專利名稱：：成花基因座t(ft)和經(jīng)遺傳修飾可調(diào)節(jié)開花的植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及植物遺傳工程，特別涉及具有可調(diào)節(jié)成花表型的遺傳工程植物，以及培育這些植物的方法。背景絕大多數(shù)種類的被子植物受環(huán)境刺激，如晝夜長(zhǎng)短和溫度，以及內(nèi)在因素如年齡的誘導(dǎo)而開花，有花植物的成熟組織由被稱作分生組織的幾類干細(xì)胞發(fā)育而來。每種分生組織的特性是由其發(fā)育而成的結(jié)構(gòu)決定的營(yíng)養(yǎng)分生組織發(fā)育成根和葉，花序分生組織發(fā)育成成花分生組織，成花分生組織發(fā)育成花器官如花萼和花瓣。不僅分生組織能夠產(chǎn)生具有不同特性的新的分生組織，而且它們自身特性在發(fā)育過程中也能改變。例如，營(yíng)養(yǎng)莖分生組織經(jīng)成花誘導(dǎo)后可轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄐ蚍稚M織，而且在一些植物種類中花序分生組織自身最終將轉(zhuǎn)變?yōu)槌苫ǚ稚M織。盡管分生組織的轉(zhuǎn)化在植物發(fā)育過程中具有重要意義，但對(duì)其中的機(jī)理了解很少。在植物發(fā)芽后，莖分生組織在其兩側(cè)產(chǎn)生一系列葉分生組織，然而，一旦經(jīng)成花誘導(dǎo)，莖分生組織會(huì)轉(zhuǎn)而產(chǎn)生花分生組織，成花分生組織產(chǎn)生花器官原基，原基進(jìn)而單獨(dú)發(fā)育成花萼、花瓣、雄蕊和心皮。這樣，花的形成可設(shè)想為一系列不同的發(fā)育階段，即成花誘導(dǎo)、花原基的形成、花器官的產(chǎn)生，已從多種植物中分離出中斷每一階段的突變體，這說明有整套遺傳體系在控制成花過程(見綜述，Weigel和Meyerowitz，“形態(tài)發(fā)生的分子基礎(chǔ)”(M.Bernfield編著)，發(fā)育生物學(xué)會(huì)第51屆年會(huì)，pp.93-107，紐約，1993)。最近通過對(duì)二種遠(yuǎn)緣雙子葉植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)和金魚草(Antirrhinummajus)的研究鑒定出三類同源基因，它們單獨(dú)或共同決定花組織特性(Bowman等，Development,112:1,1991；Carpenter和Coen等，GenesDevl.,4:1483,1990；Schwarz-Sommer等，Science,250:931,1990)。這些基因其中一些是轉(zhuǎn)錄因子，它們DNA結(jié)合的保守區(qū)已確定為MADS閱讀框(Schwarz-Sommer等，見上)。已經(jīng)鑒定早期啟動(dòng)的控制成花分生組織特性的基因，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)和金魚草(Antirrhinummajus)中成花分生組織是由花序分生組織發(fā)育而來，已經(jīng)知道二種因子參與控制分生細(xì)胞發(fā)育成為花。在擬南芥中，控制因子是LEAFY基因(Weigel等Cell69:843,1992)和APETALAl基因(Mandel等，Nature360:273,1992)的產(chǎn)物，當(dāng)這些基因中的一個(gè)突變失活后，花和花序的結(jié)構(gòu)和特性便形成(Weigel等見上；Irish和Sussex,PlantCell,2:741,1990)。在金魚草中，與擬南芥LEAFY基因同源的是FLORICAULA，與APETALAI基因同源的是SQUAMOSA(Huijser等，EMBOJ.,11:1239,1992)，這一對(duì)基因包含有MADS閱讀框區(qū)域。有花植物具有二種類型的花序構(gòu)成無序型的，其花序生長(zhǎng)不定，或有序型的，最終形成定型的花序。在這二個(gè)遠(yuǎn)緣種擬南芥的terminalflower1基因和金魚草的centroradialis基因突變體中，通常是無序型的花序轉(zhuǎn)變?yōu)橛行驑?gòu)型。金魚草的基因CENTRORADIALIS(CEN)和擬南芥的基因TERMINALFLOWER1(TFL1)表現(xiàn)出同源性，說明在這些植物中花序的無定型具有共同的遺傳機(jī)制。然而，與CEN基因不同的是，TFL1基因在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段也表達(dá)，這會(huì)推遲花序發(fā)育，從而影響花序分生組織形成的時(shí)間及其特性(見實(shí)施例，PCT/GB96/02276，詳見參考文獻(xiàn))。在植物生物
技術(shù)領(lǐng)域：
已成功構(gòu)建出包括一些主要作物在內(nèi)的基因工程植物，這些研究成果讓人振奮，其中通過改變植物基因而促使其提前開花是經(jīng)濟(jì)上所需要的，花誘導(dǎo)經(jīng)常是種植作物的制約因素。除地域因素外控制開花誘導(dǎo)最重要的因素之一是白晝的長(zhǎng)短，它隨季節(jié)的變化而變化。需要建立一種方法能人為控制和誘導(dǎo)植物開花而使其不受地域和環(huán)境條件的制約，這樣就能使作物在所需要的時(shí)間內(nèi)結(jié)實(shí)，由于大多數(shù)作物的果實(shí)(即種子，谷粒，水果)來源于花，因此能夠控制開花的方法具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值。概述本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)的一個(gè)調(diào)節(jié)植物開花的基因。這個(gè)基因定義為“開花基因座T”或“FT”，其功能是調(diào)節(jié)開花時(shí)間。在擬南芥中FT基因的過量表達(dá)導(dǎo)致開花明顯提前，而FT基因通過突變或反義失活喪失功能時(shí)會(huì)導(dǎo)致延遲開花。本發(fā)明第一實(shí)施方案是提供了FT多肽，其特征為通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定其分子量約20KD；基因位于擬南芥1號(hào)染色體上；功能是調(diào)節(jié)開花時(shí)間。FT多肽的一個(gè)示例性氨基酸序列見SEQIDNO:2。具有促進(jìn)開花活性的一個(gè)示例性FT多肽見SEQIDNO:4，特別是SEQIDNO:6。本發(fā)明還包括分離的編碼FT多肽的多聚核苷酸，編碼FT的一個(gè)示例性核苷酸序列見SEQIDNO:1。本發(fā)明又一實(shí)施方案是提供一個(gè)在基因組中至少含有一個(gè)外源核苷酸序列如編碼FT的核苷酸序列，并具有可調(diào)節(jié)成花特性的遺傳修飾植物。通過本發(fā)明的方法能抑制或促進(jìn)成花。本發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案是提供了一個(gè)構(gòu)建遺傳修飾的植物細(xì)胞方法，由該細(xì)胞發(fā)育而成的植物與野生株相比具有開花可調(diào)節(jié)的特性。該方法包括至少將本發(fā)明的編碼FT的多聚核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；在允許FT多肽表達(dá)的環(huán)境中使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞生長(zhǎng)從而生長(zhǎng)出開花可調(diào)節(jié)的植物。本發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案是提供一個(gè)培育具有提早成花的基因修飾植物的方法。該方法包括用一個(gè)含有至少含有編碼FT多肽的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列的質(zhì)粒導(dǎo)入植物細(xì)胞，并將結(jié)構(gòu)基因與一個(gè)啟動(dòng)子有效相連，從而獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞生長(zhǎng)出植株；篩選提早開花的植株。本發(fā)明又一實(shí)施方案是提供一個(gè)調(diào)節(jié)植物細(xì)胞成花的方法。該方法包括用一個(gè)含有至少含有編碼可調(diào)節(jié)成花FT多肽的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列的質(zhì)粒導(dǎo)入植物細(xì)胞，并將結(jié)構(gòu)基因與一個(gè)啟動(dòng)子相連以獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；在植株形成的條件下使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞生長(zhǎng)；在一定條件下誘導(dǎo)植物提早成花，并誘導(dǎo)一段時(shí)間后足以調(diào)節(jié)花的形成。調(diào)節(jié)花的形成包括加速或抑制其形成。本發(fā)明還包括提供一個(gè)含有阻斷或干擾開花定時(shí)基因(FT)表達(dá)的轉(zhuǎn)化基因的遺傳修飾植物，該轉(zhuǎn)化基因通過染色體插入到植物基因組中。本發(fā)明還包括培育具有延遲成花特性的植株的方法，該方法包括用一個(gè)含有一段核苷酸序列的質(zhì)粒導(dǎo)入植物細(xì)胞，該核苷酸序列至少包含有能阻斷或干擾FT多肽表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因，并將結(jié)構(gòu)基因與一個(gè)啟動(dòng)子相連以獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞生長(zhǎng)出植株；篩選具有延遲成花特性的植株。本發(fā)明還包括用包含有FT反義核苷酸序列或FT負(fù)顯性編碼核苷酸序列的質(zhì)粒替代能阻斷或干擾FT多肽表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因。本發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案是提供了一個(gè)鑒定調(diào)節(jié)FT活性或其基因表達(dá)的化合物的方法。該方法包括將包括該化合物和FT多肽或表達(dá)FT的重組細(xì)胞的組分在足以使這些組分相互作用的條件下溫育；確定該化合物對(duì)FT活性或表達(dá)的影響。該化合物可能抑制或刺激FT的活性或表達(dá)。本發(fā)明又一實(shí)施方案是提供一個(gè)鑒定模擬或抑制野生型FT活性或表達(dá)的FT多肽的方法。該多肽可用于替代野生型FT，以野生型作為對(duì)照以便確定該多肽對(duì)開花時(shí)間的影響。本發(fā)明又一實(shí)施方案是提供一個(gè)對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾的方法，由所述細(xì)胞長(zhǎng)成的植株與野生型相比具有能調(diào)節(jié)成花的特性，所述方法包括至少將編碼FT多肽的多聚核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞以便獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，在允許FT多肽表達(dá)的條件下使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞生長(zhǎng)，這樣培育出可調(diào)節(jié)成花的植株。在一個(gè)實(shí)施方案中，植株因表達(dá)FT和LFY而加速成花，在另一實(shí)施方案中，植株通過抑制FT表達(dá)而表達(dá)TFL1來抑制成花。該多聚核苷酸的表達(dá)或抑制表達(dá)二者可在其它任何多肽表達(dá)之前、實(shí)際上同時(shí)或之后進(jìn)行。圖1表示T-DNA載體插入的部分圖譜。對(duì)于質(zhì)粒pSKI083，如圖所示KpnⅠ片斷是從原始1733細(xì)胞株分離。該序列包含啟動(dòng)FT轉(zhuǎn)錄的基因組區(qū)、原始T-DNA插入的右邊界，以及來自原始激活標(biāo)記載體的CaMV35S增強(qiáng)子序列的四聚體。FT的外顯子用方框標(biāo)出，內(nèi)顯子用細(xì)線標(biāo)出。3’和5’端非翻譯區(qū)由陰影標(biāo)出，翻譯區(qū)由實(shí)心黑標(biāo)出。對(duì)于質(zhì)粒pSKI059和pSKI060，包含有FTcDNA的XbaⅠ/XhoⅠ片斷如圖所示，其起始位點(diǎn)與CaMV35S啟動(dòng)子有關(guān)，3’端nos序列見圖。+1表示轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)。圖2表示用于正義和反義構(gòu)建載體pSKI059(SEQIDNO:5)和pSKI060FT(SQEIDNO:3)的FTcDNA的核苷酸序列。由正義鏈翻譯而成的FT蛋白序列見DNA序列下面的氨基酸三字母代碼，載體序列有下劃線。圖3顯示FT蛋白與植物和哺乳動(dòng)物中相關(guān)蛋白的序列比較，氨基酸用單字母代碼表示。At-擬南芥；Am-金魚草；Rn-小鼠；Hs-人類.TFL1-TERMINALFLOWER1(Fradley等.,(1997),Science275,80-83)；CEN-CENTRORADIALIS(Bradley.