專(zhuān)利名稱(chēng)：在絲狀真菌突變細(xì)胞中生產(chǎn)多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在絲狀真菌細(xì)胞的突變體，絲狀真菌細(xì)胞的突變體中生產(chǎn)多肽的方法，以及獲得該突變體的方法。
已應(yīng)用數(shù)種方法改進(jìn)通過(guò)對(duì)細(xì)胞誘變處理而生產(chǎn)多肽的方法。例如，通過(guò)典型性誘變生產(chǎn)突變細(xì)胞而改變了蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，所述典型性誘變涉及用化學(xué)作用劑、物理作用劑和生物作用劑作為誘變(誘發(fā)突變)劑處理細(xì)胞而增大突變事件的頻率。
一種增大多肽產(chǎn)量的廣泛應(yīng)用的方法是擴(kuò)增而產(chǎn)生編碼該多肽的基因的許多拷貝。例如，美國(guó)專(zhuān)利No.5,578,461公開(kāi)了借助于與一種基因串聯(lián)的一種可擴(kuò)增選擇性標(biāo)記基因的同源重組，其中，可通過(guò)在適當(dāng)選擇劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞而選擇包含選擇性標(biāo)記的擴(kuò)增拷貝板的細(xì)胞。
此外，通過(guò)用不同的啟動(dòng)子替換一種啟動(dòng)子或者用另一種信號(hào)肽編碼區(qū)替換一種信號(hào)肽編碼區(qū)增大了多肽的產(chǎn)量。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.5,641,670。還通過(guò)分泌型蛋白質(zhì)的超量生產(chǎn)(Ruohonen等，1997,酵母(yeast),13:337～351)和產(chǎn)生分泌過(guò)多的細(xì)胞(美國(guó)專(zhuān)利No.5,312,735)改善了多肽的分泌。
還通過(guò)破壞編碼能在生產(chǎn)多肽的條件下水解該多肽的蛋白酶的DNA序列而增大了多肽的產(chǎn)量。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供增大突變型絲狀真菌菌株中多肽產(chǎn)量的改進(jìn)方法，從而在工業(yè)上生產(chǎn)大量多肽。
本發(fā)明涉及生產(chǎn)多肽的方法，它包括(A)在有助于生產(chǎn)該多肽的條件下培養(yǎng)親代絲狀真菌細(xì)胞的突變細(xì)胞，其中，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，所述突變細(xì)胞比親代細(xì)胞生產(chǎn)更多的多肽，其中，所述突變細(xì)胞包含一條編碼該多肽的第一種核酸序列以及一條或多條選自下組的第二種核酸序列的修飾(ⅰ)編碼具有一種氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少50％與序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性；(ⅱ)具有至少50％與序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性的核酸序列；(ⅲ)一條核酸序列，它在低嚴(yán)格性條件下與如下物質(zhì)雜交(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(b)至少100個(gè)核苷酸的(a)的子序列，或者(c)(a)或(b)的互補(bǔ)鏈；(ⅳ)一條編碼多肽的變體的核酸序列，所述多肽具有一條序列2或序列5的氨基酸序列，所述變體包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代、缺失和/或插入；(ⅴ)(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的等位變體；以及(ⅵ)(ⅰ)、(ⅱ)、(ⅲ)或(ⅴ)的子序列，其中，該子序列編碼具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽片段；以及(B)從所述突變細(xì)胞的培養(yǎng)基回收所述多肽。
本發(fā)明還涉及絲狀真菌細(xì)胞的突變體和獲得該突變細(xì)胞的方法。
本發(fā)明還涉及編碼DDC2或DDC3多肽的分離的第二種核酸序列，由該第二種核酸序列編碼的、分離的DDC2或DDC3多肽，以及包含該第二種核酸序列的核酸構(gòu)建物、重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。


圖1A和1B示出了DDC2的基因組核酸序列和推斷的氨基酸序列(分別為序列1和2)。
圖2A和2B示出了DDC2的基因組核酸序列和推斷的氨基酸序列(分別為序列4和5)。
圖3示出了pToC391的限制圖。
圖4示出了pToC401的限制圖。
本發(fā)明涉及以提高的量生產(chǎn)多肽的方法，它包括在有助于生產(chǎn)該多肽的條件下培養(yǎng)親代絲狀真菌細(xì)胞的突變細(xì)胞，再?gòu)乃鐾蛔兗?xì)胞的培養(yǎng)基分離所述多肽，其中，所述突變細(xì)胞包含一條編碼該多肽的第一種核酸序列以及一條或多條第二種核酸序列(該序列是親代細(xì)胞的內(nèi)源性序列)的一個(gè)修飾(例如破壞或缺失)，其中，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，所述修飾提高了突變細(xì)胞的多肽產(chǎn)量(與親代細(xì)胞相比)。
在本發(fā)明的方法中，所述一條或多條第二種核酸序列具有(ⅰ)編碼具有一種氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少50％與序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性；(ⅱ)具有至少50％與序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性的核酸序列；(ⅲ)一條核酸序列，它在低嚴(yán)格性條件下與如下物質(zhì)雜交(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(b)至少100個(gè)核苷酸的(a)的子序列，或者(c)(a)或(b)的互補(bǔ)鏈；(ⅳ)一條編碼多肽的變體的核酸序列，所述多肽具有一條序列2或序列5的氨基酸序列，所述變體包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代、缺失和/或插入；(ⅴ)(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的等位變體；以及(ⅵ)(ⅰ)、(ⅱ)、(ⅲ)或(ⅴ)的子序列，其中，該子序列編碼具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽片段。
DDC2和/或DDC3多肽活性在本文被定義為這樣的一種或多種活性當(dāng)減小(更優(yōu)選消除)時(shí)，它增大或提高多肽的產(chǎn)量。
在第一個(gè)實(shí)施方案中，第二種核酸序列編碼具有一條氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有至少約50％、優(yōu)選至少約60％、優(yōu)選至少約70％、更優(yōu)選至少約80％、進(jìn)一步優(yōu)選至少約90％、最優(yōu)選至少約95％、進(jìn)一步最優(yōu)選至少約97％與序列2的氨基酸19～64(即成熟多肽)的同一性程度，該多肽具有DCC2多肽活性(下文“DCC2同源多肽”或“DCC2多肽”)，或者至少約50％、優(yōu)選至少約60％、優(yōu)選至少約70％、更優(yōu)選至少約80％、進(jìn)一步優(yōu)選至少約90％、最優(yōu)選至少約95％、進(jìn)一步最優(yōu)選至少約97％與序列5的氨基酸21～83(即成熟多肽)的同一性程度，所述多肽具有DCC3多肽活性(下文“DCC3同源多肽”或“DCC3多肽”)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述同源多肽具有的氨基酸序列有五個(gè)氨基酸、優(yōu)選有四個(gè)氨基酸、更優(yōu)選有三個(gè)氨基酸、進(jìn)一步優(yōu)選有兩個(gè)氨基酸、最優(yōu)選有一個(gè)氨基酸不同于序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，兩種氨基酸序列之間的同一性程度是通過(guò)Clustal法(Higgins,1989,CABIOS 5:151～153)測(cè)定的，即應(yīng)用LASERGENETM MEGALIGNTM軟件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)，采用同一性表和下列序列多重對(duì)比參數(shù)間隙罰分(gap penalty)為10并且間隙長(zhǎng)度罰分(gap length penalty)為10。成對(duì)對(duì)比參數(shù)為Ktuple=1，間隙罰分=3，窗(windows)=5，以及斜列(diagonals)=5。
優(yōu)選地，所述第二種核酸序列編碼這樣的多肽，即，該多肽包含序列2的氨基酸序列或其等位變體；或其具有DCC2多肽活性的片段。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列編碼DCC2多肽，該多肽包含序列2的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列編碼一種多肽，該多肽包含序列2的氨基酸19～64，或其等位變體；或其具有DCC2多肽活性的片段。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列編碼一種多肽，該多肽包含序列2的氨基酸19～64。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列編碼一種多肽，該多肽由序列2的氨基酸序列或其等位變體；或其具有DCC2多肽活性的片段構(gòu)成。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列編碼一種多肽，該多肽由序列2的氨基酸序列構(gòu)成。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列編碼一種多肽，該多肽由序列2的氨基酸19～64或其等位變體；或其具有DDC2多肽活性的片段構(gòu)成。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列編碼一種多肽，該多肽由序列2的氨基酸19～64構(gòu)成。
優(yōu)選地，所述第二種核酸序列編碼這樣的多肽，即，該多肽包含序列5的氨基酸序列或其等位變體；或其具有DCC3多肽活性的片段。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列編碼DCC3多肽，該多肽包含序列5的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列編碼一種多肽，該多肽包含序列5的氨基酸21～83，或其等位變體；或其具有DCC3多肽活性的片段。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列編碼一種多肽，該多肽包含序列5的氨基酸21～83。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列編碼一種多肽，該多肽由序列5的氨基酸序列或其等位變體；或其具有DCC3多肽活性的片段構(gòu)成。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列編碼一種多肽，該多肽由序列2的氨基酸序列構(gòu)成。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列編碼一種多肽，該多肽由序列5的氨基酸21～83，或其等位變體；或其具有DDC3多肽活性的片段構(gòu)成。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列編碼一種多肽，該多肽由序列5的氨基酸19～64構(gòu)成。
所述第二種核酸序列還包含這樣的核酸序列，即，它們編碼一種具有序列2或序列5的氨基酸序列的多肽，它們由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而分別不同于序列1或序列4。本發(fā)明還涉及序列1的子序列(它們編碼具有DDC2多肽活性的序列2的片段)和序列4的子序列(它們編碼具有DDC3多肽活性的序列5的片段)。
序列1或序列4的子序列分別是序列1或序列4所包含的核酸序列，不同的是從5′和/或3′端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失了。優(yōu)選地，序列1的子序列包含至少114個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少138個(gè)核苷酸，最優(yōu)選至少162個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，序列4的子序列包含至少159個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少189個(gè)核苷酸，最優(yōu)選至少219個(gè)核苷酸。
序列2或序列5的片段是一種多肽，該多肽有一個(gè)或多個(gè)氨基酸從該氨基酸序列的氨基端和/或羧基端缺失了。優(yōu)選地，序列2的片段包含至少38個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少46個(gè)氨基酸殘基，最優(yōu)選至少54個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，序列5的片段包含至少53個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少63個(gè)氨基酸殘基，最優(yōu)選至少73個(gè)氨基酸殘基。
等位變體表示占據(jù)同一個(gè)染色體基因座的任何兩種或多種基因備選形式。等位變異是通過(guò)突變自然地引起的，可能導(dǎo)致群體中的多形性?；蛲蛔兛赡苁浅聊?在編碼的多肽中沒(méi)有變化)或者可能編碼具有改變了的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。
在第二個(gè)實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列具有至少約50％、優(yōu)選至少約60％、優(yōu)選至少約70％、更優(yōu)選至少約80％、進(jìn)一步優(yōu)選至少約90％、最優(yōu)選至少約95％、進(jìn)一步最優(yōu)選至少約97％與序列1的成熟多肽編碼序列(即核苷酸1014～1151)的同源性程度，它們編碼活性DDC2多肽；或者序列1的等位變體和子序列(它們編碼具有DDC2多肽活性的多肽片段)，或者具有至少約50％、優(yōu)選至少約60％、優(yōu)選至少約70％、更優(yōu)選至少約80％、進(jìn)一步優(yōu)選至少約90％、更進(jìn)一步優(yōu)選至少約95％、最優(yōu)選至少約97％與序列4的成熟多肽編碼序列(即核苷酸1041～1229)的同源性程度，它們編碼活性DDC3多肽；或者序列4的等位變體和子序列(它們編碼具有DDC3多肽活性的多肽片段)。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，兩種核酸序列之間的同源性程度是通過(guò)Wilbur-Lipman法(Wilbur和Lipman,1983，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proceedings of theNational Academy of Science USA)80:726～730)測(cè)定的，即應(yīng)用LASERGENETM MEGALIGNTM軟件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)，采用同一性表和下列序列多重對(duì)比參數(shù)間隙罰分為10，并且間隙長(zhǎng)度罰分為10。成對(duì)對(duì)比參數(shù)Ktuple=1，間隙罰分=3，以及窗=20。
在第三個(gè)實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列在很低嚴(yán)格性條件、優(yōu)選低嚴(yán)格性條件、更優(yōu)選中度嚴(yán)格性條件、更優(yōu)選中-高嚴(yán)格性條件、進(jìn)一步優(yōu)選高嚴(yán)格性條件、最優(yōu)選很高嚴(yán)格性的條件下與一種核酸探針雜交，該核酸探針在相同條件下與下列物質(zhì)雜交(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(b)至少100個(gè)核苷酸的(a)的子序列，或者(c)(a)或(b)的互補(bǔ)鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatus,1989，“分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor,New York)。序列1或序列4的子序列可能是至少100個(gè)核苷酸或者優(yōu)選至少200個(gè)核苷酸。此外，該子序列可以編碼具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽片段。
