專利名稱：用于核苷合成的熱穩(wěn)定生物催化劑結(jié)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
(脫氧)核苷是由結(jié)合于核糖或脫氧核糖的堿基如嘌呤或嘧啶組成的糖基胺，核糖或脫氧核糖是環(huán)狀戊糖。它們的實(shí)例包括胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、胸苷和肌苷。核苷類似物被廣泛用作抗病毒劑和抗癌劑，因?yàn)樗鼈冊(cè)赗NA或DNA合成中能夠用作反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或鏈終止劑[I]?；瘜W(xué)合成核苷類似物已經(jīng)被立體選擇性地實(shí)現(xiàn)，但要使用昂貴或污染試劑[2]并涉及可能費(fèi)時(shí)的多階段過程。生物催化步驟很好地替代了核苷的化學(xué)合成，原因是生物催 化反應(yīng)具有區(qū)域選擇性和立體選擇性，并且可使得降低副產(chǎn)物的含量。特別關(guān)注的生物催化步驟是借助催化一般可逆反應(yīng)的酶在供糖核苷和受體堿基之間的酶促轉(zhuǎn)糖基作用[3]，如圖I和2中所述。核苷磷酸化酶是廣泛分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌中并在核苷代謝補(bǔ)救途徑中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)移酶。它們具有雙重功能。在一方面，它們?cè)跓o機(jī)磷酸鹽存在下催化核糖核苷或脫氧核糖核苷的糖苷鍵的可逆切割，目的是生成堿基和核糖-I-磷酸或脫氧核糖-I-磷酸。應(yīng)用嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的這些酶促反應(yīng)顯示于圖I中。在另一方面，這些酶催化嘌呤或嘧啶堿基和核苷之間的磷酸依賴的戊糖轉(zhuǎn)移，即轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，以產(chǎn)生具有不同堿基的核苷。圖2示出了使用核苷磷酸化酶一鍋法合成的實(shí)例。當(dāng)嘧啶和嘌呤核苷磷酸化酶結(jié)合使用時(shí)，有可能將糖從供體嘧啶核苷轉(zhuǎn)移至嘌呤或嘧啶受體堿基，以及從供體嘌呤核苷轉(zhuǎn)移至嘧啶或嘌呤受體堿基，具體取決于使用的起始材料[4]。因此，不同來源(主要是細(xì)菌)的核苷磷酸化酶已經(jīng)被開發(fā)用作酶促合成核苷類似物的工具。在天然情況下，這些酶已經(jīng)被報(bào)道存在于多種微生物株系中，特別是在嗜熱細(xì)菌(即在45°C和80°C之間的溫度下旺盛生長的細(xì)菌)，它們?cè)谠S多工作中已經(jīng)被用作核苷磷酸化酶的來源，用于通過酶促轉(zhuǎn)糖基作用獲得修飾的核苷。然而，雖然在這些研究中目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率非常高，但轉(zhuǎn)糖基作用所需的酶活性的量或比率不是最佳的[5]。它們或者需要相當(dāng)長的反應(yīng)時(shí)間(多達(dá)數(shù)日)或者需要增加所使用的細(xì)菌生物量，以達(dá)到所需的轉(zhuǎn)化深度。另外，當(dāng)發(fā)生轉(zhuǎn)糖基過程時(shí)會(huì)出現(xiàn)另一個(gè)問題大量底物和產(chǎn)物難以溶解，它們中的許多在室溫下難溶于水性介質(zhì)。雖然該問題可能通過使用較高溫度解決，但是這需要酶在這些更苛刻的反應(yīng)條件中足夠穩(wěn)定。古菌是一組單細(xì)胞微生物，是二個(gè)生命域之一；其他兩個(gè)是細(xì)菌和真核生物。它們以前在細(xì)菌分類單位下稱為古細(xì)菌，但現(xiàn)在被認(rèn)為是獨(dú)立的和不同的。古菌域現(xiàn)在分成兩個(gè)主要的門廣古菌門(Euryarchaeota)和泉古菌門(Crenarchaeota)。廣古菌門包括產(chǎn)甲烷菌、極度嗜鹽菌、嗜熱嗜酸菌和少數(shù)超嗜熱菌的組合。相比之下，泉古菌門僅包括超嗜熱菌。超嗜熱菌是那些在極度熱環(huán)境(60°C以上，最適超過80°C)旺盛生長的生物。
Cacciapuoti et al. [6_8]描述了來自超嗜熱古菌的兩種嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase),其具體地公開了來自硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)的5，-脫氧-5’-甲硫基腺苷磷酸化酶IKSsMTAPII，EC2. 4. 2. 28)和來自強(qiáng)烈熾熱球菌(Pyrococcusfuriosus)的嘌呤核苷磷酸化酶(PfPNP)。該強(qiáng)烈熾熱球菌酶最初被注釋為MTAPII，但是它由于不能切割甲硫基腺苷而被重新命名為PNP。硫磺礦硫化葉菌屬于泉古菌門，而強(qiáng)烈熾熱球菌屬于廣古菌門。上文的EC代碼是國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)提供的常規(guī)的酶命名法，該酶命名法根據(jù)酶催化的反應(yīng)將酶分類。從超嗜熱菌表征的大多數(shù)酶在接近宿主生物的最適生長溫度的溫度下有最佳的活性。當(dāng)將其在嗜溫宿主像大腸桿菌(Escherichia coli )中克隆和表達(dá)時(shí),超嗜熱酶通常保持它們的熱特性。有時(shí)，所述的酶在遠(yuǎn)高于宿主生物最適生長溫度的溫度下有最佳活性。還有時(shí)，酶被描述為在比宿主生物最適生長溫度低10°C到20°C的溫度下有最佳活性 [10-11]。