等，(1996),Nature379,791-797)；E12A11-EST克隆(GenBank中的部分序列[編號(hào)AA042630]；全序列由Kardailsky&Weigel測(cè)定，未發(fā)表)；HCNP-海馬類乙酰膽堿神經(jīng)刺激多肽前體蛋白(Ojika等，(1992),BrainRes.572,164-171.(1992),BrainRes.572,164-171；Tohdoh等.,(1995),BrainRes.Mol.Brain.Res.30,381-384).圖3A表示排列的蛋白全氨基酸序列。在四行蛋白序列中同列至少有2個(gè)氨基酸出現(xiàn)才標(biāo)出，與共有序列不同的氨基酸用點(diǎn)標(biāo)出，缺失用水平破折號(hào)標(biāo)出。圖3B是依據(jù)全部五個(gè)基因編碼的蛋白序列的排列繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹。分支長(zhǎng)度反映了進(jìn)化距離，金魚草的CEN和擬南芥的TFL1是正調(diào)控蛋白(Bradley等.,(1996)同上；Bradley等.,(1997)同上)，而且其聚群在一起。圖3C表示出小鼠和人類的海馬類乙酰膽堿神經(jīng)刺激多肽前體蛋白與植物蛋白相對(duì)應(yīng)的區(qū)域。對(duì)海馬類乙酰膽堿神經(jīng)刺激多肽前體蛋白活性所必須的三個(gè)碳端氨基酸(Ojika等.,Neurosci.Lett.215,127-30)中有二個(gè)(脯氨酸-亮氨酸)和植物多肽中的相同，而前一個(gè)氨基酸在植物中是酸性氨基酸(天冬氨酸或谷氨酸)，在哺乳動(dòng)物中是甘氨酸。發(fā)明詳細(xì)說明本發(fā)明提供了一個(gè)編碼調(diào)節(jié)植物成花的多肽的基因。該基因即成花基因座T，定義為“FT”，可用于培育具有可調(diào)節(jié)成花表型特性的遺傳修飾植物，比如提早或延遲開花。這些植物能夠至少用編碼FT的結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行遺傳改造以便調(diào)節(jié)植物開花。多肽、多聚核苷酸和載體本發(fā)明提供了一種基本上純化的開花位點(diǎn)T(FT)多肽和編碼該多肽的多聚核苷酸。本發(fā)明的FT的特點(diǎn)是用SDS-PAGE鑒定其分子量為約20KD，位于擬南芥1號(hào)染色體上，具有調(diào)節(jié)成花時(shí)間的功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基本上純化的FT多肽。FT具有在SEQIDNO:2中所列的氨基酸序列?！盎旧霞兓边@個(gè)詞用在這里指多肽基本上不含有天然狀態(tài)下與之結(jié)合的其它蛋白、脂類、碳水化合物或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化技術(shù)能純化FT。基本上純化的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠電泳上產(chǎn)生一條主帶。FT多肽的純度還可以用氨基端氨基酸序列分析進(jìn)行鑒定。本發(fā)明包括與在SEQIDNO:2中所列出的氨基酸序列基本上一致的多肽或其中的功能片段，或者與SEQIDNO:2基本上相似的氨基酸序列?！盎旧弦恢隆被颉皩?shí)質(zhì)相似”意思是一個(gè)多肽或核苷酸與所述氨基酸或核苷酸序列至少有80％，較好的有85％，更好的有90％，最好的有95％的同源性。對(duì)于多肽，對(duì)照序列的長(zhǎng)度一般至少16個(gè)氨基酸，較好的至少有20個(gè)氨基酸，更好的至少有25個(gè)氨基酸，最好的至少有35個(gè)氨基酸。對(duì)于核苷酸，對(duì)照序列的長(zhǎng)度一般至少50個(gè)核苷酸，較好至少有60個(gè)核苷酸，更好至少有75個(gè)核苷酸，最好的至少可有110個(gè)核苷酸。與FT基本上具有相同序列的FT類似物例如可以用如圖3B所示的系統(tǒng)進(jìn)化樹鑒定，F(xiàn)T的類似物在進(jìn)化圖上可能比例如TFL1/CEN距離FT更近。功能片段包括那些保留FT功能或活性的FT片段。這種肽的一個(gè)例證見SEQIDNO:4，特別是SEQIDNO:6(來源于植物的多肽)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員運(yùn)用本文提供的實(shí)施例能選出這樣的功能片段，在該實(shí)施例中描述了全長(zhǎng)FT的功能(例如，見轉(zhuǎn)基因植物實(shí)施例3)。可以設(shè)想用同樣的方法鑒定出抑制或延遲開花的FT片段。“基本上相同”還指氨基酸序列的不同僅限于氨基酸保守置換，例如，氨基酸被另一同一族的氨基酸取代(例如纈氨酸取代甘氨酸，精氨酸取代賴氨酸等)，或在供測(cè)試的蛋白氨基酸序列中在不使其功能喪失的位置上的一個(gè)或多個(gè)非保守置換、缺失或插入(例如，如本文所述)。該序列在氨基酸水平上應(yīng)至少有85％與SEQIDNO:2同源，最好能夠完全一樣。同源性通常用序列分析軟件測(cè)定(例如，GeneticsComputerGroup公司的序列分析軟件包，威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心，學(xué)院路1710，麥迪遜，WI53705)，這種軟件通過對(duì)各種置換、缺失、替代或其它改變分配相似程度匹配相似序列?！盎旧霞兓亩嚯摹敝概cFT多肽已從天然狀態(tài)下與之伴隨的多肽中分離出來。典型地，多肽基本上純凈是指當(dāng)占其重量的60％不含有天然與之結(jié)合的蛋白和天然狀態(tài)下存在的有機(jī)分子。優(yōu)選地，這種分離至少占其重量的75％，更優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少99％的分子是FT多肽?；旧霞兓腇T多肽例如可以從天然原料(比如，植物細(xì)胞)中提??；通過編碼FT多肽的重組核苷酸的表達(dá)；或通過化學(xué)合成蛋白。純度可用任何適合的方法檢測(cè)，例如，如柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析所述方法。蛋白當(dāng)其從天然狀態(tài)下與其伴隨的污染物中分離出來時(shí)即為基本上不含有天然狀態(tài)下與其相關(guān)的成分。這樣，一種蛋白若是化學(xué)合成的或來自與之天然起源的細(xì)胞不同的細(xì)胞系統(tǒng)時(shí)，則基本上不含有其天然結(jié)合的成分，相應(yīng)地，基本上純化的多肽包括那些來源于真核生物但在大腸桿菌或其它原核生物表達(dá)的蛋白。對(duì)FT一級(jí)氨基酸序列的較小修飾所產(chǎn)生的蛋白，可以與本文所描述的沒有修飾的對(duì)應(yīng)多肽具有基本上相同的活性，這些修飾可能是有意引入的，如點(diǎn)突變，或者是自發(fā)的。所有由這些修飾產(chǎn)生的蛋白只要其FT的生物活性仍存在都包含于此。例如，本發(fā)明提供了具有FT多肽生物活性的肽段，一個(gè)FT肽段的例子見SEQIDNO:4(AADISQWAGPL)，詳見SEQIDNO:6(SINIRDPL)(分別見圖3C中RnHNCP和AtFT肽段序列；At-擬南芥；Rn-大鼠)本發(fā)明的多肽還包括沒有FT生物活性的FT多肽的負(fù)顯性形式(dominantnegativeform)，F(xiàn)T的“負(fù)顯性形式”指結(jié)構(gòu)與FT類似但沒有野生型FT功能的多肽。例如，負(fù)顯性的FT多肽可通過結(jié)合或通過屏蔽、調(diào)控因子干擾野生型FT的功能，而這些調(diào)控因子例如上游區(qū)或下游區(qū)成分，正常情況下與FT多肽功能相關(guān)。本發(fā)明提供了編碼FT蛋白的多聚核苷酸。這些多聚核苷酸包括編碼FT的DNA、cDNA和RNA序列，可以理解所有編碼FT的多聚核苷酸只要它們編碼具有FT活性的多肽都包括于此，這些多聚核苷酸包括天然存在的、合成的和人工操作獲得的多核苷酸。例如，F(xiàn)T多聚核苷酸可以被點(diǎn)突變。FT多核苷酸序列還包括反義序列，編碼FT負(fù)顯性形式的序列，以及編碼諸如象SEQIDNO:4，特別是SEQIDNO:6中的FT多肽。本發(fā)明的多聚核苷酸包括遺傳密碼的簡(jiǎn)并序列，有20中天然氨基酸，大多數(shù)有不只一種密碼子，因此，只要核苷酸序列編碼的FT多肽功能不變，本發(fā)明包括所有這樣的簡(jiǎn)并核苷酸序列。本文具體公開的是包含F(xiàn)T基因的多聚核苷酸序列。首選的FT核苷酸序列見SEQIDNO:1?！岸嗑酆塑账帷被颉昂塑账嵝蛄小敝钢辽儆?0堿基長(zhǎng)度的核苷酸多聚形式。所使用的術(shù)語“分離的多聚核苷酸”意思是不直接與天然存在的生物體的基因組中與其緊密相鄰的兩個(gè)(一個(gè)在5’端，一個(gè)在3’端)序列緊密相鄰。因此該術(shù)語包括并入載體的重組DNA；或并入能自我復(fù)制的質(zhì)?；虿《镜闹亟MDNA；或并入原核或真核生物的染色體DNA的重組DNA；或作為獨(dú)立于其它序列的單獨(dú)的分子(例如cDNA)。本發(fā)明的核苷酸可以是核糖核酸、脫氧核糖核酸或經(jīng)修飾的任何核苷酸形式，該術(shù)語包括單鏈和雙鏈DNA形式。正如以上所定義的那樣，“基本上相同”的核苷酸序列編碼基本上相同的氨基酸序列?！凹兓腄NA”或“分離的DNA”指的是不直接與天然存在的生物體的基因組中與其緊密相鄰的兩個(gè)(一個(gè)在5’端，一個(gè)在3’端)序列緊密相鄰。因此，該術(shù)語包括例如并入載體的重組DNA；或并入能自我復(fù)制的質(zhì)?；虿《镜闹亟MDNA；或并入原核或真核生物的染色體DNA的重組DNA；或作為獨(dú)立于其它序列的單獨(dú)的分子(例如cDNA，或通過PCR或者限制性酶切而獲得的染色體DNA片段)，還包括作為編碼額外多肽序列的雜交基因一部分的重組DNA。術(shù)語“基本上純化的DNA”指的是DNA不與一種基因側(cè)接，而這種基因在產(chǎn)生本發(fā)明的DNA的天然存在的生物體的基因組中與其側(cè)接。因此該術(shù)語包括，例如，并入載體的重組DNA；或并入能自我復(fù)制的質(zhì)?；虿《镜闹亟MDNA；或并入原核或真核生物的染色體DNA的重組DNA；或作為獨(dú)立于其它序列的單獨(dú)的分子(例如cDNA，或通過PCR或者限制性酶切而獲得的染色體DNA片段)，還包括作為編碼額外多肽序列的雜交基因一部分的重組DNA。編碼FT的多聚核苷酸包括SEQIDNO:1,FT的負(fù)顯性形式和與SEQIDNO:1互補(bǔ)的核苷酸序列?；パa(bǔ)序列可包括反義核苷酸。當(dāng)序列是RNA時(shí)，脫氧核糖核酸A、G、C和T分別被核糖核酸A、G、C和U取代。本發(fā)明還包括至少有15個(gè)堿基長(zhǎng)的上述核苷酸序列片段，這么長(zhǎng)的片段足以能在生理?xiàng)l件下與編碼SEQIDNO:2的蛋白或FT相近的家族成員的DNA選擇性雜交。術(shù)語“選擇性雜交”指在溫和條件下或排除非相關(guān)核苷酸序列的高度苛刻條件下雜交。在核苷酸雜交反應(yīng)中，用于獲得特定苛刻水平的條件根據(jù)雜交的核苷酸性質(zhì)而變化。例如，在選擇雜交條件時(shí)核苷酸雜交區(qū)的長(zhǎng)度、互補(bǔ)程度、核苷酸序列組成(例如，GC和AT含量)、核苷酸類型(例如，RNA還是DNA)都要考慮，另外還要考慮一條核苷酸是否被固定，例如固定在濾膜上。一個(gè)苛刻條件逐漸增高的的例子如下約室溫下2×SSC/0.1％SDS(雜交條件)；約室溫下0.2×SSC/0.1％SDS(低苛刻條件)；約在42℃下0.2×SSC/0.1％SDS(溫和苛刻條件)；和約在68℃下0.1×SSC(高苛刻條件)。只用這些方法中的一種，例如高苛刻條件進(jìn)行清洗，或可以用每種條件按上面所列的順序清洗，每種條件10-15分鐘，可重復(fù)所列的任何一種或所有步驟。然而，如上面所提到的，最佳條件有賴于進(jìn)行的特定雜交反應(yīng)而不同，而且可以通過經(jīng)驗(yàn)確定。本發(fā)明編碼FT多肽的核苷酸序列包括公開的序列和它的保守突變。用在本文的術(shù)語“保守突變”指氨基酸殘基被另一個(gè)生物功能相似的殘基取代。保守突變的例子包括一個(gè)疏水殘基如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸被另一個(gè)取代，或者一個(gè)極性殘基被另一個(gè)取代，例如精氨酸取代賴氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，谷氨酰胺取代天冬酰胺，以及類似取代。術(shù)語“保守突變”還包括用一個(gè)已取代的氨基酸代替一個(gè)沒被取代的親本氨基酸，條件是由取代的多肽產(chǎn)生的抗體仍能夠和沒被取代的多肽免疫反應(yīng)。編碼FT的DNA序列可以通過DNA轉(zhuǎn)移到合適的宿主細(xì)胞而體外表達(dá)?！八拗骷?xì)胞”指載體在其中能復(fù)制而且它的DNA能表達(dá)的細(xì)胞，細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞，該術(shù)語還包括宿主細(xì)胞的任何子代細(xì)胞。可以理解由于在復(fù)制過程中可能發(fā)生突變所有子代細(xì)胞和親本細(xì)胞可能不完全一樣，然而術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括這樣的子代細(xì)胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)移的方法，含義是外源DNA在宿主中連續(xù)存在，這一點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是已知的。在本發(fā)明中，F(xiàn)T多聚核苷酸序列可以插入到表達(dá)載體中，術(shù)語“表達(dá)載體”指質(zhì)粒、病毒或現(xiàn)有技術(shù)中已知的已經(jīng)進(jìn)行FT遺傳序列插入或并入操作的其它載體。