專利名稱：與法尼基指導(dǎo)的內(nèi)肽酶有關(guān)的新核酸和多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明背景含有C-末端CAAX基序的真核蛋白最終形成成熟和具有生物學(xué)活性的多肽需經(jīng)過(guò)一系列修飾，包括異戊二烯化、蛋白水解和甲基化。Ras即是修飾的異戊二烯化蛋白的一個(gè)例子。法尼基指導(dǎo)的內(nèi)肽酶是異戊二烯化蛋白加工所涉及的一類酶。由于法尼基指導(dǎo)的內(nèi)肽酶參與了ras信號(hào)途徑，所以它在各種細(xì)胞過(guò)程包括細(xì)胞增殖疾病中具有根本性的作用。
本發(fā)明描述本發(fā)明涉及法尼基指導(dǎo)的內(nèi)肽酶、尤其是哺乳動(dòng)物的法尼基指導(dǎo)的內(nèi)肽酶例如人或鼠的RCE1的所有方面。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離的哺乳動(dòng)物RCE1多肽或其片段、編碼哺乳動(dòng)物RCE1多肽或其片段的分離的核酸以及這些多肽和核酸的衍生物。本發(fā)明的另一特征涉及相關(guān)的多肽，例如可通過(guò)與哺乳動(dòng)物RCE1核酸雜交獲得的核酸編碼的多肽。
本發(fā)明還涉及應(yīng)用這些多肽、核酸或其衍生物的方法，例如在治療、診斷中的應(yīng)用和作為研究工具如鑒定調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物RCE1的化合物。本發(fā)明還涉及RCE1的配體如抗體、核酸相似物(aptamer)和底物。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示人RCE1的核苷酸和氨基酸序列。
圖2顯示鼠RCE1的完整核苷酸序列。
圖3顯示鼠RCE1的完整氨基酸序列。
圖4顯示人、鼠和酵母RCE1氨基酸序列間的比較。顯示了共有序列。對(duì)氨基酸序列相同區(qū)域加以突出顯示。
圖5顯示人和鼠RCE1氨基酸序列間的比較。對(duì)序列不相同區(qū)域加以突出顯示。
本發(fā)明詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明，描述了一種新的多肽和編碼哺乳動(dòng)物RCE1多肽的核酸和多種核酸。本文中，RCE1多肽具有可天然獲得并具有至少一種下列活性的氨基酸序列內(nèi)切蛋白酶活性、底物結(jié)合活性、轉(zhuǎn)化促進(jìn)活性或RCE1特異的免疫原活性。
RCE1的內(nèi)切蛋白酶活性是指例如RCE1可在內(nèi)部的氨基酸識(shí)別位點(diǎn)處蛋白水解或酶解底物。該內(nèi)切蛋白酶優(yōu)選針對(duì)CAAX基序，其中A是任何一種脂肪族氨基酸，而X是任意一種氨基酸。在這種情況下，底物的完全裂解將產(chǎn)生兩個(gè)片段，每一片段的末端均由裂解位點(diǎn)的氨基酸殘基所確定，例如-C-COOH和-NH4-A。該內(nèi)切蛋白酶活性優(yōu)選依賴于底物與脂類的結(jié)合(如在半胱氨酸殘基上)，例如膽固醇中間物，如15-碳法尼基或20-碳香葉基香葉基(geranylgeranyl)部分。
由于底物作為一種配體必需首先附著于酶表面，酶才能執(zhí)行其催化反應(yīng)，故底物結(jié)合一般被認(rèn)為是酶催化反應(yīng)的第一步。該酶表面可指酶的活性位點(diǎn)。底物與酶表面的結(jié)合可涉及多種與酶的相互作用，例如與酶的一或多個(gè)氨基酸和/或功能基團(tuán)形成化學(xué)鍵。文中底物結(jié)合活性是指底物附著于酶上。與酶的附著可通過(guò)使酶抓住其天然存在的底物的一或多種相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)；然而，當(dāng)一個(gè)多肽抓住底物的相互作用的數(shù)量和質(zhì)量不如天然存在的相互作用時(shí)，它也具有底物結(jié)合活性。底物結(jié)合和催化活性可相互分開(kāi)。這樣，根據(jù)本發(fā)明的RCE1多肽可具有底物結(jié)合活性但無(wú)內(nèi)切蛋白酶活性。可選擇性地實(shí)施底物結(jié)合以實(shí)現(xiàn)底物的催化、競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性地與活性位點(diǎn)結(jié)合、不可逆地與酶附著、導(dǎo)致催化活性喪失(如使用自殺性底物)等。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面中，底物包含CAAX基序。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化促進(jìn)活性”是指使細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)化表型的活性，例如誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)非貼壁依賴生長(zhǎng)、增加ras活性等。這種作用可是部分或不完全的。例如，細(xì)胞中RCE1基因的表達(dá)可產(chǎn)生轉(zhuǎn)化表型，或可增強(qiáng)已轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表型。
免疫原活性是指該多肽可引起RCE1特異的免疫應(yīng)答。該免疫應(yīng)答可是體液免疫(如抗體誘導(dǎo))、細(xì)胞免疫或它們的組合。
RCE1上述活性可按以下實(shí)施例中描述的方法或根據(jù)技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行檢測(cè)。例如，內(nèi)切蛋白酶活性可按如下實(shí)施例中的描述進(jìn)行檢測(cè)。也可參見(jiàn)如酶學(xué)方法(Methods of Enzymology),250:251-266,1995；Boyartchuk等，科學(xué)(Science)275:1796,1997。底物結(jié)合活性可按傳統(tǒng)方法檢測(cè)。例如可采用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合方法如通過(guò)在有效條件下混合帶有可檢測(cè)標(biāo)記的底物、RCE1多肽或其片段、和用于測(cè)定底物結(jié)合活性的化合物，來(lái)鑒定與多肽或其衍生物結(jié)合的底物。該方法可在液相中完成，其中結(jié)合底物和游離底物可通過(guò)膜分離，或者如果需要，該方法也可在固相中完成?？刹捎酶咄糠椒ㄟM(jìn)行固相分析，如在芯片、晶片等上進(jìn)行。
哺乳動(dòng)物RCE1多肽是指具有可從天然來(lái)源獲得的氨基酸序列的哺乳動(dòng)物多肽。因此，它包括天然存在的、正常的、突變的、多態(tài)的等可獲自天然群體的氨基酸序列。天然來(lái)源包括例如活細(xì)胞(如來(lái)源于組織或整個(gè)生物體)、培養(yǎng)細(xì)胞系(包括原代或永生化細(xì)胞系)、活體解剖組織等。本發(fā)明還涉及全長(zhǎng)哺乳動(dòng)物RCE1多肽的片段。這些片段優(yōu)選具有生物學(xué)活性的片段。所謂生物學(xué)活性是指該多肽片段在生物系統(tǒng)中或與生物系統(tǒng)的成分一起時(shí)具有活性。生物學(xué)活性包括上述的各種活性，例如內(nèi)切蛋白酶活性、底物結(jié)合活性、轉(zhuǎn)化促進(jìn)活性和/或免疫原活性。片段可根據(jù)任何期望的方法制備，包括化學(xué)合成、遺傳工程、裂解產(chǎn)物等。見(jiàn)下。
本發(fā)明還涉及具有第1-329位氨基酸序列的人RCE1；連續(xù)含有第1-230和第252-329位氨基酸的變體；第231-251位氨基酸；19-329位氨基酸。見(jiàn)圖1。該329個(gè)氨基酸的多肽預(yù)測(cè)的分子量為大約35.8kDa。
除了人RCE1序列，另一種哺乳動(dòng)物-小鼠的RCE1序列也已獲得克隆和鑒定。這些序列包括AA021859、AA072190、AA154658、AA154864、AA168614、AA218396、AA619282、AA790517、AA77052、C86966、W14344、W57162。因此，本發(fā)明涉及圖2和3所示的全長(zhǎng)鼠RCE1序列。
哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物的其它同系物可根據(jù)各種方法獲得。例如，與RCE1的選擇性寡核苷酸(見(jiàn)下)雜交可用于篩選這些同系物，方法參見(jiàn)Sambrook等，分子克隆(Molecular Cloning)1989，第11章。這些同系物與RCE1可具有不同數(shù)量的核苷酸和氨基酸序列一致性和相似性。非哺乳動(dòng)物生物包括例如脊椎動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物、斑馬魚(yú)、雞、果蠅(Drosophila)、C.elegans、蛔蟲(chóng)、原核生物、植物、阿布屬植物、病毒等。
本發(fā)明還涉及RCE1特異的或獨(dú)特的氨基酸序列，例如一段僅出現(xiàn)于特定RCE1序列中而不出現(xiàn)于其它氨基酸序列的確定氨基酸序列。特異氨基酸序列可通過(guò)常規(guī)方法尋找，例如采用BLAST系列計(jì)算機(jī)程序搜索基因/蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。這些特異序列包括，例如人和鼠的而非酵母的RCE1；人的而非鼠或酵母的RCE1；鼠的而非人或酵母的RCE1。人和鼠的RCE1特異序列包括如AALGGD、TGIQPGT、MQLSMDCPCD、DGLKVV、ARCLTDMRWL、LVFRACM、RFRQSSVG和PKLYGS。見(jiàn)圖4。