然而，當(dāng)在嗜溫宿主中表達(dá)時(shí)，硫磺礦硫化葉菌5’-甲硫基腺苷磷酸化酶(一種包含六個(gè)亞基間二硫鍵的六體酶)會(huì)形成不正確的二硫鍵，并且其穩(wěn)定性和耐熱性比天然酶弱[12]。熱變形菌綱(Thermoprotei)是泉古菌門中超嗜熱的綱。從古菌熱變形菌綱(Archaea Thermoprotei class)測(cè)序且可獲的基因組中，發(fā)現(xiàn)僅3條嘌呤-核苷磷酸化酶(EC 2.4. 2. I)的序列和僅3條尿苷磷酸化酶(EC2. 4. 2. 3)的序列。這6個(gè)蛋白質(zhì)已經(jīng)分別以如下登記號(hào)錄入U(xiǎn)niProtKB/TrEMBL中A1RW90 (AlRW90_THEro)，來自下垂熱絲菌(Thermofilum pendens)(菌株 Hrk 5)的假設(shè)蛋白質(zhì)；Q97Y30 (Q97Y30_SULS0),來自硫磺礦硫化葉菌的假設(shè)蛋白質(zhì)；A3DME1 (A3DME1_STAMF)來自的海葡萄嗜熱菌(Staphylothermusmarinus)(菌株 ATCC 43588/DSM 3639/F1)的假設(shè)蛋白質(zhì)；Q9YA34 (Q9YA34_AERPE)，來自敏捷氣熱菌(Aeropyrum pernix)的假設(shè)蛋白質(zhì)；A2BJ06 (A2BJ06_HYPBU),來自丁醇棲高溫菌(Hyperthermus butylicus)(菌株 DSM 5456/JCM 9403)的假設(shè)蛋白質(zhì)；以及 D9PZN7(D9PZN7_ACIS3)，來自 Acidilobus saccharovorans(菌株DSM 16705/VKM B-2471/345-15)的假設(shè)蛋白質(zhì)。所有這些序列都處于未經(jīng)檢驗(yàn)的注釋狀態(tài)，這意味著它們?cè)诠啪械拇嬖趦H經(jīng)過計(jì)算機(jī)驗(yàn)證。即使許多基因可以成功地在大腸桿菌中以高產(chǎn)率表達(dá)，來自超嗜熱菌的幾個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)很弱或根本不表達(dá)，部分原因是由于稀有密碼子的使用。實(shí)際上，據(jù)我們所知，仍沒有人成功表達(dá)上述基因的任一個(gè)?？紤]到以上偏見，考慮到所述技術(shù)困難，本發(fā)明人意外地能夠制備有活力的重組載體，并且重要的是獲得了在高于60°C的溫度下有最適活性的重組磷酸化酶。本發(fā)明的熱穩(wěn)定的和化學(xué)穩(wěn)定的催化劑是嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase，E. C. 2. 4. 2. I)和尿苷磷酸化酶(UPase, E. C. 2. 4. 2. 3)，它們?cè)醋怨啪鸁嶙冃尉V，其中所述PNPase來自硫磺礦硫化葉菌(SEQ ID NO. 7)，所述 UPase 來自敏捷氣熱菌(SEQ ID NO. 8)。具體而言，意外地發(fā)現(xiàn)，源自所述超嗜熱的熱變形菌綱的重組核苷磷酸化酶具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)-功能性質(zhì)，如增加的熱穩(wěn)性、高催化效率以及在溫度接近或高于100°c時(shí)最適的酶活性。這些重組酶可以以細(xì)胞裂解物的形式以及以粗提取物或純化的提取物的形式有利地用于轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，用于工業(yè)生產(chǎn)天然的和修飾的核苷類似物。它們特別功能多樣，因?yàn)樗鼈兛梢栽谒越橘|(zhì)、有機(jī)溶劑、在60°c和120°C之間的溫度時(shí)或者均具有這些參數(shù)的組合時(shí)催化轉(zhuǎn)糖基作用，使得可以以可接受的生產(chǎn)率、反應(yīng)時(shí)間，使用經(jīng)濟(jì)用量的所述酶制備許多的且不同類型的核苷。重要地，本發(fā)明中描述的生物催化劑可以用于需要存在有機(jī)溶齊U、高于60°c的溫度或兩者同時(shí)存在的條件下的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，目的是溶解所述底物或反應(yīng)產(chǎn)物。這些磷酸化酶在底物不溶于水的的反應(yīng)中是理想的。這些磷酸化酶的另一優(yōu)點(diǎn)在于它們耐受有機(jī)溶劑以及在于它們可以重復(fù)用于多個(gè)反應(yīng)循環(huán)。更有利地，本發(fā)明提供了可用于一鍋法合成核苷的熱變形菌綱核苷磷酸化酶的結(jié)合物。所述酶可以在一步驟(一鍋)或兩步驟合成方法中用于產(chǎn)生天然的核苷或核苷類似物。在一步驟合成中，嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶被用于同一批中，目的是將連接于糖的堿基更換為另一個(gè)選擇的堿基。在兩步驟合成中，嘧啶核苷磷酸化酶被用于釋放嘧啶核苷的糖，然后將I-磷酸-糖分離，隨后在另一個(gè)容器中使用嘌呤核苷磷酸化酶將嘌呤堿基連接到糖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種重組表達(dá)載體，包含a)編碼嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase，E. C. 2. 4. 2. I)的序列；b)編碼尿苷磷酸化酶(UPase，E. C. 2. 4. 2. 3)的序列；c)或前述兩者；所述序列每一個(gè)可操作地連接于指導(dǎo)在合適的表達(dá)宿主中產(chǎn)生所述磷酸化酶的一個(gè)或多個(gè)控制序列；所述序列源自于古菌熱變形菌綱，其特征在于PNPase來自硫磺礦硫化葉菌(SEQID NO. 7)、UPase 來自敏捷氣熱菌(SEQ ID NO. 8)。另外，本發(fā)明涉及一種在磷酸離子存在下在供糖核苷和受體堿基之間的轉(zhuǎn)糖基方法，特征在于所述方法包括使用敏捷氣熱菌的尿苷磷酸化酶(UPase)(NCBI 參考序列(National Center for Biotechnology Information ReferenceSequence) :NC_000854. 2)、硫磺礦硫化葉菌的嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase) (NCBIRefSeq:NC_002754. I)或它們的結(jié)合物。