編碼FT的多聚核苷酸序列可以有效連接到表達(dá)調(diào)控序列，“有效連接”指使描述的成分并置于能按照預(yù)想方式行使功能的位置，編碼序列之所以與表達(dá)調(diào)控序列有效相連，是為了編碼序列在與表達(dá)調(diào)控序列相容的條件下表達(dá)。在本文使用的術(shù)語“表達(dá)調(diào)控序列”指調(diào)節(jié)與之有效相連的一段核苷酸序列表達(dá)的核苷酸序列，表達(dá)調(diào)控序列一旦與一段核苷酸有效連接，它就控制和調(diào)節(jié)該核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和合適的翻譯。這樣，表達(dá)調(diào)控序列包括合適的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、位于蛋白編碼基因前面的起始密碼子(例如，ATG)、內(nèi)含子的剪接信號(hào)、維持正確的閱讀框以便允許基因的mRNA恰當(dāng)翻譯。術(shù)語“調(diào)控序列”設(shè)定為至少包括能影響表達(dá)的成分，還包括對(duì)表達(dá)有利的額外成分，例如引導(dǎo)序列和融合伴隨序列。表達(dá)調(diào)控序列可以包括啟動(dòng)子?！皢?dòng)子”指能指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的最小序列。在本發(fā)明中還包括那些使啟動(dòng)子依賴型基因的表達(dá)對(duì)于特定種類細(xì)胞和特定組織可控的啟動(dòng)元件，或表達(dá)可被外界誘導(dǎo)信號(hào)或試劑誘導(dǎo)；這些元件可位于基因的5’或3’區(qū)，組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子均包括于本發(fā)明中(見例如，Bitter等，1987,MethodsinEnzymology,153:516-544)。用于本發(fā)明結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)可以受多個(gè)啟動(dòng)子啟動(dòng)。盡管內(nèi)源啟動(dòng)子可以用于所感性趣的結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，但傾向于啟動(dòng)子是外源調(diào)控序列。對(duì)于植物表達(dá)載體，適合的病毒啟動(dòng)子包括CaMV病毒35SRNA和19SRNA啟動(dòng)子(Brisson等，Nature,310:511,1984；Odell，等，Nature,313:810,1985)；來自玄參花葉病毒(FMV)的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(Gowda，等，J.CellBiochem.,13D:301,1989)和FMV外殼蛋白啟動(dòng)子(Takamatsu，等，EMBOJ.,6:307,1987)?；蛘?，植物啟動(dòng)子，諸如來自二磷酸核酮糖羧化酶(ssRUBISCO)小亞基的光誘導(dǎo)啟動(dòng)子(Comzzi，等，EMBOH.,3:1671,1984；Broglie，等，Science,224:838,1984)；甘露糖合成酶啟動(dòng)子(Velten，等，EMBOJ.,3:2723,1984),仙人掌素合成酶(NOS)和章魚堿合成酶(OCS)啟動(dòng)子(攜帶有土壤根癌農(nóng)桿菌的根癌誘導(dǎo)質(zhì)粒并有植物活性)；乙烯誘導(dǎo)啟動(dòng)子，用乙烯或類似化合物如丙烯處理可增加其活性水平；熱休克啟動(dòng)子，例如大豆熱休克蛋白hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley，等，Mol.Cell.Biol.,6:559,1986；Severin，等，PlantMol.Biol.,15:827,1990)；也可使用乙醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子(Caddick，等，NatureBiotech.,16:177,1998)。本發(fā)明中有用的啟動(dòng)子包括組成型和誘導(dǎo)型的天然啟動(dòng)子，還有設(shè)計(jì)的啟動(dòng)子，CaMV啟動(dòng)子就是組成型啟動(dòng)子的一個(gè)例子。要達(dá)到最大效用，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子應(yīng)1〕在沒有誘導(dǎo)物的條件下低表達(dá)；2〕在誘導(dǎo)物存在時(shí)高表達(dá)；3〕其誘導(dǎo)機(jī)制不影響植物正常的生理活動(dòng)；和4〕不影響其它基因的表達(dá)。植物中有益的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子包括那些通過化學(xué)方法誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如酵母能被銅離子活化的金屬硫因啟動(dòng)子(Mett，等，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,90:4567,1993)；能被替代的苯磺胺藥物，如除草安全劑劑活化的In2-1和In2-2調(diào)節(jié)序列(Hershey，等，PlantMol.Biol.,17:679,1991)；被腎上腺皮質(zhì)類脂醇誘導(dǎo)的GRE調(diào)節(jié)序列(Schena，等，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,88:10421,1991)；以及乙醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子(Caddick.，等，同上)。其它啟動(dòng)子，包括組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，則是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。所選擇的特定啟動(dòng)子應(yīng)該能夠引發(fā)足夠的表達(dá)，從而使結(jié)構(gòu)基因表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到有效的含量，例如使FT引發(fā)提前成花或使反義引發(fā)延遲成花。本發(fā)明中用于載體構(gòu)建的啟動(dòng)子如果愿意可以被改變，這樣可以影響它們的調(diào)控特性。組織特異性啟動(dòng)子也可用于本發(fā)明，本文使用的術(shù)語“組織特異性啟動(dòng)子”作為啟動(dòng)子的一段DNA序列，例如調(diào)控一段特定的與啟動(dòng)子相連的DNA序列的表達(dá)，組織特異性啟動(dòng)子在特定細(xì)胞中影響特定的DNA序列表達(dá)，例如在植物的根或莖中。該術(shù)語還包括叫做“泄漏”啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子起初在一種組織中調(diào)節(jié)特定DNA序列表達(dá)，但在其它組織中也可引發(fā)表達(dá)。這些啟動(dòng)子還包括對(duì)表達(dá)必需的額外DNA序列，諸如內(nèi)含子和增強(qiáng)子序列。一個(gè)組織特異性分生組織的例子是在莖分生組織表達(dá)的HHA啟動(dòng)子(Atanassova，等，PlantJ.,2:291,1992)，其它對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物有用的組織特異性啟動(dòng)子包括cdc2a啟動(dòng)子和cyc07啟動(dòng)子，則是那些熟練的技術(shù)人員所知道的。(見例如，Ito，等PlantMol.Biol,24:863,1994；Martinez,Proc.Natl.Acad.SciUSA,89:7360,1992；Medford,PlantCell,3:359,1991；Terada,PlantJournal,3:241,1993；Wissenbach,PlantJournal,4:411,1993)。在花分生組織有活性的組織特異性啟動(dòng)子的例子是Jack，等，Cell,76:703,1994和Hempel，等，Development,124:3845,1997中表述的無花瓣3和無花瓣1基因，另外，也包括來自UFO基因的分生組織特異性啟動(dòng)子?？蛇x擇的標(biāo)記可隨意與異源核苷酸序列相連，即結(jié)構(gòu)基因可有效地與啟動(dòng)子相連。在本文使用的術(shù)語“標(biāo)記”指編碼一種特征或表型的基因，它允許含有該標(biāo)記的植物或植物細(xì)胞能被選擇或篩選。標(biāo)記基因可以是抗生素抗性基因，這樣使用合適的抗生素就能從沒有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選出轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，或者標(biāo)記基因可以是除草劑抗性基因。合適的可選擇的標(biāo)記的例子包括腺苷脫氨酶、二氫葉酸還原酶、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶、胸腺激酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸-核糖轉(zhuǎn)移酶、甘油磷酸鹽抗性和氨基-糖苷3’-O-磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(卡那霉素，新霉素和G418抗性)，其它合適的標(biāo)記則是本領(lǐng)普通技術(shù)人員已知的。本發(fā)明中用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以調(diào)節(jié)成花分生組織發(fā)育的載體包括至少一個(gè)編碼調(diào)節(jié)成花分生組織的蛋白的結(jié)構(gòu)基因，及與之相連的一個(gè)啟動(dòng)子。為了起始與本發(fā)明的轉(zhuǎn)化過程，首先需要構(gòu)建一個(gè)合適的載體并將它適當(dāng)?shù)貙?dǎo)入植物細(xì)胞，本文所使用的載體的構(gòu)建細(xì)節(jié)是植物基因工程技術(shù)人員所知道的。在本發(fā)明中，編碼調(diào)節(jié)成花分生組織發(fā)育蛋白的基因首選是FT基因。FT基因可以單獨(dú)使用，或和其它的結(jié)構(gòu)基因聯(lián)合使用，例如其它對(duì)成花進(jìn)程起重要作用的基因。這些基因的例子包括LEAEY(LFY),APETALA1(AP1),CONSTANS(CO),TERMINALFLOWER1(TFL1),FLORICAULA(FLO),SQUAMOSA(SQUA),FLOWERINGLOCUSCA(FCA)，以及將它們聯(lián)合使用。當(dāng)聯(lián)合使用時(shí)，應(yīng)該了解聯(lián)合的基因的表達(dá)可能先于、基本同時(shí)或遲于其它基因，應(yīng)該了解對(duì)于本文描述的所有方法和植物短語“至少(包含)FT基因”(atleastFT)或類似短語指使用一種或多種其他的成花基因，例如以上所列的那些或技術(shù)人員所知道的那些。例如，本發(fā)明中可以用Ti質(zhì)粒、根誘導(dǎo)(Ri)質(zhì)粒和植物病毒載體將異源核苷酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞。(這些技術(shù)的綜述見，例如，Weissbach&Weissbach,1998,MethodsforPlantMolecularBiology(植物分子生物學(xué)方法)，AcademicPress(科學(xué)出版社)，NY(紐約)，第SVⅢ節(jié)，pp.421-463；Grierson&Corey,1998,PlantMolecularBiology(植物分子生物學(xué))，第二版，Blackie，倫敦，7-9章，和Horsch，等，Science,227:1229,1985，在本文將二者一并參考)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠選擇合適的載體將異源核苷酸序列在相對(duì)完整的狀態(tài)下導(dǎo)入，這樣，只要載體使植物攜帶有導(dǎo)入的DNA序列就應(yīng)該足夠了，可以預(yù)測(cè)即使是裸DNA片段也有本發(fā)明中所描述的特性，盡管其轉(zhuǎn)化效率低下。載體的選擇，或者是否使用載體，通常是由所選擇的轉(zhuǎn)化方法所定。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化本質(zhì)上可以通過那些植物分子生物學(xué)熟練技術(shù)人員所知道的各類方法中的任何一種來完成。(見例如，MethodsofEnzymlogy(酶學(xué)方法)，Vol.153,1987,Wu和Grossman.編，AcademicPress(科學(xué)出版社)，在本文一并參考)。本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”意思是通過導(dǎo)入異源核苷酸序列改變宿主植物的表型?！稗D(zhuǎn)化”指將外源多聚核苷酸插入宿主細(xì)胞，不論采用何種方式插入，例如直接吸收、轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因槍或電穿孔。外源多聚核苷酸可以保持為非整合的載體狀態(tài)，例如質(zhì)粒，或者是另外一種狀態(tài)，即整合到宿主基因組中。