序列1或序列4的核酸序列或其子序列，以及序列2或序列5的氨基酸序列或其片段可被用于設(shè)計(jì)核酸探針從而按本領(lǐng)域熟知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽的DNA。具體地說(shuō)，這樣的探針可被用于按標(biāo)準(zhǔn)的DNA印跡法操作與感興趣的屬或種的基因組的或cDNA雜交，以便鑒定和分離其中相應(yīng)的基因。這樣的探針可能比全長(zhǎng)序列短得多，但長(zhǎng)度應(yīng)是至少15個(gè)、優(yōu)選至少25個(gè)、更優(yōu)選至少35個(gè)核苷酸。還可應(yīng)用更長(zhǎng)的探針?？蓱?yīng)用DNA探針和RNA探針這兩種。通常對(duì)探針作標(biāo)記以檢測(cè)相應(yīng)的基因(例如，以32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白標(biāo)記)。本發(fā)明包括這樣的探針。
因此，從這樣的其它生物制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)可用于DNA篩選，該DNA與上述探針雜交并且編碼具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽。得自這樣的其它生物的基因組DNA或其它DNA可通過(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，或者通過(guò)其它分離技術(shù)分離。得自所述文庫(kù)的DNA或分離的DNA可被轉(zhuǎn)移到或固定在硝化纖維素或其它合適的載體上。為了鑒定與序列1或序列4或其子序列同源的克隆或DNA，在DNA印跡法中應(yīng)用所述載體材料。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，“雜交”表示某核酸序列與標(biāo)記的核酸探針(相應(yīng)于序列1或序列5中所示的核酸序列、它的互補(bǔ)鏈或其子序列)在很低嚴(yán)格性到很高嚴(yán)格性條件下雜交。應(yīng)用X光片檢測(cè)在這些條件下核酸探針與之雜交的分子。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸探針是序列1。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸探針是編碼序列2或其子序列的多肽的核酸序列。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸探針是序列1的核苷酸1014～1151，它編碼具有DDC2多肽活性的成熟多肽。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸探針是含于粘粒18H7[它被包含于大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DSM 12060中]中的核酸序列，其中，該核酸序列編碼具有DDC2多肽活性的多肽。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸探針是含于粘粒18H7(它被包含于大腸埃希氏菌DSM12060中)中的成熟DDC2多肽編碼區(qū)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸探針是序列4。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸探針是編碼序列5或其子序列的多肽的核酸序列。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸探針是序列4的核苷酸1041～1229，它編碼具有DDC3多肽活性的成熟多肽。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸探針是含于粘粒34G12(它被包含于大腸埃希氏菌DSM11924中)中的核酸序列，其中，該核酸序列編碼具有DDC3多肽活性的多肽。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸探針是含于粘粒34G12(它被包含于大腸埃希氏菌DSM11924中)中的成熟DDC3多肽編碼區(qū)。
就長(zhǎng)度至少為100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針來(lái)說(shuō)，“很低嚴(yán)格性到很高嚴(yán)格性條件”被定義為在42℃下，在5X SSPE,0.3％SDS,200μg/ml剪切并變性的鮭精DNA，以及或者25％甲酰胺(對(duì)很低嚴(yán)格性和低嚴(yán)格性條件來(lái)說(shuō))，35％甲酰胺(對(duì)中度嚴(yán)格性和中-高嚴(yán)格性條件來(lái)說(shuō))，或者50％甲酰胺(對(duì)高嚴(yán)格性和很高嚴(yán)格性條件來(lái)說(shuō))中，按標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡法操作的預(yù)雜交和雜交。
就長(zhǎng)度至少為100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針來(lái)說(shuō)，最后應(yīng)用2X SSC,0.2％SDS優(yōu)選至少在45℃(很低嚴(yán)格性)，更優(yōu)選至少在50℃(低嚴(yán)格性)，更優(yōu)選至少在55℃(中度嚴(yán)格性)，更優(yōu)選至少在60℃(中-高嚴(yán)格性)，進(jìn)一步更優(yōu)選至少在65℃(高嚴(yán)格性)，最優(yōu)選至少在70℃(很高嚴(yán)格性)下將所述載體材料洗滌三次，每次15分鐘。
就長(zhǎng)度為約15個(gè)核苷酸～約70個(gè)核苷酸的短探針來(lái)說(shuō)，“嚴(yán)格性條件”被定義為按標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡法操作預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌，即，在低于[應(yīng)用Bolton和McCarthy的計(jì)算法(1962，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)48:1390)]計(jì)算的Tm約5℃～約10℃下，在0.9M NaCl,0.09MTris-HCl(pH7.6),6mM EDTA,0.5％NP-40,1X Denhardt溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mM ATP，和0.2mg酵母RNA/ml中洗滌。
就長(zhǎng)度為約15個(gè)核苷酸～約70個(gè)核苷酸的短探針來(lái)說(shuō)，將所述載體材料用6X SCC加0.1％SDS洗滌一次(達(dá)15分鐘)和應(yīng)用6X SSC在低于計(jì)算的Tm約5℃～約10℃下洗滌兩次(每次15分鐘)。
所述第二種核酸序列是這樣獲得的(a)在很低嚴(yán)格性、低嚴(yán)格性、中度嚴(yán)格性、中-高嚴(yán)格性、高嚴(yán)格性或很高嚴(yán)格性的條件下，將DNA與下列物質(zhì)雜交(ⅰ)序列1的核苷酸1014～1151,(ⅱ)(ⅰ)的子序列，或者(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的互補(bǔ)鏈；或者(ⅰ)序列4的核苷酸1041～1229,(ⅱ)(ⅰ)的子序列，或者(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的互補(bǔ)鏈；以及(b)分離該核酸序列。所述子序列優(yōu)選是至少100個(gè)核苷酸的序列，例如，編碼具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽片段的序列。
在第四個(gè)實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列編碼具有序列2或序列5的氨基酸序列的多肽的變體(包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替換、缺失和/或插入)。
所述變異的多肽的氨基酸序列可能因一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的插入或缺失和/或由不同的氨基酸殘基替代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而不同于序列2或序列5的氨基酸序列或其成熟多肽。優(yōu)選地，氨基酸改變是微小性的改變，即不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸替代；少量缺失(通常1個(gè)～約30個(gè)氨基酸)；小的氨基端或羧基端延伸(例如一個(gè)氨基端甲硫氨酸殘基)；至多約20～25個(gè)殘基的小接頭肽；或者有助于通過(guò)改變靜電荷或另一功能而純化的小的延伸(例如多組氨酸序列段、抗原表位或結(jié)合域)。
保守替代的實(shí)例是在下列氨基酸范圍內(nèi)堿性氨基酸(精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)，芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。一般不改變比活性的氨基酸替代是本領(lǐng)域中已知的，例如，由H.Neurath和R.L.Hill(1979)描述于“蛋白質(zhì)”(The Proteins),Academic Press,New York中。最常出現(xiàn)的交換有Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，反之亦然。
變異的序列可在作為序列1或序列4的多肽編碼部分(例如，其子序列)給出的核酸序列基礎(chǔ)上被構(gòu)建，和/或通過(guò)引入核苷酸替代(該替代不產(chǎn)生由核酸序列編碼的多肽的另一氨基酸序列，但相當(dāng)于生產(chǎn)多肽所預(yù)期的宿主生物的密碼子選擇)而構(gòu)建，或者通過(guò)引入可能產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸替代而構(gòu)建。至于核苷酸替代的一般描述，可參見(jiàn)例如Ford等，1991，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化(Protein Expression andPurification)2:95～107。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，這樣的替代可在對(duì)分子的功能起關(guān)鍵作用的區(qū)之外進(jìn)行，并且仍產(chǎn)生活性多肽。對(duì)于被所述第二種核酸序列編碼的多肽活性起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基(因而優(yōu)選不經(jīng)歷替代)可按本領(lǐng)域已知的方法鑒定，例如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(參見(jiàn)例如，Cunningham和Wells，科學(xué)(Science)244:1081～1085)。在后一種技術(shù)中，在分子中的每個(gè)正電荷殘基上引起突變，再測(cè)定生成的突變分子的DDC2或DDC3多肽活性從而鑒定對(duì)該分子的活性起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點(diǎn)還可通過(guò)三維結(jié)構(gòu)的分析測(cè)定，三維結(jié)構(gòu)可通過(guò)例如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和性標(biāo)記測(cè)定(參見(jiàn)例如，de Vos等，1992，科學(xué)255:306～312；Smith等，1992，分子生物學(xué)雜志(Journal of Molecular Biolegy)224:899～904；Wlodaver等，1992,FEBS通訊(FEBS Letters)309:59～64)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，修飾了編碼DDC2和DDC3多肽的兩條第二種核酸序列。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，修飾了分別含于序列1和序列4中的DCC2和DDC3核酸序列。
所述第二種核酸序列可從任意屬的微生物獲得。就本發(fā)明來(lái)說(shuō)，本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“得自”與給定的源聯(lián)系將表示由核酸序列編碼的多肽是由該源生產(chǎn)的或者是由一種細(xì)胞(其中，插入了該源的核酸序列)生產(chǎn)的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，由所述第二種核酸序列編碼的多肽是胞外分泌的。
所述第二種核酸序列可得自真菌源，更優(yōu)選得自酵母菌株，例如，假絲酵母(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、或Yarrowia菌株；或者更優(yōu)選得自絲狀真菌菌株，例如支頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、Magnaporthe、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、漆斑菌屬(Myrothecium)、Neocallimastix、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌屬(Schizophyllum)、籃霉菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、Tolypocladium或木霉屬(Trichoderma)菌株。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列得自卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或Saccharomyces oviformis菌株。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二種核酸序列得自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀鐮孢(Fusariumculmorum)、禾本科鐮孢(Fusarium graminearum)、禾赤鐮孢(Fusariumgraminum)、異孢鐮孢(Fusarium heterosporum)、合歡木鐮孢(Fusarium negundi)、尖鐮孢(Fusarium oxysporum)、多枝鐮孢(Fusarium reticulatum)、粉紅鐮孢(Fusarium roseum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)、膚色鐮孢(Fusarium sarcochroum)、擬分枝孢鐮孢(Fusarium sporotrichioides)、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusariumvenenatum、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米黑毛霉(Mucor miehei)、Myceliophthora thermophila、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Trichoderma harzianum、康寧木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或綠色木霉(Trichoderma viride)菌株。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼DCC2多肽的第二種核酸序列得自米曲霉菌株，最優(yōu)選得自米曲霉IFO4177或其突變株(例如具有序列2的氨基酸序列的多肽)。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸序列是含于粘粒18H7(它含于大腸埃希氏菌DSM12060中)中的序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸序列是序列1的核苷酸1014～1151。
在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼DDC3多肽的第二種核酸序列得自米曲霉菌株，最優(yōu)選得自米曲霉IFO4177或其突變株(例如具有序列2的氨基酸序列的多肽)。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸序列是含于粘粒34G12(它含于大腸埃希氏菌DSM11924中)中的序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸序列是序列4的核苷酸1041～1229。