鼠或人RCE1特異或獨(dú)特的氨基酸序列，當(dāng)其具有免疫原活性時(shí)，可用于制備多肽作為抗原以產(chǎn)生特異于RCE的免疫應(yīng)答。該免疫所獲的抗體可作為RCE蛋白的特異探針用于診斷或研究目的。
本發(fā)明的多肽例如具有圖1和圖3所示多肽序列的多肽，可通過(guò)現(xiàn)有方法進(jìn)行分析，以鑒定該多肽的結(jié)構(gòu)和/或功能域。例如，通過(guò)親水性研究(如Kyte和Doolittle，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Bio.),157:105,1982)分析圖1所示多肽編碼序列時(shí)，鑒定出了如下推斷的跨膜區(qū)域A25-W56、F72-W89、L109-M136、A181-F209、V223-I249、T251-L276和L284-L302。多種其它程序可用于分析其結(jié)構(gòu)并常規(guī)地預(yù)測(cè)其功能域，這些程序包括EMBL Protein Predict(EMBL蛋白預(yù)測(cè))；Rost和Sander，蛋白質(zhì)(Proteins),19:55-72,1994。
本發(fā)明多肽的氨基酸序列也可具有與圖1所示氨基酸序列100％或較少的一致性。在以下的討論中，序列一致性是指在圖1、圖2或圖4所示序列中發(fā)現(xiàn)的核苷酸或氨基酸同樣出現(xiàn)于相比較的一或多個(gè)序列(如酵母RCE1)的相應(yīng)位置。見(jiàn)圖4。與圖1或圖3所示氨基酸序列的一致性少于100％的多肽可含有多種對(duì)天然存在序列的替代，包括同源氨基酸替代。參見(jiàn)如下同源氨基酸替代的例子。相同和同源性殘基的數(shù)目除以相比較的RCE1多肽序列的總殘基數(shù)即是序列相似百分?jǐn)?shù)。為了計(jì)算序列一致性和相似性，可根據(jù)任何期望的方法、算法、計(jì)算機(jī)程序等，包括如FASTA、BLASTA來(lái)對(duì)比和計(jì)算相比較的序列。與圖1氨基酸序列的一致性少于100％的多肽可含有如約99％、97％、95％但大于35％的一致性。序列一致性的優(yōu)選數(shù)量是約大于94％(如，人和鼠之間顯示94％序列一致性)。
RCE1多肽、片段或替代的多肽還可含有多種修飾，這些修飾包括脂類修飾如異戊二烯化(如15-碳法尼基，20-碳香葉基香葉基)或其它膽固醇中間物和衍生物、甲基化、磷酸化、糖基化、共價(jià)修飾(如氨基酸R基團(tuán)的共價(jià)修飾)、氨基酸替代、氨基酸缺失或氨基酸插入。對(duì)多肽的修飾可按多種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括重組、合成、化學(xué)方法等。
可篩選RCE1多肽的突變以產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的RCE1，如內(nèi)切蛋白酶活性、底物結(jié)合活性、轉(zhuǎn)化促進(jìn)活性或免疫原活性。下文將討論這些突變體的篩選和制備。
本發(fā)明的多肽(如RCE1、其片段、其突變體)可以多種方式使用，例如用于各種分析、按下面描述用作免疫原制備抗體、用作生物學(xué)活性試劑(例如具有RCE1相關(guān)的一或多種活性)?？墒褂镁哂衦as底物結(jié)合活性并選擇性缺少其它活性的片段來(lái)阻斷ras的加工。這些片段可采用DNA形式(例如載體，裸露DNA等)施用，或采用其它可進(jìn)入細(xì)胞的形式，例如脂質(zhì)體、與吞噬試劑(phagocytosed agent)偶聯(lián)等形式。有用片段通?？赏ㄟ^(guò)檢測(cè)RCE1全長(zhǎng)的重疊片段抑制RCE1活性的能力來(lái)鑒定。這些活性的測(cè)定將在下文和實(shí)施例中描述。這些多肽還可按EP 496 162所述方法鑒定和制備。多肽也可進(jìn)行化學(xué)修飾等。
RCE1多肽、其衍生物或其片段可與一或多個(gè)結(jié)構(gòu)域、功能域、可檢測(cè)域、抗原域和/或期望的目標(biāo)多肽組合在一起，其排列方式自然界并不存在，即并非以天然存在的、例如從生物(如動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物例如人、鼠，或它們的細(xì)胞系)基因組制備的基因組片段RCE1基因中的排列方式存在。具有這些性質(zhì)的多肽是嵌合多肽或融合多肽。這種嵌合多肽可根據(jù)多種方法制備，包括化學(xué)的、合成的、半合成的、和/或重組方法。編碼嵌合多肽的嵌合核酸可在一個(gè)連續(xù)的或中斷的開(kāi)放閱讀框如含有內(nèi)含子、拼接位點(diǎn)、增強(qiáng)子等的開(kāi)放閱讀框中含有多個(gè)域或目標(biāo)多肽?？筛鶕?jù)多種方法制備嵌合核酸。參見(jiàn)如美國(guó)專利5,439,819。域或目標(biāo)多肽可具有任何期望的性質(zhì)，包括生物功能如催化功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)促進(jìn)、細(xì)胞導(dǎo)向(如導(dǎo)向內(nèi)體、溶酶體、ER、細(xì)胞核的信號(hào)序列、導(dǎo)向序列)等，結(jié)構(gòu)功能如疏水性、親水性、跨膜區(qū)等，受體-配體功能，和/或檢測(cè)功能如與酶、熒光多肽、綠色熒光蛋白相結(jié)合(Chalfie等，1994，科學(xué)263:802；Cheng等，1996，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology),14:606；Levy等，1996，自然生物技術(shù)，14:610)等。此外，當(dāng)RCE1多肽或其部分被導(dǎo)入宿主細(xì)胞后其可用作篩選標(biāo)記。例如，編碼本發(fā)明的氨基酸序列的核酸可與目標(biāo)編碼序列在閱讀框中融合，并作為標(biāo)簽用于純化、篩選或標(biāo)記目的。融合區(qū)域可編碼一個(gè)裂解位點(diǎn)以利于表達(dá)、分離、純化等。
本發(fā)明的多肽可在本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)，如體內(nèi)、體外、無(wú)細(xì)胞、重組、細(xì)胞融合等系統(tǒng)中產(chǎn)生。由這些系統(tǒng)賦予的多肽修飾包括糖基化，氨基酸替代(如由于采用的密碼子不同)，多肽加工如消化、裂解、內(nèi)肽酶或外肽酶活性、化學(xué)部分包括脂類(異戊二烯化)、磷酸根的結(jié)合等。
本發(fā)明的多肽可根據(jù)常規(guī)方法從天然原料、轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(培養(yǎng)基或細(xì)胞)中回收，這些方法包括去污劑抽提(如CHAPSO、辛基葡糖苷)、硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、羥基磷灰石層析和外源凝集素層析。如果需要可采用蛋白重折疊步驟以完成成熟蛋白的構(gòu)象。最后，可采用高效液相層析(HPLC)進(jìn)行最終的純化步驟。
哺乳動(dòng)物RCE1核酸或其片段是指具有天然來(lái)源核苷酸序列的核酸，或是包括可天然獲得的哺乳動(dòng)物RCE1多肽編碼序列的核酸。見(jiàn)上。因此，它包括正常、突變、多態(tài)、簡(jiǎn)并序列等天然存在序列，以及可獲自天然群體的等位基因。天然來(lái)源包括如獲自組織和整個(gè)生物的活細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞系(包括原代和永生化細(xì)胞系)。人RCE1在例如心臟、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎、胰臟、脾、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸和外周血白細(xì)胞中表達(dá)。它還在各種癌細(xì)胞中表達(dá)，包括HL-60、Hela細(xì)胞S3、慢性骨髓白血病K-562、成淋巴細(xì)胞白血病MOLT-4、Burkitt氏淋巴瘤Raji、結(jié)腸直腸腺癌SW480、肺癌A549、和黑素瘤G361。
人RCE1等位基因的核酸序列見(jiàn)圖1，它在第32到1021位核苷酸處含有一個(gè)329個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框。該核酸的一個(gè)拼接變體也描述于圖1，它在第32-722位和第786-1021位核苷酸處含有一個(gè)308個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框。本發(fā)明還涉及在拼接變體中不存在的第723-785位核苷酸(其中的有用片段)，該片段可用于例如作為探針檢測(cè)mRNA表達(dá)。本發(fā)明的核酸序列可含有從第1位氨基酸到第329位氨基酸的全部編碼序列、其簡(jiǎn)并序列和其片段。根據(jù)本發(fā)明的核酸還可含有上述和下述任何核苷酸序列的100％互補(bǔ)核苷酸序列，如反義核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的核酸可從各種不同的來(lái)源獲得。它可來(lái)源于例如分離自組織、細(xì)胞、或整個(gè)生物的DNA或RNA如聚腺苷酸化mRNA。該核酸可直接來(lái)源于DNA或RNA，或cDNA文庫(kù)。該核酸可來(lái)源于處于特定發(fā)育時(shí)期的、具有目標(biāo)基因型、表型(如致癌性轉(zhuǎn)化細(xì)胞或癌性細(xì)胞)等的細(xì)胞。
