專利名稱：木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法及其在工業(yè)漂白領(lǐng)域的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物漂白材料領(lǐng)域，具體涉及一種利用綠色糖單胞菌來制備木聚糖酶 和木質(zhì)素過氧化物酶的方法及其在工業(yè)漂白領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
紙漿漂白是造紙工業(yè)中的一個必要環(huán)節(jié)。在化學或機械制漿過程中，約有90%的 木質(zhì)素可從木材或其他粗原料的纖維素纖維中除去，但仍殘留10%，這部分殘留的木質(zhì)素 會造成紙漿呈褐色，并降低紙張的強度(陳嘉川等，1999)。為了漂白紙漿必須去除殘余的 木質(zhì)素，傳統(tǒng)的方法是使用酸性漂白劑如氯氣、二氧化氯等來去除木質(zhì)素的化學漂白法，但 該方法會使造紙廢水中含有大量難降解的、有毒的、強烈致癌、致畸的有機氯化物，從而造 成環(huán)境的嚴重污染(馮文英等，2002)。為了解決該問題，必須改革漂白工藝，發(fā)展新的無污 染漂白技術(shù)。因此傳統(tǒng)含氯漂白法后來在很大程度上被近無氯漂白(ElementalChlorine Free, ECF)及全無氯漂白(total chlorine-free, TCF)所代替。ECF漂白極大減少了有機 氯化物的形成，但同時引起了其他化學藥品消耗的增加。如果在化學漂白之前，用木聚糖酶 和木質(zhì)素降解酶等酶制劑對紙漿進行預(yù)處理，就會使氯氣等化學漂白劑更好地滲透到紙漿 里面，從而大大減少化學漂白劑的用量(謝響明等，2003)。近年來國內(nèi)外對制漿生物技術(shù) 的研究方興未艾，其中利用微生物酶促漂白成為當今造紙工業(yè)中最有發(fā)展前景的研究課題 之一。采用酶制劑生物(預(yù))漂白，不但可降低紙漿Kappa值、適當提高紙漿的粘度和白度 等性能指標，而且可減少后續(xù)ECF或TCF化學藥品用量，降低漂白廢水的污染負荷(姚春麗 等，2003)。木聚糖(Xylan)是一種多聚五碳糖，是植物半纖維素的重要組分，它占植物碳 水化合物總量的三分之一，在自然界中是繼纖維素之后含量第二豐富的可再生物質(zhì)資源 (Katagiri等，2001)。木聚糖主要存在于植物細胞的次生壁中，處于木質(zhì)素及其他多聚糖 之間，起著連接作用。木聚糖是一種雜合多聚分子，主鏈由多個吡喃木糖基通過木糖苷鍵相 連。側(cè)鏈上連著多種不同大小的短的取代基，主要有0-乙?；?、4-0-甲基-D-葡糖醛酸殘 基、L-阿拉伯糖殘基等。這些側(cè)鏈與植物細胞中其他幾種結(jié)構(gòu)性多糖(如木質(zhì)素、纖維素、 果膠、葡聚糖等)以共價或非共價鍵連接，組成植物細胞重要的結(jié)構(gòu)-細胞壁。也正由于這 些側(cè)鏈的不同，使得木聚糖的結(jié)構(gòu)變化范圍很大，從僅由0-1，4_糖苷鍵連接的多聚木糖 線性分子到高度分枝的異質(zhì)多糖(Kavita等，2002)。木聚糖酶可將木聚糖降解成低聚糖和木糖。對木聚糖酶的研究早在60年代就已 開始，已經(jīng)從不同來源的微生物中分離到大量的不同類型、不同功能的木聚糖酶(謝響明 等，2004)。最近十幾年，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展和進步，特別是基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工 程技術(shù)的廣泛應(yīng)用后，對木聚糖酶的了解更加深入，木聚糖酶在飼料工業(yè)、制漿造紙工業(yè)、 食品工業(yè)、能源工業(yè)中都顯示出廣闊的應(yīng)用前景，已經(jīng)引起科學家們的廣泛關(guān)注(懷文輝 等，2000)。
狹義上的木聚糖酶即內(nèi)切_ 0 -1，4木聚糖酶。內(nèi)切_ 0 -1，4-木聚糖酶在許多生 物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域都存在著巨大的潛力。它們主要水解木聚糖主鏈骨架的0_1，4木糖苷鍵， 將含木聚糖的木質(zhì)素纖維素材料轉(zhuǎn)化為寡聚木糖和木二糖等，進而轉(zhuǎn)化為一系列具有極高 應(yīng)用價值的生物產(chǎn)品，如應(yīng)用于面包制造，啤酒和奶酪發(fā)酵等(姚春麗等，1998)。用于紙漿 生物預(yù)漂白的木聚糖酶制品主要也是指的內(nèi)切-0_1，4木聚糖酶。在木聚糖酶的活性中 心含有多個能與底物結(jié)合的亞位點，這些位點的結(jié)構(gòu)、大小、數(shù)量及它們與催化集團的空間 關(guān)系決定該酶對不同底物的親和力、專一性、作用方式及酶反應(yīng)的動力學參數(shù)(Iqbal等， 1994)。廣義的木聚糖酶是指能夠降解半纖維素木聚糖的一組酶的總稱，主要包括三類 (1)內(nèi)切-0-1，4-木聚糖酶(endo-P-ld-xylanases)，優(yōu)先在不同位點上作用于木聚糖 和長鏈木寡糖，從0-1，4_木聚糖主鏈的內(nèi)部切割木糖苷鍵，從而使木聚糖降解為木寡糖， 其水解產(chǎn)物主要為木二糖與木二糖以上的寡聚木糖，也有少量的木糖和阿拉伯糖。(2)外 切-0 -1，4-木聚糖酶(exo- 0 -1,4-xylanases)，作用于木聚糖和木寡糖的非還原端，產(chǎn) 生木糖。(3) 0 -木糖苷酶(0 -xylosidases)，該酶通過切割木寡糖末端而釋放木糖殘基 (Jonathan 等，2003)。不同來源的木聚糖酶其催化特性也有差異，主要體現(xiàn)在不同的最適反應(yīng)pH值和 熱穩(wěn)定性上。近年來，人們已從多種微生物中提取了木聚糖酶。最主要的工作集中在從細 菌和真菌中提取的木聚糖酶的酶學特性的研究方面。有關(guān)細菌的木聚糖酶的酶學特性在 國內(nèi)外已有較多的報道。其中研究工作進行較多的有假單孢菌(Pseudomonas)，諾卡氏菌 (Nocardia)，黃桿菌(Flavobacterium)，氣桿菌(Acromonas)，黃單抱菌(Xanthonona s)等 十多個屬的報道(Suren等，1997)。數(shù)據(jù)分析顯示，細菌所產(chǎn)木聚糖酶可大體分為兩類高 分子量的耐酸木聚糖酶和低分子量的耐堿木聚糖酶。但在真菌中卻沒有這種差別，不過低 分子量木聚糖酶的耐堿性卻是共同的。細菌產(chǎn)生的木聚糖酶蛋白質(zhì)亞基比較單一，分子量 范圍在8 145kDa。而真菌產(chǎn)生的木聚糖酶蛋白質(zhì)亞基則較復(fù)雜，分子量大小變化也較大。 對真菌木聚糖酶的研究主要集中在白腐真菌、曲霉和木霉上(Hakan等，2004)。無論是從真 菌中還是從細菌中，內(nèi)切型木聚糖酶最適溫度一般在40°C 60°C之間。一般細菌所產(chǎn)木聚 糖酶比真菌所產(chǎn)木聚糖酶熱穩(wěn)定性和好。另外，放線菌的一些屬尤其是鏈霉菌，也可以分泌 木聚糖酶，且具有較好的耐熱性和耐堿性而越來越受到人們的關(guān)注(Abdul等，1997)。不同 微生物所產(chǎn)木聚糖酶所能耐受的pH值范圍一般是3 10。最適pH值一般為4 7。不同 木聚糖酶的等電點變化范圍在3 10之間。大多數(shù)已被鑒定的木聚糖內(nèi)切酶在45-75°C之 間的溫度范圍表現(xiàn)出最高活性。只有少數(shù)分離純化后的細菌和真菌的木聚糖內(nèi)切酶在80°C 以上表現(xiàn)出最大活性。因為雜木聚糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，木聚糖降解酶類并不能打開所有的木聚 糖苷鍵，因此木聚糖的水解需要重疊但不同特性的多種微生物木聚糖酶共同作用(Timcer 等，1999)。由于木聚糖酶在天然材料中表達水平太低、難以大量生產(chǎn)，并且生產(chǎn)成本昂貴以 及木聚糖酶的一些酶活性不能完全滿足應(yīng)用相關(guān)條件。因此，木聚糖酶到目前為止，并沒有 得到廣泛的推廣應(yīng)用。隨著生物技術(shù)的不斷進步，人們希望通過基因工程和蛋白質(zhì)工程來 更加深入地研究木聚糖酶基因，并且研制出符合人們要求的木聚糖酶產(chǎn)品。運用基因工程 技術(shù)在分子水平上對木聚糖酶基因進行分子改造，可望解決一些木聚糖酶活性如抗逆性、