應(yīng)懂得，對(duì)于上述菌種來(lái)說(shuō)，本發(fā)明既包括完全階段，又包括不完全階段，以及其它分類(lèi)的等值種(例如無(wú)性型)，不管它們的種名是什么。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易識(shí)別合適的等值種的個(gè)性。例如，所述多肽可得自Raper,K.D.和Fennel,D.I.(1965)在“曲霉屬”(The GenusAspergillus)(the Wilkins Company,Baitimore)中定義的曲霉屬的分類(lèi)的等值種微生物，不管它們的種名是什么。曲霉屬是有絲分裂孢子類(lèi)真菌，其特征在于這樣一種曲霉(aspergillum)它包含分生孢子柄，在泡囊中沒(méi)有已知的有性型狀態(tài)終止，泡囊本身又帶有一層或兩層同步形成的特化細(xì)胞(分別被稱(chēng)為小?；蚱抗?，以及無(wú)性形成的孢子(被稱(chēng)為分生孢子)。曲霉屬的已知有性型包括散囊菌屬(Eurotium)、Neosartorya和Emericella。曲霉屬及其有性型的菌株公眾能在一些菌種保藏單位得到，例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、德意志微生物保藏中心(DSM)、真菌菌種保藏中心(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專(zhuān)利菌種保藏中心(NRRL)。此外，這樣的核酸序列可應(yīng)用上述探針從其它源[包括從自然界(例如土壤、堆肥、水等)分離的微生物]鑒定和獲得。從自然生境分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。然后可通過(guò)類(lèi)似地篩選另一種微生物的基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)獲得核酸序列。一旦用探針檢測(cè)了編碼多肽的核酸序列，就可通過(guò)應(yīng)用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)(參見(jiàn)例如Sambrook等，1989，上文)分離或克隆該序列。
所述第二種核酸序列可以是突變型核酸序列，它包含至少一個(gè)在序列1的成熟多肽編碼序列中的突變(其中，該突變型核酸序列編碼由序列2的氨基酸19～64構(gòu)成的多肽)，或者至少一個(gè)在序列4的成熟多肽編碼序列中的突變(其中，該突變型核酸序列編碼由序列5的氨基酸21～83構(gòu)成的多肽)。
用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，它們包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。從這樣的基因組DNA克隆本發(fā)明的核酸序列可這樣進(jìn)行例如，通過(guò)應(yīng)用熟知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選檢測(cè)具有共享結(jié)構(gòu)特征的克隆化DNA片段。參見(jiàn)例如，Innis等，1990,“PCR方法和應(yīng)用指南”(PCR:A Guide to Methods and Application),Academic Press,NewYork?？蓱?yīng)用其它核酸擴(kuò)增方法，例如，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，連接活化的轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。所述第二種核酸序列可從曲霉屬或者別的或相關(guān)的微生物菌株克隆，所以，例如所述第二種核酸序列可以是核酸序列的多肽編碼區(qū)的等位變體或變種。
突變型絲狀真菌細(xì)胞可通過(guò)應(yīng)用本領(lǐng)域熟知的方法(例如，插入、破壞、替代或缺失)減少或消除本文所述的一條或多條第二種核酸序列的表達(dá)而構(gòu)建。待修飾的或滅活的所述第二種核酸序列可以是，例如，對(duì)活性來(lái)說(shuō)必需的編碼區(qū)或其部分，或者表達(dá)該編碼區(qū)所需的調(diào)節(jié)元件或控制元件。一個(gè)這種調(diào)節(jié)序列或控制序列的實(shí)例可以是啟動(dòng)子序列或其功能部分(即，足以影響該核酸序列的表達(dá)的部分)?？赡苄揎椀钠渌刂菩蛄邪ǖ幌抻谇皩?dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號(hào)序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活因子。
所述第二種核酸序列的修飾或滅活可這樣進(jìn)行使親代細(xì)胞經(jīng)歷誘變，再選擇突變細(xì)胞(其中，所述第二種核酸序列的表達(dá)已被減少或消除了)。所述誘變(它可以是專(zhuān)一的或隨機(jī)的)可這樣進(jìn)行例如，通過(guò)應(yīng)用合適的物理誘變劑或化學(xué)誘變劑，應(yīng)用合適的寡核苷酸，或者使DNA序列經(jīng)歷PCR產(chǎn)生的誘變。此外，還可應(yīng)用這些誘變方法的任意組合進(jìn)行誘變。
適合本目的的物理誘變劑或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類(lèi)似物。
當(dāng)應(yīng)用這樣的作用劑時(shí)，通常是這樣進(jìn)行誘變的將需要誘變處理的親代細(xì)胞在選定的誘變劑存在下和在合適的條件下保溫，再選擇表現(xiàn)為減少了或沒(méi)有所述第二種核酸序列的表達(dá)的突變細(xì)胞。
所述第二種核酸序列的修飾或滅活還可通過(guò)引入、替代或除去其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的序列或調(diào)節(jié)元件中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸來(lái)完成。例如，可插入或除去核苷酸從而導(dǎo)致終止密碼子的引入、起始密碼子的除去或開(kāi)放讀框的改變。這樣的修飾或滅活可通過(guò)按本領(lǐng)域已知的方法的定點(diǎn)誘變或PCR產(chǎn)生的誘變而完成。不過(guò)，一般說(shuō)來(lái)，可在體內(nèi)進(jìn)行修飾，即，直接在表達(dá)待修飾的所述第二種核酸序列的細(xì)胞上進(jìn)行，優(yōu)選按下文說(shuō)明的那樣進(jìn)行體外修飾。
一個(gè)減少或消除由選定的絲狀真菌細(xì)胞表達(dá)所述第二種核酸序列的簡(jiǎn)便方法的實(shí)例基于基因替代、基因缺失或基因破壞的技術(shù)。例如，在基因破壞方法中，在體外誘變相應(yīng)于感興趣的內(nèi)源性基因或基因片段的核酸序列而產(chǎn)生缺損核酸序列，再將它轉(zhuǎn)化入親代細(xì)胞而產(chǎn)生缺損基因。通過(guò)同源重組，該缺損核酸序列替代內(nèi)源性基因或基因片段。可能希望所述缺損基因或基因片段還編碼可被用于選擇轉(zhuǎn)化體(其中，核酸序列已被修飾了或破壞了)的標(biāo)記。
也可通過(guò)既定的反義技術(shù)應(yīng)用與該基因的核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列進(jìn)行所述第二種核酸序列的修飾或滅活。更具體地說(shuō)，可這樣減少或消除通過(guò)絲狀真菌細(xì)胞的基因的表達(dá)，即，通過(guò)引入與所述第二種核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，該序列可在所述細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄并且能與細(xì)胞中生產(chǎn)的mRNA雜交。在使互補(bǔ)反義核苷酸序列可與該mRNA雜交的條件下，于是，減少或消除了翻譯的蛋白質(zhì)的量。
與序列1或序列4的第二種核酸序列同源或互補(bǔ)的核酸序列可得自下述任意微生物源。核酸序列源的選擇將依賴(lài)于絲狀真菌細(xì)胞，但優(yōu)選的源是真菌源(例如酵母和絲狀真菌)。優(yōu)選的絲狀真菌源包括但不限于支頂孢屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、毀絲霉屬、毛霉屬、脈孢菌屬、青霉屬、Phanerochaete、梭孢殼屬、Tolypocladium和木霉屬。優(yōu)選的酵母源包括但不限于假絲酵母、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)和Yarrowia。此外，該核酸序列可以是所述絲狀真菌細(xì)胞的天然序列。
應(yīng)懂得，本發(fā)明的方法不限于獲得突變絲狀真菌細(xì)胞的具體順序?？稍跇?gòu)建生產(chǎn)多肽的細(xì)胞時(shí)的任意步驟將本文所述的第二種核酸序列的修飾引入親代細(xì)胞。優(yōu)選的是，在引入編碼異源多肽的第一種核酸序列之前已修飾了突變絲狀真菌細(xì)胞的第二種核酸序列。
在本發(fā)明的方法中，所述絲狀真菌細(xì)胞可以是野生型細(xì)胞或其突變體。優(yōu)選地，該絲狀真菌細(xì)胞是支頂孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、隱球酵母屬、Filibasidium、鐮孢屬、赤霉屬、腐質(zhì)霉屬、Magnaporthe、毛霉屬、毀絲霉屬、漆斑菌屬(Myrothecium)、Neocallimastix、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、Piromyces、裂褶菌屬、籃霉菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、Tolypocladium或木霉屬細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲狀真菌細(xì)胞是棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲狀真菌細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、Fusarium crookwellense(Fusarium cerealis的異名)、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、腐皮鐮孢(Fusarium solani)、擬分枝孢鐮孢、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides或Fusarium venenatum細(xì)胞。
在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲狀真菌細(xì)胞是Gibberellapulicaris、Gibberella zeae、Humicola insolens、Humicolalanuginosa、米黑毛霉、Myceliophthora thermophila、Myrotheciumroridin、粗糙脈孢菌或產(chǎn)紫青霉細(xì)胞。
在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲狀真菌細(xì)胞是Trichodermaharzianum、康寧木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichodermareesei或綠色木霉細(xì)胞。
所述突變絲狀真菌細(xì)胞是應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法在適合生產(chǎn)由所述第一種核酸序列編碼的多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。例如，所述細(xì)胞可通過(guò)搖瓶培養(yǎng)法培養(yǎng)，通過(guò)在合適的培養(yǎng)基中和使所述異源多肽能被表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行的、在實(shí)驗(yàn)室用發(fā)酵罐或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、間歇發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)培養(yǎng)。該培養(yǎng)是應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(包含碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽)中進(jìn)行的。合適的培養(yǎng)基可從供應(yīng)商獲得或者可按公開(kāi)的組成(例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的產(chǎn)品目錄)制備。可直接從培養(yǎng)基回收多肽(如果分泌的話)。
所述多肽可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法(該多肽專(zhuān)一性的方法)檢測(cè)。這些檢測(cè)方法可包括特異性抗體的應(yīng)用、酶產(chǎn)品的生成、酶底物的消失、SDS-PAGE或本領(lǐng)域已知的任何其它方法。例如，可應(yīng)用酶驗(yàn)定法測(cè)定所述多肽的活性。對(duì)很多酶來(lái)說(shuō)，測(cè)定酶活性的方法是本領(lǐng)域已知的。
生成的多肽可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法分離。例如，可通過(guò)包括但不限于離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀的常規(guī)方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基分離所述多肽。然后，可通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法進(jìn)一步純化分離的多肽，這些方法包括但不限于層析法(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)，電泳法(例如制備型等電聚焦)，差示溶解(例如硫酸銨沉淀)，或者提取[參見(jiàn)例如，“蛋白質(zhì)純化”(Protein Purification),J.C.Janson和Lars Ryden編輯，VCHPublishers,New York,1989]。
由所述第一種核酸序列編碼的多肽可以是對(duì)突變絲狀真菌細(xì)胞來(lái)說(shuō)天然的或外源的任意多肽。術(shù)語(yǔ)“多肽”在本文并不意味著表示特定長(zhǎng)度的編碼產(chǎn)品，所以，它包括肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“異源多肽”在本文被定義為對(duì)所述絲狀真菌細(xì)胞來(lái)說(shuō)不是天然的多肽。突變絲狀真菌細(xì)胞可能包含一個(gè)或多個(gè)編碼異源多肽的核酸序列的拷貝。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽是激素、激素變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分、或者報(bào)道分子。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶或連接酶。在一個(gè)更進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠溶解酶、過(guò)氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
編碼感興趣的多肽的所述第一種核酸序列可得自任何原核生物源、真核生物源或其它源。
在本發(fā)明的方法中，突變絲狀真菌細(xì)胞還可被用于重組生產(chǎn)該細(xì)胞天然的多肽。該天然的多肽可這樣重組生產(chǎn)例如，使編碼該多肽的基因受不同的啟動(dòng)子控制而增強(qiáng)多肽的表達(dá)，通過(guò)應(yīng)用信號(hào)序列加速感興趣的天然多肽輸出細(xì)胞，以及增大編碼(通常由細(xì)胞生產(chǎn)的)多肽的基因拷貝數(shù)。本發(fā)明在術(shù)語(yǔ)“異源多肽”的范圍內(nèi)還包括這種重組生產(chǎn)所述絲狀真菌細(xì)胞天然的內(nèi)源性多肽至這樣的程度以致這種表達(dá)涉及所述細(xì)胞非天然遺傳因子的應(yīng)用，或者被操作而以宿主細(xì)胞中一般不出現(xiàn)的方式起作用的天然因子的應(yīng)用。
本文描述了用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術(shù)。編碼所述多肽的核酸序列可以是基因組的、cDNA、RNA、半合成的、合成源的或其任意組合。
在本發(fā)明的方法中，所述多肽還可以是多肽的改造變體。
在本發(fā)明的方法中，所述多肽可進(jìn)一步包括融合的或雜合的多肽，其中，另一種多肽被融合在該多肽或其片段的N端或C端。融合多肽是通過(guò)將編碼一種多肽的核酸序列(或其一部分)融合到編碼另一種多肽的核酸序列(或其一部分)而生產(chǎn)的。生產(chǎn)融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括連接編碼所述多肽的編碼序列使它們處于讀框中，于是，融合多肽的表達(dá)受相同的啟動(dòng)子和終止子的控制。雜合多肽可包括得自至少兩種不同多肽(其中，一種或多種可以是突變絲狀真菌細(xì)胞的異源性多肽)的部分或全部多肽序列的組合。
可按多種方法操作編碼感興趣多肽的、分離的第一種核酸序列供多肽的表達(dá)。“表達(dá)”應(yīng)被理解為包括在多肽生產(chǎn)中涉及的任意步驟，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。在其插入載體之前操作核酸序列可能是希望的或必要的，這取決于表達(dá)載體。利用克隆方法修飾核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