圖I示出了由核苷磷酸化酶催化的兩個(gè)酶促反應(yīng)的實(shí)例。上方的第一個(gè)反應(yīng)是通過經(jīng)氧鎗樣中間體的SnI樣機(jī)制發(fā)生的磷酸解，以產(chǎn)生a-核糖-I-磷酸。第二個(gè)反應(yīng)通過其中磷酸被堿基取代的SN2機(jī)制發(fā)生[13]，從而提供￠-核苷。在該方案中，尿苷核苷磷酸化酶催化尿苷的C-N糖苷鍵的磷酸解切割，形成核糖-I-磷酸和尿嘧啶。在無機(jī)正磷酸鹽(Pi)作為第二底物存在時(shí)，嘌呤核苷磷酸化酶(腺苷核苷磷酸化酶)催化切割糖苷鍵，以生成嘌呤堿基和核糖(脫氧核糖)-1_磷酸。對(duì)于天然底物，該反應(yīng)是可逆的。圖2.使用核苷磷酸化酶進(jìn)行一鍋法合成的方案。圖3示出克隆之前起始表達(dá)載體pt:_no2/i.)-_rop(:)K的遺傳學(xué)圖譜。載體長度為6315核苷酸。17啟動(dòng)子堿基209-225 ;!7啟動(dòng)子引發(fā)位點(diǎn)堿基209-228 ;1迎操縱基因(IacO):堿基228-252 ;核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS):堿基282-288 ;His_補(bǔ)片(His-patch，HP)硫氧還蛋白ORF :堿基298-627 ；TrxFus正向引發(fā)位點(diǎn)堿基607-624 ；EK識(shí)別位點(diǎn)堿基643-657 ;TOPO*識(shí)別位點(diǎn)I :堿基670-674 ;懸突堿基675-678 ;TOPOWW別位點(diǎn)2 :堿基679-683 ;V5表位堿基700-741 ;多組氨酸(6XHis)區(qū)堿基751-768 ；T7反向引發(fā)位點(diǎn)堿基822-841 ;!7轉(zhuǎn)錄終止區(qū)堿基783-911 啟動(dòng)子堿基1407-1505 ;氨芐西林(bla)抗性基因(ORF):堿基 1506-2366 ；pBR322 起始位點(diǎn)堿基 2511-3184 ；R0P ORF :堿基3552-3743 (互補(bǔ)鏈)lacl ORF :堿基 5055-6146 (互補(bǔ)鏈)。圖4示出了 5個(gè)溫度與3個(gè)pH值組合的“Doehlert矩陣”，形成溫度和pH的7個(gè)組合。圖5.顯示pH和溫度對(duì)UPase活性的交互效應(yīng)的等高線圖。使用“Minitab”軟件，將數(shù)據(jù)以響應(yīng)面方法(Response Surface Methodology) (RSM)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。該酶表現(xiàn)出高嗜熱的；其活性增加迅速直至最高測(cè)定溫度(100°C )，活性在pH中性附近(6. 5-7. 5)，優(yōu)選7.0，呈現(xiàn)明顯的pH最適。圖6.顯示pH和溫度對(duì)PNPase活性的交互效應(yīng)的等高線圖。使用“Minitab”軟件，將數(shù)據(jù)以響應(yīng)面方法(Response Surface Methodology)(RSM)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。該酶表現(xiàn)出高嗜熱的；其活性增加迅速直至最高測(cè)定溫度(100°C)，所述活性在pH中性附近(6. 5-7. 0) 呈現(xiàn)明顯的pH最適。圖7示出了硫磺礦硫化葉菌的嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)的編碼區(qū)的DNA序列(SEQ ID NO. 7)，又稱 deoD 基因。GenBank 登記號(hào) AE006766。圖8示出了敏捷氣熱菌的嘧啶核苷磷酸化酶(UPase)的編碼區(qū)的DNA序列(SEQ IDNO. 8)，又稱 udp 基因。GenBank 登記號(hào) NC000854。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及包含如下序列的重組表達(dá)載體a)編碼嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase, E. C. 2. 4. 2. I)的序列；b)編碼尿苷磷酸化酶(UPase, E. C. 2. 4. 2. 3)的序列；c)或前述兩者；所述序列每一個(gè)可操作地連接于指導(dǎo)在合適的表達(dá)宿主中產(chǎn)生所述磷酸化酶的一個(gè)或多個(gè)控制序列；所述序列源自于古菌熱變形菌綱，其特征在于PNPase來自硫磺礦硫化葉菌(SEQ ID NO. 7)，UPase來自敏捷氣熱菌(SEQ ID NO. 8)。敏捷氣熱菌和硫磺礦硫化葉菌是能夠在高溫(超過90°C )下生長的超嗜熱菌古菌。古菌是屬于不同于真核生物和原核生物的第三類生物。它們被認(rèn)為源于原始生物，是既未進(jìn)化又不適應(yīng)常溫環(huán)境的特殊生物。在它們的細(xì)胞內(nèi)天然環(huán)境中的UPase和PNPase不能以產(chǎn)業(yè)水平所需的高產(chǎn)率合成核苷或核苷類似物。