含有編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的核酸可僅包括RCE1編碼序列；或包括RCE1編碼序列和其它編碼序列(如編碼前導(dǎo)肽、分泌肽、導(dǎo)向肽、酶、熒光或其它診斷多肽的序列)，或RCE1編碼序列和非編碼序列(如位于5’端、3’端或分散于編碼序列內(nèi)的非翻譯序列如內(nèi)含子)。含有不中斷的RCE1多肽編碼核苷酸序列的核酸意味著該核苷酸序列含有RCE1多肽的氨基酸編碼序列，且該編碼序列中無(wú)非編碼核苷酸的中斷或介入如無(wú)內(nèi)含子。也可將這種核苷酸序列描述為連續(xù)的。編碼RCE1的基因組DNA可通過(guò)常規(guī)方法獲得。
根據(jù)本發(fā)明的核酸也可含有可操作地與上述核酸連接的表達(dá)控制序列。短語(yǔ)“表達(dá)控制序列”是指調(diào)節(jié)與其操作性連接的核酸所編碼的多肽的表達(dá)的核酸序列。表達(dá)的調(diào)節(jié)可發(fā)生在mRNA或多肽水平。因此，該表達(dá)調(diào)節(jié)序列包括mRNA相關(guān)元件和蛋白相關(guān)元件。這些元件包括啟動(dòng)子、(病毒的或細(xì)胞的)增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合序列、轉(zhuǎn)錄終止子等。當(dāng)表達(dá)控制序列以一種方式放置可實(shí)現(xiàn)或獲得核苷酸編碼序列的表達(dá)時(shí)，則該表達(dá)控制序列即為可操作地與該編碼序列連接。例如，當(dāng)一個(gè)啟動(dòng)子可操作地連接到編碼序列的5’端時(shí)，該啟動(dòng)子就可驅(qū)動(dòng)該編碼序列的表達(dá)。表達(dá)控制序列可是與正?；虍愒吹幕蛲吹摹?br> 本發(fā)明的核酸可根據(jù)核酸雜交進(jìn)行篩選。兩條單鏈核酸制品雜交在一起的能力是它們的核苷酸序列互補(bǔ)性的量度，核苷酸序列互補(bǔ)性即核苷酸之間的堿基配對(duì)如A-T、C-G等。因此，本發(fā)明還涉及與含有圖1和圖2所示核苷酸序列的核酸雜交的核酸。與后面的序列雜交的核苷酸序列有一條互補(bǔ)核酸鏈，在聚合酶(即一種合適的核酸合成酶)存在時(shí)，其可作為合成模板。本發(fā)明包括核酸的雙鏈，即有義鏈和反義鏈。
可選擇雜交條件以選擇與圖1或2所示核苷酸具有期望大小的的核苷酸互補(bǔ)性的核酸。能與這種序列雜交的核酸與該序列間優(yōu)選具有85％、90％、更優(yōu)選95％、99％或更高的互補(bǔ)性。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與圖1或2所示核苷酸序列雜交的DNA序列。此處所用嚴(yán)格條件是指在核苷酸之間具有至少約85％、約94％、優(yōu)選約97％的核苷酸互補(bǔ)性時(shí)發(fā)生雜交的任何條件。嚴(yán)格條件包括50％甲酰胺，6×SSC或6×SSPE，可選擇性加入封閉劑(Denhardt’s試劑、BLOTTO、肝素、變性鮭精DNA片段)，42℃(如不加甲酰胺為68℃)。洗滌和雜交程序可參見(jiàn)Sambrook等，分子克隆，1989，第9章。雜交也可基于探針及其靶標(biāo)之間形成的雜交體的解鏈溫度(Tm)的計(jì)算，見(jiàn)Sambrook等。優(yōu)選排除的核酸有AA021859、AA072190、AA154658、AA154864、AA168614、AA218396、AA619282、AA790517、C77052、C86966、W14344、W57162、酵母RCE1或酵母RCE1的片段。
根據(jù)本發(fā)明，核酸或多肽可與圖1、2或3所示核苷酸和氨基酸序列有一或多個(gè)差異。核苷酸和/或氨基酸序列的改變或修飾可通過(guò)任何現(xiàn)有方法包括定向或隨機(jī)誘變來(lái)實(shí)現(xiàn)。
編碼本發(fā)明RCE1的核酸序列可包含在天然存在的RCE1基因中出現(xiàn)的核苷酸序列，“天然存在”包括例如多態(tài)性、正常或突變等位基因(核苷酸或氨基酸)、在天然哺乳動(dòng)物(如人、猴、豬、小鼠、大鼠或兔)群體中發(fā)現(xiàn)的突變。術(shù)語(yǔ)“天然存在”是指該核酸可來(lái)自天然來(lái)源如動(dòng)物組織和細(xì)胞、體液、組織培養(yǎng)細(xì)胞、法醫(yī)樣品。RCE1的天然存在突變可包括核苷酸序列的缺失(例如截短的氨基或羧基末端)、替代或插入。這些基因可按本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的方法通過(guò)核酸雜交檢測(cè)和分離。人們已認(rèn)識(shí)到，和其它癌基因類似，RCE1天然存在的變體包括在宿主細(xì)胞和生物中致病的缺失、替代和插入。
編碼本發(fā)明的RCE1多肽的核酸序列可含有如圖1、2或3所示天然基因、轉(zhuǎn)錄本或cDNA中存在的密碼子，其也可含有編碼相同氨基酸序列的簡(jiǎn)并密碼子。
RCE1序列的修飾如突變也可根據(jù)對(duì)基因數(shù)據(jù)庫(kù)如Genbank、EMBL的同源性搜索來(lái)制備。序列同源性搜索可采用多種方法進(jìn)行，包括BLAST家族的計(jì)算機(jī)程序所描述的算法、Smith-Waterman算法等。例如可在不同序列(例如人和酵母RCE1)間鑒定出同源氨基酸，并可作為氨基酸替代的基礎(chǔ)。見(jiàn)例如圖2。
然后，可通過(guò)鑒定、對(duì)比多肽間的保守氨基酸之后修飾保守或非保守位氨基酸向RCE1序列中引入突變。
本發(fā)明的核酸和相應(yīng)多肽包括與圖1或圖2的核苷酸序列不同但表型沉默的序列。這些序列修飾包括例如不影響氨基酸序列的核苷酸替代(如相同氨基酸的不同密碼子或簡(jiǎn)并序列)，以同源氨基酸替代天然存在的氨基酸，同源氨基酸例如(基于側(cè)鏈的大小和極性的程度)小的非極性氨基酸半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸、蘇氨酸；小的極性氨基酸絲氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺；大的極性氨基酸谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸；中等大小的極性氨基酸酪氨酸、組氨酸、色氨酸；大的非極性氨基酸苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸。
同源氨基酸也可按如下方式分組不帶電荷的極性R基氨基酸，包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；酸性氨基酸(帶負(fù)電荷)，包括天冬氨酸、谷氨酸；堿性氨基酸(帶正電荷)，包括賴氨酸、精氨酸、組氨酸。
同源氨基酸還包括Dayhoff的蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖集5(Atlas ofProtein Sequence and Structure 5)(1978)和Argos的EMBO J.,8,779-785(1989)所描述的氨基酸。
核酸可包含編碼具有圖1或圖3所示氨基酸序列之多肽的核苷酸序列，除了該序列的一或多個(gè)位置由保守氨基酸替代；或包含編碼具有圖1或圖3所示氨基酸序列之多肽的核苷酸序列，除了該序列有例如1、5、10、15、20個(gè)替代，此處替代是保守氨基酸。本發(fā)明還涉及這些核酸所編碼的多肽。此外，按需要可改變?cè)撔蛄兄械拿艽a子以優(yōu)化其在目標(biāo)宿主中的表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的核酸可包括例如DNA、RNA、合成核酸、肽核酸、修飾的核苷酸或它們的混合物。DNA可是單鏈的也可是雙鏈的。構(gòu)成核酸的核苷酸可通過(guò)各種已知的連接方式連接起來(lái)，例如酯、氨基磺酸酯、磺酰胺、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基甲酸酯等，對(duì)這些方法的選擇依賴于所要達(dá)到的目的，例如抗核酸酶(如RNaseH)、改善體內(nèi)穩(wěn)定性等。見(jiàn)例如美國(guó)專利5,378,825。
可對(duì)核酸作各種修飾，例如加上可檢測(cè)標(biāo)記(抗生物素蛋白、生物素、放射性元素)或改善雜交、檢測(cè)或穩(wěn)定性的部分。還可根據(jù)所需要的方法將該核酸附著于固相支持物上，例如硝酸纖維素、磁性或順磁性微球體(如參見(jiàn)美國(guó)專利5,411,863；美國(guó)專利5,543,289；包括例如鐵磁體、超磁體、順磁體、超順磁體、氧化鐵和多糖)、尼龍、瓊脂糖、重氮化纖維素、乳膠固體微球、聚丙烯酰胺等。見(jiàn)例如美國(guó)專利5,470,967、5,476,925、5,478,893。