“核酸構(gòu)建物”在本文被定義為一種核酸分子(單鏈或雙鏈的)，它是從天然基因分離的或者已被修飾而包含核酸的節(jié)段(該節(jié)段以自然界不存在的方式被組合和并列)。當(dāng)該核酸構(gòu)建物包含表達(dá)編碼序列所需的全部控制序列時(shí)，“核酸構(gòu)建物”這個(gè)術(shù)語(yǔ)就與術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”同義。術(shù)語(yǔ)“編碼序列”在本文被定義為被轉(zhuǎn)錄成mRNA和被翻譯成多肽的序列。編碼序列的邊界一般是通過(guò)ATG起始密碼子(它恰好位于mRNA的5′端處開(kāi)放讀框的上游)和轉(zhuǎn)錄終止子序列(它恰好位于mRNA的3′端處開(kāi)放讀框的下游)測(cè)定的。編碼序列可能包括但不限于基因組的、cDNA、RNA、半合成的、合成的、重組的或其任意組合。
術(shù)語(yǔ)“控制序列”在本文被定義為包含對(duì)于異源多肽的表達(dá)來(lái)說(shuō)必要的或有益的全部組分。每種控制序列可以是編碼多肽的核酸序列的天然的或外源的序列。這樣的控制序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)序列和轉(zhuǎn)錄終止子。控制序列至少包括啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和翻譯終止信號(hào)。控制序列可與接頭一起提供，為的是引入特異性限制位點(diǎn)從而促進(jìn)該控制序列與編碼異源多肽的核酸序列編碼區(qū)連接。術(shù)語(yǔ)“可操作地連接的”在本文被定義為一種構(gòu)型，其中，一條控制序列被適當(dāng)?shù)刂糜谙鄬?duì)于DNA序列的編碼序列的位置以致該控制序列指導(dǎo)異源多肽的生產(chǎn)。
控制序列可以是合適的啟動(dòng)子序列、核酸序列(它被表達(dá)該核酸序列的絲狀真菌細(xì)胞識(shí)別)。啟動(dòng)子序列包含介導(dǎo)異源多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。所述啟動(dòng)子可以是在絲狀真菌細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子，可得自編碼該細(xì)胞同源的或異源的、胞外或胞內(nèi)的多肽的基因。
在本發(fā)明的方法中，指導(dǎo)核酸構(gòu)建物的轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子實(shí)例有得自編碼下列酶的基因的啟動(dòng)子米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根粘菌(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根粘菌脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、米曲霉乙酰胺酶(amdS)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(美國(guó)專(zhuān)利4,288,627),及其突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子。特別優(yōu)選的啟動(dòng)子是NA2-tpi啟動(dòng)子(一種得自編碼黑曲霉中性α淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的啟動(dòng)子雜合體)、葡糖淀粉酶啟動(dòng)子和TAKA淀粉酶啟動(dòng)子。
所述控制序列還可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，即，一種被絲狀真菌細(xì)胞識(shí)別而終止轉(zhuǎn)錄的序列。該轉(zhuǎn)錄終止子序列被可操作地連接到編碼異源多肽的核酸序列的3′端。在所述絲狀真菌細(xì)胞中起作用的任意終止子都可被應(yīng)用于本發(fā)明。
優(yōu)選的終止子得自編碼下列酶的基因米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。
所述控制序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，即mRNA的未翻譯區(qū)(它對(duì)于通過(guò)絲狀真菌細(xì)胞的翻譯來(lái)說(shuō)是重要的)。該前導(dǎo)序列被可操作地連接到編碼異源多肽的核酸序列的5′端。在絲狀真菌細(xì)胞中起作用的任何前導(dǎo)序列都可用于本發(fā)明。
優(yōu)選的前導(dǎo)序列得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因。
所述控制序列還可以是聚腺苷酸化序列，即一種這樣的序列被可操作地連接到所述核酸序列的3′端，并且當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)，它被絲狀真菌細(xì)胞作為一個(gè)信號(hào)識(shí)別而添加聚腺苷殘基到轉(zhuǎn)錄的mRNA。在絲狀真菌細(xì)胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可用于本發(fā)明。
優(yōu)選的聚腺苷酸化序列得自編碼下列酶的基因米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶和黑曲霉α葡糖苷酶。
所述控制序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，它編碼與所述異源多肽的氨基端連接的氨基酸序列并指導(dǎo)編碼多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。所述核酸序列的編碼序列的5′端可能本來(lái)包含一個(gè)(在翻譯讀框中與編碼分泌型多肽的編碼區(qū)節(jié)段自然連接的)信號(hào)肽編碼區(qū)。所述編碼序列的5′端也可能包含該編碼序列的外源信號(hào)肽編碼區(qū)。如果所述編碼序列通常不含信號(hào)肽編碼區(qū)，所述外源信號(hào)肽編碼區(qū)可能是所需的。該外源信號(hào)肽編碼區(qū)也可能僅僅替代天然信號(hào)肽編碼區(qū)以便達(dá)到多肽的增強(qiáng)分泌作用。然而，指導(dǎo)表達(dá)的異源多肽進(jìn)入絲狀真菌細(xì)胞的分泌途徑的任何信號(hào)肽編碼區(qū)都可應(yīng)用于本發(fā)明。
對(duì)絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼區(qū)是得自下列酶的基因的信號(hào)肽編碼區(qū)米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根粘菌天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纖維素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶。
所述控制序列還可能是一個(gè)前肽編碼區(qū)，它編碼位于多肽的氨基端的氨基酸序列。生成的多肽被稱(chēng)為“酶原”(proenzyme)或“多肽原”[或在某些情況下被稱(chēng)為“酶原”(zymogen)]。多肽原一般是惰性的，可通過(guò)前肽的催化分裂或自動(dòng)催化分裂而從該多肽原轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。前肽編碼區(qū)可得自米黑根粘菌天冬氨酸蛋白酶基因或Myceliophthora thermophila漆酶基因(WO95/33836)。
如果信號(hào)肽區(qū)和前肽區(qū)二者都存在于多肽的氨基端，那么，前肽區(qū)位于鄰近多肽的氨基端，信號(hào)肽區(qū)則位于鄰近前肽區(qū)的氨基端。
所述核酸構(gòu)建物還可能包括一條或多條核酸序列，該核酸序列編碼一個(gè)或多個(gè)對(duì)于指導(dǎo)異源多肽的表達(dá)有益的因子，例如，轉(zhuǎn)錄激活因子(諸如反式作用因子)、陪伴分子和加工蛋白酶。在絲狀真菌細(xì)胞中起作用的任意因子都可應(yīng)用于本發(fā)明。編碼一個(gè)或多個(gè)這些因子的核酸不必與編碼異源多肽的核酸序列串聯(lián)。
還可能希望添加調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列能調(diào)節(jié)與絲狀真菌細(xì)胞的生長(zhǎng)相關(guān)的異源多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例有那些，即，它們引起基因的表達(dá)響應(yīng)化學(xué)刺激物或物理刺激物(包括調(diào)節(jié)化合物的存在)而開(kāi)啟或關(guān)閉。TAKAα淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子可被用作調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例有能使基因擴(kuò)增的那些，例如，用重金屬擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼異源多肽的核酸序列將可操作地與該調(diào)節(jié)序列連接。
上述各種核酸序列和控制序列可被連接在一起而產(chǎn)生可能包含一個(gè)或多個(gè)合適的限制位點(diǎn)的重組表達(dá)載體，所述限制位點(diǎn)可供在這樣的位點(diǎn)插入或替代編碼異源多肽的核酸序列。編碼異源多肽的核酸序列也可通過(guò)將該序列或包含該序列的核酸構(gòu)建物插入用于表達(dá)的合適載體中來(lái)表達(dá)。在產(chǎn)生表達(dá)載體時(shí)，編碼序列處于該載體中，于是，該編碼序列與用于表達(dá)和可能分泌的合適的控制序列可操作地連接。
所述重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如質(zhì)?；虿《?，該載體可以方便地經(jīng)歷DNA重組操作而且能引起編碼異源多肽的核酸序列的表達(dá)。該載體的選擇一般將取決于該載體與該載體被引入的絲狀真菌細(xì)胞的相容性。該載體可以是線形質(zhì)粒或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。該載體可以是自主復(fù)制型載體，即，一種作為染色體外的實(shí)體存在的載體，它的復(fù)制與染色體復(fù)制無(wú)關(guān)，例如質(zhì)粒、染色體外因子、微型染色體或人工染色體。所述載體可包含保障自復(fù)制的任意作用劑。該載體也可以是這樣的載體當(dāng)引入絲狀真菌細(xì)胞時(shí)，它被整合入基因組并與染色體(它已被整合入該染色體)一起被復(fù)制。所述載體系統(tǒng)可以是單一的載體或質(zhì)?；蛘呤莾煞N或多種載體或質(zhì)粒(它們共同包含將被引入絲狀真菌細(xì)胞的基因組的全部DNA)，或者是一種轉(zhuǎn)座子。
所述載體優(yōu)選包含一種或多種允許容易地選擇轉(zhuǎn)化的絲狀真菌細(xì)胞的選擇性標(biāo)記。一種選擇性標(biāo)記是一種基因，它的產(chǎn)物可提供殺生物劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷體的原養(yǎng)型等。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞中的選擇性標(biāo)記可選自包括但不限于下組的物質(zhì)amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥(niǎo)氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5 ′-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)，以及得自其它種的等同物。應(yīng)用于絲狀真菌細(xì)胞的優(yōu)選的選擇性標(biāo)記是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
所述載體優(yōu)選包含這樣的因子，即，該因子允許所述載體穩(wěn)定整合入絲狀真菌細(xì)胞基因組或所述載體在該細(xì)胞中與該細(xì)胞的基因組無(wú)關(guān)的自主復(fù)制。
“引入”表示將包含核酸序列的載體引入絲狀真菌細(xì)胞以致該載體作為染色體整合體或者作為自我復(fù)制的染色體外載體保持。通常認(rèn)為整合是有益的，因?yàn)楹怂嵝蛄懈赡鼙环€(wěn)定保持在細(xì)胞中。載體整合入染色體是通過(guò)同源重組、非同源重組或轉(zhuǎn)座發(fā)生的。
將表達(dá)載體引入絲狀真菌細(xì)胞可能涉及一種方法，該方法包括按本來(lái)已知的方式的原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞壁再生。轉(zhuǎn)化曲霉屬宿主細(xì)胞的合適操作被描述于EP238 023和Yelton等，1984年，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proceedings of the National Academyof Sciences USA)81:1470～1474。一種轉(zhuǎn)化鏈孢屬的合適方法由Malardier等(1989)描述于基因(Gene)78:147～156和WO96/00787。
就整合入絲狀真菌細(xì)胞的基因組來(lái)說(shuō)，所述載體可能依靠編碼異源多肽的核酸序列或者該載體的任何其它(通過(guò)同源重組或非同源重組將該載體穩(wěn)定整合入基因組的)因子。該載體也可能包含用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組整合入絲狀真菌細(xì)胞基因組的另外的核酸序列。該另外的核酸序列能使載體整合入染色體的準(zhǔn)確位置上的基因組。為了增大準(zhǔn)確位置上整合的可能性，整合因子應(yīng)優(yōu)選包含足夠量的核酸，例如100～1,500個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選400～1,500個(gè)堿基對(duì)，最優(yōu)選800～1,500個(gè)堿基對(duì)，它們與相應(yīng)的靶序列是高度同源的，從而提高同源重組的可能性。整合因子可以是與絲狀真菌細(xì)胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合因子還可以是非編碼的或編碼的核酸序列。另一方面，所述載體可通過(guò)非同源重組被整合入細(xì)胞的基因組。
就自主復(fù)制來(lái)說(shuō)，所述載體可進(jìn)一步包含一種復(fù)制源，它能使該載體在所述絲狀真菌細(xì)胞中自主復(fù)制。
用于連接本文描述的因子而構(gòu)建重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見(jiàn)例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989，“分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”，第2版，Cold Spring Harbor,New York)。
在本發(fā)明的另一方面，所述突變絲狀真菌細(xì)胞可能另外包含一條或多條第三種核酸序列的修飾，所述核酸序列編碼可能對(duì)感興趣的多肽的生產(chǎn)、回收和/或應(yīng)用有害的蛋白質(zhì)。所述修飾減少或消除了一條或多條第三種核酸序列的表達(dá)，導(dǎo)致這樣的突變細(xì)胞當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，該突變細(xì)胞可能比沒(méi)有修飾第三種核酸序列的突變細(xì)胞生產(chǎn)更多的多肽。
第三種核酸序列可能編碼任何蛋白質(zhì)或酶。例如，該酶可以是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶、氧化酶、果膠溶解酶、過(guò)氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。第三種核酸序列優(yōu)選編碼蛋白酶，例如，氨肽酶、羧肽酶或蛋白酶。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)突變絲狀真菌細(xì)胞的方法，該方法包括(A)修飾一條或多條親代絲狀真菌細(xì)胞的核酸序列，該細(xì)胞具有下列序列(ⅰ)編碼具有一種氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少50％與序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性；(ⅱ)具有至少50％與序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性的核酸序列；(ⅲ)一條核酸序列，它在低嚴(yán)格性條件下與如下物質(zhì)雜交(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(b)至少100個(gè)核苷酸的(a)的子序列，或者(c)(a)或(b)的互補(bǔ)鏈；(ⅳ)一條編碼多肽的變體的核酸序列，所述多肽具有一條序列2或序列5的氨基酸序列，所述變體包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代、缺失和/或插入；(ⅴ)(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的等位變體；以及(ⅵ)(ⅰ)、(ⅱ)、(ⅲ)或(ⅴ)的子序列，其中，該子序列編碼具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽片段；以及(B)從步驟(A)鑒定包括所述修飾的核酸序列的突變體。