一種方法叫做直接轉(zhuǎn)化，包括吸收和質(zhì)?；蚓€性化DNA整合到植物原生質(zhì)體基因組中，原生質(zhì)體即去除細(xì)胞壁材料的單個(gè)細(xì)胞(Lorz，等，Mol.Genet,199:178-182)。另一種方法包括將外源噬菌體或質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入發(fā)育的花粉顆粒以改變植物性狀。當(dāng)成熟的花粉顆粒形成花粉管時(shí)，細(xì)胞壁材料沉積在生長(zhǎng)點(diǎn)的后面。第三種方法依賴于土壤農(nóng)桿菌的侵染，它將質(zhì)粒即Ti-質(zhì)粒序列插入到植物細(xì)胞的基因組中(Chilton，等，1977,Cell11:263-271)。外源核苷酸能利用帶有Ti-質(zhì)粒的土壤根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)導(dǎo)入植物細(xì)胞，在使用土壤農(nóng)桿菌培養(yǎng)基作為運(yùn)載體時(shí)，最方便的是使用非致瘤的農(nóng)桿菌種類作為載體傳遞體，以便可能區(qū)分正常非致瘤的轉(zhuǎn)化組織。而且農(nóng)桿菌首選地帶有二元Ti質(zhì)粒系統(tǒng)，這種二元系統(tǒng)包括1〕第一個(gè)質(zhì)粒含有一個(gè)毒力區(qū)，它對(duì)于將轉(zhuǎn)移的DNA(T-DNA)導(dǎo)入植物是必須的，2〕嵌合質(zhì)粒。后者至少包含一個(gè)位于所要轉(zhuǎn)移的核苷酸二側(cè)野生型，后者至少包括一個(gè)位于所要轉(zhuǎn)移核苷酸二側(cè)野生型Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)的一個(gè)邊界區(qū)，二元Ti質(zhì)粒系統(tǒng)已表明能有效轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞(DeFramond,Biotechnology,1:262,1983；Hoekema，等，Nature,303:179,1983)，首選這樣的雙重系統(tǒng)是因?yàn)樗谵r(nóng)桿菌中不需要整合到Ti質(zhì)粒中。涉及使用農(nóng)桿菌的方法包括，但不只限于1〕將培養(yǎng)分離的原生質(zhì)體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)；2〕用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織；或者3〕用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化種子、莖尖或分生組織。此外，基因轉(zhuǎn)移可以通過如Bechtol等人所描述的農(nóng)桿菌原位轉(zhuǎn)化完成，(C.R.Acad.Sci.Paris,316:1194,1993)，該方法依據(jù)農(nóng)桿菌細(xì)胞懸浮液真空滲入。將異源核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞首選的方法是用以上描述的轉(zhuǎn)化的土壤根癌農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞、外植體、分生組織或種子，在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知道的合適的條件下，轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞長(zhǎng)成莖、根，并發(fā)育成植株。本發(fā)明首選的質(zhì)粒包括含有編碼FT蛋白異源核苷酸序列的二元Ti質(zhì)粒系統(tǒng)，這種質(zhì)粒至少包含編碼另一個(gè)成花因子的核苷酸序列，例如LEAEY(LFY),APETALA1(AP1),CONSTANS(CO),TERMINALFLOWER1(TFL1),FLORICAULA(FLO),SQUAMOSA(SQUA),FCA，以及將它們聯(lián)合使用?；蛘撸梢允褂脙蓚€(gè)質(zhì)粒，其中每個(gè)質(zhì)粒包含至少一個(gè)外源核苷酸序列，在這些核苷酸聯(lián)合表達(dá)的細(xì)胞中，第一個(gè)核苷酸的表達(dá)可能先于、基本同時(shí)或后于第二個(gè)核苷酸序列的表達(dá)。其它成花基因可以類似的方法用于構(gòu)建一個(gè)或多個(gè)載體?；蛘?，異源核苷酸可以通過機(jī)械或化學(xué)方法與植物細(xì)胞接觸導(dǎo)入植物細(xì)胞。例如，核苷酸通過使用顯微吸管直接微量注射到植物細(xì)胞而進(jìn)行機(jī)械轉(zhuǎn)移，或者核苷酸可通過使用聚乙二醇轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，聚乙二醇與遺傳物質(zhì)形成沉淀能被細(xì)胞吸收。異源核苷酸還可以用電擊法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Fromm，等，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,82:5824,1985，在本文一并參考)。在該技術(shù)中，在有包含相關(guān)核苷酸序列的載體或核酸存在下對(duì)植物原生質(zhì)體電擊，高場(chǎng)強(qiáng)的電沖擊波可逆性地穿透質(zhì)膜將核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞，經(jīng)電擊的植物原生質(zhì)體重新形成細(xì)胞壁，分裂并形成植物愈傷組織，帶有轉(zhuǎn)化基因的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的篩選可以通過使用本文描述的表型標(biāo)記來完成。將核苷酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞的又一種方法是將帶有需要導(dǎo)入的核苷酸的微粒高速子彈打入，核苷酸可包在微粒的矩陣中，或在其表面(Klein，等，Nature327:79,1987)，盡管典型地只需要一個(gè)新的核苷酸序列的單一導(dǎo)入，但該方法尤其能進(jìn)行多重導(dǎo)入。花椰菜花葉病毒(CaMV)也可以用作載體將異源核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞(美國專利No.4,407,956).CaMV病毒DNA基因組插入親本細(xì)菌質(zhì)粒構(gòu)建成的重組DNA分子可以在細(xì)菌中繁殖，克隆后，重組質(zhì)粒可以在此克隆并通過引入想要的核苷酸序列進(jìn)行進(jìn)一步修飾，重組質(zhì)粒經(jīng)修飾的病毒部分接著從親本細(xì)菌質(zhì)粒上切下來，用于接種植物細(xì)胞或植物。培育遺傳修飾植物的方法在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)構(gòu)建遺傳修飾的植物細(xì)胞的方法，由該細(xì)胞發(fā)育而成的植物與野生株相比具有開花可調(diào)節(jié)的特性。該方法包括至少將本發(fā)明中編碼FT的多聚核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞得到轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，并在允許FT多肽表達(dá)的環(huán)境中使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞生長(zhǎng)從而生長(zhǎng)出開花可調(diào)節(jié)的植物，術(shù)語“可調(diào)節(jié)”指加速成花，或抑制或延遲成花。加速成花可通過誘導(dǎo)或增加FT基因的表達(dá)或FT多肽活性實(shí)現(xiàn)。本文描述了本發(fā)明方法中有用的編碼FT多肽的載體，例如，在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子的調(diào)控下FT基因的表達(dá)可用于使FT表達(dá)量增加到高于野生型植株的水平。同樣，抑制成花可通過抑制植物中FT基因表達(dá)或FT多肽活性實(shí)現(xiàn)。例如，F(xiàn)T反義或FT負(fù)顯性核苷酸序列可用于抑制FT基因表達(dá)。而現(xiàn)有例證表明成花調(diào)節(jié)基因(FT)的組成型表達(dá)引起加速成花，反義核苷酸的表達(dá)可用于抑制或延遲成花，該系統(tǒng)能被修改以便成花可以被負(fù)顯性多肽抑制。例如，F(xiàn)T或其它花調(diào)節(jié)基因的負(fù)顯性變型可以組成型表達(dá)，負(fù)顯性的突變蛋白有效干擾正常內(nèi)源蛋白的功能，這樣，基因的行為不通過使結(jié)構(gòu)基因本身或其RNA失活就可以被阻斷，這種方法已成功用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和轉(zhuǎn)錄因子(例如，Attardi，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:10563,1993；Lloyd，等，Nature,352:635,1991；Logeat，等，EMBOJ.,10:1827,1991；Mantovani，等，J.Biol.Chem.,269:20340,1994；Ransone，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:3806,1990；Richardson，等，Mech.Dev.,45:173,1994:Tsai,GenesDev.,6:2258,1992；Thomas,NatureGenetics,17:58,1997；Wittbrodt,J.AndRosa,F.,GenesandDevelopment,8:1448,1994；Kashles等，Mol.Cell.Biol.,U:1454,1991；Pierce&Kimelman,Development,121:755,1995)。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一個(gè)培育具有成花分生組織發(fā)育可調(diào)節(jié)特性的遺傳修飾植物，包括用載體與植物細(xì)胞相連，該載體包含至少一個(gè)編碼FT多肽結(jié)構(gòu)基因的異源核苷酸相連，并將其與啟動(dòng)子相連以獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞種植植株；篩選表現(xiàn)成花分生組織發(fā)育可調(diào)的植株。本文所用的術(shù)語“相連”指將載體導(dǎo)入植物細(xì)胞的任何方式，包括以上描述的化學(xué)和物理方式。首選的“相連”是指通過以上描述的用異源核苷酸轉(zhuǎn)化的土壤根癌農(nóng)桿菌將核苷酸或載體導(dǎo)入植物細(xì)胞(包括外植體、分生組織或種子)。一般地，植物細(xì)胞在轉(zhuǎn)化過程中再生獲得整個(gè)植株。轉(zhuǎn)化的直接產(chǎn)物是指“轉(zhuǎn)基因體”。用在本文的術(shù)語“種植”或“再生”意思是由一個(gè)植物細(xì)胞、一群植物細(xì)胞、植物的一部分(包括種子)或植物碎片(例如原生質(zhì)體、愈傷組織或植株塊)。本文所用的植物細(xì)胞包括藻類、藍(lán)細(xì)菌、種子、培養(yǎng)懸液、胚芽、分生組織區(qū)、葉、根、莖、配子體、孢子體、花粉和小孢子，沒有限制。原生質(zhì)體再生依植物種類不同而不同，但一般首先制得原生質(zhì)體懸液，對(duì)于某些種類的植物，接著從原生質(zhì)體懸液誘導(dǎo)形成胚，直至象天然胚一樣到成熟和發(fā)芽階段。培養(yǎng)基一般含生長(zhǎng)和再生所必需的各種氨基酸和激素，使用激素的例子包括生長(zhǎng)素和分裂素，有時(shí)在培養(yǎng)基中添加谷氨酸和脯氨酸，尤其是對(duì)于谷類和苜蓿是有利的。有效的再生依賴于培養(yǎng)基、基因型和培養(yǎng)過程。如果這些可變因子都得到控制，再生是可重復(fù)的。再生也可以來自植物愈傷組織、外植體、器官或它的一部分，轉(zhuǎn)化可以在器官或植物的一部分再生過程中進(jìn)行。(見酶學(xué)方法(MethodsinEnzymology),Vol118和Klee，等，AnnualReviewofPlantPhysiology,38:467,1987)。利用Horsch，等，Science,227:1229,1985的葉盤一轉(zhuǎn)化一再生方法，葉盤在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，接著在大約2-4周后莖形成，形成的莖從分生組織上切下移植到生根選擇培養(yǎng)基中，根出現(xiàn)后盡快將生根的幼苗移植到土壤中，幼苗如需要可再換盆直至生長(zhǎng)成熟。對(duì)于無性繁殖的作物，成熟的轉(zhuǎn)基因植物可通過用切塊或者組織培養(yǎng)技術(shù)培植多個(gè)相同的植株，篩選想要的轉(zhuǎn)基因體并獲得新的變種，并無性繁殖用于商業(yè)。對(duì)于種子繁殖的作物，成熟的轉(zhuǎn)基因植株可自交產(chǎn)生同型雜交植株，雜交植株結(jié)出的種子含有新導(dǎo)入的外源基因，這些種子長(zhǎng)成的植株會(huì)具有并選擇的表型，例如提早成花。取自再生植株的一部分，例如花、種子、葉、枝、果實(shí)以及諸如此類，只要這些部位含有所描述的已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，均包含于本發(fā)明中。