4PH值、熱穩(wěn)定性等的應(yīng)用缺陷，利用生物反應(yīng)器則有望成百上千倍地提高它的表達量。木聚 糖酶的基因工程研究已成為世界性的研究熱點之一。國際上的研究表明，放線菌中的某些菌株也可通過其分泌的胞外酶(木聚糖酶和 過氧化物酶)降解半纖維素和木質(zhì)素。1988年Ramachandra等首次報道放線菌-綠孢鏈霉 菌(Str印tomycesviridosporus)分泌的降解木質(zhì)素的過氧化物酶AliP_P3，并對酶進行初 步鑒定(Ramachandra等，1988)。Ball和McCarthy于1988年也曾報道可產(chǎn)生胞外木聚糖 酶和過氧化物酶、但無纖維素酶活性的放線菌(Ball等，1988)，1994年之后相繼報道其他 放線菌“如熱紫鏈霉菌(S. thermoviolacaceus)，除蟲鏈霉菌(S. avermilitis UAH30)，白 色鏈霉菌(S. albus)，褐色熱單孢菌(Thermomonospora fusca BD25)等可分泌熱穩(wěn)定性高 的木聚糖酶和過氧化物酶。木質(zhì)素(lignin)是一類由苯丙烷單元通過醚鍵和碳鍵連接而成、在植物界中僅 次于纖維素的最豐富和最重要的天然芳香族高分子聚合物，廣泛分布于具有維管束的高等 植物中，是裸子植物和被子植物特有的化學成分(Hammel K E，Jensen K A, Mozuch M D， et al.，1993)。木質(zhì)素在木質(zhì)纖維中除存在于初生細胞壁和次生細胞壁外，還包圍著纖維 素和半纖維素一起填充于微原纖維之間，與細胞壁多糖成分緊密結(jié)合，構(gòu)成一體，加強植物 組織的強度和硬度，同時防止過多的水分和有害物質(zhì)滲入細胞，對植物具有支持和保護作 用(程言君，1994)。研究表明，木質(zhì)素的完全降解是真菌、細菌及相應(yīng)微生物群落共同作用的結(jié)果。 自然界中，真菌被認為在木質(zhì)素的降解中起著主導(dǎo)作用(Higuchi T,1990 ；Ball A S，B Godden，P Helvenstein,et al.，1990)。根據(jù)真菌對木質(zhì)纖維素中不同組分的腐朽類型，可 將其分為白腐菌、褐腐菌和軟腐菌三類(Tuomela M.，Vikman M.，Hatakka A，etal. ,2000) 白腐菌、褐腐菌都屬于擔子菌綱(Basidiomycetes)，軟腐菌屬于囊菌綱(Ascomycetes)或 半知菌類(Fungi Imperfect)。許多研究者相繼發(fā)現(xiàn)細菌也具有分泌木質(zhì)素降解酶的功能，細菌能在加有純木 質(zhì)素的土壤中繁殖，并能夠緩慢降解該分子。其中起作用的細菌類主要是不動桿菌屬 (Acinetobacter sp.)、黃桿菌屬(Flavobacterium sp.)、微球菌屬(Micrococcussp.)、 假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)和黃單胞菌屬(Xanthomonas sp.)的菌株(Tuomela M.， Vikman M. Hatakka A，et al.，2000 ；Carol A C,1996 ；De Boer H A,Zhang Y Z,Collins C, et al.，1987 ；Nie G，ReadingN S，Aust S D，1998)。在這些細菌中，假單胞菌屬是最有效 的降解者(Lokesh K V，2001)。目前已肯定木質(zhì)素降解酶在細菌降解木質(zhì)素過程中的催化 作用，研究發(fā)現(xiàn)細菌能夠降解木質(zhì)素低分子量部分和木質(zhì)素的降解產(chǎn)物，因此推測它們可 能在木質(zhì)素降解的最后階段起作用，并且細菌降解木質(zhì)素發(fā)生在初級代謝階段，木質(zhì)素降 解酶的合成時間是在細菌生長的對數(shù)期和穩(wěn)定期(Nie G, Reading N S, Aust S D，1998)。放線菌不僅可以在初級代謝階段降解木質(zhì)素，在降解作用的初期使木質(zhì)纖維物質(zhì) 發(fā)生改性，也可在降解作用后期代謝真菌降解木質(zhì)素產(chǎn)生的低分子量物質(zhì)(Mohamed S A, Sami S，Ali G，1999)。放線菌在木質(zhì)素降解過程中通過增加木質(zhì)素的水溶性進而促進其 降解，同時由于能穿透木質(zhì)纖維素等不溶基質(zhì)，因而在中性、微堿性土壤或堆肥中，放線菌 也參與有機質(zhì)的初始降解和腐殖化(Tuomela M.，Vikman M.，Hatakka A, et al.，2000 ； George P C, Susan K K, Tawnya M B，2000)。
近年來國際上對放線菌中的鏈霉菌屬(Str印tomyces)假諾卡氏菌屬 (Pseudonocardia)中的一些菌株的研究表現(xiàn)出強烈關(guān)注(Alan C andDavid B ff, 1983 ； Joshua S,Diana I and David Bff et al.，1997)，一些菌株可產(chǎn)生熱穩(wěn)定的多種酶系，參與 降解木質(zhì)纖維素，其中鏈霉屬的絲狀菌降解木質(zhì)素最高可達20% (Tuomela M.，Vikman M.， HatakkaA, et al. , 2000) 0同時研究發(fā)現(xiàn)放線菌較之屬于擔子菌亞門的白腐真菌具有生長 迅速、營養(yǎng)條件簡單、不易污染、易于大規(guī)模應(yīng)用和產(chǎn)酶耐熱堿性強等特點(Antonopoulos VT, Hernandez M and Arias ME, et al. ,2001) 因此，放線菌對木質(zhì)的降解更具有商業(yè)價 值和潛力應(yīng)用，近年對其研究開始得到研究者的重視，但仍處于開始階段。自1934年Boruff和Buswell首次發(fā)現(xiàn)能降解木質(zhì)素的微生物種群后，人們對木 質(zhì)素的生物降解酶系進行了大量研究。1983年Glenn和Tien等同時發(fā)現(xiàn)白腐真菌中黃孢 原毛平革菌產(chǎn)生胞外過氧化物酶系一木質(zhì)素過氧化物酶(Lignin peroxidases)和錳過氧 化物酶(Manganese peroxidases)；日本的吉田首次在生漆中發(fā)現(xiàn)漆酶(Laccase) (Buswell J. A, E. Odier, 1985)。最終研究表明木質(zhì)素的生物降解主要酶系由這三種酶組成。木質(zhì)素過氧化物酶是代表一系列含F(xiàn)e3+、卟啉環(huán)(IX)和血紅素附基的同工酶，由 不同微生物產(chǎn)生的酶的種類和理化性質(zhì)各不相同。木質(zhì)素過氧化物酶是最先從黃孢原毛平 革菌(Phanerochaetechrysosporium)發(fā)現(xiàn)的木質(zhì)素降解酶，在木質(zhì)素降解中起關(guān)鍵性作 用，是降解木質(zhì)素的過氧化物酶的主要成分。木質(zhì)素過氧化物酶底物范圍比較廣，不但可以 氧化木質(zhì)素和木質(zhì)素模型物，還可以直接氧化具有高氧化還原電勢的甲基氧、酚類或非酚 類的芳香族化合物，以及一大類其它有機復(fù)合物。錳過氧化物酶的分子結(jié)構(gòu)與木質(zhì)素過氧化物酶相似，也是一種依賴H202帶有糖 基的胞外過氧化物酶，酶促反應(yīng)需要錳離子。