本發(fā)明的另一方面涉及寡核苷酸和核酸探針。這些寡核苷酸或核酸探針可用于例如檢測(cè)、定量、或分離測(cè)試樣品中的RCE1核酸。檢測(cè)可期望用于各種不同目的，包括研究、診斷和法醫(yī)目的。對(duì)于診斷目的，可能期望鑒定樣品中RCE1核酸序列的存在或數(shù)量，其中所述樣品可來(lái)源于組織、細(xì)胞、體液等。在一個(gè)優(yōu)選方法中，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)RCE1核酸的方法，其包括在可有效實(shí)現(xiàn)靶核酸與寡核苷酸雜交的條件下用該寡核苷酸接觸測(cè)試樣品中的靶核酸，然后檢測(cè)雜交。根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸還可用于合成性核酸擴(kuò)增如PCR(例如Saiki等，1988，科學(xué)，241:53；美國(guó)專利4,683,202；PCR手冊(cè)方法和應(yīng)用指南(PCR Protocol:A Guideto Methods and Applications),Innis等編,Academic Press,New York,1990)或差異顯示(見(jiàn)例如Liang等，核酸研究(Nucl.Acid.Res.)，21:3269-3275,1993；美國(guó)專利5,599,672；W097/18454)。有用的寡核苷酸包括例如圖1的723-785位核苷酸5’CAGTGTTCTCCTGCCTCAGCCT 3’(有義鏈)，5’TCCATAGAGAGCTGCATCAGTG 3’(反義鏈)；5’CCTCACAGACATGCGTTGGCTGCGGAAC 3’(有義鏈)，和5’GGGTGCTCCAAGGCCGCGCAAAC 3’(反義鏈)。檢測(cè)可聯(lián)合針對(duì)其它基因如ras的寡核苷酸來(lái)完成。方法和探針參見(jiàn)如美國(guó)專利5,591,582。
本發(fā)明的另一方面涉及RCE1獨(dú)特的核苷酸序列。所謂RCE1獨(dú)特序列是指存在于RCE1例如圖1或圖2之核苷酸序列中的確定順序的核苷酸，但該核苷酸在其它核酸，尤其是動(dòng)物優(yōu)選哺乳動(dòng)物如人、大鼠、小鼠等的核酸中很少或不常見(jiàn)。有義鏈和反義鏈均包括在內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的獨(dú)特核酸可按常規(guī)方法鑒定。含有RCE1獨(dú)特序列的核酸可用作雜交探針通過(guò)例如Northern印跡鑒定含有核酸混合物的樣品中是否存在RCE1。雜交可在嚴(yán)格條件下進(jìn)行以篩選與探針有至少95％一致性(即互補(bǔ))的核酸，但雜交也可采用不太嚴(yán)格的條件。獨(dú)特RCE1核苷酸序列還可與本專利中提及的各種核苷酸序列的5’端或3端在編碼框中融合，這些核苷酸序列包括RCE1其它部分、酶、GFP等的編碼序列，以及表達(dá)控制序列等。
雜交可根據(jù)期望的選擇性在不同條件下進(jìn)行，例如參見(jiàn)Sambrook等，分子克隆，1989。例如，為特異檢測(cè)RCE1’可在寡核苷酸僅雜交RCE1的條件下進(jìn)行該寡核苷酸與靶核酸的雜交，這時(shí)寡核苷酸與靶核酸100％互補(bǔ)。如需要篩選少于100％的、至少大約如99％、97％、95％、90％、70％、67％的核苷酸互補(bǔ)的靶核酸，可采用不同的條件。由于RCE1的突變會(huì)引起疾病或病理狀態(tài)，如癌癥、良性腫瘤，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸可用于診斷。例如，對(duì)于表現(xiàn)與Ras信號(hào)途徑(見(jiàn)下)相關(guān)的癌癥或其它疾病癥狀的患者，可采用如下步驟診斷疾病采用根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸，并聯(lián)合ras信號(hào)途徑中其它癌基因或基因(如GRB2,H-、K-、和N-ras,c-Raf,MAP激酶，p42,p44,Ser/Thr激酶，Elk-1,c-myc,c-Jun,G蛋白，F(xiàn)tase,PPSEP,PPSMT等)的寡核苷酸，用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，之后進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定序列是否正常。在一個(gè)優(yōu)選方法中，本發(fā)明涉及診斷癌癥的方法，其包括在允許靶核酸與寡核苷酸有效雜交的條件下將該寡核苷酸與含有靶核酸的樣品接觸；檢測(cè)雜交，其中該寡核苷酸含有RCE1序列，優(yōu)選RCE1的獨(dú)特序列；并測(cè)定與該寡核苷酸雜交的靶核酸的核苷酸序列。序列的測(cè)定可采用多種方法，包括分離靶核酸，或其cDNA，并根據(jù)所需方法測(cè)定其序列。
根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸(核酸)可是任意需要的大小，例如約10-200個(gè)核苷酸、12-100個(gè)核苷酸，優(yōu)選12-50、12-25、14-16，至少大約15，至少大約20個(gè)核苷酸等。這些寡核苷酸可含有非天然存在的核苷酸例如肌苷。這些寡核苷酸與圖1或圖2之序列100％一致或互補(bǔ)，或其可含有不匹配核苷酸或核苷酸替代例如1、2、3、4、或5個(gè)替代。根據(jù)本發(fā)明，該核苷酸可組成試劑盒，該試劑盒中包括適宜的緩沖液(如磷酸鹽、tris等)，檢測(cè)組分等。該寡核苷酸可使用本領(lǐng)域已知的放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記或不標(biāo)記。
還可從根據(jù)本發(fā)明的核酸制備反義核酸，優(yōu)選圖1、2或3之編碼序列的反義核酸。反義核酸有多種用途，例如調(diào)節(jié)RCE1的表達(dá)(如抑制其表達(dá))、檢測(cè)其表達(dá)、或用于原位雜交。這些核苷酸可按類似美國(guó)專利5,576,208所述方法使用以抑制ras。為了達(dá)到調(diào)節(jié)RCE1表達(dá)的目的，可將反義寡核苷酸可操作性地與表達(dá)控制序列連接。
根據(jù)本發(fā)明的核酸可根據(jù)任何適宜的方法進(jìn)行標(biāo)記。該核酸的標(biāo)記可采用放射性示蹤物如32p、35S、125I、3H、或14C(在此僅提及了最常用的示蹤物)?？筛鶕?jù)任何方法進(jìn)行放射性標(biāo)記，如采用放射性標(biāo)記核苷酸、多核苷酸激酶(可用也可不用磷酸酶去磷酸化)或連接酶(依賴于將標(biāo)記的末端)進(jìn)行3’或5’末端標(biāo)記。還可使用非放射性標(biāo)記，即將本發(fā)明的核酸與具有如下性質(zhì)的殘基結(jié)合免疫學(xué)特性(抗原或半抗原)、與特定試劑(配體)的特異親和性、完成可檢測(cè)酶反應(yīng)的性質(zhì)(酶或輔酶、酶底物、或其它參與酶反應(yīng)的物質(zhì))或特征性物理性質(zhì)如熒光或在希望波長(zhǎng)的光發(fā)射或吸收，等。
根據(jù)本發(fā)明的核酸，包括寡核苷酸、反義核酸等，可用于通過(guò)各種技術(shù)檢測(cè)RCE1在整個(gè)器官、組織、細(xì)胞等中的表達(dá)，所述技術(shù)包括Northern印跡、PCR、原位雜交等。這些核酸尤其有利于檢測(cè)RCE1的紊亂表達(dá)如細(xì)胞特異性和/或亞細(xì)胞改變。RCE1的水平可單獨(dú)測(cè)定，也可與其它基因(癌基因如ras)產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄本等聯(lián)合測(cè)定。
根據(jù)本發(fā)明的核酸可根據(jù)不同目的在各種不同的體內(nèi)和體外表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。例如，可將核酸插入表達(dá)載體，導(dǎo)入目標(biāo)宿主，然后在實(shí)現(xiàn)該核酸編碼多肽有效表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。有效條件包括任何適合宿主細(xì)胞中該多肽生產(chǎn)的培養(yǎng)條件，包括有效溫度、pH、培養(yǎng)基、培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中的添加物(如擴(kuò)大或誘導(dǎo)表達(dá)的添加物例如丁酸鹽或當(dāng)編碼核酸鄰近dhfr基因時(shí)可加入氨甲蝶呤)，環(huán)己酰胺、細(xì)胞密度、培養(yǎng)皿等?？刹捎萌魏斡行У姆椒▽⒑怂釋?dǎo)入細(xì)胞，這些方法包括例如裸DNA、磷酸鈣沉淀、電穿孔、注射、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體融合、與增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)其攝取的試劑聯(lián)合使用、病毒轉(zhuǎn)染。導(dǎo)入了本發(fā)明核酸的細(xì)胞是轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。該核酸可位于染色體外或整合于宿主細(xì)胞的一或多條染色體上。其可是穩(wěn)定的或瞬時(shí)的。選擇與宿主細(xì)胞兼容的表達(dá)載體。宿主細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞如COS-7、CH0、HeLa、LTK、NIH3T3,酵母，昆蟲(chóng)細(xì)胞如Sf9(S.frugipeda)、High Five Cells(Invitrogen)、果蠅，細(xì)菌如大腸桿菌、鏈球菌、芽胞桿菌，酵母，真菌細(xì)胞，植物，胚胎干細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物如鼠或人的)，癌或腫瘤細(xì)胞。Sf9優(yōu)選用于昆蟲(chóng)表達(dá)；表達(dá)的實(shí)施可根據(jù)例如O’Reilly等，桿狀病毒表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory Manual)，F(xiàn)reeman,NY,1992。HEK293哺乳動(dòng)物細(xì)胞可用于哺乳動(dòng)物的超表達(dá)。見(jiàn)例如Collins等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),271:17349-17353(1996)。對(duì)表達(dá)控制序列的選擇同樣根據(jù)宿主兼容性和所需目的如高拷貝數(shù)、高表達(dá)量、誘導(dǎo)、擴(kuò)增、控制表達(dá)?？墒褂玫钠渌蛄邪ㄔ鰪?qiáng)子如SV40、CMV、RSV，可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，細(xì)胞類型特異性元件或允許選擇性或特異性細(xì)胞表達(dá)的序列?？捎糜趩?dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子包括例如同源性啟動(dòng)子、MMTV、SV40；用于細(xì)菌宿主的trp、lac、tac、或T7啟動(dòng)子；或用于酵母的α因子、醇氧化酶或PGH的啟動(dòng)子。