為了克服該嚴(yán)重局限，發(fā)明人使用重組DNA技術(shù)設(shè)計(jì)了包含udp和deoD基因以及合適元件的表達(dá)載體，以在選擇的宿主如細(xì)菌中過表達(dá)核苷磷酸化酶。所設(shè)計(jì)的表達(dá)載體還有利于不同磷酸化酶的溶解和純化。本發(fā)明的載體包含編碼不同核苷磷酸化酶的核苷酸序列和使得所述載體在所述宿主細(xì)胞中有選擇性且可自主復(fù)制的核苷酸序列。所述重組表達(dá)載體的構(gòu)建是使用常規(guī)重組DNA技術(shù)進(jìn)行的，即在無細(xì)胞系統(tǒng)中將DNA區(qū)段連接起來的操作。術(shù)語“載體”是指另一合適大小的DNA片段可以整合(克隆)到其中而不失去載體的自我復(fù)制能力的源自病毒、質(zhì)?；蚵劦壬锏募?xì)胞的DNA分子。實(shí)例有質(zhì)粒、粘粒和酵母人工染色體。載體通常是包含多種來源的DNA序列的重組體分子。術(shù)語“表達(dá)載體”是指進(jìn)一步包含所需控制或調(diào)節(jié)序列以使得可轉(zhuǎn)錄和翻譯所克隆的一個(gè)或多個(gè)基因的載體。環(huán)狀或線性DNA載體可用于本發(fā)明。
為了使本發(fā)明的載體在宿主細(xì)胞中有選擇性且可自主復(fù)制，所選擇的載體必需和所選擇的宿主細(xì)胞相容。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使得所述載體在大腸桿菌中有選擇性且可自主復(fù)制的核苷酸序列是使得所選擇的大腸桿菌菌株的T7 RNA聚合酶結(jié)合于啟動(dòng)子的T7啟動(dòng)子編碼基因。術(shù)語“選擇性的”是指載體在后代細(xì)菌中保持穩(wěn)定。所述的選擇是根據(jù)在所述載體中引入合適的選擇性標(biāo)記物基因通過嚴(yán)格的介質(zhì)條件實(shí)現(xiàn)的，其中所述基因的表達(dá)使得可以鑒定出已經(jīng)以所述載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。所述選擇性標(biāo)記物基因通常是抗生素抗性基因。用于本發(fā)明的優(yōu)選的選擇性標(biāo)記物基因有卡那霉素、四環(huán)素、羧芐西林和更優(yōu)選的氨節(jié)西林。本發(fā)明還涉及包含上述任一種重組表達(dá)載體或在同一宿主細(xì)胞中含有兩種重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指以包含PNPase或UPase核苷酸序列的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的 細(xì)胞。所述重組DNA載體的另一方面使得所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生核苷磷酸化酶，并且當(dāng)培養(yǎng)基條件合適時(shí)，所述核苷磷酸化酶催化核苷的獲得。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，將分別來自硫磺礦硫化葉菌和敏捷氣熱菌的PNPase和UPase基因引入所述DNA表達(dá)載體中。圖7和圖8列出了本發(fā)明相關(guān)的核酸和氨基酸序列，分別是硫磺礦硫化葉菌deoD的核酸序列(SEQID NO. 7)和敏捷氣熱菌udp的核酸序列(SEQ ID NO. 8)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)適當(dāng)?shù)剡x擇由初始載體和宿主細(xì)胞株構(gòu)成的表達(dá)體系來使核苷的產(chǎn)生最大化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述大腸桿菌屬于BL21細(xì)菌菌株。用于大腸桿菌BL21的合適表達(dá)載體有例如pET載體、trcHis載體和pUB載體(它們都獲自Invitrogen)；以及PGEX載體和GST載體(獲自Amersham)。大腸桿菌DH5 a細(xì)菌菌株與pUC載體的結(jié)合以及大腸桿菌F’與PSL載體、PEZZ載體或M13載體的結(jié)合(它們都獲自Amersham)也可用于本發(fā)明中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞被處理或者為裂解物的形式。本發(fā)明還涉及一種在磷酸離子存在下在供糖核苷和受體堿基之間的轉(zhuǎn)糖基方法，其特征在于所述方法包括使用敏捷氣熱菌的尿苷磷酸化酶(UPase)(NC_000854. 2)、硫磺礦硫化葉菌的嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase) (NC_002754. I)或它們的結(jié)合物。術(shù)語“供糖核苷”是指由經(jīng)P -糖苷鍵結(jié)合于核糖或脫氧核糖的核堿基(通常簡(jiǎn)稱為堿基)組成的糖胺。“供糖核苷”的實(shí)例包括但不限于胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、胸苷和肌苷，以及那些含D-核糖或2’ -脫氧核糖的天然核苷或修飾核苷；包含2’、3’和/或5’位修飾的核糖基團(tuán)的核苷；和其中糖是P-D-阿拉伯糖、a-L-木糖、3’ _脫氧核糖、3’，5’ -雙脫氧核糖、2’，3’ -雙脫氧核糖、5’ -脫氧核糖、2’，5’ -雙脫氧核糖、2’ -氨基-2’ -脫氧核糖、3’ -氨基-3’ -脫氧核糖或2’ -氟-2’ -脫氧核糖的核苷。術(shù)語“受體堿基”是指核堿基、核苷酸堿基、含氮堿基或簡(jiǎn)稱為堿基。在自然界，堿基是DNA或RNA的一部分。