再生植株的子代和變異體以及突變體，只要這些部位含有導(dǎo)入的核苷酸序列，也包含于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。成花可調(diào)節(jié)的植株可以通過肉眼觀測(cè)篩選。本發(fā)明包括使用本發(fā)明的方法培植的植株，這包括來自遺傳修飾植株的植物組織、種子和其它植物細(xì)胞。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)在植物細(xì)胞中調(diào)控成花分生組織發(fā)育的方法，包括如以上描述的將載體與植物細(xì)胞相連以獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，在植物生長(zhǎng)的條件下培植轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，在植物中條件成花分生組織的發(fā)育。本發(fā)明的方法需要有與結(jié)構(gòu)基因相連的啟動(dòng)子序列，當(dāng)需要成花誘導(dǎo)時(shí)啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。例如，按照上述方法培植出植物細(xì)胞或植株，通過與編碼FT的核苷酸序列相連的啟動(dòng)子與合適的誘導(dǎo)物接觸誘導(dǎo)可調(diào)節(jié)成花分生組織的形成，這些誘導(dǎo)型啟動(dòng)子上面已經(jīng)描述，并包括那些首選用化學(xué)方法誘導(dǎo)的啟動(dòng)子?！稗D(zhuǎn)化”意思是將新的DNA(即對(duì)于細(xì)胞來說是外源DNA)并入細(xì)胞而導(dǎo)致細(xì)胞屬性的改變。當(dāng)細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，屬性改變一般可通過將DNA導(dǎo)入細(xì)胞基因組來實(shí)現(xiàn)(即穩(wěn)定型的)?！稗D(zhuǎn)化的細(xì)胞”意思是通過重組DNA技術(shù)已將編碼FT的DNA分子導(dǎo)入其中的細(xì)胞，用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可通過常規(guī)技術(shù)，以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知道的方法完成?？贵w本發(fā)明的FT多肽可用于制備抗體，抗體有免疫活性或者和FT多肽表位結(jié)合?？贵w必須由具有不同表位特性的單克隆抗體總和組成，同時(shí)提供獨(dú)特的單克隆抗體制品。制備單克隆抗體對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是熟知的，見，例如，Green等，單克隆抗血清的制備(ProductionofPolyclonalAntisera),in:ImmunochemicalProtocols(Manson,ed),pages1-5(HumanaPress1992)；Coligan等，兔、小鼠、大鼠和倉鼠單克隆抗血清的制備(ProductionofPolyclonalAntiserainRabbits,Rats,MiceandHamsters),inCurrrentProtocolsinImmunology,section2.4.1(1992),引入本文作為參考。單克隆抗體的制備同樣是常規(guī)方法。見，例如，Kohler&Milstein,1975,Nature256:495；Coligan等，sections2.5.1-2.6.7；andHarlow等，in:Amidodies:aLaboratoryManual,page726(ColdSpringHarborPub.1998)，據(jù)此一并參考。簡(jiǎn)而言之，單克隆抗體可通過以下途徑獲得用含有抗原的組合物免疫小鼠，分離血清樣品確定抗體產(chǎn)物的存在，切下脾臟獲得B淋巴細(xì)胞，將B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，克隆雜交瘤細(xì)胞，選擇產(chǎn)生該抗原的抗體的陽性克隆，從雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中分離抗體?？赏ㄟ^已建立的各種成熟技術(shù)分離純化單克隆抗體，這些分離技術(shù)包括用Protein-ASepharose親和層析、分子排阻層析和離子交換層析，見例如，Coligan等，Sections2.7.1-2.7.12andsections2.9.1-2.9.3；Barnes等，免疫球蛋白G(IgG)的純化(PurificationofImmunoglobulinG(IgG)),in:MethodsinMolecularBiology,Vol.10,pages79-104(HumanaPress1992).單克隆抗體在體外或體內(nèi)增殖的方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知，體外增殖可在合適的培養(yǎng)基例如Dulbecco改進(jìn)伊格耳氏培養(yǎng)基(Dulbecco′sModifiedEagleMedium)或RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行，在培養(yǎng)基中選擇加入哺乳動(dòng)物血清例如胎牛血清，或微量元素和生長(zhǎng)維持添加劑，例如正常鼠腹膜分泌細(xì)胞、脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞或骨髓巨噬細(xì)胞。體外生產(chǎn)提供相對(duì)純的抗體制品，而且允許擴(kuò)大規(guī)模生產(chǎn)大量所需的抗體。大量培養(yǎng)雜交瘤可在氣舉反應(yīng)器、連續(xù)振蕩反應(yīng)器或者固定的或夾住的細(xì)胞培養(yǎng)器中進(jìn)行均質(zhì)懸浮培養(yǎng)。體內(nèi)增殖可通過將細(xì)胞克隆注射到與親本細(xì)胞組織相容的哺乳動(dòng)物例如同型小鼠中實(shí)現(xiàn)，這樣抗體產(chǎn)生瘤就能在體內(nèi)生長(zhǎng)，注射前可選擇烴類，特別是礦物油例如降植烷(四甲基五葵烷)致敏動(dòng)物，一至三周后，就能從動(dòng)物的體液中回收所需的單克隆抗體。本發(fā)明中所使用的術(shù)語“抗體”包括完整的分子以及其片段，例如能與表位決定簇結(jié)合的Fab、F(ab′)2和Fv片段。這些抗體片段保存某些與抗體或受體選擇性結(jié)合的能力，詳細(xì)說明如下(1)Fab片段，該片段包含抗體分子單價(jià)抗原一結(jié)合部分，它可以通過將整個(gè)抗體用木瓜蛋白酶消化獲得，它含有一個(gè)完整的輕鏈和重鏈的一部分；(2)Fab′片段，該抗體分子片段可以通過用木瓜蛋白酶處理整個(gè)抗體然后還原獲得，它含有完整的輕鏈和重鏈的一部分；每個(gè)抗體分子可得到兩個(gè)Fab′片段；(3)F(ab′)2片段，該抗體片段可通過將整個(gè)抗體用木瓜蛋白酶處理但不進(jìn)行隨后的還原而獲得；F(ab′)2是兩個(gè)Fab′片段通過兩個(gè)二硫鍵結(jié)合在一起形成的二聚體；(4)Fv片段，定義為表達(dá)成為雙鏈的基因工程片段，它包含輕鏈的可變區(qū)和重鏈可變區(qū)；以及(5)單鏈抗體(“SCA”)，定義為包含有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的基因工程分子，二者由一個(gè)合適的多肽鏈連接成為基因融合單鏈分子。制備這些片段的方法是技術(shù)人員所了解的。(見例如，HarlowandLane,Antidodies:ALaboratoryManual(抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，ColdSpringHarborLaboratory,NewYork(1998)，據(jù)此一并參考)。本發(fā)明使用的術(shù)語“表位”意思是任何抗原決定簇，它們是抗原分子上與抗體結(jié)合的抗體結(jié)合部位，表位決定簇通常由分子的化學(xué)活性表面集團(tuán)組成，例如氨基酸或糖側(cè)鏈，并且通常具有特異性三維結(jié)構(gòu)特征以及特異的電荷特征。本發(fā)明的抗體片段可以通過蛋白酶水解抗體或在大腸桿菌中表達(dá)編碼該片段的DNA得到，抗體片段可以通過常規(guī)方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整個(gè)抗體獲得。例如，抗體片段可用胃蛋白酶酶切抗體產(chǎn)生一個(gè)5S的F(ab′)2片段制備，該片段用硫醇還原劑進(jìn)一步切割，并選擇性的封閉巰基導(dǎo)致二硫鍵連接斷裂，這樣產(chǎn)生3.5SFab′單價(jià)片段，或者，用胃蛋白酶酶切直接產(chǎn)生2個(gè)單價(jià)Fab′片段和Fc片段。這些方法已被例如Goldenberg,U.S.patentNo.4,036,945和No.4,331,647，以及其中提及的文獻(xiàn)描述。這些專利據(jù)此全部一并參考。同時(shí)見Nisonhoff等，1960,Arch.Biochem.Biophys.89:230；Porter,1959,Biochem.J.73:119；Edelman等，1967,MethodsinEnzymlogy,Vol.1,page422(AcademicPress)；以及Coligan等atsections2.8.1-2.8.10and2.10.1-2.10.4。只要片段和完整抗體識(shí)別的抗原結(jié)合，其它切割抗體的方法，例如分離重鏈獲得單價(jià)輕-重鏈片段，片段進(jìn)一步切割，其它酶，化學(xué)或遺傳手段都可以使用。例如，F(xiàn)v段由VH和VL鏈的結(jié)合組成，這種結(jié)合如Inbar等，1972,Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2659描述的可能是單價(jià)的，或者，可變鏈可以由分子間二硫鍵或化合物如戊二醛脫水交聯(lián)進(jìn)行連接，見Sandhu，同上。Fv段由一個(gè)多肽連接的VH和VL鏈組成，這些單鏈抗原結(jié)合蛋白(sFv)可通過構(gòu)建包含由一個(gè)寡聚核苷酸連接的編碼VH和VL結(jié)構(gòu)域的DNA序列的結(jié)構(gòu)基因來制備，該結(jié)構(gòu)基因插入到表達(dá)載體，隨后導(dǎo)入宿主細(xì)胞如大腸桿菌中，重組的宿主細(xì)胞合成由連接肽連接的兩個(gè)V結(jié)構(gòu)域的單個(gè)多肽鏈。制備sFvs的方法已有描述，例如Whitlow等，1991,Methods:aCompaniontoMethodsinEnzymology,Vol.2,page97；Bird等，1988,Science242:423-426；Ladner等，U.S.patentNo.4,946,778；Pack等，1993,Bio/Technology11:1271-77；以及Sandhu，同上?？贵w片段的另一個(gè)形式是對(duì)應(yīng)于單個(gè)互補(bǔ)-決定區(qū)(CDR)的多肽。CDR多肽(“最小識(shí)別單位”)可以通過構(gòu)建編碼所感性趣的抗體的CDR基因獲得，制備這些基因，例如，可以通過用聚合酶鏈反應(yīng)從抗體產(chǎn)生細(xì)胞的RNA合成。見，Larrick等Methods:aCmpaniontoMethodsinEnzymology,Vol.2,page106(1991)等。本發(fā)明中與FT多肽結(jié)合的抗體可以用完整的多肽或包含有感性趣的小肽的片段作為免疫抗原來制備。用于免疫動(dòng)物的多肽或小肽可以來自翻譯的cDNA或化學(xué)合成，如需要它們可以連接載體蛋白，這些普遍使用的將肽化學(xué)偶聯(lián)的載體包括鑰孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清清蛋白(BSA)和破傷風(fēng)類毒素。偶聯(lián)的肽隨后用于免疫動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠或兔)。如需要，單克隆或多克隆抗體可進(jìn)一步純化，例如將產(chǎn)生抗體所用的多肽或小肽與基質(zhì)相連，用它進(jìn)行抗體的結(jié)合與洗脫。熟悉的技術(shù)人員知道免疫學(xué)技術(shù)中多克隆抗體以及單克隆抗體純化和濃縮的各種常見的方法(見例如，Coligan，等，Unit9,CurrentProtocolsinImmunology(現(xiàn)代免疫學(xué)方法)，WileyInterscience,1991，引入本文作為參考)。也可能使用抗個(gè)體基因型技術(shù)制備模擬表位的單克隆抗體。例如，對(duì)應(yīng)于第一個(gè)單克隆抗體制備的抗個(gè)體基因型單克隆抗體在多變區(qū)具有結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，它是第一個(gè)單克隆抗體結(jié)合表位的“映象”。遺傳修飾的植株在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有在基因組中至少有一個(gè)編碼FT的異源核苷酸序列的遺傳修飾植物，在植物中FT序列調(diào)節(jié)成花，因此該植物具有可調(diào)節(jié)成花的特性。這里還包括所有取自本發(fā)明遺傳修飾植物的植物細(xì)胞和植物種子，此外，還提供如本文所描述的能發(fā)芽生長(zhǎng)成遺傳修飾植物的種子。用在本文的術(shù)語“遺傳修飾”指將一個(gè)或多個(gè)異源核苷酸序列導(dǎo)入一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞，這些細(xì)胞能產(chǎn)生整個(gè)有生育能力的可見植株。