為了如調(diào)節(jié)RCE1表達(dá)、闡明RCE1的功能或目標(biāo)基因的功能，可向同一個(gè)宿主中導(dǎo)入另一個(gè)目標(biāo)基因。目標(biāo)基因包括其它癌基因、參與細(xì)胞周期的基因等。這些基因可是正?；颍蜃凅w如突變、嵌合、多態(tài)性等。
本發(fā)明的核酸或多肽可用作核酸或蛋白電泳、層析等的分子量標(biāo)準(zhǔn)?？赏ㄟ^(guò)掃描序列的限制性位點(diǎn)、計(jì)算大小以及進(jìn)行相應(yīng)的限制性酶切消化確定明確的限制性片段。RCE1多肽也可在蛋白凝膠電泳中用作35.8kd分子量標(biāo)準(zhǔn)。本文公開(kāi)的RCE1 DNA也可在DNA凝膠電泳中用作1472bp的標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明的另一方面涉及調(diào)節(jié)RCE1基因參與的生物途徑，尤其是病理狀態(tài)。例如細(xì)胞增殖(如癌)、生長(zhǎng)控制、形態(tài)發(fā)生，參見(jiàn)268:233-239,1995；Bussey，科學(xué)，272:225-226,1996。例如，RCE1參與了ras依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。其負(fù)責(zé)ras成熟步驟中的一步一ras的COOH-端加工。ras(野生型、突變型、組成型等ras)的過(guò)量表達(dá)將導(dǎo)致致癌活性。治療ras過(guò)量表達(dá)的一個(gè)方法是抑制ras的成熟途徑以使其不能被完全加工，引起非活性ras的積累，從而消除或降低其致癌作用。根據(jù)本發(fā)明，可通過(guò)封閉RCE1活性來(lái)抑制ras成熟途徑。這種活性封閉的實(shí)現(xiàn)可有多種方法，包括施用RCE1的抗體或其它配體、RCE1肽(尤其是可結(jié)合CAAX基序但缺乏內(nèi)切蛋白水解活性的RCE1肽)、RCE1內(nèi)切蛋白酶抑制劑、反義或雙鏈RNA(例如Fire等，自然(Nature),391:806-811,1998)。封閉劑可根據(jù)本文所述方法或本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行鑒定。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及鑒定調(diào)節(jié)RCE1活性的化合物。該活性可通過(guò)增加、減少、拮抗、促進(jìn)、穩(wěn)定RCE1等方法來(lái)調(diào)節(jié)。本發(fā)明的一個(gè)方法中，RCE1活性的測(cè)定具體如下在哺乳動(dòng)物RCE1能有效蛋白水解除去底物的AAX氨基酸殘基，使該底物暴露出Cys-COOH末端的條件下，在存在被測(cè)化合物時(shí)使含有CAAX多肽基序的底物與哺乳動(dòng)物RCE1反應(yīng)；檢測(cè)蛋白水解除去的AAX殘基；并通過(guò)比較該被測(cè)化合物存在時(shí)和不存在時(shí)蛋白水解除去的AAX殘基量，確定該被測(cè)化合物是否能調(diào)節(jié)RCE1活性。
可酶解消化的底物，即可被RCE1蛋白水解的底物，優(yōu)選包含CAAX識(shí)別位點(diǎn)的多肽，在該位點(diǎn)RCE1切割于半胱氨酸和脂肪族氨基酸之間，或含有異戊二烯化CAAX的多肽如法尼基化或香葉基香葉基CAAX多肽。任何可被RCE1作用的底物都是適合的。因此，底物可含有其它原子例如通過(guò)肽鍵或其它鍵連接的額外氨基酸，并可按任何期望的方式進(jìn)行修飾。例如，可將底物固定在固相支持物上，如由下列物質(zhì)構(gòu)成的支持物乳膠、瓊脂糖凝膠(sepharose)、二氧化硅、瓊脂糖、葡聚糖凝膠(sephadex)、纖維素、多糖、玻璃、聚合物等。還可用可檢測(cè)標(biāo)記物如抗體、抗生物素蛋白、生物素、放射性標(biāo)記、aptamer、熒光標(biāo)記、核酸等標(biāo)記底物。底物還可含有磷酸、甲基、糖或脂。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，底物含有脂如膽固醇中間物(如15-碳法尼基或20-碳香葉基香葉基)。優(yōu)選該底物是異戊二烯化的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，底物是生物素-Lys-Lys-Ser-Lys-Thr-Lys-(法尼基)Cys-Val-Ile-Met，更一般地，它是一個(gè)含有香葉基香葉基化的CAAX的多肽。所述被測(cè)化合物優(yōu)選與RCE1在RCE1可切割該底物的環(huán)境中反應(yīng)。這種環(huán)境可被稱為有效條件?？稍跓o(wú)被測(cè)化合物時(shí)測(cè)定這些條件以確立一個(gè)基線活性即作為對(duì)照?？刹捎贸Ｒ?guī)方法篩選有效反應(yīng)條件，如所用的鹽、緩沖液、還原和/或氧化劑、pH值等。當(dāng)使用含有CAAX基序的底物時(shí)，有效裂解導(dǎo)致底物的AAX殘基的去除并暴露出Cys-COOH末端。
在可進(jìn)行蛋白水解的條件下將底物、被測(cè)化合物和RCE1進(jìn)行反應(yīng)，之后測(cè)定蛋白水解是否發(fā)生。如同有效反應(yīng)條件的選擇一樣，可在無(wú)被測(cè)化合物時(shí)優(yōu)化蛋白水解的測(cè)定，以確立RCE1的基線活性。一般地，蛋白水解檢測(cè)包括反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定。例如，當(dāng)裂解位點(diǎn)是一個(gè)氨基酸序列時(shí)，底物的完全蛋白水解將產(chǎn)生具有新的3’和5’末端的裂解產(chǎn)物。這些產(chǎn)物可按如下方法直接測(cè)定，如層析、電泳、質(zhì)譜分析、免疫分析等，或可通過(guò)測(cè)定新末端的出現(xiàn)或性質(zhì)等方法檢測(cè)末端。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，底物含有CAAX且裂解產(chǎn)生Cys-COOH末端的出現(xiàn)，通過(guò)甲基化酶和標(biāo)記的甲硫氨酸底物甲基化該末端來(lái)檢測(cè)該末端的出現(xiàn)。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，甲基化酶是異戊二烯基蛋白特異性甲基轉(zhuǎn)移酶(PPSMT)，甲硫氨酸底物是3H-S-腺苷甲硫氨酸?？砂磦鹘y(tǒng)方法分離所獲的標(biāo)記RCE1底物和游離標(biāo)記物。例如，如果RCE1底物的5’末端標(biāo)記了生物素，其可被優(yōu)選附著于小珠上的抗生物素蛋白所捕獲。此外，可將RCE1底物附著在固相表面如磁珠等之上，然后按常規(guī)方法進(jìn)行處理。
甲基化酶可從哺乳動(dòng)物細(xì)胞或酵母細(xì)胞等的細(xì)胞抽提物中純化和富集。抽提物或裂解物可獲自各種細(xì)胞，包括轉(zhuǎn)化了甲基轉(zhuǎn)移酶基因的細(xì)胞如酵母STE14。見(jiàn)例如Hrycyna等，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)250:251-266,1995。加入反應(yīng)混合液中的RCE1成分(即多肽或其內(nèi)切蛋白水解片段)可是多種形式，如基本純化的形式、作為細(xì)胞膜成分(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng))、或作為可溶性抽提物。在每種情況下，RCE1多肽均可獲自天然來(lái)源、重組來(lái)源，或可合成生產(chǎn)(化學(xué)或酶學(xué)方法生產(chǎn)，如全長(zhǎng)RCE1的裂解)。