主要的核堿基有胞嘧啶(DNA和RNA)、鳥嘌呤(DNA和RNA)、腺嘌呤(DNA和RNA)、胸腺嘧啶(DNA)和尿嘧啶(RNA)，分別簡(jiǎn)寫為C、G、A、T和U。在本發(fā)明中，術(shù)語“受體堿基”意欲還包括修飾核堿基和核堿基類似物。在DNA中，最常見的修飾堿基是5-甲基胞苷(m5C)。在RNA中，有許多修飾堿基，包括假尿苷(屯)、二氫尿苷(D)、肌苷(I)、核糖胸苷(rT)和7-甲基鳥苷(m7G)。次黃嘌呤和黃嘌呤是通過存在的誘變劑形成的許多堿基中的兩種堿基。受體堿基的其他實(shí)例包括天然或取代嘧啶和嘌呤堿基；在1、2和6位中有一個(gè)或多個(gè)被取代的嘌呤堿基；在3和5位中有一個(gè)或多個(gè)被取代的嘧啶堿基；以及嘌呤、2-氮雜嘌呤、8-氮雜嘌呤、I-脫氮嘌呤(咪唑并吡啶)、3-脫氮嘌呤、7-脫氮嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、5-氟尿喃卩定、5- 二氟甲基尿喃唳、反式玉米素、2-氯-6-甲氨基嘌呤、6- 二甲氨基嘌呤、6-巰基嘌呤。該轉(zhuǎn)糖基方法可用于制備核苷、核苷類似物以及特別是活性藥物成分(API);包括或包含核苷部分或其類似物或者由核苷部分或其類似物組成。將API理解為意欲用于制造藥物(醫(yī)藥)產(chǎn)品的任何物質(zhì)或物質(zhì)混合物，以及在其用于產(chǎn)生藥物時(shí)其成為藥物產(chǎn)品的活性成分。這類物質(zhì)意欲提供藥理學(xué)活性或者在診斷、治愈、減輕、治療或預(yù)防疾病中的其他作用，或者影響身體的結(jié)構(gòu)和功能(Eudralex, Part II of volume 4 EU Guidelines toGood Manufacturing Practice)。尿苷磷酸化酶(UPase, E. C. 2. 4. 2. 3)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP ；E. C. 2. 4. 2. I)的 結(jié)合物可將糖部分從供體核苷高效轉(zhuǎn)移至受體堿基。當(dāng)脫離其他嘧啶核苷，且以嘧啶堿基作為起始材料制備嘧啶核苷時(shí)，僅使用UPase就已足夠，但優(yōu)選使用PNPase和UPase兩種酶，因?yàn)镻NPase也可以促成磷酸解步驟。相反地，當(dāng)脫離其他嘌呤核苷，且以嘌呤堿基作為起始材料制備嘌呤核苷時(shí)，也優(yōu)選使用PNPase和UPase 二者。在另一方面，與單獨(dú)使用每種類型的酶相比，當(dāng)反應(yīng)是從嘧啶生成嘌呤核苷例如從尿苷生成2，6 二氨基嘌呤核糖核苷時(shí)，使用PNPase和UPase兩種酶成功得多。轉(zhuǎn)糖基方法優(yōu)選使用UPase和PNPase的結(jié)合物?？梢詫⒋旨?xì)胞裂解物或澄清的粗酶溶液以不同比例混合，以得到優(yōu)化的生物催化劑用于具體的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)糖基方法中，敏捷氣熱菌的UPase和硫磺礦硫化葉菌的PNPase由上文和下文描述的任一實(shí)施方案的宿主細(xì)胞提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)糖基方法中，UPase、PNPase或其結(jié)合物以裂解物的形式使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)糖基方法包括步驟(i)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；(ii)過表達(dá)UPaSe、PNPaSe或其二者；(iii )任選地制備細(xì)胞裂解物；(iv)加入供糖核苷、受體堿基和磷酸離子；以及(V)從所述反應(yīng)混合物回收核苷。在具體的實(shí)施方案中，可以將包含所述載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)于含有胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉和選自卡那霉素、四環(huán)素、羧芐西林和氨芐西林的抗生素的培養(yǎng)基中——優(yōu)選在37°C下培養(yǎng)——至其在波長約600nm下的光密度值為0. 5-0. 8。然后，可以向所述培養(yǎng)基加入異丙基-P -D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)至終濃度100mg/l，并可以在37°C下誘導(dǎo)6-12小時(shí)?？梢酝ㄟ^在4°C下離心收獲細(xì)胞，并可以將細(xì)胞片狀沉淀物通過三次凍融循環(huán)裂解。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)破壞重組宿主細(xì)胞。所產(chǎn)生的細(xì)胞裂解物可直接用作生物催化劑，或者通過離心除去細(xì)胞碎片以得到澄清的粗酶溶液。本文使用的術(shù)語“生物催化劑”是指能夠催化底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物(在本文的情況下是核苷生物轉(zhuǎn)化)的任何生物實(shí)體。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)糖基方法中，所述供糖核苷選自包含D-核糖和2’ -脫氧核糖的天然核苷或修飾核苷；包含2’、3’和/或5’位修飾的核糖基團(tuán)的核苷；以及其中糖是0 _D_阿拉伯糖、a -L-木糖、3’ -脫氧核糖、3’, 5’ -雙脫氧核糖、2’, 3’ -雙脫氧核糖、5’ -脫氧核糖、2’，5’ -雙脫氧核糖、2’ -氨基-2’ -脫氧核糖、3’ -氨基-3’ -脫氧核糖、2’ _氟-2’ -脫氧核糖的核苷。 