用在本文的術(shù)語“遺傳修飾”指通過前面提到的過程之一培育的植株。本發(fā)明遺傳修飾的植物能夠自花授粉或與相同種交叉授粉，以便種系攜帶的外源基因能夠插入或雜交進(jìn)入農(nóng)業(yè)上有用的植物變種。本文使用的“植物細(xì)胞”指原生質(zhì)體、配子產(chǎn)生細(xì)胞和再生為整個(gè)植株的細(xì)胞，包含有多個(gè)植物細(xì)胞能再生成為整株植物的種子相應(yīng)地包括在“植物細(xì)胞”的定義中。本文使用的術(shù)語“植株”指整株植物、植物一部分、植物細(xì)胞或植物細(xì)胞群，例如象植物組織，胚也包含于“植株”含義中。本發(fā)明的植物包括任何可進(jìn)行轉(zhuǎn)化技術(shù)操作的有花植物，包括單子葉植物和雙子葉植物。單子葉植物的例子包括，但不僅限于蘆筍、玉米和甜玉米、大麥、小麥、水稻、高粱、洋蔥、珍珠粟、黑麥和燕麥。雙子葉植物的例子包括，但不僅限于番茄、煙草、棉花、油菜、豆角、大豆、胡椒、萵苣、豌豆、苜蓿、三葉草、油菜類作物或油蕓苔(例如，卷心菜、椰菜、花椰菜、芽甘藍(lán))、蘿卜、黃蘿卜、甜菜、茄子、菠菜、黃瓜、南瓜、西瓜、甜瓜、向日葵和觀賞植物，木本種類包括白楊、松樹、美洲杉、雪松和橡樹。用在本文的術(shù)語“異源核苷酸序列”指至少一個(gè)與調(diào)控序列如啟動(dòng)子相連的結(jié)構(gòu)基因。核苷酸序列起源于外源種，或者，如果是從其原始形式進(jìn)行實(shí)質(zhì)改造的則是相同種。例如，術(shù)語“外源核苷酸序列”包括起源于相同種的核苷酸序列，這種序列與和天然或野生啟動(dòng)子不同的啟動(dòng)子相連。本文使用的術(shù)語“核苷酸序列”指核糖核酸或脫氧核糖核酸的多聚體，以獨(dú)立的片段存在或作為更大結(jié)構(gòu)的一組份。編碼本發(fā)明方法中使用的蛋白的DNA可以從cDNA片段組合而成，或是來自含有能夠在重組轉(zhuǎn)錄單位中表達(dá)的合成基因的寡聚核苷酸。本發(fā)明中的多聚核苷酸或核苷酸序列包括DNA、RNA和cDNA序列(見先前描述)。反義多聚核苷酸抑制或延遲成花可以通過將反義分子導(dǎo)入植物細(xì)胞實(shí)現(xiàn)，植物細(xì)胞可生長(zhǎng)為轉(zhuǎn)化的或遺傳修飾的植株。該方法包括，用反義核苷酸、核酶或者三聚體阻斷轉(zhuǎn)錄或FTmRNA翻譯，可用反義核苷酸或三聚體屏蔽mRNA，或者用核酶切割。本發(fā)明反義多聚核苷酸的例子見SEQIDNO:3(圖2)。在實(shí)施方案中，本發(fā)明包括對(duì)成花時(shí)間基因(FT)表達(dá)有終止或干擾的遺傳修飾植物，轉(zhuǎn)基因插入到植物染色體基因組中?！稗D(zhuǎn)基因”是人工插入到細(xì)胞，并成為由該細(xì)胞發(fā)育而成的器官或植物基因組的一部分的DNA片段，該轉(zhuǎn)基因可以包括部分或完全與轉(zhuǎn)基因器官異源的基因，或者代表與器官的內(nèi)源基因同源。本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”是指含有一個(gè)或更多在遺傳修飾植物或轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的DNA序列，它們對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物部分或完全異源，或者與轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)源基因同源但設(shè)計(jì)插入植物基因組的位點(diǎn)不同于天然基因，轉(zhuǎn)基因包含有一個(gè)或更多的啟動(dòng)子和其它任何對(duì)所選擇的DNA表達(dá)必需的DNA，比如內(nèi)含子，它們與所選擇的DNA相連，并可以包括增強(qiáng)子序列。本發(fā)明提供培育具有延遲成花特性的遺傳修飾植物的方法，它是將含有至少一個(gè)能終止或干擾FT多肽表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列的載體與植物細(xì)胞相連，為獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞該基因可與啟動(dòng)子相連接；從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育植株；并篩選表現(xiàn)晚成花的植株。晚成花可以按本文實(shí)施例上所示方法確定，例如目測(cè)觀察轉(zhuǎn)基因植物成花時(shí)間與野生型植物成花時(shí)間的差別，成花時(shí)間可以通過第一個(gè)花形成前計(jì)數(shù)葉的數(shù)量確定(Koormmeef等，MolGen.Genet.,229:57,1991)。其它指標(biāo)包括檢測(cè)花分生組織特征基因例如LEAFY或APETALA1啟動(dòng)子活性，(Blazquez等，Development,124:3838,1997；Hempel,同上)。培育具有延遲成花特性的遺傳修飾植物的方法包括將含有與啟動(dòng)子相連的FT反義核苷酸序列或編碼FT負(fù)顯性形式的核苷酸序列的載體與植物細(xì)胞相連。在這提供的反義核苷酸序列DEQIDNO:3，應(yīng)用它培育出相對(duì)于野生型植株有延遲成花特性的遺傳修飾植物見實(shí)施例3。反義核苷酸是與特定mRNA(Weintraub,1990,ScientificAmerican,262:40)至少部分互補(bǔ)的DNA或RNA分子。在細(xì)胞中，反義核苷酸與相應(yīng)的mRNA雜交形成雙鏈分子，由于細(xì)胞不能翻譯雙鏈的mRNA，反義核苷酸干擾了mRNA的翻譯。首選15個(gè)堿基的反義多聚物，是因?yàn)樗鼈內(nèi)菀缀铣桑⑶耶?dāng)導(dǎo)入產(chǎn)生FT的靶細(xì)胞時(shí)比大分子引起的問題少，在體外應(yīng)用反義方法抑制基因翻譯已為技術(shù)人員熟知(Marcus-Sakura,1988,Anal.Biochem.,172:289)，病毒也可用于反義抑制(AngellandBalcombe,EMBOJ.,16:3675,1997)。使用寡聚核苷酸終止轉(zhuǎn)錄叫做三重策略，是由于寡聚體纏繞在雙鏈DNA周圍形成三鏈螺旋。因此，這些三重復(fù)合物設(shè)計(jì)成為能識(shí)別所選擇基因獨(dú)特位點(diǎn)(Maher，等，1991,AntisenseRes.AndDev.,1(3):227；Helene,C.,1991,AnticancerDrugDesign,6(6):569)。核酶是具有特異切割其它單鏈RNA能力的RNA分子，切割方式與DNA內(nèi)切酶類似。通過改變編碼這些RNAs的核苷酸序列，可能設(shè)計(jì)出識(shí)別RNA分子中特異核苷酸序列并切割它的分子(Cech,1988,J.Amer.Med.Assn.,260:3030)。該方法的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是由于它們具有序列特異性，只有含有特定序列的mRNAs才能被失活。有兩種基本類型的核酶，叫做四膜蟲型(Hasselhoff,1988,Nature,334:585)和“錘頭”型，四膜蟲型核酶識(shí)別4個(gè)堿基長(zhǎng)的序列，而“錘頭”型核酶識(shí)別11-18個(gè)堿基長(zhǎng)的序列。識(shí)別序列越長(zhǎng)，特異性切割靶mRNA種類中序列的可能性就越大。因此，優(yōu)選選擇錘頭型核酶用于特定mRNA種類失活而不選擇四膜蟲型核酶，而且寧愿選擇18個(gè)堿基的識(shí)別序列而不選擇更短的序列。負(fù)顯性突變?cè)诒景l(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了編碼FT負(fù)顯性蛋白的核苷酸序列。例如，包含有負(fù)顯性編碼基因的遺傳結(jié)構(gòu)可與啟動(dòng)子相連，例如組織特異性啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子和使用方法的例子見以上描述。這些結(jié)構(gòu)在植物中調(diào)節(jié)成花的方法中十分有用。例如，本發(fā)明的方法包括用編碼負(fù)顯性FT蛋白的經(jīng)驗(yàn)結(jié)構(gòu)和與之相連的合適的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并表達(dá)編碼FT負(fù)顯性基因，這樣，可通過干擾野生型FT活性調(diào)控成花。篩選FT抑制因子在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)鑒定能調(diào)控FT蛋白或基因表達(dá)的化合物的方法。該方法包括將含有該化合物的成分，與FT多肽或表達(dá)FT多肽的重組細(xì)胞在足以使之能相互反應(yīng)的條件下溫育，確定該化合物對(duì)FT活性或表達(dá)的影響。化合物對(duì)FT活性的影響可以通過許多分析測(cè)定，可以包括加入化合物溫育前和溫育后的測(cè)定，影響FT活性或基因表達(dá)的化合物包括肽、肽類似物、多肽、化合物和生物試劑。分析包括Northernblot分析FT的mRNA(例如對(duì)基因表達(dá))，和Westernblot分析(例如對(duì)蛋白活性)。溫育包括允許供試化合物和FT多肽或表達(dá)FT多肽的重組細(xì)胞二者相接觸的條件，接觸包括在液相、固相或在細(xì)胞中。供試化合物可以是用于篩選多數(shù)化合物的任意組合庫。本發(fā)明方法中鑒定的化合物可以進(jìn)一步評(píng)價(jià)、檢測(cè)、克隆、測(cè)序，諸如此類，可以在溶液中或結(jié)合到固體支持物上，可以用檢測(cè)特異DNA序列的常用方法，例如PCR，多聚物限制(Saiki,等，Bio/Technology,3:1008-1012,1985)，特異位點(diǎn)寡聚核苷酸(ASO)探針分析(Conner,等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:278,1983),寡聚核苷酸連接分析(OLAs)(Landegren，等，Science,241:1077,1988)，以及類似方法。DNA分析的分子手段已有綜述(Landegren，等，Science,242:229-237,1988)。鑒定影響FT的化合物的方法本發(fā)明提供了鑒定能調(diào)節(jié)FT活性化合物的方法。該方法包括將FT多肽或表達(dá)FT多肽的重組細(xì)胞或其變體與供試化合物在足以允許各個(gè)成分相互作用的條件下溫育，并測(cè)定化合物對(duì)FT活性或表達(dá)的影響。影響FT活性或基因表達(dá)的化合物包括肽、多肽、肽類似物、化學(xué)化合物和生物試劑。“溫育”包括允許供試化合物和FT多肽二者接觸的條件，“接觸”包括在液相和固相。供試化合物可以是用于篩選多數(shù)化合物的任意組合庫，其它各類試劑包括在篩選分析中，這些包括用于優(yōu)化蛋白-蛋白結(jié)合或降低非特異性或背景相互作用的試劑例如鹽、中性蛋白例如清蛋白、去污劑等。也可以使用例如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗菌試劑等制劑提供分析效率。各成分的混合物以任何能得到精確結(jié)合的順序加入，溫育可在任何適合的溫度進(jìn)行，典型地在4-40℃。依最佳活性選擇溫育時(shí)間，但也可以依據(jù)實(shí)施快速高效篩選而優(yōu)化，典型地0.1至10小時(shí)就足夠了。本發(fā)明方法中鑒定的是天然核苷酸的化合物可以進(jìn)一步評(píng)價(jià)、檢測(cè)、克隆、測(cè)序，諸如此類，可以在溶液中或結(jié)合到固體支持物上，可以用檢測(cè)特異DNA序列的常用方法，例如PCR，多聚物限制(Saiki，等1985,Bio/Technology,3:1008-1012,)，特異位點(diǎn)寡聚核苷酸(ASO)探針分析(Conner,等，Proc.Nad.Acad.Sci.USA,80:278,1983)，寡聚核苷酸連接分析(OLAs)(Landegren,1988，等，Science,241:1077)，以及類似方法。DNA分析的分子手段已有綜述(Landegren，等，1988,Science,242:229-237)。影響FT的候選化合物包括化學(xué)化合物。一類是有機(jī)分子，首選是分子量大于50并少于2,500道爾頓的小有機(jī)化合物。候選試劑包括對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的相互作用必需的功能集團(tuán)，尤其是氫鍵，以及典型地包括至少一個(gè)胺、羰基、羥基或羧基，首選地至少有兩個(gè)功能化學(xué)集團(tuán)。候選試劑通常包括被以上一個(gè)或多個(gè)功能集團(tuán)取代的環(huán)碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳族或多芳族結(jié)構(gòu)。從廣泛的各類來源包括合成庫或天然化合物中得到候選化合物。例如，有許多方法可進(jìn)行隨機(jī)和導(dǎo)向合成廣泛多樣的有機(jī)化合物和生物分子，包括隨機(jī)寡聚核苷酸和寡聚核苷酸的表達(dá)，或者，也可使用細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物這些天然化合物庫。此外，天然或合成制備的化合物很容易通過常規(guī)的化學(xué)、物理和生化手段進(jìn)行修飾，并可用于制備組合庫，已知的醫(yī)藥試劑可進(jìn)行有意或隨機(jī)的化學(xué)修飾，例如?；?、烷基化、酯化、酰胺化等以生產(chǎn)結(jié)構(gòu)類似物。