錳過氧化物酶的主要產(chǎn)生菌多是一些白腐真 菌，屬擔子菌亞門，無隔擔子菌亞綱，無褶菌目的多孔菌科。錳過氧化物酶的特點是只能氧 化酚型木質(zhì)素，氧化苯酚的過程中，錳過氧化物酶在H202的啟動下，氧化Mn2+為Mn3+，然后 Mn3+氧化苯酚生成苯氧殘基。這與木質(zhì)素過氧化物酶氧化苯酚的方式有明顯不同(王海磊， 李宗義，2003)。漆酶是一類能有效降解木質(zhì)素纖維素，廣泛存在于多種植物和菌類的分泌物中的 生物酶。在真菌中，漆酶大多分布在擔子菌(Basidimycetes)、多孔菌(Polyporus)、柄孢殼 菌(Podospora)中(Duran N, Ferrer I，Rodriguez J, 1987)。近來,研究發(fā)現(xiàn)細菌也能產(chǎn) 生漆酶，如生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)，此外，在一些動物腎臟和血清中也發(fā) 現(xiàn)了漆酶(張甲耀，龔利萍，羅宇煊等，2002)。利用木聚糖酶的生物漂白研究雖然已經(jīng)進行了相當一定長的時間，但仍需要不斷 改進以適應(yīng)實際生產(chǎn)的要求。一般木聚糖酶中往往含有纖維素酶的活性。特別是內(nèi)切纖維 素酶的活性過高，會在酶處理過程中引起纖維強度、漿粘度下降，因此對酶源的選擇是十分 關(guān)鍵的。在近20年中，木聚糖酶的發(fā)展經(jīng)歷了酸性低溫酶(pH5_6，55°C )、偏堿性中溫酶 (pH8-9，65°C )及堿性耐高溫酶(pH9-10,70°C )三個階段(Milagres等，2004)。早期開發(fā) 的木聚糖酶最適PH值大多在酸性范圍內(nèi)，由于制漿漂白時必須調(diào)節(jié)漿料pH值，給操作帶來 不便。為了適應(yīng)堿法化學漿氧脫木質(zhì)素后紙漿的堿性高溫條件，最近幾年開發(fā)的木聚糖酶 一般是中性偏堿，最適作用溫度較早期也有提高。這樣的酶用于紙漿漂白時無需調(diào)節(jié)漿料的pH值和溫度，利于漂白操作，且在酶處理后，可將溶解在洗滌廢水中的木質(zhì)素、木聚糖等 提取后回收利用，從而降低廢水的色度及COD等(張勇等，2003)?？梢娧芯亢烷_發(fā)無纖維 素酶活性的耐熱耐堿性木聚糖酶具有十分重要的意義。對于一些造紙業(yè)非常發(fā)達的國家如 美國、加拿大、瑞典，大多以木材為主要原料，漿廠的規(guī)模大多數(shù)在每天數(shù)百噸，以生物途徑 代替或部分代替化學途徑進行紙漿漂白自七十年代開始就受到廣泛的青睞，而且近年來經(jīng) 改良的木聚糖酶制品的在造紙工業(yè)中的應(yīng)用已經(jīng)實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化(Qasim等，2000)。在我國， 用于生物漂白的微生物酶產(chǎn)品的研究最近十幾年才開始，基本上還限于對產(chǎn)木聚糖酶天然 優(yōu)良菌株的篩選、木聚糖酶純化及其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)的分析上，僅克隆了少數(shù)木聚糖酶基因，運 用基因工程手段產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)木聚糖酶產(chǎn)品還未見報道。因此，從優(yōu)良菌株胞外酶中篩選、分 離和鑒定適用于制漿漂白的耐堿耐熱木聚糖酶具有重要的意義。而木質(zhì)素過氧化物酶在生物技術(shù)及環(huán)境工程如生物制漿、生物漂白、土壤生物除 污等方面具有巨大的實際應(yīng)用潛力，研究者對其進行了大量的研究，但是，在實際應(yīng)用中存 在的諸如經(jīng)濟性、可行性及適應(yīng)性等方面問題依舊困擾著該酶的研究發(fā)展。首先，已報道的大部分木質(zhì)素過氧化物酶其性能不能滿足工業(yè)應(yīng)用的實際要求， 在制漿造紙工業(yè)中要求所用的酶制劑既耐熱又耐堿且不含纖維素酶活性，因此，優(yōu)良的產(chǎn) 木質(zhì)素過氧化物酶菌株極為重要。其次，目前木質(zhì)素過氧化物酶生產(chǎn)成本較高，其原因主要 是木質(zhì)素過氧化物酶生產(chǎn)菌株產(chǎn)量較低，急需提高菌株單位發(fā)酵酶活力，以解決酶的大規(guī) 模生產(chǎn)和工業(yè)化應(yīng)用等問題。再有，木質(zhì)素過氧化物酶酶制劑的酶學特性及應(yīng)用特點也是 實際應(yīng)用中所必需的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。目前，國內(nèi)外對產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶的菌種研究仍集中在真菌類，事實上木質(zhì)素 的降解轉(zhuǎn)化絕不僅僅是擔子菌作用的結(jié)果，許多放線菌及細菌的作用不容忽視。放線菌不 僅可以在初級代謝階段降解木質(zhì)素，在降解作用的初期使木質(zhì)纖維物質(zhì)發(fā)生改性，也可在 降解作用后期代謝真菌降解木質(zhì)素產(chǎn)生的低分子量物質(zhì)。而對放線菌產(chǎn)生的胞外酶研究主 要集中于木聚糖酶，在其中的木質(zhì)素過氧化物酶研究方面，僅有個別文獻報道其分泌產(chǎn)生 機制、發(fā)酵條件、部分提純和評估其在木質(zhì)纖維降解中的潛在用途，與白腐菌分泌的木質(zhì)素 降解酶研究相比，放線菌來源的木質(zhì)素過氧化物酶在其提純與鑒定、以及對木質(zhì)素的降解 分子機理方面研究報道較少(Sunna A and Antranikian G，1997)。對綠色糖單孢菌分泌胞 外酶類，尤其是木質(zhì)素過氧化物酶的報道國內(nèi)外尚未見報道，也未見對綠色糖單孢菌木質(zhì) 素過氧化物酶純化及特性研究。因此有必要對該菌木質(zhì)素過氧化物酶分泌的機制，酶的純 化和酶學特性等方面進行深入研究。本發(fā)明方法利用綠色糖單孢菌制備的木聚糖酶和木質(zhì)素過氧化物酶具有一定耐 堿耐熱性，能適應(yīng)工業(yè)漂白的要求，因此可以用于紙漿漂白效果研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供一種具有耐熱耐堿性的木聚糖酶及木質(zhì)素過氧化物酶 的制作方法，利用該方法制備的木聚糖酶及木質(zhì)素過氧化物酶可以適應(yīng)堿法化學漿氧脫木 質(zhì)素后紙漿的堿性高溫條件。實現(xiàn)上述目的本發(fā)明的技術(shù)方案為，木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法， 其特征在于，該制備方法包括以下步驟，(1)將綠色糖單孢菌菌種活化培養(yǎng)制得母液；(2)