在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)糖基方法中，所述受體堿基選自天然嘧啶和嘌呤堿基或者取代的嘧啶和嘌呤堿基；在1、2、6位被取代的嘌呤堿基或所述嘌呤環(huán)的其結(jié)合物；在3、5位被取代的嘧啶堿基或所述嘧啶環(huán)的其結(jié)合物；例如嘌呤、2-氮雜嘌呤、8-氮雜嘌呤、I-脫氮嘌呤(咪唑并吡啶)、3_脫氮嘌呤、7-脫氮嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、反式玉米素、2-氯-6-甲氨基嘌呤、6-二甲氨基嘌呤、6-巰基嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)糖基方法中，所產(chǎn)生的核苷類似物是本領(lǐng)域中所知的活性藥物成分(API)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)糖基方法中，所述方法在60°C和100°C之間進(jìn)行。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)糖基方法在水性介質(zhì)中進(jìn)行，或者在非質(zhì)子極性共溶劑體系中進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非質(zhì)子極性共溶劑體系選自二甲基亞砜、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、二甲基甲酰胺或它們的任意結(jié)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)糖基方法中，所述供糖核苷選自尿苷和2’ -脫氧尿苷，所述受體堿基是2，6- 二氨基嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用尿苷或2’ -脫氧尿苷作為糖部分供體的一鍋法酶促合成核苷的方法，因?yàn)楸景l(fā)明的重組UPase酶對(duì)于這些底物是最特異的。然而，該酶可以與糖部分的任何供體一起使用，因?yàn)樗粎^(qū)分尿苷、2’ -脫氧尿苷以及其他嘧啶核苷，很遺憾，這與許多低等生物例如嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophiIus)中的情況一樣[14]。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)糖基方法中，所述供糖核苷選自尿苷和2’ -脫氧尿苷，所述受體堿基是5-氟尿嘧啶。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)糖基方法中，所述供糖核苷選自尿苷和2’ -脫氧尿苷，所述受體堿基是5-三氟甲基尿嘧啶。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)糖基方法中，所述供糖核苷選自尿苷和2’ -脫氧尿苷，所述受體堿基是反式玉米素。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)糖基方法中，所述供糖核苷選自尿苷和2’ -脫氧尿苷，所述受體堿基是2-氯-6-甲氨基嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)糖基方法中，所述供糖核苷選自尿苷和2’ -脫氧尿苷，所述受體堿基是6- 二甲氨基嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)糖基方法中，所述供糖核苷選自尿苷和2’ -脫氧尿苷，所述受體堿基是6-巰基嘌呤。術(shù)語“熱穩(wěn)定的核苷磷酸化酶”是指對(duì)熱穩(wěn)定、耐熱，并且其在發(fā)生轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)所需的時(shí)間內(nèi)處于升高的溫度時(shí)能夠保持足夠的核苷磷酸化酶活性從而使得能發(fā)生其他反應(yīng)，而且不會(huì)發(fā)生不可逆的變性(失活)。如下給出的實(shí)施例的目的是為了對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說明，其不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)范圍的限制。實(shí)施例如上文所述，使用從產(chǎn)UPase或產(chǎn)PNPase的細(xì)胞中得到的UPase和PNPase酶進(jìn)行本發(fā)明的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)。這類細(xì)胞優(yōu)選是能夠表達(dá)大量UPase或PNPase的遺傳修飾的大腸桿菌細(xì)胞。獲得這類細(xì)胞、酶和它們的特征的方法，以及生產(chǎn)一些核苷類似物的方法在隨附的如下所述的實(shí)施例中給出。實(shí)施例I 構(gòu)建大腸桿菌deoD硫磺礦硫化葉菌的嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)序列見于GenBank,登記號(hào)為AE006766。將該基因使用PCR從硫磺礦硫化葉菌P2擴(kuò)增，使用2單位的Platinum Pfx酶(Invitrogen)UmM MgSOjPlX酶擴(kuò)增緩沖液、200uM dNTP和0. 3 y M每種引物，引物寡核苷酸為 5，-caccgtgccatttttagaaaatggttcc-3’(硫磺礦硫化葉菌 deoD 正向；SEQ IDNO. I)和 5’-aatcagttttaagaatcttaaggtaat_3’(硫橫礦硫化葉菌 deoD 反向；SEQ ID NO. 2)。