優(yōu)選地，該RCE1在轉(zhuǎn)化了RCE1編碼序列(如cDNA、基因、基因組片段等)的細(xì)胞系中表達(dá)。在此情況下，RCE1作為細(xì)胞的異源成分存在；所謂異源是指RCE1不僅在不同種的細(xì)胞系中表達(dá)，RCE1還是由通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等方法導(dǎo)入細(xì)胞的編碼序列編碼的。優(yōu)選地，RCE1在細(xì)胞中高水平表達(dá)。編碼序列優(yōu)選人RCE1或其片段。見(jiàn)如圖1。RCE1的有用片段包含內(nèi)切蛋白酶活性和底物結(jié)合活性，如第19-329位氨基酸。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，RCE1以細(xì)胞裂解物的形式提供，例如轉(zhuǎn)化了RCE1的細(xì)胞裂解后，所獲裂解液直接用于分析，即粗裂解物?？蛇x擇從含有重組RCE1的粗裂解物中提純和富集RCE1。例如，分離膜組分等。例如，收獲表達(dá)RCE1的細(xì)胞(例如HEK293)，以PBS+20mM EDTA洗滌，采用低滲裂解緩沖液處理或氮抽空溶解細(xì)胞，低速離心去除不溶物和細(xì)胞碎片(包括未破裂細(xì)胞和細(xì)胞核)，然后以100,000g離心足夠長(zhǎng)時(shí)間以有效沉淀膜組分。
該實(shí)驗(yàn)的目的是篩選和鑒定調(diào)節(jié)RCE1活性的化合物。因此，典型地，分別在存在和不存在被測(cè)化合物時(shí)進(jìn)行蛋白水解檢測(cè)。化合物是否能調(diào)節(jié)RCE1活性可采用常規(guī)方法鑒定，例如通過(guò)被測(cè)化合物存在時(shí)發(fā)生的蛋白水解量的改變來(lái)鑒定。
該實(shí)驗(yàn)還可在整體細(xì)胞中進(jìn)行。例如，過(guò)表達(dá)RCE1的細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化促進(jìn)活性?？赏ㄟ^(guò)遺傳工程方法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)，例如轉(zhuǎn)化可操作地連接了強(qiáng)啟動(dòng)子的RCE1基因，然后篩選具有該活性的細(xì)胞系(如HEK293)，等。可將試劑施用于這樣的細(xì)胞，并通過(guò)如檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)等方法檢測(cè)其抑制轉(zhuǎn)化的能力。見(jiàn)例如美國(guó)專利5,688,655。也可按如下專利中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)美國(guó)專利5,710,171；5,703,241；5,585,359；5,557,729；5,532,359；5,470,832；5,420,245；5,185,248。
以這種或其它方法鑒定的化合物可用于在細(xì)胞、組織、整個(gè)生物體、原位、體外(在試管中，在固相支持物上等)、體內(nèi)、或任何希望的環(huán)境中調(diào)節(jié)RCE1活性。一般，具有體外活性的化合物將有利于體內(nèi)調(diào)節(jié)RCE1相關(guān)的生物途徑，如治療上述生物和細(xì)胞活性相關(guān)的病理狀態(tài)。因此本發(fā)明還涉及治療和防止ras介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的疾病和病理狀態(tài)，如癌癥、異常細(xì)胞增殖相關(guān)疾病。例如，本發(fā)明涉及一種治療癌癥的方法，其包括給需要治療的患者施用治療該疾病有效劑量的化合物，其中該化合物是RCE1基因或多肽表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。治療該疾病可指延緩其發(fā)生、延緩該疾病發(fā)展、改善或延緩疾病的臨床和病理癥狀。調(diào)節(jié)化合物或化合物混合物可是合成的、天然存在的、或兩者的結(jié)合。調(diào)節(jié)化合物可含有氨基酸、核苷酸、碳?xì)浠衔?、脂質(zhì)、多糖等。調(diào)節(jié)化合物優(yōu)選RCE1的調(diào)節(jié)劑，如抑制或增加其mRNA、蛋白表達(dá)、或加工的調(diào)節(jié)劑?？墒褂貌煌噭┱{(diào)節(jié)表達(dá)，如反義核酸、核酶、aptamer、合成化合物或天然存在的化合物。為了治療疾病，可將該化合物或混合物配制成含有藥物學(xué)可接受的載體和技術(shù)人員已知的其它賦形劑的藥物組合物。見(jiàn)例如Remington氏藥物學(xué)(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第十八版，Mack Publishing Company,1990。該組合物還可含有有效劑量的其它化合物，尤其是用于癌癥治療的化合物。
本發(fā)明還涉及特異識(shí)別RCE1多肽的抗體?？贵w如多克隆、單克隆、重組、嵌合抗體可根據(jù)任何適宜的方法制備。例如，為制備單克隆抗體，可將圖1的多肽按有效引起免疫應(yīng)答的劑量在有或無(wú)佐劑情況下通過(guò)皮下或腹膜內(nèi)途徑給小鼠、山羊或兔施用。該抗體還可是單鏈或FAb。該抗體可是IgG或亞型IgG2a、IgG1等?？贵w還可通過(guò)施用裸DNA產(chǎn)生。見(jiàn)例如美國(guó)專利5,703,055；5,589,466；5,580,859。
RCE1特異性抗體是指該抗體識(shí)別圖1或圖3之RCE1氨基酸序列中的或包含該序列的特定氨基酸序列。因此，如用免疫印跡分析檢測(cè)和/或測(cè)量，特異抗體結(jié)合圖1或圖3中的氨基酸序列即表位的親和性高于與其它蛋白的表位的結(jié)合。因此，特異于RCE1表位的抗體可用于檢測(cè)樣品中是否存在該表位，例如可區(qū)別含有RCE1基因產(chǎn)物的組織樣品和無(wú)該表位的樣品。這種抗體的用途描述于Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Research Product Catalog，并可據(jù)此配制，如100ug/ml。已產(chǎn)生了人RCE1羧基端12個(gè)殘基的特異抗體，這12個(gè)殘基序列是Glu-Arg-Ala-Gly-Asp-Ser-Glu-Ala-Pro-Leu-Cys-Ser。
此外，與根據(jù)本發(fā)明的RCE1多肽結(jié)合的配體或其衍生物還可采用如合成多肽文庫(kù)或aptamer來(lái)制備(例如Pitrung等，美國(guó)專利5,143,854；Geysen等，1987，免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods),102:259-274；Scott等，科學(xué)，249:386；Blackwell等，1990，科學(xué)，250:1104；Tuerk等，1990，科學(xué)，249:505)。
結(jié)合RCE1的抗體和其它配體可有多種用途，包括治療、診斷、和商業(yè)研究工具，如定量測(cè)定動(dòng)物、組織、細(xì)胞等中的RCE1多肽水平，鑒定RCE1的細(xì)胞定位和/或分布，純化RCE1或含有RCE1一部分的多肽，調(diào)節(jié)RCE1的功能，等。RCE1或其衍生物的抗體可用于Western印跡，ELISA，免疫沉淀、RIA等。本發(fā)明涉及進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)的方法、組分和試劑盒等。同樣，結(jié)合RCE1的抗體可用于從細(xì)胞裂解物中免疫沉淀RCE1以鑒定結(jié)合RCE1的物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的抗體可用于檢測(cè)多種樣品中的RCE1多肽或其片段，包括組織、細(xì)胞、體液、血、尿、腦脊液。本發(fā)明的方法包括在本領(lǐng)域已知的有效條件下將樣品與結(jié)合圖1或圖3之多肽的配體接觸以實(shí)現(xiàn)結(jié)合，檢測(cè)配體與多肽間的特異結(jié)合。特異結(jié)合是指配體與如圖1或圖3中的氨基酸序列或包含該序列的確定氨基酸序列結(jié)合。該抗體及其衍生物還可用于抑制RCE1或其片段的表達(dá)。RCE1多肽水平可單獨(dú)測(cè)定或聯(lián)合其它基因產(chǎn)物測(cè)定。具體地，RCE1多肽的量(如其表達(dá)水平)可與相同或不同樣品中的其它多肽如ras、Ftase等的量進(jìn)行比較(例如表示為比率)。RCE1的配體可聯(lián)合其它抗體如識(shí)別癌的腫瘤學(xué)標(biāo)志包括ras等的抗體，一起使用。一般地，特異于RCE1的試劑可根據(jù)任何希望的方法用于診斷和/或法醫(yī)研究，如美國(guó)專利5,397,712；5,434,050；5,429,947。
本發(fā)明還涉及標(biāo)記的RCE1多肽，其可根據(jù)任何適宜的方法制備，如美國(guó)專利5,434,050所公開(kāi)的方法。標(biāo)記多肽可用于如結(jié)合實(shí)驗(yàn)，以鑒定結(jié)合或附著RCE1的物質(zhì)，示蹤RCE1在細(xì)胞、體外、體內(nèi)或原位系統(tǒng)等中的運(yùn)動(dòng)。同樣，結(jié)合RCE1的抗體可用于從細(xì)胞裂解物中免疫沉淀RCE1以鑒定與RCE1共沉淀的物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的核酸、多肽、抗體、RCE1配體等均可是分離的。術(shù)語(yǔ)“分離的”是指物質(zhì)以其原始環(huán)境中不存在的形式存在，例如濃度更大、更純、與組分分離等。分離的核酸包括例如具有分離自活體動(dòng)物染色體DNA的RCE1序列的核酸。該核酸可是載體的一部分或插入染色體(通過(guò)特異基因?qū)蚧蛟谄湔Ｎ恢弥獾奈恢蒙想S機(jī)整合)，這種核酸仍是分離的，因?yàn)檫@些形式均非其天然環(huán)境中的存在形式。本發(fā)明的核酸或多肽還可是基本純的?；炯兪侵负怂峄蚨嚯谋环蛛x，并基本上不含有其它核酸或多肽，即該核酸或多肽是主要的和活性的成分。