7將(1)步制得的母液接種于含有誘導(dǎo)底物的誘導(dǎo)產(chǎn)酶桑塔斯培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；(3)將(2) 步制得的菌液離心后收集清夜，即得酶的粗提液；(4)將(3)步粗提液透析后進行層析和純 化得到木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶液。上述木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法中，步驟(1)中的母液的制備方法 是將4°C下保存的綠色糖單孢菌菌種，于無菌條件下挑取適量菌絲或孢子，接種于桑塔斯固 體培養(yǎng)基平面上，于45°C下培養(yǎng)72h，然后從上述活化培養(yǎng)后的綠色糖單孢菌中，在無菌條 件下挑取適量菌絲，接于150mL三角瓶裝的50mL液體桑塔斯培養(yǎng)基中，在45°C、120rpm條 件下振蕩培養(yǎng)3天作為母液。上述木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法中，所用桑塔斯培養(yǎng)基(STS)的組 成為大豆蛋白胨10. 0g,酵母粉2. 0g,酶水解酪素2. 0g,氯化鈉6. 0g,葡萄糖10. 0g,蒸餾水 1000.OmLo上述木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法中，步驟(2)中用于制備木聚糖酶 所用的誘導(dǎo)底物是下述之一棉紗、木聚糖、木聚糖和棉紗混合物、楊木粉、楊木粉和棉紗混 合物、松木粉或松木粉和棉紗混合物。上述木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法中，步驟(2)中用于制備木質(zhì)素過 氧化物酶所用的誘導(dǎo)底物是下述之一胡枝子、麥草、毛白楊、松木粉、麥草漿、粗木質(zhì)素、苯 甲醇、藜蘆醇、二四二氯苯酚或愈創(chuàng)木粉。上述木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法中，步驟(2)中，母液于接種含有 誘導(dǎo)底物的誘導(dǎo)產(chǎn)酶桑塔斯培養(yǎng)基時的接種量為2% (lmL/50mL)。上述木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法中，步驟(3)中，采用CM Sephadex C-50作為交換介質(zhì)，pH 6. 0磷酸緩沖液作為實驗緩沖液對粗提液進行陽離子交換層析。上述木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法中，可以將(1)步制得的母液接種 于含有誘導(dǎo)底物后進行發(fā)酵培養(yǎng)制得木質(zhì)素過氧化物酶。利用上述方法制備的木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶可以用于工業(yè)漂白領(lǐng)域。本發(fā)明的技術(shù)方案具有以下優(yōu)點，(1)本發(fā)明方法中利用綠色糖單胞菌所產(chǎn)的木 聚糖酶液中，其纖維素酶的活性較低，可以防止在酶處理過程中引起纖維強度、漿粘度的下 降；(2)利用本發(fā)明方法制備的木聚糖酶，具有一定的耐熱耐堿性，在pH 7.0下反應(yīng)表現(xiàn)最 高活性，同時在90°C下處理3h后酶活殘留達63. 55%,適應(yīng)工業(yè)條件的要求；(3)本發(fā)明方 法中還利用綠色糖單孢菌發(fā)酵大量生產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶液，并可以直接有效的攻擊木質(zhì) 素而產(chǎn)生漂白效果；(4)本方法利于綠色糖單孢菌所產(chǎn)的木質(zhì)素過氧化物酶，具有一定的 耐熱耐堿性，在PH7. 0 8. 0下反應(yīng)表現(xiàn)最高活性，同時在70 90°C下處理lh后酶活為原 來的61%，適應(yīng)工業(yè)條件的要求。


圖1是以STS培養(yǎng)基為對照針對不同誘導(dǎo)底物的產(chǎn)木聚糖酶活性分析結(jié)果；圖中，k、STS培養(yǎng)基；k+、誘導(dǎo)底物是棉紗的培養(yǎng)基；m、誘導(dǎo)底物是木聚糖培養(yǎng)基； m+、誘導(dǎo)底物是木聚糖和棉紗混合物的培養(yǎng)基；y、誘導(dǎo)底物是楊木粉培養(yǎng)基；y+、誘導(dǎo)底物 是楊木粉和棉紗混合物的培養(yǎng)基；s、誘導(dǎo)底物是松木粉培養(yǎng)基；s+、誘導(dǎo)底物是松木粉和 棉紗混合物的培養(yǎng)基。
圖2是以STS培養(yǎng)基為對照針對不同誘導(dǎo)底物的產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶活性分析結(jié) 果；圖3是發(fā)酵罐中綠色糖單孢菌菌體生長曲線；圖4是發(fā)酵過程中溶氧及pH變化曲線；圖5是發(fā)酵過程中接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶影響；圖6是發(fā)酵培養(yǎng)基中碳氮源比例對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響；圖7是攪拌速度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響；圖8是不同通氣量對產(chǎn)酶影響的結(jié)果；圖9是木聚糖酶的產(chǎn)酶時程；圖10是木聚糖酶的耐堿性分析結(jié)果；圖11是對三倍體毛白楊硫酸鹽漿進行生物漂白，分析漂后紙漿的白度、粘度變 化；圖12是對三倍體毛白楊硫酸鹽漿進行生物漂白，分析漂后紙漿的卡帕值變化；圖13紙漿Sav漂白后的白度和粘度變化；圖14紙漿Sav漂白后的卡帕值變化。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的技術(shù)方案進行具體描述，本發(fā)明所用的綠色糖單孢菌 (Saccharomonospora viridis (Schuurmans etal) Nonmura&0hara4. 1089)菌禾中購自中國禾斗 學院微生物研究所菌種保藏中心，為衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所從波蘭引進。下述實施方 式中所用材料均為市售可得。1. 1菌種的活化培養(yǎng)將4°C下保存的綠色糖單孢菌菌種，于無菌條件下挑取適量菌絲或孢子，接種于桑 塔斯固體培養(yǎng)基平面上，于45°C下培養(yǎng)72h。1. 2培養(yǎng)基的制備綠色糖單孢菌誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基為桑塔斯培養(yǎng)基加誘導(dǎo)底物。桑塔斯培養(yǎng)基(STS) 的成份為大豆蛋白胨10. 0g，酵母粉2. 0g，酶水解酪素2. 0g，氯化鈉6. 0g，葡萄糖10. 0g, 蒸餾水 1000. OmL。(固體培養(yǎng)基加瓊脂 15. 0 20. 0g/1000. 0ml)，pH 7. 2。產(chǎn)木聚糖酶的誘導(dǎo)底物是以下物質(zhì)之一棉紗(4cm2*3)、木聚糖8g、木聚糖和棉 紗混合物、楊木粉16g、楊木粉和棉紗混合物、松木粉16g、或松木粉和棉紗混合物。產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶的誘導(dǎo)底物是以下物質(zhì)之一胡枝子、麥草、毛白楊、松木粉、 麥草漿、粗木質(zhì)素、苯甲醇、藜蘆醇、二四二氯苯酚、愈創(chuàng)木粉。1. 3產(chǎn)酶培養(yǎng)基的篩選設(shè)置了 7種不同的誘導(dǎo)底物，同時以STS培養(yǎng)基作為對照。將接種后的產(chǎn)酶培養(yǎng) 基在45°C，120rpm條件下震蕩培養(yǎng)12h后，每間隔12h取樣，制備粗酶液測定木聚糖酶、纖 維素酶活性、木質(zhì)素過氧化物酶，確定在每種培養(yǎng)基的產(chǎn)酶高峰及最高酶活，篩選能誘導(dǎo)產(chǎn) 生活力較高的木聚糖酶而無纖維素酶活性、木質(zhì)素過氧化物酶的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基。1. 4母液及粗酶液的制備將活化培養(yǎng)后的綠色糖單孢菌在無菌條件下挑取適量菌絲，接于150mL三角瓶裝