候選試劑還可在生物分子中找到，包括但不僅限于肽、糖類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、咪啶、衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或其中組合。化合物通過刺激或抑制報(bào)告基因的表達(dá)影響報(bào)告基因表達(dá)。如果報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄水平或蛋白產(chǎn)物相對(duì)于沒有供試化合物時(shí)減少，化合物就“抑制”報(bào)告基因表達(dá)，如果報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄水平或蛋白產(chǎn)物增加，化合物就“刺激”報(bào)告基因表達(dá)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能確定許多報(bào)告基因用于本發(fā)明的篩選方法。本發(fā)明使用報(bào)告基因的例子是lacZ、發(fā)光酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、β-葡糖苷酸酶和綠色熒光蛋白?；衔飳?duì)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的影響可通過技術(shù)人員所熟悉的檢測(cè)其表達(dá)的方法測(cè)定(例如Northem雜交；EMSA)?；蛘?，報(bào)告基因的蛋白產(chǎn)物可由技術(shù)人員熟悉的方法測(cè)定(例如酶聯(lián)免疫分析(ELISA)或放射免疫測(cè)定(RIA)；Western雜交；SDS-PAGE)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了鑒定與FT多肽或其突變體結(jié)合的細(xì)胞蛋白的方法，它是通過將至少一種細(xì)胞蛋白與FT多肽或其突變體在足以使之相互作用的條件下溫育，并從未結(jié)合的FT中分離FT多肽復(fù)合物和假定結(jié)合的蛋白，并分離這種蛋白(例如，2-雜交系統(tǒng))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中使用了分離的細(xì)胞蛋白。然而，部分純化的蛋白、細(xì)胞提取物組份、整個(gè)細(xì)胞提取物或完整的細(xì)胞可用于本發(fā)明方法中?！皽赜卑ㄔ试S細(xì)胞組份與FT多肽接觸的條件，術(shù)語“接觸”包括在液相和固相中，并包括任何復(fù)合物形成或細(xì)胞組份與FT多肽的結(jié)合，接觸還包括任何細(xì)胞組份行使對(duì)FT多肽生化修飾的酶的相互作用。細(xì)胞組份與FT多肽的復(fù)合物可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段從未形成復(fù)合物的FT多肽中分離，細(xì)胞組份與FT結(jié)合的復(fù)合物可通過大小分離、物理分離或其它常規(guī)方法完成。例如，非變性膠電泳可用于從非結(jié)合的FT中分離結(jié)合有細(xì)胞組份的FT。一旦復(fù)合物被分離，用技術(shù)人員熟知的方法可對(duì)細(xì)胞組份分離和定性。例如，如果細(xì)胞組份是蛋白，蛋白可以用技術(shù)人員熟知的方法測(cè)序，編碼蛋白的多聚核苷酸可通過DNA合成技術(shù)制備，然后多聚核苷酸可用技術(shù)人員所熟知的分子技術(shù)插入到載體并用以上所描述的技術(shù)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后，大量蛋白可通過常規(guī)手段分離和純化。例如，可制備表達(dá)宿主細(xì)胞的溶解產(chǎn)物，并運(yùn)用高壓液相色譜(HPLC)、排阻層析、凝膠電泳、親和層析或其它純化技術(shù)純化溶解產(chǎn)物。純化的蛋白一般至少約80％的純度，最好至少約90％的純度，甚至可達(dá)100％的純度，純度指預(yù)期不含其它蛋白以及細(xì)胞碎片。以上公開的內(nèi)容一般性地描述本發(fā)明，更完整的理解可通過參考以下特定的實(shí)施例獲得，本文提供實(shí)施例僅僅是為了說明，并沒有有意限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1FT的鑒定在過去幾年，我們用真空滲透法(Bechtold等，(1993),C.R.Acad.Sci.316,1194-1199)，使有活化標(biāo)志的T-DNA載體產(chǎn)生了大量轉(zhuǎn)化的擬南芥(Arabidopsisthaliana)。這個(gè)載體在T-DNA的右側(cè)有一個(gè)椰菜花葉病毒35S增強(qiáng)子的四聚體(Walden等，(1994),PlantMol.Biol.26,1521-1528)。在我們培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化植物中，我們鑒定出一個(gè)品系，包含有一個(gè)顯性可遺傳的突變，引致開花提前而不受環(huán)境因素影響。這個(gè)品系1733，不管日照時(shí)間長(zhǎng)短，在平均只有3.5片葉時(shí)就開花，而野生型則受照時(shí)間影響，分別在有13和45片葉時(shí)開花。在確定這種顯性表型與活化標(biāo)記的栽體共分離后，我們通過質(zhì)?；厥辗蛛x側(cè)翼序列。一個(gè)包含3.4kb的基因組序列連同原載體上多聚化的增強(qiáng)子一起，插入另一個(gè)T-DNA載子，從而得到pSKIO83(圖1)。然后再用真空滲透法把質(zhì)粒導(dǎo)入植物。大量用pSKI083轉(zhuǎn)化的植物和原來的突變品系表型一致，顯示pSKIO83片段包含引致早開花的基因。通過用一組酵母人工染色體庫與之雜交做出pSKIO83的圖譜，從而將之定位在1號(hào)染色體的底部。而己知定位于此區(qū)域內(nèi)與開花有關(guān)的基因只有FT基因。其隱性等位基因引致晚開花(Koomneef等，(1991),Mol.Gen.Genet.229,57-66)，編碼FT基因座的結(jié)構(gòu)基因在此之前從未被分離。來自三個(gè)相互獨(dú)立的、可被EMS誘導(dǎo)的fl等位基因的基因組片段分別被測(cè)序，發(fā)現(xiàn)它們都有單堿基對(duì)突變，有的在基因組片段上引入錯(cuò)義突變，有的變?yōu)榻K止密碼子(參見下文)。因此，最初的活化標(biāo)記的突變是FT基因座的顯性早成花等位基因。它的失活將導(dǎo)致相反的現(xiàn)象-遲開花。實(shí)施例2FT序列及其與其他基因的關(guān)系我們測(cè)定了在pSHI083上的基因組片段序列和來源于該片段的cDNA的序列(圖1,2)。FTcDNA包含單獨(dú)一個(gè)開放讀碼框，編碼的蛋白質(zhì)有175個(gè)氨基酸，分子量19.8kD，等電點(diǎn)7.89。搜索基因庫的結(jié)果顯示FT是植物、真菌和哺乳類動(dòng)物所共有的一個(gè)基因家族的成員。我們己經(jīng)知道植物的一對(duì)定向進(jìn)化同源基因和哺乳類的另一對(duì)定向進(jìn)化同源基因的功能(圖3A)。這兩個(gè)植物基因是金魚草(Antirrhinummajus)的CENTRORADIALIS(CEN)基因和擬南芥的TERMINALFLOWER1(TFL1)基因(Bradley等，1996,supra；Bradley等，1997,supra)。使這些基因失活的突變導(dǎo)致主枝和側(cè)枝末端長(zhǎng)出末端花。此外，和野生株相比，tfl1突變株開花時(shí)間稍早一點(diǎn)(ShannonandMeeks-Wagner,(1991),PlantCell3,877-892)，我們最近得而TFL1過度表達(dá)的植物(35S∷TFL1)，這些植物的開花時(shí)間較晚。因此可知TFL1基因影響開花時(shí)間，TFL1和FT的基因序列相關(guān)，但FT過度表達(dá)卻引致提前開花。tfl1突變引致功能缺失也引起提前開花，相反，導(dǎo)致功能缺失的ft突變和TFL1過度表達(dá)一樣可使開花變晚。擬南芥基因組內(nèi)至少還有基因?qū)儆贔T/TFL1基因家族，這基因被確認(rèn)作假表達(dá)序列標(biāo)記(ESTclone#E12A11)，在GenBank上的訪問號(hào)是AA042630。我們測(cè)定了E12A11cDNA的全部序列(圖3A)。與FT和TFL1不同，轉(zhuǎn)基因植物(35S∷E12A11)中該基因的過度表達(dá)并不影響開花。CEN,TFL1,FT和E12A11蛋白質(zhì)序列的系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，TFL1和CEN關(guān)系比FT和E12A11的關(guān)系更近，其中的TFL1,FT和E12A11來自同一物種，與CEN來源不同。TFL1與CEN的較近關(guān)系肯定了它們是定向進(jìn)化同源基因(圖3B)。此外，序列比較顯示FT與CEN/TFL1較相近，與E12A11則比較遠(yuǎn)。因此，系統(tǒng)發(fā)生樹為鑒定其他物種的FT的定向進(jìn)化同源提供重要的判據(jù)這些定向進(jìn)化同源基因與來自Arabidopsisthaliana的FT的相關(guān)性應(yīng)比CEN/TFL1或E12A11更大。哺乳物物的FT/TFL1家族中的兩個(gè)成員編碼老鼠和人的海馬類乙酰膽堿供能神經(jīng)激肽(HCNP)的前體(Tohdoh等，supra)(圖3)。這個(gè)鼠蛋白被確認(rèn)為蛋白前體，產(chǎn)生一個(gè)肽類激素，激發(fā)腦組織體外培養(yǎng)時(shí)乙酰膽堿的合成(Ojika等，supra)。以前，HCNP的活性部分被純化并測(cè)得它是一個(gè)長(zhǎng)11氨基酸的肽，序列為乙酰-Ala-Ala-Asp-Ile-Ser-Gln-Trp-Ala-Gly-Pro-Leu(SEQIDNO:4)(圖3C)。由肽序列推得DNA序列，并且克隆了這個(gè)前體蛋白。前體變成活性肽經(jīng)過N-末端斷裂分別刪去蛋氨酸和乙?；?，但是乙?；瘜?duì)活性并不重要。乙?；蜎]有乙?；腍CNP在體內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)(Ojika等，supra)。編碼人HCNP前體蛋白的基因也被克隆。雖然人與鼠的這兩個(gè)基因總體上十分相似，但N末端的11個(gè)氨基酸中只有六個(gè)一樣。盡管如此，兩者都能激發(fā)內(nèi)隔核培養(yǎng)物中乙酰膽堿的合成。用包括人和鼠HCNP的小肽測(cè)定生物活性，只有包括HCNP羧基端的四肽和六肽有生物活性。根據(jù)序列比較，HCNP有活性最小共有序列被推定為X-Gly-Pro-Leu(Ojika等，1996)。盡管植物蛋白的氨基端相當(dāng)不同，但它們都有(Asp/Glu)-Pro-Leu(圖3C)。如果植物蛋白的斷裂與HCNP一樣，發(fā)生在亮氨酸之后，預(yù)計(jì)植物的多肽長(zhǎng)度將為7-11個(gè)氨基酸(圖3C)。序列的相似強(qiáng)有力地暗示植物蛋白是影響植物開花的多肽的前體。因此，我們猜想除了FT的過量表達(dá)和失活外，使用FT肽或其過量表達(dá)也會(huì)影響開花時(shí)間。實(shí)施例3正義方向和反義方向過量表達(dá)FT的轉(zhuǎn)基因植物把質(zhì)?；厥辗蛛x所得的基因組DNA片段作為探針，我們從擬南芥成花cDNA文庫得到10個(gè)cDNA克隆。把cDNA克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)它們?nèi)紒碓从谕粋€(gè)基因。其中pSKI1.1.1長(zhǎng)1814bp,包含有完整的開放讀碼框和5’和3’端非編碼序列。上述一些重組DNA的局部構(gòu)造圖見于圖1，而正向和反向插入的確切序列可見于圖2。我們構(gòu)建了pSKI090雙向T-DNA載體用來轉(zhuǎn)化植物，該載體的T-DNA邊界之間有BAR基因，賦予植物對(duì)除草劑glufosinate(BASTATM或IgniteTM)的抗性，還有多克隆位點(diǎn)，在一個(gè)來源于病毒的植物強(qiáng)啟動(dòng)子和翻譯增強(qiáng)子(其中包括椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子的200bp(Odell等，(1985),IdentificationofDNA-sequencesrequiredforactivityofthecauliflowermosaicvirus-35Spromoter.Nature313,810-812)和煙草花葉病毒5’端ω區(qū)的70bp(Sleat等,(1987),Gene60,217-225)，此外還有土壤農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶(nos)基因的轉(zhuǎn)錄終止子。生成pSKI090的兩個(gè)中間步驟是pBluescriptKS+(Stratagene)派生載體pSKI087和T-DNA載體pSKI089，前者包括椰菜花葉病毒35S的啟動(dòng)子和3’端的nos序列，后者包含有BAR基因。為了生成正向插入，pSKI1.1.1上的cDNA插入片段被切成XbaⅠ-XhoⅠ片段，亞克隆到pSKI087，構(gòu)造了pSKI053；用BamHⅠ消化以除去多余的多接頭序列，重新連接，得到pSKI058；最后，包含有合成的啟動(dòng)子、FTcDNA和nos終止子的片段被插入到pSKI089載體，得到pSKI059(圖1)。用pSKI059轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)會(huì)產(chǎn)生過多的FTmRNA。為了得到反向插入，pSKI1.1.1的cDNA插入片段用KpnⅠ和XbaⅠ除去，得到KpnⅠ-XbaⅠ片段，然后與合適的pSKI090載體DNA(圖1)連接，得到pSKI060。