按如下進(jìn)行PCR反應(yīng)初始變性步驟在94°C下30分鐘，然后36個(gè)溫度循環(huán)——在94°C下I分鐘的變性步驟以及在60°C下I. 5分鐘和在68°C下I分鐘的退火/延伸步驟。在所述36個(gè)循環(huán)后，使所述樣品處于68°C下10分鐘，最后處于4°C。通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，并從所述凝膠純化DNA條帶(S.N.A.P. UV-Free Gel PurificationKit, Invitrogen)。將所擴(kuò)增的片段克隆至攜帶氨節(jié)西林抗性基因的pUC18載體的多位點(diǎn)接頭區(qū)[17]。將克隆的區(qū)域完全測(cè)序，發(fā)現(xiàn)它與數(shù)據(jù)庫序列完全相同。實(shí)施例2構(gòu)建大腸桿菌udp敏捷氣熱菌的嘧啶核苷磷酸化酶(UPase )序列見于GenBank，登記號(hào)為NC_000854. 2。將該基因通過PCR從敏捷氣熱菌Kl擴(kuò)增，使用2單位的Platinum Pfx酶(Invitrogen)、ImM MgSOjPlX酶擴(kuò)增緩沖液、200 y M dNTP和0. 3 y M每種引物，引物寡核苷酸為 5’-caccgtggcccgctacgttctcctc-3’(敏捷氣熱菌 udp 正向；SEQ ID NO. 3)和 5，-gaattcctatgtgcgtctgcacgccagg-3’(敏捷氣熱菌反向；SEQ ID NO. 4)[16] 按如下進(jìn)行 PCR反應(yīng)初始變性步驟在94°C下30分鐘，然后36個(gè)溫度循環(huán)——940C I分鐘的變性步驟以及60°C I. 5分鐘和68°C I分鐘的退火/延伸步驟。在所述36個(gè)循環(huán)后，使所述樣品處于68°C下10分鐘，最后處于4°C。通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，并從所述凝膠純化DNA條帶(S. N. A. P. UV-Free Gel Purification Kit, Invitrogen)。將所擴(kuò)增的片段克隆至攜帶氨芐西林抗性基因的PUC18載體的多位點(diǎn)接頭區(qū)[17]。將克隆的區(qū)域完全測(cè)序，發(fā)現(xiàn)它與數(shù)據(jù)庫序列完全相同。實(shí)施例3克降至nF/n ()2/r)-TO丨載體和細(xì)朐轉(zhuǎn)化將包含敏捷氣熱菌udp基因序列和硫磺礦硫化葉菌deoD基因序列的DNA片段克隆至包含用于質(zhì)粒復(fù)制的pBR322ori、氨芐西林抗性基因、允許I7RNA聚合酶結(jié)合的17啟動(dòng)子、當(dāng)不存在異丙基硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)時(shí)抑制表達(dá)的乳糖(Iac)操縱基因、用于RNA翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、用于增加融合蛋白溶解性的His-補(bǔ)片-硫氧還蛋白以及用于檢測(cè)和純化融合蛋白的多組氨酸標(biāo)簽(6XHis)的pia'丨02/l_>-'r0丨載體(PET102Directional TOPO Expression Kit, Invitrogen)(圖 3)。將所述載體通過熱激弓I入大腸桿菌 BL21(pET102 Directional 'TOPO'"' Expression Kit, Invitrogen),該菌株為用于異源基因受控表達(dá)的商業(yè)菌株。它包含編碼I7RNA聚合酶的基因，該聚合酶使所述菌株能夠與含17啟動(dòng)子的pET載體的應(yīng)用相容用于在有IPTG存在時(shí)過表達(dá)重組蛋白。將所產(chǎn)生的重組載體通過以10個(gè)單位的酶HindIII進(jìn)行的DNA限制性酶切進(jìn)行分析。將陽性克隆使用TrxFus正向測(cè)序引物5 ’TTCCTCGACGCTAACCTG3’ (SEQ ID NO. 5)和 T7 反向測(cè)序引物 5 ’ TAGITATTGCTCAGGGGTGG3’ (SEQ ID NO. 6)進(jìn)行測(cè)序。實(shí)施例4發(fā)酵所述重組體菌株將本發(fā)明涉及的重組菌株在添加有氨芐西林的胰蛋白酶解酪蛋白大豆固體培養(yǎng)基中在pH=7下以分批模式分開培養(yǎng)。將一個(gè)培養(yǎng)物的菌落轉(zhuǎn)入添加有200mg/l氨芐西林的包含Lab-Iemco粉末10g/l、蛋白胨10g/l和NaCl 5g/l的營養(yǎng)肉湯n° 2 (Oxoid)中。將 其在37°C下劇烈搖晃(200rpm)孵育。將攜帶表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株培養(yǎng)至600nm下的光密度值為0. 6，然后加入IPTG(最多100mg/l)并繼續(xù)再培養(yǎng)8小時(shí)。當(dāng)發(fā)酵完成后，將所述培養(yǎng)基離心，將細(xì)胞沉淀物在30mM-pH 7磷酸鹽緩沖液中洗滌。將所得到的菌體在-20° C下保存直至使用。實(shí)施例5部分UPase和PNPase純化(細(xì)胞裂解物制備)為了部分純化所述蛋白，將通過離心或微孔過濾從表達(dá)酶UPase或PNPase的重組體菌株培養(yǎng)物分離的細(xì)胞糊狀物通過以下方式破壞加入160mg溶菌酶并在0°C下孵育I小時(shí)，然后是3個(gè)超快速凍融循環(huán)(_80°C /37°C)和加入1，000單位脫氧核糖核酸酶I降低粘度的最后步驟。實(shí)施例6UPase酶的酶活件測(cè)定將100微升離心細(xì)胞裂解物——其包含UPase表達(dá)細(xì)胞的懸浮物，且以1:100 (體積/體積)的比例用PH 7. 