本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)多肽的突變絲狀真菌細(xì)胞，該突變絲狀真菌細(xì)胞包含編碼該多肽的一條第一種核酸序列以及一條或多條下組的第二種核酸序列的修飾(a)編碼具有一種氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少50％與序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性；(b)具有至少50％與序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性的核酸序列；(c)一條核酸序列，它在低嚴(yán)格性條件下與如下物質(zhì)雜交(ⅰ)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(ⅱ)至少100個(gè)核苷酸的(ⅰ)的子序列，或者(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的互補(bǔ)鏈；
(d)一條編碼多肽的變體的核酸序列，所述多肽具有一條序列2或序列5的氨基酸序列，所述變體包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代、缺失和/或插入；(e)(a)、(b)或(c)的等位變體；以及(f)(a)、(b)、(c)或(e)的子序列，其中，該子序列編碼具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽片段。
本發(fā)明還涉及分離的DDC2和DDC3多肽，及其由本文描述的核酸序列編碼的片段、等位變體和變體。所述分離的多肽選自下組物質(zhì)(a)具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有至少50％與序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性；(b)由一種核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列在低嚴(yán)格性條件下與如下物質(zhì)雜交(ⅰ)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(ⅱ)至少100個(gè)核苷酸的(ⅰ)的子序列，或者(ⅲ)(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的互補(bǔ)鏈；(c)具有一條序列2或序列5的氨基酸序列的多肽的變體，它包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代、缺失和/或插入；(d)(a)或(b)的等位變體；以及(e)(a)、(b)或(d)的片段，其中，該片段具有DDC2或DDC3多肽活性。
本發(fā)明分離的DDC2和DDC3多肽具有至少20％、優(yōu)選至少40％、更優(yōu)選至少60％、進(jìn)一步優(yōu)選至少80％、更進(jìn)一步優(yōu)選至少90％、最優(yōu)選至少100％序列2或序列5的多肽活性。
DDC2和DDC3多肽可得自真菌源，更優(yōu)選得自酵母菌株，例如假絲酵母、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或Yarrowia菌株；或者絲狀真菌菌株，例如支頂孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、隱球酵母屬、Filibasidium、鐮孢屬、赤霉屬、腐質(zhì)霉屬、Magnaporthe、毛霉屬、毀絲霉屬、漆斑菌屬、Neocallimastix、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、Piromyces、裂褶菌屬、籃霉菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、Tolypocladium或木霉屬菌株。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的DDC2多肽得自米曲霉菌株，最優(yōu)選得自米曲霉IFO4177或其突變株，例如，具有序列2的氨基酸序列的多肽。
在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的DDC3多肽得自米曲霉菌株，最優(yōu)選得自米曲霉IFO4177或其突變株，例如，具有序列2的氨基酸序列的多肽。
應(yīng)懂得，如前所述，對(duì)于上述菌種來(lái)說(shuō)，本發(fā)明既包括完全階段，又包括不完全階段，以及其它分類(lèi)的等值種(例如無(wú)性型)，不管它們的種名是什么。
DDC2和DDC3多肽可應(yīng)用本文描述的技術(shù)分離。本文定義的“分離的”多肽是這樣一種多肽它大致不含其它多肽，例如，通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定，至少約20％純的，優(yōu)選至少約40％純的，更優(yōu)選約60％純的，進(jìn)一步優(yōu)選約80％純的，更進(jìn)一步優(yōu)選約90％純的，最優(yōu)選約95％純的。
本發(fā)明還涉及分離的核酸序列，該核酸序列編碼DDC2和DDC3多肽及其片段(如本文所述那樣)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸序列如序列1所示。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸序列是含于粘粒18H7(它含于大腸埃希氏菌DSM12060中)中的序列。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸序列是序列1的多肽編碼區(qū)。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸序列是含于粘粒18H7(它含于大腸埃希氏菌DSM12060中)中的多肽編碼區(qū)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸序列如序列4所示。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸序列是序列4的多肽編碼區(qū)。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸序列是含于粘粒34G12(它含于大腸埃希氏菌DSM11924中)中的序列。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸序列是含于粘粒34G12(它含于大腸埃希氏菌DSM11924中)中的多肽編碼區(qū)。
本發(fā)明還涉及分離的突變核酸序列，它包括在序列1或序列4的多肽編碼序列中至少一次突變，其中，該突變核酸序列編碼分別由序列2或序列5構(gòu)成的多肽。
用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并且在本文被描述了。
本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“分離的核酸序列”表示這樣的核酸序列它大致不含其它核酸序列，例如，通過(guò)瓊脂糖電泳測(cè)定，至少約20％純的，優(yōu)選至少約40％純的，更優(yōu)選至少約60％純的，進(jìn)一步優(yōu)選至少約80％純的，最優(yōu)選至少約90％純的。例如，分離的核酸序列可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)克隆方法獲得，標(biāo)準(zhǔn)克隆方法在遺傳工程中被用于將核酸序列從它的自然位置再定位到它將被再生產(chǎn)的位點(diǎn)?？寺》椒赡馨ㄋ璧暮怂崞?它包含編碼多肽的核酸序列)的切除和分離，將該片段插入載體分子，以及將重組載體結(jié)合入宿主細(xì)胞(將在這里復(fù)制所述核酸序列的許多拷貝或克隆)。所述核酸序列可以是基因組的、cDNA、RNA、半合成的、合成源的或其任意組合。
編碼本發(fā)明的DDC2或DDC3多肽的核酸序列的修飾對(duì)于大致與DDC2或DDC3多肽類(lèi)似的多肽的合成來(lái)說(shuō)可能是必要的。關(guān)于DDC2或DDC3多肽的術(shù)語(yǔ)“大致類(lèi)似的”表示所述多肽的非天然形式。這些多肽在某些工程化方式中與從它的天然源分離的DDC2或DDC3多肽不同，例如，在比活性、熱穩(wěn)定性、最佳pH等方面不同的變體。變異的多肽可按前文描述的那樣構(gòu)建。
本發(fā)明還涉及通過(guò)如下方法生產(chǎn)的、分離的核酸序列，即，(a)在很低嚴(yán)格性、低嚴(yán)格性、中度嚴(yán)格性、中-高嚴(yán)格性、高嚴(yán)格性、很高嚴(yán)格性的條件下將一種DNA與下列物質(zhì)雜交(ⅰ)序列1的核苷酸1014～1151,(ⅱ)(ⅰ)的子序列，或者(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的互補(bǔ)鏈；或者與下列物質(zhì)雜交(ⅰ)序列4的核苷酸1041～1229,(ⅱ)(ⅰ)的子序列，或者(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的互補(bǔ)鏈；以及(b)將核酸序列與所述DNA分離。所述子序列優(yōu)選是至少100個(gè)核苷酸的序列，例如，編碼具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽片段的序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)突變核酸序列的方法，該方法包括在序列1或序列4的多肽編碼序列或其子序列中引入至少一個(gè)突變，其中，所述突變核酸序列編碼分別由序列2或序列5構(gòu)成的多肽，或其具有DDC2或DDC3多肽活性的片段。
在核酸序列中引入突變而將一種核苷酸換成另一種核苷酸可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的任意方法通過(guò)定點(diǎn)誘變來(lái)進(jìn)行。特別適用的是這種方法它應(yīng)用具有感興趣的插入片段的超螺旋的、雙鏈DNA載體和兩種包含所需突變的合成引物。該寡核苷酸引物(各自與載體的相反鏈互補(bǔ))在溫度循環(huán)過(guò)程中通過(guò)pfu DNA聚合酶伸展。在摻入所述引物時(shí)，產(chǎn)生了包含交錯(cuò)切口的突變質(zhì)粒。在溫度循環(huán)后，用DpnI(它是甲基化和半甲基化DNA特異性的)處理產(chǎn)物而消化親代DNA模板并選擇用于含突變的合成的DNA。還可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的其它方法。
本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建物、用于序列的表達(dá)的重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞，它們包含如本文所述的序列1或序列4的核酸序列，其子序列或同源物。所述構(gòu)建物和載體可按本文描述的方法構(gòu)建。所述宿主細(xì)胞可以是適合核酸序列的表達(dá)的任意細(xì)胞，優(yōu)選是真菌細(xì)胞，更優(yōu)選是選自本文描述的組的絲狀真菌細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括親代細(xì)胞的任意子代，它與親代細(xì)胞不相同，這是由于復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)的突變。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來(lái)源。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)DDC2或DDC3多肽的方法，該方法包括(a)在有助于生產(chǎn)DDC2或DDC3多肽的條件下培養(yǎng)一種菌株(它的野生型能生產(chǎn)該多肽)；以及(b)從培養(yǎng)基回收該多肽。優(yōu)選地，所述菌株是曲霉屬，更優(yōu)選是米曲霉的菌株。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明的DDC2或DDC3多肽的方法，該方法包括(a)在有助于生產(chǎn)DDC2或DDC3多肽的條件下培養(yǎng)一種宿主細(xì)胞；以及(b)從培養(yǎng)基回收該DDC2或DDC3多肽。
在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，應(yīng)用如本文所述的、本領(lǐng)域已知的方法在適合生產(chǎn)DDC2或DDC3多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。生成的DDC2或DDC3多肽可通過(guò)如本文所述的、本領(lǐng)域已知的方法回收和純化。信號(hào)肽本發(fā)明還涉及包含編碼一種蛋白質(zhì)的基因的核酸構(gòu)建物，所述蛋白質(zhì)與一種核酸序列可操作地連接，該核酸序列由編碼由序列2的氨基酸1～18構(gòu)成的信號(hào)肽的序列1的核苷酸960～1013構(gòu)成或者由編碼由序列5的氨基酸1～20構(gòu)成的信號(hào)肽的序列4的核苷酸981～1040構(gòu)成，其中，所述基因?qū)λ龊怂嵝蛄卸允峭庠吹摹?br> 本發(fā)明還涉及包含這樣的核酸構(gòu)建物的重組表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(a)在適合生產(chǎn)該蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)這種重組宿主細(xì)胞；以及(b)回收該蛋白質(zhì)。
所述核酸序列可被可操作地與其它控制序列一起與外源基因連接。這樣的其它控制序列在上文被描述了。
所述蛋白質(zhì)可能是宿主細(xì)胞的天然的或異源的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”在本文并不意味著表示特定長(zhǎng)度的編碼產(chǎn)物，所以，它包括肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”還包括合并而形成編碼產(chǎn)品的兩個(gè)或多個(gè)多肽。該蛋白質(zhì)還包括雜合多肽，該雜合多肽包括得自至少兩種不同蛋白質(zhì)(其中，一種或多種可能是所述宿主細(xì)胞異源的或天然的蛋白質(zhì))的部分的或完全的多肽序列的組合。蛋白質(zhì)進(jìn)一步包括上述蛋白質(zhì)和雜合蛋白質(zhì)的天然等位變異和人工改造變異。
優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)是激素、激素變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分、或者報(bào)道分子。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該蛋白質(zhì)是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶或連接酶。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，該蛋白質(zhì)是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶、氧化酶、果膠溶解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
所述基因可得自任何原核生物源、真核生物源或其它源。
通過(guò)如下實(shí)施例(不能將它們認(rèn)作限制本發(fā)明的范圍)進(jìn)一步描述了本發(fā)明。實(shí)施例原料用作緩沖劑和底物的化學(xué)藥品都是至少試劑級(jí)的商品。實(shí)施例1通過(guò)米曲霉菌株HC4.01和27生產(chǎn)CAREZYMETM按WO91/17243中描述的那樣構(gòu)建了生產(chǎn)胞外β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(CAREZYMETM)的米曲霉菌株。CAREZYMETM是由Novo NordiskA/S,Bagsvd,Denmark生產(chǎn)的Trichoderma harzianum纖維素酶。選擇米曲霉A1560-T40中的pSX320的轉(zhuǎn)化體no.27(WO91/17243)用于誘變以便生產(chǎn)優(yōu)異的菌株。通過(guò)NTG誘變處理轉(zhuǎn)化體No.27，分離具有改變了的平板形態(tài)學(xué)的菌株。在搖瓶發(fā)酵和罐發(fā)酵中顯示這些被稱(chēng)為HC4.01的菌株之一的CAREZYMETM產(chǎn)率增大了。在試圖進(jìn)一步表征米曲霉菌株HC4.01和no.27之間的差異時(shí)，通過(guò)示差顯示法(differential display method)比較了得自這兩種菌株的mRNA制品。