在pSKI060中FT開放讀碼框與合成啟動(dòng)子的方向(視作正常轉(zhuǎn)錄方向)相反。把pSKI059(35S∷FT)和pSKI060(35S∷antiFT)轉(zhuǎn)入根癌土壤農(nóng)桿菌ASE品系(Fraley等，(1985)，TheSEVsystem:anewdisarmedTiplasmidvectorsystemforplanttransformation.Biotechnology3,629-635).該質(zhì)粒用真空滲透法引入到擬南芥哥倫比亞生態(tài)型(Bechtold等，1993)。通過反復(fù)向幼苗噴灑1∶10,000IgniteTM稀釋物來篩選轉(zhuǎn)基因植物。對(duì)pSiKI060(35S∷antiFT)而言，我們分析了50株轉(zhuǎn)化株，其中兩株晚開花，長(zhǎng)出超過25片玫瑰狀葉子(野生型只有13片葉子)。對(duì)于pSKI059(35S∷FT)，我們分析了50株轉(zhuǎn)化株，其中45株比野生型提前很長(zhǎng)時(shí)間開花，其中9株開花時(shí)間與原始的1733突變株相同。(葉片數(shù)3.5)FT還可能作為L(zhǎng)EAFY的活性因子(Ruiz-Garcia等，PlantCell,9:1921,1997)。我們用常規(guī)方法把35S∷FT和35S∷LFY雜交并觀察到協(xié)同作用。換句話說，這些植物開花但并未產(chǎn)生任何營(yíng)養(yǎng)性葉片。應(yīng)該注意這種增效作用是因?yàn)橐环N或多種基因在另一些基因表達(dá)的同時(shí)、之前或之后進(jìn)行表達(dá)所引致。例如，同時(shí)使兩者過度表達(dá)使植物發(fā)芽后立即開花。(參見表1)表1#數(shù)據(jù)選用最早開花的一組，但使對(duì)照的葉數(shù)都一樣此外，我們用常規(guī)方法把35S∷FT和35S∷TFL1雜交，并觀察到拮抗作用。同上，這種作用也緣于基因表達(dá)。例如，TFL1過度表達(dá)令植物晚開花，而TFL1及FT同時(shí)過度表達(dá)則出現(xiàn)中間表型。但是，在過度表達(dá)TFL1的同時(shí)減少FT的表達(dá)量，將使植物的開花時(shí)間比只有TFL1過度表達(dá)晚些。(參見表2)表2<tablesid="table2"num="002"><table>種類開花之前的葉片數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差n35S∷TFL136.93.310ft-1/+#；35S∷TFL154.32.310</table></tables>#ft突變雜合，如表達(dá)50％正常FT以上是為了說明這項(xiàng)發(fā)明的范疇，但并不限定于此，事實(shí)上，根據(jù)如上的說明，只需這方面的普通技術(shù)就可以容易地想出并做出更多的具體應(yīng)用而無需進(jìn)行過多的實(shí)驗(yàn)。因此，這項(xiàng)發(fā)明受以下權(quán)利要求所限制。權(quán)利要求1．一種基本上純化的成花基因座T(FT)多肽。2．權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于a)用SDS-PAGE測(cè)得分子量大約20kD；b)位于擬南芥第1條染色體上；c)有調(diào)節(jié)開花時(shí)間功能。3．權(quán)利要求1所述的多肽，其中，所說的多肽的氨基酸順序基本上與SEQIDNO:2相同，或其功能片段。4．權(quán)利要求1所述的多肽，其中，氨基酸順序?yàn)镾EQIDNO:2。5．分離的編碼權(quán)利1所述的多肽的多聚核苷酸。6．一種選自下組的分離的多核苷酸a)SEQIDNO:1；b)SEQIDNO:1，其中，T也可為U；c)與SEQIDNO:1互補(bǔ)的核苷酸順序，和能與編碼SEQIDNO:2多肽的核酸雜交，而且長(zhǎng)度為至少15bp的a),b)和c)序列的片段。7．權(quán)利要求5所述的多聚核苷酸，其中，該多聚核苷酸是從植物細(xì)胞中分離的。8．包含權(quán)利要求5所述的多聚核苷酸序列的重組表達(dá)載體。9．包括有權(quán)利要求8所述的載體的宿主細(xì)胞。10．與權(quán)利要求1所述的多肽結(jié)合的抗體，或者與該肽的抗原片段結(jié)合的抗體。11．一種遺傳修飾的植物，它在基因組中至少包含一個(gè)外源核酸序列，該外源序列至少包括編碼FT的核酸序列，其特征為成花可調(diào)節(jié)。12．權(quán)利要求11所述的植物，其中的調(diào)節(jié)是加速成花。13．權(quán)利要求11所述的植物，其中的調(diào)節(jié)是抑制成花。14．權(quán)利要求11所述的植物，還包含編碼選自下組的多肽的外源基因LEAFY(LFY),APETALA1(AP1),CONSTANS(CO),TERMINALFLOWER1(TFL1),FLORICAULA(FLO),SQUAMOSA(SQUA),FLOWERINGLOCUSCA(FCA)，以及它們的組合。15．權(quán)利要求11所述的植物，其中，結(jié)構(gòu)基因與一段調(diào)控核酸序列有效連接。16．權(quán)利要求15所述的植物，其中的調(diào)控核酸序列是啟動(dòng)子。17．權(quán)利要求16所述的植物，其中的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。18．權(quán)利要求16所述的植物，其中的啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子。19．權(quán)利要求11所述的植物，其中的核酸序列還包括一個(gè)選擇性標(biāo)記。20．權(quán)利要求11所述的植物，它是雙子葉植物。21．權(quán)利要求11所述的植物，它是單子葉植物。22．從權(quán)利要求11的植物獲得的植物細(xì)胞。23．從權(quán)利要求11所述的植物獲得的植物組織。24．能發(fā)芽生長(zhǎng)成基因組中帶有至少一段外源核酸序列的植物種子，該外源核酸序列至少含有編碼FT的核苷酸序列，其特征是可調(diào)節(jié)成花。25．一種載體，它含有一段與一個(gè)啟動(dòng)子有效連接的核酸序列，該核酸序列含有至少一個(gè)編碼調(diào)節(jié)成花的多肽的結(jié)構(gòu)基因。26．權(quán)利要求25所述的載體，其中該載體包括T-DNA衍生的載體。27．權(quán)利要求25所述的載體，其中該結(jié)構(gòu)基因編碼FT多肽。28．權(quán)利要求27所述的載體，進(jìn)一步包括一個(gè)結(jié)構(gòu)基因，該結(jié)構(gòu)基因編碼選自下組的多肽LEAFY(LFY),APETALA1(AP1),CONSTANS(CO),TERMINALFLOWER1(TFL1),FLORICAULA(FLO),SQUAMOSA(SQUA),FLOWERINGLOCUSCA(FCA),以及它們的組合。29．權(quán)利要求25所述的載體，其中的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。30．權(quán)利要求25所述的載體，其中的啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。31．權(quán)利要求25所述的載體，其中啟動(dòng)子是用化學(xué)方法誘導(dǎo)。32．一種對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾的方法，使從這種細(xì)胞產(chǎn)生的植物的特征為與野生型的植株相比具有成花可調(diào)節(jié)的特征，所述方法包括將權(quán)利要求5的至少編碼FT的多核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞，以獲得轉(zhuǎn)化了的植物細(xì)胞；在容許FT多肽表達(dá)的情況下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了的植物細(xì)胞，由此產(chǎn)生可調(diào)節(jié)成花的植株。33．權(quán)利要求32所述的方法，其中所說的調(diào)節(jié)指的是加速成花。34．權(quán)利要求32所述的方法，其中所說的調(diào)節(jié)指的是抑制成花。35．權(quán)利要求33所述的方法，其中所說的加速成花是通過在植物中誘導(dǎo)了FT的表達(dá)或活性而完成的。36．權(quán)利要求33所述的方法，其中所說的加速成花是通過增加植物內(nèi)FT的表達(dá)或活性而完成的。37．權(quán)利要求35所述的方法，還包括誘導(dǎo)LFY的表達(dá)或活性。38．權(quán)利要求34所述的方法，其中所說的抑制成花是通過在植物內(nèi)抑制FT的表達(dá)或活性而完成的。39．權(quán)利要求38所述的方法，其中所說的抑制成花是由FT反義或FT負(fù)顯性核酸序列完成的。40．權(quán)利要求34所述的方法，其中所說的抑制成花是通過TFL1過度表達(dá)或活性提高而完成的。41．權(quán)利要求38所述的方法，還包含TFL1活性或表達(dá)量的提高。42．一種產(chǎn)生具有提早成花特征的遺傳修飾植物的方法，包括將植物細(xì)胞與一種載體接觸，以獲得轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，該載體含有一種核酸，該核酸含有編碼FT多肽的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)基因，所說的基因與一種啟動(dòng)子有效連接；由上述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞產(chǎn)生植株；篩選表現(xiàn)為提早成花的植株。43．權(quán)利要求42所述的方法，其中所說的接觸用的是物理方法。44．權(quán)利要求42所述的方法，其中所說的接觸用的是化學(xué)方法。45．權(quán)利要求42所述的方法，其中的植物細(xì)胞選自下組原生質(zhì)體、配子生成細(xì)胞和能再生出整個(gè)植株的細(xì)胞。46．權(quán)利要求42所述的方法，其中的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。47．權(quán)利要求42所述的方法，其中的啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。48．由權(quán)利要求42所述的方法產(chǎn)生出的植株。49．來自由權(quán)利要求42所述的方法產(chǎn)生出的植株獲得的植物組織。50．一種在植物細(xì)胞中調(diào)節(jié)成花的方法，包括將所述植物細(xì)胞與權(quán)利要求25所述的載體相接觸，以獲得轉(zhuǎn)化了的植物細(xì)胞；在形成植物的條件下生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化了的植物細(xì)胞；在足以加速成花的條件和時(shí)間下誘導(dǎo)植物提前開花。51．一種遺傳修飾植物，轉(zhuǎn)入的基因破壞或干擾成花時(shí)間基因(FT)的表達(dá)，并整合進(jìn)植物基因組染色體。52．培育具有延遲成花特征的遺傳修飾植物的方法，該方法包括將植物細(xì)胞與含有一種核酸序列的載體相接觸，以獲得轉(zhuǎn)化了的植物細(xì)胞，該核酸序列含有至少一個(gè)破壞或干擾FT多肽表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因，該基因與啟動(dòng)子有效連接；從所說的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞產(chǎn)生植株；篩選表現(xiàn)延遲成花的植株。53．培育具有延遲成花特征的遺傳修飾植物的方法，該方法包括將植物細(xì)胞與含F(xiàn)T反義核酸序列的載體接觸，以獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，該基因與一種啟動(dòng)子有效相連；由轉(zhuǎn)化了的植物細(xì)胞產(chǎn)生植株；篩選表現(xiàn)延遲成花的植株。54．包含SEQIDNO:3核苷酸序列的反義核酸序列。55．一種分離的多肽，它具有SEQIDNO:2的氨基酸序列。56．用于鑒定影響FT活性或表達(dá)的化合物的方法，包括在組分能相互作用的條件下，溫育包含該化合物和FT多肽或表達(dá)FT多肽的重組細(xì)胞的各組分；測(cè)定該化合物對(duì)FT的活性或表達(dá)的影響；57．權(quán)利要求56所述的方法，其中所說的影響是FT活性或表達(dá)的抑制。58．權(quán)利要求56所述的方法，其中所說的影響是FT活性或表達(dá)的刺激。全文摘要本發(fā)明提供了一種被稱作“FT”的基團(tuán),表示開花基因座T,以及由FT編碼的調(diào)節(jié)植物成花的多肽。FT可用于本發(fā)明的生產(chǎn)遺傳修飾的植物的方法,該植物的特征為具有調(diào)節(jié)成花的表型性狀,例如提早或延遲開花。這種植物可用編碼功能性的FT肽的核酸;至少一個(gè)FT的反義核酸;編碼野生型FT多肽的結(jié)構(gòu)基因;或者編碼負(fù)顯性多肽的結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行遺傳修飾,以調(diào)節(jié)植物的成花。文檔編號(hào)C12N15/29GK1302328SQ99806502公開日2001年7月4日申請(qǐng)日期1999年4月13日優(yōu)先權(quán)日1998年4月15日發(fā)明者德特勒夫·魏格爾申請(qǐng)人:索爾克生物研究學(xué)會(huì)被以下專利引用(1),