、雄蕊向花瓣的轉(zhuǎn)變，出現(xiàn)子房狀萼片、 開裂的花瓣和彎曲的雄蕊，而且由于雄蕊彎曲和縮短，導(dǎo)致雄蕊無法觸及雌蕊，而不能正常 授粉；此外，GmMADSl轉(zhuǎn)基因植株的花藥不能正常開裂，花粉的活力降低，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因 植株育性下降甚至完全不育。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)大豆MADS-box基因及其在花器官改造中的應(yīng)用及其在花器官改造中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。GmMADS1是定位于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，在四輪花器官中都有所表達(dá)，但花瓣和雄蕊中表達(dá)量較大，過量表達(dá)GmMADS1的煙草，增加了萼片、雄蕊和花瓣的數(shù)目，產(chǎn)生了萼片、雄蕊向花瓣的轉(zhuǎn)變，出現(xiàn)了開裂的花瓣和彎曲的雄蕊等，導(dǎo)致雄蕊無法觸及雌蕊，而不能正常授粉以及花藥不能正常開裂，花粉的活力降低。以上結(jié)果表明GmMADS1在花瓣位置和數(shù)目的確定以及雄性器官發(fā)育方面發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。利用GmMADS1基因獲得的花器官發(fā)生變異的新材料可用于農(nóng)作物和觀賞園藝植物的育種應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101805740SQ201010156259
公開日2010年8月18日 申請(qǐng)日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者喻德躍, 遲英俊, 黃方 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)