9的50mL液體桑塔斯培養(yǎng)基中，在45°C、120rpm條件下振蕩培養(yǎng)3天作為母液。將制備好的 母液接種于誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，接種量為2% (lmL/50mL)。在45°C、120rpm下振蕩培養(yǎng)。取 培養(yǎng)好的菌液在4°C，10000g下離心8min，收集上清夜，即酶的粗提液，可于_20°C下保存?zhèn)溆谩?. 5綠色糖單孢菌發(fā)酵產(chǎn)酶最佳條件1. 5. 1發(fā)酵罐中綠色糖單孢菌菌體生長曲線及菌液光密度0D660在發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中，接種后每6h取樣，至發(fā)酵結(jié)束。以同條件下未接種培養(yǎng)液 為空白對照，培養(yǎng)時間為橫坐標，菌液的0D660吸光度值為縱坐標繪制綠色糖單孢菌在發(fā) 酵罐中的生長曲線。取定量培養(yǎng)液在3000r/min條件下離心lOmin，傾去清液，用蒸餾水洗滌菌絲體2 次，于105°C下烘干至恒重，測定綠色糖單孢菌在發(fā)酵罐中不同發(fā)酵時期菌體濃度。1. 5. 2最佳發(fā)酵條件探索在前面的實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，本組實驗采用桑泰斯培養(yǎng)基+麥草漿作為最佳誘導(dǎo)產(chǎn) 木質(zhì)素過氧化物酶培養(yǎng)基。將綠色糖單孢菌母液接種于該培養(yǎng)基中。根據(jù)溶氧、PH、接種 量、碳氮源比例、攪拌速度、通氣量確定了最適的產(chǎn)酶工藝條件。1. 6發(fā)酵后酶活及蛋白質(zhì)含量時程分析1. 7 結(jié)果1. 7. 1. 1產(chǎn)木聚糖酶最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基以STS培養(yǎng)基為空白對照，通過8種不同液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，誘導(dǎo)產(chǎn)酶結(jié)果如圖1 所示。7種加誘導(dǎo)底物的培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)酶結(jié)果與對照培養(yǎng)基相比，誘導(dǎo)產(chǎn)木聚糖酶的效果 均差別不大，其中楊木粉培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)木聚糖酶活最高，松木粉和棉紗混合物培養(yǎng)基次之， 分別為46. 89U/mL和45. 14U/mL,與空白對照(39. 62U/mL)相比無顯著差異。因此不能通 過產(chǎn)木聚糖酶活性的高低來篩選最佳誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基。同時從纖維素酶活性誘導(dǎo)結(jié)果可 知，酶活在0. 08U/mL到5. 47U/mL之間，與木聚糖酶的活性相比水平較低。其中松木粉和 棉紗混合物培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)纖維素酶活性為0.08U/mL，與空白對照(5.40U/mL)相比差異顯 著0.05)，而其他幾種培養(yǎng)基與空白對照相比并無顯著差異。綜合兩種酶活誘導(dǎo)結(jié)果 與適應(yīng)紙漿漂白實際應(yīng)用的要求，選擇該培養(yǎng)基為最佳誘導(dǎo)綠色糖單孢菌產(chǎn)木聚糖酶培養(yǎng) 基。1. 7. 1. 2產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶最佳培養(yǎng)基由圖2可以看出，與對照相比，胡枝子粉、麥草粉、毛白楊粉、松木粉、麥草漿等能 夠較好地促進三種木質(zhì)纖維降解酶的產(chǎn)生，其中麥草漿的誘導(dǎo)效果最好(LiP 0.27U/mL、 Xylanase 5. 14U/mL、Cellulase 1. lOU/mL)。而粗提木質(zhì)素，苯甲醇，藜蘆醇，2，4-DCP，愈創(chuàng) 木酚等對木質(zhì)纖維降解酶的產(chǎn)生并沒有明顯的促進作用。由此可見，相對于單一的木質(zhì)素 結(jié)構(gòu)類似物，木粉類物質(zhì)能更的促進木質(zhì)纖維降解酶的產(chǎn)生，其原因可能是由于在木粉 類物質(zhì)除了含有木質(zhì)素，纖維素，半纖維素等物質(zhì)外，還含有少量的樹脂、脂肪、蠟、可溶性 單寧、色素和灰分等，成分相對復(fù)雜，其中的一些組分能夠分別促進幾種降解酶的產(chǎn)生，幾 種酶有協(xié)同作用，而降解的中間產(chǎn)物又能夠?qū)ζ渌拿割惼鸬揭欢ǖ恼T導(dǎo)作用。1. 7. 2綠色單孢菌發(fā)酵產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶最佳發(fā)酵條件1. 7. 2. 1發(fā)酵罐中綠色糖單孢菌菌體生長曲線及菌液光密度0D660
如圖3結(jié)果顯示，綠色糖單孢菌在發(fā)酵罐中經(jīng)歷了大約5個小時的遲緩期后，很快 進入對數(shù)生長期，但隨著菌體生長、營養(yǎng)物質(zhì)消耗、代謝產(chǎn)物積累和pH等環(huán)境的變化，逐漸 不宜菌的生長，導(dǎo)致生長速率逐漸降低，發(fā)酵66小時后菌體進入穩(wěn)定期，此時菌體濃度達 到19. 08g/L。由圖3同時可以看出，菌液吸光值隨時間的變化趨勢與菌液濃度一致，說明菌 液濃度與吸光度值存在一定的正相關(guān)關(guān)系。因此，可用菌液吸光值替代綠色糖單孢菌的生 長曲線，根據(jù)吸光度值的變化判斷菌液所處發(fā)酵階段，準確的掌握發(fā)酵時間，此方法既簡便 又可減少人為誤差，對大規(guī)模生產(chǎn)意義非常重大。1. 7. 2. 2發(fā)酵過程中溶氧及pH變化對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖4所示，在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，由于綠色糖單孢菌為好氧微生物，在 生長過程消耗大量氧氣，致使發(fā)酵過程中溶氧參數(shù)(DO)在培養(yǎng)開始一段時間后持續(xù)明顯 下降，但適當?shù)臄嚢杷俣群瓦M氣量使DO都保持在35%以上，這基本保障了該菌株在好氧性 發(fā)酵產(chǎn)酶過程中細胞的快速生長繁殖以及酶產(chǎn)品合成等菌體代謝活動對溶氧的需求。發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH值變化可以大概分成3個階段，在第一階段可以看到pH在 逐漸降低，其原因可能是由菌體生長過程中對氮源的消耗以及利用碳源產(chǎn)生有機酸造成； 隨著發(fā)酵時間的增加，菌體進行初級代謝、次級代謝，胞外蛋白質(zhì)迅速增加，同時消耗氮源 而積累的銨物質(zhì)也導(dǎo)致pH的逐漸上升；而在產(chǎn)酶末期，pH及產(chǎn)酶量不再增加，延長產(chǎn)酶時 間可以發(fā)現(xiàn)，由于氮源的耗盡，菌體的死亡、自溶，大量堿性物質(zhì)的釋放又導(dǎo)致PH再次上 升。1. 7. 2. 3發(fā)酵過程中接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，加入不同比例種子液進行發(fā)酵，結(jié)果如圖5所示， 當接入菌液量為培養(yǎng)基加入量的10%時，菌體產(chǎn)酶量最高。接種量為5%時，由于發(fā)酵培 養(yǎng)基中菌體濃度過低，因而不利于菌體的大量繁殖，進而影響其產(chǎn)酶能力；相反，接種量為 15%時，菌體大量繁殖，導(dǎo)致培養(yǎng)基中氧氣含量及營養(yǎng)物質(zhì)迅速下降，菌體生長受到限制， 也不利于其產(chǎn)酶。