在34℃、pH7、800～1100rpm的2升補(bǔ)料分批發(fā)酵物中并排生長(zhǎng)米曲霉菌株HC4.01和27達(dá)5天，所述發(fā)酵物由Nutriose、酵母抽提物、MgSO4·7H2O、檸檬酸、K2SO4、KH2PO4、脲、三甲基甘氨酸和痕量金屬溶液組成。
以pH7時(shí)1％CMC溶液的粘度變化(減小)測(cè)定了CAREZYMETM活性(與得自Novo Nordisk A/S,Bagsvd,Denmark的純化CAREZYMETM標(biāo)準(zhǔn)物比較)。
在48小時(shí)，通過(guò)這兩種菌株生產(chǎn)的CAREZYMETM水平開(kāi)始不同了。
按Wahleithner等(1996)在現(xiàn)代遺傳學(xué)(CurrentGenetics)29:395～403中描述的方法在48小時(shí)從每種細(xì)胞系的冷凍菌絲體制備了RNA。應(yīng)用MessageClean Kit(GenHunterCorp.,Nashville,TN)按生產(chǎn)商的指示通過(guò)DNA酶處理除去了基因組DNA片段。
對(duì)于每種錨式dT12N2引物，在兩個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)中，將3.75μg得自米曲霉菌株HC4.01和27的總RNA與下列物質(zhì)混合1.0μM引物、15μl5x第一鏈合成緩沖劑(Life Technologies,Gaithersburg,MD)、10μM二硫蘇糖醇和20μM dNTP(總體積為75μl)。在65℃下將該溶液保溫5分鐘，在冰上快速冷卻，添加500單位SuperScriptⅡTM逆轉(zhuǎn)錄酶(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)。在37℃下保溫1小時(shí)后，通過(guò)在95℃下熱處理5分鐘停止反應(yīng)，在-20℃貯存第一鏈樣品。表1.用于示差顯示反應(yīng)的引物oligo(dT12N2)引物A GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTCT(序列7)B GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTCC(序列8)C GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTCG(序列9)D GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTGT(序列10)E GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTGG(序列11)F GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTGA(序列12)G GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTAT(序列13)H GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTAC(序列14)I GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTAG(序列15)K GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTAA(序列16)L GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTCA(序列17)M GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTGC(序列18)隨機(jī)引物01 CGGGAAGCTTATCGACTCCAAG(序列19)02 CGGGAAGCTTTAGCTAGCATGG(序列20)03 CGGGAAGCTTGCTAAGACTAGC(序列21)04 CGGGAAGCTTTGCAGTGTGTGA(序列22)05 CGGGAAGCTTGTGACCATTGCA(序列23)06 CGGGAAGCTTGTCTGCTAGGTA(序列24)07 CGGGAAGCTTGCATGGTAGTCT(序列25)08 CGGGAAGCTTGTGTTGCACCAT(序列26)09 CGGGAAGCTTAGACGCTAGTGT(序列27)10 CGGGAAGCTTTAGCTAGCAGAC(序列28)11 CGGGAAGCTTCATGATGCTACC(序列29)12 CGGGAAGCTTACTCCATGACTC(序列30)13 CGGGAAGCTTATTACAACGAGG(序列31)14 CGGGAAGCTTATTGGATTGGTC(序列32)15 CGGGAAGCTTATCTTTCTACCC(序列33)16 CGGGAAGCTTATTTTTGGCTCC(序列34)17 CGGGAAGCTTATCGATACAGG(序列35)18 CGGGAAGCTTTATGGTAAAGGG(序列36)19 CGGGAAGCTTTATCGGTCATAG(序列37)20 CGGGAAGCTTTAGGTACTAAGG(序列38)應(yīng)用每個(gè)引物對(duì)(240個(gè)不同的引物對(duì))關(guān)于對(duì)比RNAs和突變RNAs一式三份引起了PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增物由下列物質(zhì)組成1.0μl cDNA反應(yīng)物，2.0μl 10x PCR緩沖劑[500mM KCl；100mM Tris-HCl(pH9.0)；15mM MgCl2；1％(w/v)明膠；1％(v/v)Triton X-100],1.5μl 25mM dNTP,2.5μl 10mM 5′任意引物，1.25μl 1OmM富含T的引物，0.15μl32P-dATP(2000 Ci/mM,New England Nuclear-DuPont,Boston,MA)，以及2.5單位Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Corp.,Brahchburg,NJ)，用H2O調(diào)節(jié)體積至20μl。應(yīng)用熱循環(huán)儀按下列程序進(jìn)行了反應(yīng)98℃一次循環(huán)10秒；四次循環(huán)，每次在94℃30秒、42℃60秒和72℃30秒；以及25次循環(huán)，每次在94℃30秒、60℃60秒和72℃30秒。
將3.5μl各PCR反應(yīng)的等分液在甲酰胺測(cè)序染料溶液中變性，在6％聚丙烯酰胺、7M脲測(cè)序凝膠上分離。呈相鄰的行(為了比較條帶帶型)電泳處理三份對(duì)比PCR反應(yīng)物和得自一個(gè)引物對(duì)的突變PCR反應(yīng)物。在Whatman 3M紙上干燥凝膠，用熒光規(guī)尺帶(fluorescent rulertape)對(duì)取向進(jìn)行標(biāo)記，暴露于一張醫(yī)用X光片一夜。將示差顯示反應(yīng)的未利用部分在-20℃下冷凍用于片段篩選。
應(yīng)用所述熒光規(guī)尺的痕跡校準(zhǔn)所述膠片和凝膠。標(biāo)記示差顯示的條帶并用解剖刀從凝膠切除。將該凝膠切片(包括Whatman濾紙)在室溫下浸泡10分鐘，然后在1.5ml Eppendorf微量離心管內(nèi)在95℃的0.1ml水中保溫15分鐘。應(yīng)用10μl 3M乙酸鈉、5μl 10mg/ml糖原和0.45μl 100％乙醇的溶液沉淀洗脫的DNA。將該DNA片重懸浮于10μl水中，應(yīng)用初始用于擴(kuò)增的相同引物對(duì)和在上述相同的條件下(但應(yīng)用60℃退火溫度)重?cái)U(kuò)增40輪PCR。
將PCR擴(kuò)增的條帶連接入pCR2.1(Invitrogen,La Jolla,CA)，該pCR 2.1已按Hadjeb和Berkowitz(1996)在生物技術(shù)(Biotechniques)20:20～22中描述的方案用EcoRV線性化并TA-加尾。將連接物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸埃希氏菌DH5α細(xì)胞，通過(guò)包含X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)的瓊脂糖板上藍(lán)色/白色選擇來(lái)篩選生成的集落。對(duì)于每種示差顯示的片段，挑選六個(gè)集落供進(jìn)一步分析。實(shí)施例3示差顯示的片段的篩選使實(shí)施例2中描述的六組集落的每一組在補(bǔ)加了100μg氨芐西林/ml的3ml Luria培養(yǎng)液(1％胰酶解胨-0.5％酵母抽提物-0.5％氯化鈉)中生長(zhǎng)。通過(guò)離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞片重懸浮于0.3ml含l00μg RNA酶A/ml的10mM EDTA-50mM Tris-HCl緩沖劑(pH8.0)中，通過(guò)接著添加0.3ml 1％ SDS-200mM NaOH溶解。在室溫下保溫5分鐘后，添加0.3ml 2.0M乙酸鉀(pH5.5)。通過(guò)在15,0000xg(4℃)下離心10分鐘澄清溶胞產(chǎn)物。將上清液轉(zhuǎn)至微量離心管，然后添加0.7ml異丙醇使DNA沉淀。通過(guò)在15,000xg(4℃)下離心15分鐘收集該DNA。將離心片重懸浮于0.1ml的1mM EDTA-10mM Tris-HCl(pH8.0)中，在-20℃下貯存樣品。
初步篩選克隆片段用于通過(guò)再雜交返回它們的起始PCR反應(yīng)(在-20℃下貯存的所述反應(yīng)物的未利用部分)的示差表達(dá)。用H2O以1∶20稀釋從每個(gè)集落制備的DNA，然后應(yīng)用狹線印跡裝置涂到雙層尼龍膜上。每個(gè)雙層膜攜帶得自應(yīng)用四種獨(dú)立的引物對(duì)鑒定的那些片段的克隆(即，從包含得自oligo E以及引物01、03、06和08的擴(kuò)增子的泳道切除的片段)。在80℃的真空干燥箱中將膜烘1～2小時(shí)，然后在高嚴(yán)格性條件(50％甲酰胺，6xSSC,42℃)下雜交。用于一個(gè)濾器的雜交探針包含變性的產(chǎn)物，該產(chǎn)物得自應(yīng)用來(lái)自突變株的cDNA和四種相應(yīng)于被篩選的集落的引物對(duì)擴(kuò)增的三重反應(yīng)；就另一個(gè)濾器來(lái)說(shuō)，cDNA是從對(duì)比菌株合成的。如果集落得自應(yīng)用oligo D與引物01、03、06和08以及米曲霉HC4.01 cDNA生產(chǎn)的片段，就將那些PCR反應(yīng)物加到雜交混合物中。在65℃下的0.5xSSC、0.1％SDS中將膜洗滌一次(達(dá)15分鐘)，在Phosphor Imager(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)上分析。如果片段是從米曲霉HC4.01 cDNA而不是米曲霉27 cDNA擴(kuò)增的，就只將克隆雜交返回米曲霉HC4.01 PCR反應(yīng)。將符合原始示差顯示、只與所述兩種探針之一雜交的克隆貯存，它們的插入片段被用作Northern分析中的探針。
RNA印跡分析是按Maniatis等(1982，“分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York)關(guān)于甲醛凝膠電泳的方法進(jìn)行的。將包含分別得自米曲霉菌株27和HC4.01的總RNA的濾器在高嚴(yán)格性條件(50％甲酰胺，6xSSC,42℃)下與放射性標(biāo)記的瓊脂糖凝膠純化的DNA雜交，該DNA得自那些在初步狹線印跡篩選后呈陽(yáng)性的克隆。該DNA是應(yīng)用α[32P]dCTP(Amersham,Arlington Heights,IL)通過(guò)切口平移(Maniatis，上文)放射性標(biāo)記的，并且以大約1×106cpm/ml緩沖劑的活度被加到雜交緩沖劑中。
兩種不同的插入片段顯示示差雜交，其中，它們與米曲霉27 RNA而不與米曲霉HC4.01 RNA雜交。這些質(zhì)粒被稱(chēng)為pToC367(插入片段被稱(chēng)為DDC2)和pToC370(插入片段被稱(chēng)為DDC3)。實(shí)施例4DDC2和DDC3的cDNA克隆的分離和表征在ABI自動(dòng)DNA測(cè)序儀(Applied Biosystems,Foster City,CA)上按生產(chǎn)商的指示對(duì)得自pToC367的DDC2插入片段(大約250bp)測(cè)序而獲得一部分cDNA序列，它包含一段腺苷殘基(即，位于一端的所謂的“polyA尾”，指示該基因的轉(zhuǎn)錄方向)。
按下列方案合成了雙鏈cDNA。為了產(chǎn)生第一鏈cDNA，在1.0μg得自米曲霉27(第2天)的總的RNA中添加總體積為5μl的1mMCapSwitchTM寡核苷酸(Clontech,Palo Alto,CA)和1mM(CDS/3′PCR引物[Oligo(dT)30N1N，而且N1=A、C或G](Clontech,Palo Alto,CA),在72℃下保溫2分鐘，然后在冰上急冷2分鐘。在微型離心機(jī)(microfuge)中將反應(yīng)物離心30秒，然后添加下列物質(zhì)2.0μl 5x第一鏈合成緩沖轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies,Gaithersburg,MD),1.0μl 20mM二硫蘇糖醇，1.0μl 10mM dNTP和200單位SuperScriptTMⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies,Gaithersburg,MD)。在42℃下保溫1小時(shí)后，在-20℃下貯存該cDNA。第二鏈cDNA是通過(guò)PCR擴(kuò)增制備的，其中，將2μl第一鏈反應(yīng)物與下列物質(zhì)混合10μl 10x PCR緩沖劑，2μl 10mM dNTP,2μl 5′PCR引物，2μl CDS/3′PCR引物和2μl 50x Advantage KlenTaq聚合酶混合物(Clontech,PaloAlto,CA)。在熱循環(huán)儀中按下列程序進(jìn)行了擴(kuò)增95℃一次循環(huán)1分鐘；20次循環(huán)，每次在95℃15秒和68℃5分鐘。
基于得自pToC367的插入片段的序列信息，合成了一種DDC2特異性的寡核苷酸用于分離cDNA克隆。所述引物以與基因的轉(zhuǎn)錄相反的方向取向。該引物具有下列序列26186:CATCTCATTATCAGCCATTCC(序列39)基于得自pToC370的插入片段的序列信息，合成了一種DDC3特異性的寡核苷酸用于分離cDNA克隆。所述引物以與基因的轉(zhuǎn)錄相反的方向取向。該引物具有下列序列26183:CCCAACATACCCGGAAATCG(序列40)26184:GCGGGTGGTTCGGGAACACC(序列41)用引物26186(DDC2)和得自CAP Finder Kit(Clontech,PaloAlto,CA)的5′引物對(duì)米曲霉no.27 cDNA進(jìn)行了PCR反應(yīng)。操作了三十個(gè)PCR循環(huán)(退火溫度為60℃)。5′引物是CAP Finder Kit的一部分，它將與該試劑盒產(chǎn)生的cDNA的5′端雜交。獲得了大約400bp的片段。
為了獲得DDC3 PCR產(chǎn)物，進(jìn)行了嵌套式聚合酶鏈反應(yīng)。用引物26183和得自CAP Finder Kit(Clontech,Palo Alto,CA)的5′引物操作了第一個(gè)PCR反應(yīng)達(dá)30個(gè)循環(huán)(退火溫度為60℃)。5′引物是Clontech CAP Finder Kit的一部分，它將與該試劑盒產(chǎn)生的cDNA的5′端雜交。將一份該P(yáng)CR反應(yīng)的等分樣用作與引物26184和5′CAPFinder引物的新反應(yīng)的模板。再次操作該反應(yīng)達(dá)30個(gè)循環(huán)(退火溫度為60℃)。在第二個(gè)PCR反應(yīng)中，獲得了大約400bp的片段。
將這些片段獨(dú)自地克隆入pCRⅡ載體(Invitrogen,San Diego CA)并在ABI自動(dòng)DNA測(cè)序儀上按生產(chǎn)商的指示測(cè)序。獲得的DDC2全長(zhǎng)cDNA序列和推斷的氨基酸序列分別示于序列3和序列2。獲得的DDC3全長(zhǎng)cDNA序列和推斷的氨基酸序列分別示于序列6和序列5。
通過(guò)Testcode和Codonpreference(Genetics ComputerGroup,Inc.,Madison,WI)的編碼區(qū)計(jì)算機(jī)分析和對(duì)DDC2的cDNA的翻譯啟示了編碼64個(gè)氨基酸的多肽(序列2)的可讀框以及對(duì)DDC3的cDNA的翻譯啟示了編碼83個(gè)氨基酸的多肽(序列5)的可讀框。程序Sigcleave(Genetics Computer Group,Inc.,Madison,WI)預(yù)示了關(guān)于DCC2多肽存在18個(gè)氨基酸的分泌信號(hào)和關(guān)于DCC3多肽存在20個(gè)氨基酸的分泌信號(hào)，這啟示所述多肽被分泌了。
DDC3多肽包含三次重復(fù)的18個(gè)氨基酸的如下序列DDGAIRIPVKGVPEPEKR(序列5)。第三次重復(fù)表明在C端的偏差，其中，該重復(fù)中的最后兩個(gè)氨基酸是Lys和Arg。已知該二堿基位點(diǎn)(dibasicsite)是酵母和真菌中分泌性蛋白質(zhì)的成熟中涉及的kex2蛋白酶的分裂位點(diǎn)?；蚪Y(jié)構(gòu)啟示，DDC3編碼一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)被分泌和被加工成可能3個(gè)小的肽。DDC3的基因結(jié)構(gòu)類(lèi)似釀酒酵母的α因子基因(Kurjan等，1982，細(xì)胞(Cell)30:933～943)的結(jié)構(gòu)。