本發(fā)明還涉及含有RCE1核酸的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如非人哺乳動(dòng)物如小鼠。可根據(jù)已知的方法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述方法包括例如重組基因原核注射至1細(xì)胞胚胎的原核中、將人工酵母染色體整合至胚胎干細(xì)胞、基因?qū)蚍椒?、胚胎干?xì)胞方法。見(jiàn)例如美國(guó)專利4,736,866；4,873,191；4,873,316；5,082,779；5,304,489,5,174,986；5,175,384；5,175,385；5,221,778；Gordon等，美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)77:7380-7384(1980)；Palmiter等，細(xì)胞(Cell)41:343-345(1985)；Palmiter等，Ann.Rev.Genet.,20:465-499(1986)；Askew等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Bio.)，13:4115-4124,1993；Games等，自然，373:523-527,1995；Valancius和Smithies，分子細(xì)胞生物學(xué)，11:1402-1408,1990；Stacey等，分子細(xì)胞生物學(xué)，14:1009-1016,1994；Hasty等，自然，350:243-246,1995；Rubinstein等，核酸研究，21:2613-2617,1993?？蓪⒏鶕?jù)本發(fā)明的核酸導(dǎo)入任何非人哺乳動(dòng)物，包括小鼠(Hogan等，1986，操作鼠胚胎實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Manipulating theMouse Embryo:A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor，紐約)，豬(Hammer等，自然，315:343-345,1985)，綿羊(Hammer等，自然，315:343-345,1985)，牛，大鼠，或靈長(zhǎng)類動(dòng)物。也見(jiàn)例如Church,1987，生物技術(shù)發(fā)展(Trends in Biotech.)5:13-19；Clark等，1987，生物技術(shù)發(fā)展，5:20-24；和DePamphilis等，1988，生物技術(shù)(Biotechniques)6:662-680。此外，例如常規(guī)轉(zhuǎn)基因大鼠和小鼠產(chǎn)品可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用作癌癥模型例如以檢測(cè)藥物，或用作蛇的食物。
一般地，本發(fā)明的核酸、多肽、抗體等的制備和使用可參見(jiàn)美國(guó)專利5,501,969,5,506,133,5,441,870；WO 90/00607；WO 91/15582。
這些核酸、多肽、抗體等的其它方面參考分子生物學(xué)、蛋白科學(xué)和免疫學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)。見(jiàn)例如Davis等(1986)，分子生物學(xué)基本方法(BasicMethods in Molecular Biology)，Elsevir Sciences Publishing公司，紐約；Hames等(1985)，核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization),ILPress；Sambrook等，分子克隆；分子生物學(xué)最新方法(Current Protocolsin Molecular Biology),F.M.Ausubel等編，John Wiley & Sons公司；人類遺傳學(xué)最新方法(Current Protocols in Human Genetics)，Nicholas C.Dracopoli等編，John Wiley & Sons公司；蛋白科學(xué)最新方法(Current Protocols in Protein Science),John E.Coligan等編，John Wiley & Sons公司；免疫學(xué)最新方法(Current Protocols inImmunology),John E.Coligan等編，John Wiley & Sons公司。
實(shí)施例說(shuō)明RCE1的實(shí)驗(yàn)可是一個(gè)與異戊二烯基指導(dǎo)的羧甲基化酶(酵母同系物STE14；見(jiàn)例如酶學(xué)方法(Methods Enzymol)1995,250:251-66)相連的偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)。生物素化、異戊二烯化多肽底物(例如，生物素-Lys-Lys-Ser-Lys-Thr-Lys-(法尼基)Cys-Val-Ile-Met)基于K-Ras-4B的C-端序列。簡(jiǎn)而言之，表達(dá)人RCE1的昆蟲(chóng)細(xì)胞膜切除底物最后三個(gè)氨基酸以暴露出(法尼基)Cys-羧基基團(tuán)；接著，內(nèi)源(或外源)異戊二烯基半胱氨酸指導(dǎo)的羧甲基化酶將使用共底物3H-S-腺苷甲硫氨酸使暴露的羧基基團(tuán)甲基化。整合至底物多肽的標(biāo)記采用鏈霉抗生物素蛋白包被的SPA珠進(jìn)行定量。
標(biāo)準(zhǔn)分析在96孔樣品板(Wallac Part No.1450-401)上進(jìn)行，總分析體積為100ul，其中一般含有50ul化合物、25ul膜和25ul3H-SAM/底物，并按此順序加入。pH 7.4的HEPES終濃度是100mM。
每孔加入25ul溶于100mM pH 7.4的HEPES中的膜，接著加入25ul稀釋底物(蛋白酶底物生物素-Lys-Lys-Ser-Lys-Thr-Lys-(法尼基)Cys-Val-Ile-Met在100％ DMSO中儲(chǔ)存于-20℃，臨使用前用10％ DMSO稀釋至所需工作濃度)。再向孔中加入標(biāo)記物即3H-SAM(約85Ci.mmol；1mCi/ml；12uM)，典型地每孔加入0.2ul，然后以100mMpH 7.4的HEPES補(bǔ)至25ul。然后將該板密封并室溫孵育60分鐘。加入150ul終止混合液(在pH7.1PBS+5mM EDTA+0.1％ Tween-20中含有250ug SPA珠)終止該反應(yīng)。再次密封該板并將這些小珠放置過(guò)夜，然后讀數(shù)。
無(wú)需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所述方法本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度的應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的優(yōu)選具體實(shí)施方案應(yīng)理解為僅是舉例說(shuō)明，而非以任何方式限制本公開(kāi)其余部分。
以上引用的和附圖中的所有專利申請(qǐng)、專利和出版物的完整公開(kāi)均以參考文獻(xiàn)方式并入本文。
從以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易明了本發(fā)明的本質(zhì)特征，而且在不偏離其主旨和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變更和修改以適應(yīng)于各種用途和條件。
權(quán)利要求
1．分離的哺乳動(dòng)物RCE1多肽或其生物學(xué)活性多肽片段，條件是所述多肽不是如下序列編碼的多肽AA021859、AA072190、AA154658、AA154864、AA168614、AA218396、AA619282、AA790517、C77052、C86966、W14344、或W57162。
2．權(quán)利要求1的分離的哺乳動(dòng)物RCE1或其生物學(xué)活性多肽片段，其中所述多肽具有內(nèi)切核酸酶活性、底物結(jié)合活性或免疫原活性。
3．權(quán)利要求1的分離的哺乳動(dòng)物RCE1或其生物學(xué)活性多肽片段，其中底物結(jié)合活性是結(jié)合異戊二烯化CAAX肽底物。
4．權(quán)利要求1的分離的哺乳動(dòng)物RCE1或其生物學(xué)活性多肽片段，其是人的。
5．權(quán)利要求1的分離的哺乳動(dòng)物RCE1或其生物學(xué)活性多肽片段，其是小鼠的。
6．權(quán)利要求1的分離的哺乳動(dòng)物RCE1，其是人的，并含有圖1所示第1-329位氨基酸。
7．權(quán)利要求1的分離的哺乳動(dòng)物RCE1，其是人的，并連續(xù)含有圖1所示第1-230位氨基酸和第252-329位氨基酸。
8．權(quán)利要求1的分離的哺乳動(dòng)物RCE1，其含有圖3所示第1-329位氨基酸。
9．權(quán)利要求1的分離的RCE1，其由在嚴(yán)格條件下與圖1所示DNA序列或其互補(bǔ)序列雜交的可天然獲得的核酸編碼，條件是所述序列不是AA021859、AA072190、AA154658、AA154864、AA168614、AA218396、AA619282、AA790517、C77052、C86966、W14344、W57162、酵母RCE1或酵母RCE1的片段。