1. 7. 2. 4發(fā)酵培養(yǎng)基中碳氮源比例對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖6所示碳氮比的大小不僅直接影響培養(yǎng)基的pH值，導(dǎo)致代謝途徑和代謝產(chǎn)物 發(fā)生變化，嚴重影響菌體的生長和產(chǎn)酶，同時也容易造成原料的浪費。以不同的碳氮比例進 行發(fā)酵，結(jié)果表明，在碳氮比為1 3時，菌體的產(chǎn)酶量最高，比未優(yōu)化前(C/N為1)相對酶 活性高出近70%，說明該菌產(chǎn)酶與碳營養(yǎng)的限制有關(guān)。1. 7. 2. 5攪拌速度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖7所示，在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm時，菌液溶 氧性相對較低，致使菌體生長較差，相對攪拌轉(zhuǎn)速250rpm條件下菌體延遲16小時進入穩(wěn)定 期，產(chǎn)酶的高峰期延長及酶活力下降；攪拌轉(zhuǎn)速為350rpm時，菌體生長相對較快，但同樣會 對菌絲體造成過大的剪切力，引起酶蛋白的變性失活，同時在高速攪拌情況下，發(fā)酵罐中的 泡沫增多，也不利于產(chǎn)酶；故選擇250r pm為最適攪拌轉(zhuǎn)速，一方面使得培養(yǎng)基中溶解氧增 加，另一方面使得營養(yǎng)物質(zhì)與菌體細胞均勻接觸，同時稀釋細胞周圍的代謝物，有利于細胞 新陳代謝。由此說明適當?shù)臄嚢杷俣群芎玫馗纳屏税l(fā)酵體系的溶氧情況，減少了不必要的 動力消耗及過多的強機械攪拌，從而避免了過量的氧和剪切作用對菌體生長和酶活力產(chǎn)生 不良影響。
1. 7. 2. 6通氣量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖8所示，發(fā)酵過程中，不同通氣量對產(chǎn)酶影響的結(jié)果如圖所示，通氣量為 2. 5L/min時，培養(yǎng)基中溶氧情況相對較差，菌體生長緩慢，導(dǎo)致產(chǎn)酶時間延遲，酶活性相對 較低；當通氣量增大到5L/min，發(fā)酵罐內(nèi)溶氧值可維持在35%以上，菌體生長較快較旺盛， 產(chǎn)酶高峰期也有所提前，酶活力提高；當通氣量繼續(xù)增大到7. 5L/min時，菌體產(chǎn)酶狀況均 無明顯改善，但發(fā)酵罐中泡沫很多。所以綜合考慮，通氣量選取5L/min較為合適，此條件 下，發(fā)酵罐內(nèi)的溶氧值能維持在35%以上水平，既不至于因通氣量過低使溶氧值迅速下降， 對菌體的生長造成影響，使菌體代謝積累，抑制酶的合成；又不會因通氣量過高使發(fā)酵罐產(chǎn) 生過多泡沫。1.7.3最佳發(fā)酵條件用16L發(fā)酵罐對綠色糖單孢菌進行了木質(zhì)素過氧化物酶的誘導(dǎo)發(fā)酵，確定了最適 的產(chǎn)酶工藝條件接種量為10%，碳氮源比為1 3，攪拌速度為250r/min，通氣量為5L/ min，通過控制通氣量和調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速，使溶氧維持在35%以上，此條件下綠色糖單孢菌較 搖瓶實驗提前將近24h達到產(chǎn)酶高峰，酶活最高可達0. 41U/mL。胞外酶活性時程分析綠色糖單孢菌產(chǎn)酶變化規(guī)律見圖9，在48h之前木聚糖酶酶活顯著增加，從48h起 活性增加速度緩慢，到156h時達到最大產(chǎn)酶高峰，酶活為45. 14U/mL，此產(chǎn)酶高峰比白色鏈 霉菌晚出現(xiàn)12個小時。從156h到192h，木聚糖酶活性急劇降低，在192h時降到整個產(chǎn)酶 時程的最低點(14. 62U/mL)。與此同時由結(jié)果可知，與木聚糖酶活相比，纖維素酶活性水平極低(0.08 2. 33U/mL)，其產(chǎn)酶高峰在96h時出現(xiàn)，比木聚糖酶提前了 60個小時。在156h木聚糖酶活 最高時，纖維素酶活性已經(jīng)降到一個非常低的水平(0. 52U/mL)，此時取樣的綠色糖單孢菌 胞外酶最為適合制漿漂白的應(yīng)用要求。2、綠色糖單孢菌母液及粗酶液的制備2. 1母液及粗提液的制備將活化培養(yǎng)后的綠色糖單孢菌在無菌條件下挑取適量菌絲，接于150mL三角瓶裝 的50mL液體桑塔斯培養(yǎng)基中，在45°C、120rpm條件下振蕩培養(yǎng)3天作為母液。將制備好的 母液接種于誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，接種量為2% (lmL/50mL)。在45°C、120rpm下振蕩培養(yǎng)。取 培養(yǎng)好的菌液在4°C，10000g下離心8min，收集上清夜，即酶的粗提液，可于_20°C下保存?zhèn)溆谩?. 2粗酶液的濃縮與提純2. 2. 1粗酶液的濃縮將離心后所得的粗酶液裝入透析袋中，置于70%甘油中透析4 6h，得到濃縮后 的粗酶液。2. 2. 2陽離子交換層析采用CM Sephadex C_50作為交換介質(zhì)，pH6. 0磷酸緩沖液作為實驗緩沖液。將溶 脹平衡好的介質(zhì)與酶液充分混勻吸附后裝柱(2X40cm層析柱)。分別用0. l，0.5，1.0mol 的NaCl溶液進行洗脫，用試管收集洗脫液，2mL/管，并利用紫外分光光度計檢測蛋白洗脫 峰，同時測定木聚糖酶活性，得到純化后的木聚糖酶液。濃縮與提純過程中的木聚糖酶檢測數(shù)據(jù)如表1所示。表1木聚糖酶純化數(shù)據(jù) 2. 3DNS法測定木聚糖酶與纖維素酶活性2. 3. 1木糖，葡萄糖標準曲線的制定用pH7. 0的磷酸緩沖液分別配制lmg/ml的木糖和葡萄糖溶液。取出10支25mL 的刻度試管，分別吸入0,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8，1. 0，1. 2，1. 4，1. 6，1. 8ml木糖(葡萄糖)溶液。 加入磷酸緩沖液，使每支試管的溶液體積為3ml。每支試管加入2mlDNS溶液，在沸水中反應(yīng) 5min,反應(yīng)后迅速冷卻至室溫。向試管中加入20ml水，在540nm測定溶液的吸光度，繪制標 準曲線。2. 3. 2酶活性的測定木聚糖酶和纖維素酶的活性測定采用DNS法(Miller等，1959)。用磷酸緩沖液 (PH7.0)配制的木聚糖溶液和CMC溶液分別作為木聚糖酶和纖維素酶的底物。在 25mL刻度試管中加入1. OmL底物，0. 2mL酶液和1. 8mL磷酸緩沖液，于60 □ C下水浴20min， 加入2mLDNS試劑，在沸水中煮5min，冷卻后加水至25mL，混勻后在540nm波長下測定其吸 光度。根據(jù)標準曲線法求得測試液中木糖或葡萄糖的量，按下式求得酶活性H= 1000DC/ (tMV)；上述公式中，H酶活(U/mL) ；D酶液稀釋倍數(shù)；C測試液中的木糖(葡萄糖)含量(mg/ mL) ；t反應(yīng)時間(min) ；M木糖(葡萄糖)分子量；V酶液體積(mL) ；1個酶活單位定義為每 分鐘催化lmg底物所需的酶量。2. 3. 3相關(guān)溶液的配制磷酸緩沖液(pH7)甲液39. 0ml,乙液 61. 0ml，混勻。甲液為 0. 2mol/LNaH2P04. H20 (27. 6g/1000ml)；乙液為 0. 2mol/LNa2HP04. 2H20 (35. 61g/1000ml)。DNS 試劑(3-5 二硝 基水楊酸試劑)酒石酸鉀鈉182. Og，溶解于500ml蒸餾水，加熱(不超過50 □ C)，于熱溶 液中依次加入3，5- 二硝基水楊酸6. 3g，氫氧化鈉21. Og,苯酚5. Og,無水硫酸鈉5. Og,攪拌 均勻至溶，冷卻后用蒸餾水定容至1000ml，儲存于棕色瓶中，室溫保存，7-10天后使用。2. 4木聚糖酶的耐堿性分析分別以pH3. 0 9. 0的寬范圍pH值緩沖液作為處理條件，測定木聚糖酶活，探索 其最適反應(yīng)PH值。2. 5木聚糖酶的木聚糖酶的耐堿性分析穩(wěn)定性分析采用正交設(shè)計法，將提取的粗酶液在50 90°C下處理不同時段，每5°C為一個梯 度。每個溫度處理的時段為0. 5 3h，每0. 5h為一個梯度，然后測定木聚糖酶活性，以其相 對于未經(jīng)處理的酶液活性的百分比為剩余酶活，分析該酶的熱穩(wěn)定性。2. 6 結(jié)果