將DDC2和DDC3多肽的推斷的氨基酸序列(分別為序列2和5)通過(guò)各種檢索規(guī)則系統(tǒng)(search algorithms)與Genebank中的序列作了比較，所述檢索規(guī)則系統(tǒng)例如Fasta(Lipman和Pearson,1988，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，85:2444)和Blast(Altschul等，1990，分子生物學(xué)雜志215:403)。未發(fā)現(xiàn)同源物。實(shí)施例5:DDC2和DDC3基因組克隆的分離應(yīng)用α[32P]dCTP(Amersham,Arlington Heights,IL)通過(guò)切口平移(Sambrook等，上文)放射性標(biāo)記DDC2的cDNA克隆，以大約1×106cpm/ml緩沖劑的活度加到雜交緩沖劑中，用作對(duì)米曲霉IFO4177的粘粒文庫(kù)的探針。該粘粒文庫(kù)是應(yīng)用SuperCosl Cosmid VectorKit(Stratagene,La Jolla,CA)按生產(chǎn)商的指示構(gòu)建的。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(Christensen等，1988，生物工程(Biotechnology)6:1419～1422)從原生質(zhì)體制備了米曲霉IFO4177的基因組DNA。將該原生質(zhì)體分離后，通過(guò)在LabofugeT(Heto,Denmark)中、在2500rpm下離心5分鐘使它們成片狀。然后將離心片懸浮于10mM NaCl,20mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA,100μg/ml蛋白酶K和0.5％SDS(如SuperCosl Kit的說(shuō)明書(shū)中所述)。按該試劑盒所附的生產(chǎn)商指示進(jìn)行該DNA制備的其余步驟。應(yīng)用CHEF-凝膠裝置(BioRad Laboratories,Hercules,CA)通過(guò)電泳分析該基因組DNA的尺寸。在200伏時(shí)以10～50秒的脈沖走1％瓊脂糖凝膠達(dá)20小時(shí)。用溴化乙錠將該凝膠染色并照相。發(fā)現(xiàn)該DNA尺寸從約50到大于100kb。用Sau3A部分地消化該DNA。通過(guò)上述相同類(lèi)型的CHEF-凝膠分析法測(cè)定獲得的消化DNA的尺寸是20～50kb。按生產(chǎn)商的指示制備了CsCl梯度帶狀SuperCosl粘粒。按生產(chǎn)商的指示同樣進(jìn)行了連接和包裝。在該文庫(kù)的滴定后，將得自一次連接和包裝的全部包裝混合物轉(zhuǎn)染入大腸埃希氏菌XL1-Blue MR(Stratagene,La Jolla,CA)并鋪在補(bǔ)加了50μg氨芐西林/ml的LB板上。獲得了大約3800個(gè)集落。
得自十個(gè)集落的粘粒制品表明全部具有預(yù)期尺寸的插入片段。逐個(gè)挑選這些集落，接種入含有100μl補(bǔ)加了100μg氨芐西林/ml的Luria Broth培養(yǎng)基的微量滴定板孔中，在37℃下培養(yǎng)一夜。往每孔中添加100μl 50％甘油，在-80℃下冷凍全部文庫(kù)。貯存了共3822個(gè)集落。這表示大約4.4倍擴(kuò)增米曲霉基因組。
將全部文庫(kù)以高密度點(diǎn)到尼龍膜(GenomeSystems,Inc.,St.Louis,MO)上。在高嚴(yán)格性條件(2×SSC,65℃)下將32P標(biāo)記的DDC2 cDNA與粘粒18H7雜交。在高嚴(yán)格性條件(2×SSC,65℃)下將32P標(biāo)記的DDC3 cDNA雜交并且粘粒34G12顯示強(qiáng)雜交信號(hào)。
從粘粒18H7制備了質(zhì)粒DNA，在ABI自動(dòng)DNA測(cè)序儀上應(yīng)用下列引物(這兩種引物都含于cDNA序列中)按生產(chǎn)商的指示測(cè)序30982:TGCAGATCTCCTGGTTTGCC(序列42)30983:CTCCCTAAGGAATGCAAATGG(序列43)還從粘粒34G12制備了質(zhì)粒DNA，在ABI自動(dòng)DNA測(cè)序儀上應(yīng)用從cDNA序列制備的下列引物按生產(chǎn)商的指示測(cè)序30984:CCATGAAGCTCTTCTCTACC(序列44)30985:CTATTTCTCAGCGGGTGGTTCG(序列45)合成了新引物以便獲得進(jìn)一步的上游和下游序列。
關(guān)于DDC2和DCC3的生成的基因組核酸序列和推斷的氨基酸序列分別示于圖1(分別為序列1和2)和圖2(分別為序列4和5)。實(shí)施例6關(guān)于DDC2的缺失質(zhì)粒的構(gòu)建為米曲霉中DDC2基因的缺失設(shè)計(jì)的質(zhì)粒是這樣構(gòu)建的通過(guò)將起始密碼子的上游的1kb序列和終止密碼子的下游的1kb序列克隆入通過(guò)米曲霉pyrG基因分開(kāi)的載體。
應(yīng)用粘粒18H7為模板利用下列引物通過(guò)PCR獲得了5′片段102012:GAAGATCTTGGGGGCAGTCAGTGACGGG(序列46)102013:TCCCCCGGGTATGATTTGATTAGGATG(序列47)應(yīng)用粘粒18H7為模板利用下列引物在上述相同的條件下通過(guò)PCR獲得了3′片段102014:TCCCCCGGGAGTGTTATTAATAAGGAGG(序列48)102015:TGCACTGCAGGTATCTGTATCCCAGTCAGC(序列49)用限制酶SmaⅠ和BglⅡ切割5′PCR片段，再?gòu)沫傊悄z純化切割的片段。用SmaⅠ和PstⅠ切割3′PCR片段，再?gòu)沫傊悄z純化限制酶切片段。將該5′片段和3′片段克隆入用BglⅡ和PstⅠ限制酶切的pICl9H(Marsh等，1984，基因32:481～485)。用SmaⅠ切割生成的質(zhì)粒，再用堿性磷酸酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)去磷酸化。將包含米曲霉pyrG基因的3.5kb HindⅢ片段與pJaL335(PCT/DK 96/00528)分離，通過(guò)與DNA聚合酶的Klenow片段(Promega,Madison,WI)和dNTP保溫變成平端。將這兩個(gè)片段連接而生成如圖3所示的質(zhì)粒pToC391。pToC391可被PvuⅠ線性化后用于轉(zhuǎn)化米曲霉pyrG-菌株而生產(chǎn)轉(zhuǎn)化體(其中，DDC2基因被pyrG基因替代了)。這樣的DDC2突變株可以例如通過(guò)Southern分析或者通過(guò)PCR法發(fā)現(xiàn)。該DDC2突變株可用作任何異源蛋白的表達(dá)宿主。這樣分離的DDC2突變株可通過(guò)選擇對(duì)氟乳清酸(fluororonic acid)的抗性而變成pyrG-(是由于在pJaL335上的400bp重復(fù)側(cè)翼pyrG基因)。實(shí)施例7關(guān)于DDC3的缺失質(zhì)粒的構(gòu)建為米曲霉中DDC3的缺失設(shè)計(jì)的質(zhì)粒是這樣構(gòu)建的將起始密碼子上游的大約1kb的序列和終止密碼子下游的大約1kb的序列克隆入載體(其中，兩個(gè)插入片段被米曲霉pyrG基因分開(kāi)了)。
粘粒34G12不含能構(gòu)建缺失質(zhì)粒的足夠的上游序列。為了克隆更多的上游序列，應(yīng)用了反向聚合酶鏈反應(yīng)。用32P標(biāo)記的DDC3探針對(duì)得自米曲霉IFO4177(米曲霉A1560-T40的親代菌株)的基因組DNA的Southern分析揭示了大約2.5kb NsiⅠ片段。用NsiⅠ消化基因組DNA，連接，然后用作應(yīng)用下列引物的反向聚合酶鏈反應(yīng)的模板30985:CTATTTCTCAGCGGGTGGTTCG(序列45)101449:CTCTATGTAACCAACTCCTGC(序列50)獲得了預(yù)期尺寸(2.3kb)的片段，將它克隆入載體pCRⅡ(Invitrogen,San Diego CA)。在ABI自動(dòng)DNA測(cè)序儀上對(duì)該片段測(cè)序。
序列信息被用于設(shè)計(jì)構(gòu)建所述缺失質(zhì)粒的引物。用于獲得5′片段的引物如下116497:CGAAAGCTTACTCTCTGGAACAGG(序列51)118141:CATGGAGCTCGATGGCCAAATGACTGATTCC(序列52)用于獲得3′片段的引物如下116494:GACACTCGAGTAAGATATGCTGCAGAC(序列53)116495:CATAAGCTTTCGAGTGATAATGTCTTGG(序列54)
應(yīng)用IFO4177基因組DNA(作為模板)和引物對(duì)116497/118141或者引物對(duì)116494/116495進(jìn)行了兩個(gè)PCR反應(yīng)。用限制酶SacⅠ和HindⅢ切割5′片段，用限制酶HindⅢ和XhoⅠ切割3′片段，從瓊脂糖凝膠純化這兩個(gè)切割片段。將該片段克隆入用SacⅠ和XhoⅠ限制酶切的載體pBluescript(Stratagene,La Jolla,CA)。用HindⅢ切割生成的質(zhì)粒，再用堿性磷酸酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)去磷酸化，然后與得自包含pyrG基因的pJaL335(PCT/DK 96/00528)的3.5kb HindⅢ片段連接。這兩個(gè)片段連接而生成質(zhì)粒pToC401(如圖4所示)。PToC401可被SacⅠ線性化而用于轉(zhuǎn)化米曲霉(pyrG-)菌株而生產(chǎn)轉(zhuǎn)化體(其中，DDC3基因被pyrG基因替代了)。這樣的突變株可以例如通過(guò)Southern分析或者通過(guò)PCR法發(fā)現(xiàn)。該DDC3突變株可用作任何異源蛋白的表達(dá)宿主。通過(guò)該方法分離的DDC3突變菌株可通過(guò)選擇對(duì)氟乳清酸的抗性而輕易變成pyrG-(是由于在pJaL335上的400bp重復(fù)側(cè)翼pyrG基因)。
生物材料的保藏下列生物材料已按布達(dá)佩斯條約的條款保藏在德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 1b,D-38124 Braunschweig,Germany，被給予如下登記號(hào)保藏物 登記號(hào) 保藏日期大腸埃希氏菌DH5α+粘粒18H7 DSM12060 1998年3月3日大腸埃希氏菌DH5α+粘粒34G12 DSM11924 1998年1月19日該菌株已保藏，但必須確保在該專(zhuān)利申請(qǐng)未定期間由專(zhuān)利和商標(biāo)局官員(他按37C.F.R.ξ1.14和35 U.S.C.ξ122有資格)確定的人能獲得該培養(yǎng)物。該保藏物是該保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。當(dāng)外國(guó)專(zhuān)利法(在其中該主題申請(qǐng)或其子申請(qǐng)的對(duì)應(yīng)申請(qǐng)被提交的國(guó)家)要求時(shí)，可獲得該保藏物。但應(yīng)理解，可以獲得一個(gè)保藏物并不構(gòu)成對(duì)實(shí)施該主題發(fā)明的許可而廢除政府行為授的的專(zhuān)利權(quán)。
本文描述的和要求保護(hù)的本發(fā)明不限于本文公開(kāi)的具體實(shí)施方案的范圍，因?yàn)檫@些實(shí)施方案是作為對(duì)本發(fā)明數(shù)個(gè)方面的闡述。任何相當(dāng)?shù)膶?shí)施方案都應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)際上，從前面描述可知，除了本文示出的和描述的之外對(duì)本發(fā)明的各種修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言都是顯而易見(jiàn)的。這樣的修改也應(yīng)屬于附后的權(quán)利要求書(shū)的范圍。在沖突的情況下，本公開(kāi)包括的定義將起支配作用。
本文引用了各種參考文獻(xiàn)，它們以其整個(gè)公開(kāi)內(nèi)容并入本文作參考。
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權(quán)利要求
1．一種生產(chǎn)多肽的方法，它包括(A)在有助于生產(chǎn)該多肽的條件下培養(yǎng)親代絲狀真菌細(xì)胞的突變細(xì)胞，其中，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，所述突變細(xì)胞比親代細(xì)胞生產(chǎn)更多的多肽，其中，所述突變細(xì)胞包含一條編碼該多肽的第一種核酸序列以及一條或多條選自下組的第二種核酸序列的修飾(ⅰ)編碼具有一種氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少50％與序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性；(ⅱ)具有至少50％與序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性的核酸序列；(ⅲ)一條核酸序列，它在低嚴(yán)格性條件下與如下物質(zhì)雜交(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(b)至少100個(gè)核苷酸的(a)的子序列，或者(c)(ⅰ)或(ⅱ)的互補(bǔ)鏈；(ⅳ)一條編碼多肽的變體的核酸序列，所述多肽具有一條序列2或序列5的氨基酸序列，所述變體包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代、缺失和/或插入；(ⅴ)(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的等位變體；以及(ⅵ)(ⅰ)、(ⅱ)、(ⅲ)或(ⅴ)的子序列，其中，該子序列編碼具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽片段；以及(B)從所述突變細(xì)胞的培養(yǎng)基回收所述多肽。
2．權(quán)利要求1的方法，其中，所述第一種核酸序列編碼真菌細(xì)胞的天然多肽。
3．權(quán)利要求1的方法，其中，所述第一種核酸序列編碼真菌細(xì)胞的異源多肽。
4．權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)的方法，其中，所述多肽是激素、激素變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分或者報(bào)道分子。
5．權(quán)利要求4的方法，其中，所述酶是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶或連接酶。
6．權(quán)利要求5的方法，其中，所述酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶、氧化酶、果膠溶解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
7．權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)的方法，其中，所述絲狀真菌細(xì)胞是支頂孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、隱球酵母屬、Filibasidium、鐮孢屬、赤霉屬、腐質(zhì)霉屬、Magnaporthe、毛霉屬、毀絲霉屬、漆斑菌屬、Neocallimastix、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、Piromyces、裂褶菌屬、籃霉菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、Tolypocladium或木霉屬細(xì)胞。
8．權(quán)利要求7的方法，其中，所述絲狀真菌細(xì)胞是曲霉屬細(xì)胞。
9．權(quán)利要求8的方法，其中，所述曲霉屬細(xì)胞是米曲霉細(xì)胞。
10．權(quán)利要求8的方法，其中，所述曲霉屬細(xì)胞是黑曲霉細(xì)胞。
11．權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)的方法，其中，所述第二種核酸序列是編碼具有一種氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少50％與序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性。
12．權(quán)利要求11的方法，其中，所述第二種核酸序列是編碼具有一種氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少60％與序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性。
13．權(quán)利要求12的方法，其中，所述第二種核酸序列是編碼具有一種氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少70％與序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性。