10．權(quán)利要求9的分離的RCE1，其具有與圖1所示氨基酸序列至少95％的氨基酸一致性。
11．權(quán)利要求1的分離的RCE1，其由在嚴(yán)格條件下與圖2所示DNA序列或其互補(bǔ)序列雜交的可天然獲得的核酸編碼，條件是所述序列不是AA021859、AA072190、AA154658、AA154864、AA168614、AA218396、AA619282、AA790517、C77052、C86966、W14344、W57162、酵母RCE1或酵母RCE1的片段。
12．含有編碼哺乳動(dòng)物RCE1多肽或其生物學(xué)活性多肽片段的核苷酸序列的分離的核酸，條件是該序列不是AA021859、AA072190、AA154658、AA154864、AA168614、AA218396、AA619282、AA790517、C77052、C86966、W14344、或W57162。
13．權(quán)利要求12的分離的核酸，其中所述編碼多肽具有內(nèi)切核酸酶活性、底物結(jié)合活性或免疫原活性。
14．權(quán)利要求13的分離的核酸，其中底物結(jié)合活性是結(jié)合異戊二烯化CAAX肽底物。
15．權(quán)利要求12的分離的核酸，其是人的。
16．權(quán)利要求12的分離的核酸，其中所述核酸序列編碼圖1所示第1-329位氨基酸。
17．權(quán)利要求12的分離的核酸，其中所述核酸序列連續(xù)編碼圖1所示第1-230位氨基酸和第252-329位氨基酸。
18．權(quán)利要求12的分離的核酸，其具有圖1所示完整的核苷酸編碼序列或其互補(bǔ)序列。
19．權(quán)利要求18的分離的核酸，只是其中有一或多個(gè)氨基酸位置被替代或缺失，或此兩者均有，且該核酸編碼的多肽具有生物學(xué)活性。
20．權(quán)利要求18的分離的核酸，其中一或多個(gè)替代的氨基酸位置由同源氨基酸替代。
21．權(quán)利要求12的分離的核酸，其中所述核酸序列編碼選自圖1的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列具有內(nèi)切核酸酶活性、底物結(jié)合活性或免疫原活性。
22．權(quán)利要求12的分離的核酸，其由在嚴(yán)格條件下與圖1所示DNA序列或其互補(bǔ)序列雜交的可天然獲得的核酸編碼，條件是所述核酸不是AA021859,AA072190,AA154658,AA154864,AA168614,AA218396,AA619282,AA790517,C77052,C86966,W14344,W57162，酵母RCE1或酵母RCE1的片段。
23．權(quán)利要求12的分離的核酸，其本質(zhì)上由選自圖1所示核苷酸序列的任何連續(xù)12-100個(gè)堿基對(duì)或其互補(bǔ)序列構(gòu)成。
24．權(quán)利要求23的分離的核酸，在所述序列中出現(xiàn)至少一個(gè)但不超過(guò)5個(gè)核苷酸替代。
25．權(quán)利要求23的分離的核酸，其進(jìn)一步含有可檢測(cè)標(biāo)記。
26．權(quán)利要求12的分離的核酸，其具有圖2所示完整核苷酸編碼序列或其互補(bǔ)序列。
27．權(quán)利要求12的分離的核酸，其中該核苷酸序列可操作地與表達(dá)控制序列連接。
28．權(quán)利要求12的分離的核酸，其中該核酸含有可天然獲得的核苷酸序列。
29．權(quán)利要求12的分離的核酸，其中該核酸不間斷地編碼所述的多肽。
30．權(quán)利要求12的分離的核酸，其中該核酸是DNA或RNA。
31．權(quán)利要求11的分離的核酸，其中編碼的生物學(xué)活性多肽具有內(nèi)切核酸酶活性、底物結(jié)合活性或免疫原活性。
32．在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中表達(dá)核酸編碼的哺乳動(dòng)物RCE1多肽的方法，包括在有效表達(dá)該多肽的條件下培養(yǎng)含有根據(jù)權(quán)利要求12的核酸的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
33．權(quán)利要求32的方法，其進(jìn)一步包括分離該多肽。
34．權(quán)利要求32的方法，其進(jìn)一步包括調(diào)節(jié)該多肽的表達(dá)。
35．由權(quán)利要求32的方法生產(chǎn)的分離的多肽。
36．含有權(quán)利要求12的核酸的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
37．含有權(quán)利要求12的核酸的載體。
38．含有權(quán)利要求12的核酸的載體。
39．含有權(quán)利要求12的核酸的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物。
40．鑒定調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物RCE1活性的化合物的方法，包括在存在被測(cè)化合物時(shí)，在哺乳動(dòng)物RCE1或其內(nèi)切蛋白水解片段有效蛋白水解去除含有末端CAAX多肽基序的底物的AAX氨基酸殘基并暴露出底物的Cys-COOH末端的條件下，將含末端CAAX多肽基序的底物與哺乳動(dòng)物RCE1或所述片段反應(yīng)；檢測(cè)蛋白水解去除的AAX殘基；并通過(guò)比較存在和不存在該被測(cè)化合物時(shí)蛋白水解去除的AAX殘基的量，鑒定該被測(cè)化合物是否調(diào)節(jié)RCE1的內(nèi)切蛋白水解活性。
41．權(quán)利要求40的方法，其中所述底物是異戊二烯化的。
42．權(quán)利要求40的方法，其中所述底物是生物素-Lys-Lys-Ser-Lys-Thr-Lys-(法尼基)Cys-Val-Ile-Met。
43．權(quán)利要求40的方法，其中蛋白水解去除的檢測(cè)方法是檢測(cè)由哺乳動(dòng)物RCE1蛋白水解暴露的底物的Cys-COOH末端。
44．權(quán)利要求40的方法，其中蛋白水解去除的檢測(cè)方法是采用可檢測(cè)標(biāo)記-S-腺苷甲硫氨酸對(duì)哺乳動(dòng)物RCE1蛋白水解暴露的底物的Cys-COOH末端甲基化；檢測(cè)具有可檢測(cè)標(biāo)記的甲基化Cys-COOH。
45．權(quán)利要求40的方法，其中蛋白水解去除的檢測(cè)方法是采用可檢測(cè)標(biāo)記-S-腺苷甲硫氨酸對(duì)哺乳動(dòng)物RCE1蛋白水解暴露的底物的Cys-COOH末端甲基化，其中甲基化是由甲基轉(zhuǎn)移酶完成的，并產(chǎn)生具有可檢測(cè)標(biāo)記的甲基化Cys-COOH末端。
46．權(quán)利要求40的方法，其中所述甲基轉(zhuǎn)移酶是異戊二烯基蛋白特異的。
47．權(quán)利要求40的方法，其中所述哺乳動(dòng)物RCE1是基本純化的。
48．權(quán)利要求40的方法，其中所述哺乳動(dòng)物RCE1作為細(xì)胞膜的異源成分存在。
49．權(quán)利要求40的方法，其中所述哺乳動(dòng)物RCE1作為細(xì)胞膜抽提物的異源成分存在。
50．權(quán)利要求40的方法，其中多肽底物是生物素-Lys-Lys-Ser-Lys-Thr-Lys-(法尼基)Cys-Val-Ile-Met，且蛋白水解去除的檢測(cè)方法是采用可檢測(cè)標(biāo)記-S-腺苷甲硫氨酸對(duì)哺乳動(dòng)物RCE1蛋白水解暴露的底物的Cys-COOH末端甲基化，其中甲基化是由甲基轉(zhuǎn)移酶完成的，并產(chǎn)生具有可檢測(cè)標(biāo)記的甲基化Cys-COOH底物末端；采用鏈霉抗生物素蛋白包被的小珠捕獲該底物；對(duì)存在于捕獲底物中的可檢測(cè)標(biāo)記定量。
51．權(quán)利要求40的方法，其中哺乳動(dòng)物RCE1是人或小鼠的。
52．調(diào)節(jié)ras依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的方法，包括在所述核酸以有效調(diào)節(jié)所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的量表達(dá)的條件下，向所述細(xì)胞導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求12的核酸或其反義核酸。
53．權(quán)利要求52的方法，其中所述RCE1是人的。
54．特異于RCE1的分離的抗體。
55．權(quán)利要求54的抗體，其結(jié)合圖1所示第1-311位氨基酸的氨基酸序列。
56．權(quán)利要求54的抗體，其特異于Glu-Arg-Ala-Gly-Asp-Ser-Glu-Ala-Pro-Leu-Cys-Ser。
全文摘要
本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物、尤其是來(lái)源于人或鼠的法尼基指導(dǎo)的內(nèi)肽酶。該多肽和相應(yīng)的核酸有多種用途,例如用作診斷探針、分析鑒定干擾內(nèi)肽酶活性及其表達(dá)的因子和篩選治療癌癥及其它涉及該多肽的途徑的試劑。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1304454SQ99806459
公開(kāi)日2001年7月18日 申請(qǐng)日期1999年4月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月22日
發(fā)明者Y－J·喬伊, A·K·諾思, G·A·馬丁, G·博萊格 申請(qǐng)人:昂尼克斯藥物公司