2. 6. 1木聚糖酶的耐堿性分析綠色糖單孢菌分泌的木聚糖酶在pH3. 0 9. 0作用環(huán)境下所表現(xiàn)的酶活，結(jié)果如 圖10所示。木聚糖酶在pH3. 0 5. 0之間條件作用下所表現(xiàn)的活性變化不大而且酶活不 高，為10. 80U/mL 19. 73U/mL。在pH7. 0時反應(yīng)表現(xiàn)最高酶活，且與前相比顯著增加，達到 47. 35U/mL,在pH8. 0時也保持較高的酶活水平(44. 51U/mL)，但在pH8. 0 9. 0的堿性環(huán) 境下反應(yīng)，所表現(xiàn)的木聚糖酶活性與前相比急劇降低，在PH9. 0條件下反應(yīng)酶活僅為僅為 22. 50U/mL。由此實驗結(jié)果和前人所作的研究工作可以看出，與真菌及某些細菌分泌的酸性 木聚糖酶相比，綠色糖單孢菌分泌的木聚糖酶具有較好的耐堿性，該酶學特性符合制漿漂 白的堿性環(huán)境需要。2. 6. 2木聚糖酶的耐熱性分析按正交設(shè)計，綠色糖單孢菌分泌的木聚糖酶經(jīng)過不同溫度不同時間段的處理后， 結(jié)果如表2所示。在50 65°C條件下，處理時間的長短對木聚糖酶活性的影響不大，與未 處理的對照酶活相比，基本保持在初始酶活的90%以上。在70°C 75°C條件下，酶活隨處 理時間的增長略有降低，基本保持在初始酶活的80%左右。在75°C 85°C下，處理時間短 于2. 0h，剩余酶活在70%以上；處理時間為2. 0 3. Oh時，剩余酶活為初始酶活的65%以 上。在90°C下，處理時間短于1. 5h，酶活保持70%以上，處理1. 5 3. Oh時，剩余酶活為 60%以上。由此結(jié)果可知，在60°C 90°C的高溫環(huán)境下(此溫度范圍為實際制漿漂白工藝 環(huán)境的溫度范圍)，綠色糖單孢菌分泌的木聚糖酶在一定時間內(nèi)還保持較高活性，具有較好 的熱穩(wěn)定性。而且與白色鏈霉菌分泌的木聚糖酶相比，高溫下的耐熱性較好。表2木聚糖酶的耐熱性分析(％ )
mm
溫度 Temperature (°C ) Time (h) ____
0.51.01.52.02.53.05096.58a96.37a92.24a94.06a88.49a94.41a5590.65a98.98a96.22bc92.4 lab91.72ab95.19a6094.94a94.99a93.98abc88.24b99.46b93.19a6593.11a96.60ab88.06bcd89.78b77.17bc90.59a7082.10b85.60bc81.25bcde75.95c82.61cd76.17b7570.04bc78.56bc75.17cde71.67c68.59de68.89bc8074.55c85.37cd76.7 lde75.57c66.29de67.34bc8570.31c78.56cd72.04de71.57c65.39e68.67c9070.05c74.09d70.90e68.37c78.70e63.55d 3.綠色糖單孢菌胞外復(fù)合酶漂后紙漿性能檢測3.1紙漿制備速生三倍體毛白楊產(chǎn)自山西省臨汾地區(qū)，樹齡5年。切片后由實驗室15L電熱回 轉(zhuǎn)蒸煮鍋采用硫酸鹽法蒸煮獲得紙漿。制漿工藝條件見表3-1，所得三倍體毛白楊硫酸鹽漿 的將料性能如表3-2所示(于偉東，陳豪中，余惠生，1998)。表3-1制漿工藝條件
14 表3-2漿料性能 3. 2實驗儀器
表3-3實驗所用儀器
儀器名稱型號生產(chǎn)廠家冷凍離心機3K18Sigma(德國)紫外一可見分光光度計UV3802Unico (美國)酸度計F-20A北京屹源電子科技公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA上海亞榮生化儀器廠北歐標準粘度計—中國制漿造紙研究院球磨機—中國制漿造紙研究院油壓機ZQYC西貝輕工業(yè)學院機械廠紙樣抄取器ZQJ1-B西貝輕工業(yè)學院機械廠數(shù)字天平JA2003上海天平儀器廠電熱鼓風干燥箱101A-2上海申光儀器儀表有限公司數(shù)字白度測定儀YQ-Z-48B杭州輕通儀器開發(fā)有限公司智能型超級恒溫水槽ZC-18Q寧波市海曙天恒儀器廠電熱恒溫水浴鍋DK-S24上海精宏實驗設(shè)備有限公司恒溫磁力攪拌器JB-2上海雷磁新涇儀器有限公司3. 3實驗方法3.3. 1復(fù)合胞外酶漂白根據(jù)漂白漿濃計算所需加入的緩沖溶液量，將緩沖溶液與未漂紙漿在聚乙烯袋中 均勻混合后靜置30min，使紙漿實際pH值接近漂白設(shè)計的pH值。將Sav加入紙漿中并混 合均勻，同時加入大約0. lmmol/L的H202 (建立一個適宜木質(zhì)素過氧化物酶反應(yīng)的催化環(huán) 境)(林鹿，詹懷宇，2002)，置于設(shè)定好溫度的恒溫水浴中反應(yīng)，過程中每隔15min將聚乙烯 袋取出揉搓一次。至規(guī)定時間后將紙漿取出，用蒸餾水小心洗凈殘余酶液，在紙樣抄取器上CN 101857859 A說明書14/15 頁
抄成統(tǒng)一定量的漿片，自然風干后供漿料分析測試實驗使用。3. 3. 2后續(xù)化學漂白將漂白所需的化學漂劑加入根據(jù)漿濃得出用量的蒸餾水中，混合均勻后，一起倒 入裝有待漂紙漿的聚乙烯袋中，揉搓混勻，置于設(shè)定好溫度的恒溫水浴中反應(yīng)，過程中每隔 15min將聚乙烯袋取出揉搓一次。至規(guī)定時間后將紙漿取出，用蒸餾水小心洗凈殘余漂液， 經(jīng)PFI磨磨漿到設(shè)計打漿度后，在紙樣抄取器上抄成統(tǒng)一定量的漿片，自然風干后供漿料 分析測試實驗使用。3. 4漿料分析檢測3. 4.1 白度紙漿在ZQJ1-B型紙樣抄取器上抄片，待風干后，按照ISO標準在YQ-Z-48B數(shù)字顯 示白度儀上進行測定。3. 4. 2老化白度采用烘箱老化法，把已測定白度的漿片置于105°C的恒溫烘箱中，連續(xù)烘3h進行 老化，取出冷卻，在YQ-Z-48B數(shù)字顯示白度儀上測定。3. 4. 3 卡帕值按照GB/T1546-1989采用標準卡帕值法進行測定。3. 4. 4 粘度按照GB/T1548-1989采用銅乙二胺粘度法進行測定。3. 5實驗結(jié)果在預(yù)實驗中，固定其他四個主要影響因素(pH值、溫度、時間和漿濃)，設(shè)定Sav的 用量分別是lIU/g(絕干漿，下同)、10IU/g、50IU/g、100IU/g、200IU/g，同條件下對三倍體 毛白楊硫酸鹽漿進行生物漂白分析漂后紙漿的白度、卡帕值和粘度變化見表3-4和圖11， 圖12。表3-4分析漂后紙漿的白度、卡帕值和粘度變化結(jié)果
酶用量/ (IU/g)白度/%ISO卡帕值粘度 / (ml / g)132.613.011721032.812.811805035.911.7119510036.111.6119720036.011.61196從上述實驗可以看出，紙漿經(jīng)Sav漂白后卡帕值下降，紙漿白度升高，粘度也略有 提升。從圖11和圖12中可以看到，隨著Sav用量的增加紙漿的白度在酶用量低于50IU/ g時上升趨勢明顯；酶用量在50IU/g之后，白度不再有明顯的提升，這一點反應(yīng)在紙漿粘度 的變化上也有相同的趨勢。與此同時，漂后紙漿的卡帕值在酶用量50IU/g前，下降較為顯 著，脫木質(zhì)素效果明顯；在50IU/g之后，下降就比較平穩(wěn)，基本上不存在脫木質(zhì)素作用。說 明Sav漂白紙漿的用量應(yīng)在50IU/g以下，如果超過該用量，多余的胞外酶有可能會在漂白 反應(yīng)中失活，起不到漂白紙漿的作用。4.漂白紙漿的最佳酶用量