14．權(quán)利要求13的方法，其中，所述第二種核酸序列是編碼具有一種氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少80％與序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性。
15．權(quán)利要求14的方法，其中，所述第二種核酸序列是編碼具有一種氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少90％與序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性。
16．權(quán)利要求15的方法，其中，所述第二種核酸序列是編碼具有一種氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少95％與序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性。
17．權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)的方法，其中，所述第二種核酸序列編碼包含序列2或序列5的氨基酸序列的多肽。
18．權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)的方法，其中，所述第二種核酸序列編碼一種多肽，該多肽由序列2或序列5的氨基酸序列；或其具有DDC2或DDC3多肽活性的片段構(gòu)成。
19．權(quán)利要求18的方法，其中，所述第二種核酸序列編碼由序列2或序列5的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
20．權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)的方法，其中，所述第二種核酸序列編碼一種多肽，該多肽由序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83構(gòu)成。
21．權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)的方法，其中，所述第二種核酸序列是這樣一種核酸序列它具有至少50％與序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性。
22．權(quán)利要求21的方法，其中，所述第二種核酸序列是這樣一種核酸序列它具有至少60％與序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性。
23．權(quán)利要求22的方法，其中，所述第二種核酸序列是這樣一種核酸序列它具有至少70％與序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性。
24．權(quán)利要求23的方法，其中，所述第二種核酸序列是這樣一種核酸序列它具有至少80％與序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性。
25．權(quán)利要求24的方法，其中，所述第二種核酸序列是這樣一種核酸序列它具有至少90％與序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性。
26．權(quán)利要求25的方法，其中，所述第二種核酸序列是這樣一種核酸序列它具有至少95％與序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性。
27．權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)的方法，其中，所述第二種核酸序列是序列1或序列4的核酸序列。
28．權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)的方法，其中，所述第二種核酸序列包含序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的核酸序列。
29．權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)的方法，其中，所述第二種核酸序列是這樣一種核酸序列它在低嚴(yán)格性條件下與如下物質(zhì)雜交(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(b)至少100個(gè)核苷酸的(a)的子序列，或者(c)(a)或(b)的互補(bǔ)鏈。
30．權(quán)利要求29的方法，其中，所述第二種核酸序列是這樣一種核酸序列它在低嚴(yán)格性條件下與如下物質(zhì)雜交(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，或者(b)(a)的互補(bǔ)鏈。
31．權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)的方法，其中，所述第二種核酸序列是這樣一種核酸序列它在中度嚴(yán)格性條件下與如下物質(zhì)雜交(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(b)至少100個(gè)核苷酸的(a)的子序列，或者(c)(a)或(b)的互補(bǔ)鏈。
32．權(quán)利要求31的方法，其中，所述第二種核酸序列是這樣一種核酸序列它在中度嚴(yán)格性條件下與如下物質(zhì)雜交(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，或者(b)(a)的互補(bǔ)鏈。
33．權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)的方法，其中，所述第二種核酸序列是這樣一種核酸序列它在高嚴(yán)格性條件下與如下物質(zhì)雜交(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(b)至少100個(gè)核苷酸的(ⅰ)的子序列，或者(c)(a)或(b)的互補(bǔ)鏈。
34．權(quán)利要求33的方法，其中，所述第二種核酸序列是這樣一種核酸序列它在高嚴(yán)格性條件下與如下物質(zhì)雜交(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，或者(b)(a)的互補(bǔ)鏈。
35．權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)的方法，它編碼多肽的變體，所述多肽具有一條序列2或序列5的氨基酸序列，所述變體包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代、缺失和/或插入。
36．權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)的方法，其中，所述第二種核酸序列是含于粘粒34G12中的核酸序列，該粘粒含于大腸埃希氏菌DSM11924中。
37．權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)的方法，其中，所述第二種核酸序列是含于粘粒18H7中的核酸序列，該粘粒含于大腸埃希氏菌DSM12060中。
38．權(quán)利要求1～37任一項(xiàng)的方法，其中，所述突變細(xì)胞進(jìn)一步包括一條或多條第三種核酸序列的一個(gè)或多個(gè)修飾，其中，該修飾減少或消除了一條或多條第三種核酸序列的表達(dá)。
39．權(quán)利要求38的方法，其中，所述第三種核酸序列編碼一種酶，該酶選自氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶、氧化酶、果膠溶解酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
40．一種用于生產(chǎn)多肽的突變絲狀真菌細(xì)胞，該突變絲狀真菌細(xì)胞包含編碼該多肽的一條第一種核酸序列以及選自下組的第二種核酸序列的修飾(a)編碼具有一種氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少50％與序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性；(b)具有至少50％與序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性的核酸序列；(c)一條核酸序列，它在低嚴(yán)格性條件下與如下物質(zhì)雜交(ⅰ)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(ⅱ)至少100個(gè)核苷酸的(ⅰ)的子序列，或者(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的互補(bǔ)鏈；(d)一條編碼多肽的變體的核酸序列，所述多肽具有一條序列2或序列5的氨基酸序列，所述變體包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代、缺失和/或插入；(e)(a)、(b)或(c)的等位變體；以及(f)(a)、(b)、(c)或(e)的子序列，其中，該子序列編碼具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽片段。
41．權(quán)利要求40的突變細(xì)胞，它進(jìn)一步包括一條或多條第三種核酸序列的一個(gè)或多個(gè)修飾，其中，該修飾減少或消除了一條或多條第三種核酸序列的表達(dá)。
42．權(quán)利要求41的突變細(xì)胞，其中，所述第三種核酸序列編碼一種酶，該酶選自氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶、氧化酶、果膠溶解酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
43．一種生產(chǎn)權(quán)利要求40～42任一項(xiàng)的突變細(xì)胞的方法，它包括修飾親代絲狀真菌細(xì)胞的一條或多條第二種核酸序列，該序列選自(a)編碼具有一種氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少50％與序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性；(b)具有至少50％與序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性的核酸序列；(c)一條核酸序列，它在低嚴(yán)格性條件下與如下物質(zhì)雜交(ⅰ)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(ⅱ)至少100個(gè)核苷酸的(ⅰ)的子序列，或者(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的互補(bǔ)鏈；(d)一條編碼多肽的變體的核酸序列，所述多肽具有一條序列2或序列5的氨基酸序列，所述變體包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代、缺失和/或插入；(e)(a)、(b)或(c)的等位變體；以及(f)(a)、(b)、(c)或(e)的子序列，其中，該子序列編碼具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽片段。
44．一種分離的多肽，它選自(a)具有一種氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有至少50％與序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性；(b)由一種核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列在低嚴(yán)格性條件下與如下物質(zhì)雜交(ⅰ)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(ⅱ)至少100個(gè)核苷酸的(ⅰ)的子序列，或者(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的互補(bǔ)鏈；(c)具有一條序列2或序列5的氨基酸序列的多肽的變體，它包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代、缺失和/或插入；(d)(a)或(b)的等位變體；以及(e)(a)、(b)或(d)的片段，其中，該片段具有DDC2或DDC3多肽活性。
45．權(quán)利要求44的多肽，它包含一種氨基酸序列，該氨基酸序列具有至少50％與序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性。
46．權(quán)利要求44的多肽，它由序列2或序列5的氨基酸序列；或其具有DDC2或DDC3多肽活性的片段構(gòu)成。
47．權(quán)利要求46的多肽，它由序列2或序列5的氨基酸序列構(gòu)成。
48．權(quán)利要求46的多肽，它由序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83構(gòu)成。
49．權(quán)利要求44的多肽，它由一種核酸序列編碼，所述核酸序列在低嚴(yán)格性條件下與如下物質(zhì)雜交(ⅰ)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(ⅱ)至少100個(gè)核苷酸的(ⅰ)的子序列，或者(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的互補(bǔ)鏈。
50．權(quán)利要求44的多肽，它由一種核酸序列編碼，所述核酸序列在低嚴(yán)格性條件下與如下物質(zhì)雜交(ⅰ)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，或者(ⅱ)(ⅰ)的互補(bǔ)鏈。
51．權(quán)利要求44的多肽，它是具有一條序列2或序列5的氨基酸序列的多肽的變體，該變體包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代、缺失和/或插入。
52．權(quán)利要求44的多肽，它由含于粘粒34G12中的核酸序列編碼，所述粘粒含于大腸埃希氏菌DSM11924中。
53．權(quán)利要求44的多肽，它由含于粘粒18H7中的核酸序列編碼，所述粘粒含于大腸埃希氏菌DSM12060中。
54．一種分離的核酸序列，它編碼權(quán)利要求44的多肽。
55．一種核酸構(gòu)建物，它包含可操作地與一條或多條控制序列連接的、權(quán)利要求54的核酸序列，所述控制序列指導(dǎo)多肽在合適的表達(dá)宿主中的表達(dá)。
56．一種重組表達(dá)載體，它包含權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建物。
57．一種重組宿主細(xì)胞，它包含權(quán)利要求55的核酸構(gòu)建物。
58．一種生產(chǎn)權(quán)利要求44的多肽的方法，它包括(a)在有助于生產(chǎn)該多肽的條件下培養(yǎng)一種菌株；以及(b)從培養(yǎng)基回收該多肽。
59．一種生產(chǎn)多肽的方法，它包括(a)在有助于生產(chǎn)該多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求57的宿主細(xì)胞；以及(b)從培養(yǎng)基回收該多肽。
60．一種核酸構(gòu)建物，它包含編碼一種蛋白質(zhì)的基因，該基因可操作地與編碼一種信號(hào)肽的核酸序列連接，所述核酸序列由序列1的核苷酸960～1013或序列4的核苷酸981～1040構(gòu)成，其中，所述基因是該核酸序列的外源基因。
61．一種重組表達(dá)載體，它包含權(quán)利要求60的核酸構(gòu)建物。
62．一種重組宿主細(xì)胞，它包含權(quán)利要求60的核酸構(gòu)建物。
63．一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，它包括(a)在適合生產(chǎn)該蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求62的重組宿主細(xì)胞；以及(b)回收該蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以提高的量生產(chǎn)多肽的方法,它包括:(a)在適合生產(chǎn)該多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)親代絲狀真菌細(xì)胞的突變體,其中,(i)該突變細(xì)胞包含一條編碼該多肽的第一種核酸序列和編碼DDC2和/或DDC3多肽的一條或多條第二種核酸序列的修飾,或其同源物,以及(ii)當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí),該突變細(xì)胞比親代細(xì)胞生產(chǎn)更多的多肽;以及(b)從該突變細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基回收所述多肽。本發(fā)明還涉及所述第二種核酸序列,由該第二種核酸序列編碼的多肽,以及包含該序列的核酸構(gòu)建物、重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及絲狀真菌細(xì)胞的突變體和獲得該突變細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)C12N9/36GK1301307SQ99806230
公開(kāi)日2001年6月27日 申請(qǐng)日期1999年5月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月15日
發(fā)明者J·瓦勒斯尼爾, T·克瑞斯特森 申請(qǐng)人:諾沃諾爾迪斯克生物技術(shù)有限公司, 諾沃挪第克公司