4.1實驗方法同3.34. 2實驗結(jié)果根據(jù)實驗得出的結(jié)論，將Sav漂白紙漿的用量限制在50IU/g以下，分別設(shè)定酶用 量為10貝/^(絕干漿，下同)、20貝/^、30貝/^、40貝/^、50貝/^，同條件下生物漂白三倍體毛 白楊硫酸鹽漿，分析漂后紙漿的白度、卡帕值和粘度變化，摸索出Sav漂白三倍體毛白楊硫 酸鹽漿的最佳酶用量，結(jié)果如表4-1和圖13、圖14所示。表4-1酶用量對漂白的影響 注其它漂白條件pH值7，溫度80°C，時間120min，漿濃10%，H202 0. lmmol/L。從圖13和圖14可以看出，經(jīng)Sav漂白后，紙漿的白度和粘度均有上升，卡帕值下 降。隨著Sav用量從10IU/g到50IU/g增加漂后紙漿白度在酶用量達到30IU/g之前時， 升比較明顯，從原漿的32. 6% ISO上升到35. 8% ISO,白度提升3. 2% ISO ；紙漿粘度從原 漿的1170mL/g上升到1194mL/g，上升2. 1%，趨勢也比較明顯；紙漿卡帕值在這一區(qū)間有明 顯下降，從原漿的13下降到11. 7，下降10%，說明Sav具有一定的脫木質(zhì)素作用，原因可能 是其中的木質(zhì)素過氧化物酶對中紙漿中木質(zhì)素有降解。當酶用量在30IU/g到50IU/g之間 時，漂后紙漿的白度和粘度均不再有明顯的上升，分別只提高了 0. 1% ISO和沒有變化；卡 帕值也基本保持不變，已經(jīng)不存在脫木質(zhì)素作用。說明Sav的用量超過30IU/g之后，對紙漿 不會再有明顯的提高白度和脫木質(zhì)素作用，再增加酶用量對紙漿漂白不會有較大改善，這 可能是由于多余的Sav在紙漿漂白過程中已經(jīng)失活，起不到漂白紙漿作用的緣故。此外，在 木聚糖酶漂白紙漿的過程中，木聚糖酶會優(yōu)先降解紙漿中部分低分子量的木聚糖，因此，經(jīng) 木聚糖酶漂白后的紙漿粘度會有一定程度的提升(69 Kantelinen et al,1993 ；Suurnakki et al，1994)，本實驗中Sav在30IU/g時，漂后紙漿的粘度較原漿上升了 2. 1%，這同時也驗 證了 Kantelinen和Suurnakki的觀點。所以，從在使用酶量最少的情況下使紙漿獲得最佳 的漂白效果這一原則出發(fā)，綜合上述實驗結(jié)論可以得出，選用30IU/g(以木聚糖酶活計)作 為Sav漂白三倍體毛白楊硫酸鹽漿的最佳酶用量是比較適宜的。上述技術(shù)方案僅體現(xiàn)了本發(fā)明技術(shù)方案的優(yōu)選技術(shù)方案，本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員 對其中某些部分所可能做出的一些變動均體現(xiàn)了本發(fā)明的原理，屬于本發(fā)明的保護范圍之 內(nèi)。
1權(quán)利要求
木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下步驟，(1)將綠色糖單孢菌菌種活化培養(yǎng)制得母液；(2)將(1)步制得的母液接種于含有誘導(dǎo)底物的誘導(dǎo)產(chǎn)酶桑塔斯培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；(3)將(2)步制得的菌液離心后收集清夜，即得酶的粗提液；(4)將(3)步粗提液透析后進行層析和純化得到木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法，其特征在于，步 驟(1)中的母液制備方法是將4°C下保存的綠色糖單孢菌菌種，于無菌條件下挑取適量菌 絲或孢子，接種于桑塔斯固體培養(yǎng)基平面上，于45°C下培養(yǎng)72h，然后從上述活化培養(yǎng)后的 綠色糖單孢菌中，在無菌條件下挑取適量菌絲，接于150mL三角瓶裝的50mL液體桑塔斯培 養(yǎng)基中，在45°C、120rpm條件下振蕩培養(yǎng)3天作為母液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法，其特征在于， 所用桑塔斯培養(yǎng)基(STS)的組成為大豆蛋白胨10. 0g，酵母粉2. 0g，酶水解酪素2. 0g，氯化 鈉6. 0g,葡萄糖10. 0g,蒸餾水1000. OmL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法，其特征在于，步 驟(2)中用于制備木聚糖酶所用的誘導(dǎo)底物是下述之一棉紗、木聚糖、木聚糖和棉紗混合 物、楊木粉、楊木粉和棉紗混合物、松木粉或松木粉和棉紗混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法，其特征在于，步 驟(2)中用于制備木質(zhì)素過氧化物酶所用的誘導(dǎo)底物是下述之一胡枝子、麥草、毛白楊、 松木粉、麥草漿、粗木質(zhì)素、苯甲醇、藜蘆醇、二四二氯苯酚或愈創(chuàng)木粉。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法，其特征在 于，步驟(2)中，母液于接種含有誘導(dǎo)底物的誘導(dǎo)產(chǎn)酶桑塔斯培養(yǎng)基時的接種量為2% (lmL/50mL)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法，其特征在于，步 驟(3)中，采用CM Sephadex C_50作為交換介質(zhì)，pH6. 0磷酸緩沖液作為實驗緩沖液對粗 提液進行陽離子交換層析。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法，其特征在于，也 可以將(1)步制得的母液接種于含有誘導(dǎo)底物后進行發(fā)酵培養(yǎng)制得木質(zhì)素過氧化物酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法，其特征在于，利 用上述方法制備的木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶可以用于工業(yè)漂白領(lǐng)域。
全文摘要
本發(fā)明公開了木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶的制備方法，該方法包括以下步驟(1)將綠色糖單孢菌菌種活化培養(yǎng)制得母液；(2)將(1)步制得的母液接種于含有誘導(dǎo)底物的誘導(dǎo)產(chǎn)酶桑塔斯培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；(3)將(2)步制得的菌液離心后收集清夜，即得酶的粗提液；(4)將(3)步粗提液透析后進行層析和純化得到木聚糖酶或木質(zhì)素過氧化物酶液。(1)步制得的母液也可接種于含有誘導(dǎo)底物后發(fā)酵培養(yǎng)制得木質(zhì)素過氧化物酶。本發(fā)明方法制備的木聚糖酶和木質(zhì)素過氧化物酶，其纖維素酶的活性較低，可以防止在酶處理過程中引起纖維強度、漿粘度的下降，且具有一定的耐熱耐堿性，并可以直接有效的攻擊木質(zhì)素和降解半纖維素，適用于工業(yè)生產(chǎn)上紙漿預(yù)漂白，且漂白效果良好。
文檔編號C12N9/08GK101857859SQ20101015619
公開日2010年10月13日 申請日期2010年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月27日
發(fā)明者丁夢璇, 何曉青, 吳玉英, 孫曉霞, 張勇, 楊暖, 樊軍, 潘文音, 謝響明 申請人:謝響明