0的磷酸鉀緩沖液稀釋——加入到800微升在30°C預(yù)孵育的溶解于IOOmM的pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中的75mM尿苷溶液中。5分鐘后，通過加入Iml的2N HCl終止所述磷酸解反應(yīng)。將反應(yīng)混合物的一個(gè)等分部分使用尺寸為250X4. 6mm的Kromasil100-5C18 (Akzo Nobel)柱進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析。使用4%的甲醇-水溶液進(jìn)行洗脫。所述細(xì)胞裂解物的酶活性表示為每ml的單位數(shù)(微摩爾尿喃唳XmirT1 Xmr1),相對(duì)于相同條件下洗脫的標(biāo)準(zhǔn)尿嘧啶溶液進(jìn)行計(jì)算?；厥樟舜蠹s590個(gè)單位/ml的離心的細(xì)胞裂解物。實(shí)施例7PNPase酶的酶活件測(cè)定將100微升離心細(xì)胞裂解物——其含有PNPase表達(dá)細(xì)胞懸液并以1:100的比例(體積/體積)稀釋于PH 7. 0的磷酸鉀緩沖液中——加入到800微升在30°C預(yù)孵育的溶解于IOOmM的pH 7. 0的磷酸鹽緩沖液中的60mM肌苷溶液中。精確的10分鐘后，通過加入Iml的2N HCl停止所述磷酸解反應(yīng)。將所述反應(yīng)混合物中的一個(gè)等分部分使用尺寸為250X4. 6mm 的 Kromasil 100-5C18 (Akzo Nobel)柱進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析。使用4%的甲醇-水溶液進(jìn)行洗脫。所述細(xì)胞裂解物的酶活性表示為每ml的單位數(shù)(微摩爾次黃嘌呤XmirT1Xmr1),相對(duì)于相同條件下洗脫的標(biāo)準(zhǔn)次黃嘌呤溶液進(jìn)行計(jì)算?；厥樟舜蠹s310個(gè)單位/ml的離心的細(xì)胞裂解物。實(shí)施例8轉(zhuǎn)糖基催化活性的測(cè)定為了測(cè)定轉(zhuǎn)糖基催化活性，將包含UPase和PNPase的細(xì)胞裂解物的混合物通過如下方式制備混合所述裂解物以獲得約I: I的UPase: PNPase酶活性比，按實(shí)施例6和7中所述方法進(jìn)行測(cè)定。轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)在如下條件中以分析級(jí)(analytical scale)進(jìn)行將250 yl細(xì)胞裂解物(等于14個(gè)單位的每種UPase和PNPase酶活性)加入到IOml具有如下組分的溶液中4mM 1-3_0-呋喃核糖基尿嘧啶(尿苷核苷)、41111腺嘌呤堿基、301111^ 7的磷酸鉀緩沖液，恒溫控制在60°C。在60V反應(yīng)I. 5小時(shí)后，通過以1:5稀釋所述混合物并在冰上冷卻終止所述反應(yīng)。腺嘌呤堿基生物轉(zhuǎn)化成9- ^ -D-呋喃核糖基腺嘌呤(腺苷核苷)的百分?jǐn)?shù)通過如下方式確定使用尺寸為250X4. 6mm的Kromasil 100-5C18 (Akzo Nobel)柱 對(duì)所述反應(yīng)混合物的一個(gè)等分部分進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析，以4%的甲醇-水溶液進(jìn)行洗脫。轉(zhuǎn)糖基催化活性表示為每ml的單位數(shù)(每ml細(xì)胞裂解物混合物I. 5小時(shí)形成的Ara-A微摩爾數(shù))或者表示為每g濕的樹脂的單位數(shù)(每ml細(xì)胞裂解物I. 5小時(shí)形成的D-呋喃核糖基腺嘌呤的微摩爾數(shù))，相對(duì)于相同條件下通過HPLC洗脫的標(biāo)準(zhǔn)D-呋喃核糖基腺嘌呤溶液進(jìn)行計(jì)算。在這些條件下，形成了大約55%的腺苷核苷(每ml細(xì)胞裂解物大約9個(gè)單位)。實(shí)施例9溫度和pH對(duì)所述核苷磷酸化酶活性的影響pH和溫度對(duì)核苷磷酸化酶的性能的影響通過使用“實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法”進(jìn)行研究。將不同的溫度與不同PH值組合以探明產(chǎn)生最大酶活性的條件。實(shí)驗(yàn)區(qū)域被確定為80°C -IOO0C和pH 5. 5-8. 5o如圖4中所示，根據(jù)“Doehlert矩陣”，將5個(gè)溫度與3個(gè)pH值組合，形成7個(gè)溫度和pH的組合。將底物在選擇的反應(yīng)溶液和溫度下在無酶條件下孵育，然后加入酶并在選擇的條件下孵育。如上述方法處理所述樣品，用于測(cè)定PNPase或UPase酶的酶活性。將活性值表示為出現(xiàn)的相應(yīng)最大值(100%)的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果分別顯示于圖5和6中。實(shí)施例10熱穩(wěn)定件在80°C下測(cè)定所述酶的熱穩(wěn)定性。制備所述酶的等分試樣，100微升至200微升的UPase或/和PNPase表達(dá)細(xì)胞(細(xì)胞裂解物)懸液在pH7. 0-7. 2的磷酸鉀緩沖液中以1:100或1:1000的體積/體積比例稀釋。將所述生物催化劑在80°C下孵育不同時(shí)間。加熱后，立即將所述溶液保持在冰上，如實(shí)施例6和7中所述方法測(cè)量所述的核苷磷酸化酶活性。在80°C下10小時(shí)后未觀察到核苷磷酸化酶活性損失。溶劑對(duì)核苷磷酸化酶活性的影響有機(jī)共溶劑常用于反應(yīng)中，分離的酶必須能夠在相對(duì)高濃度的共溶劑的條件下有活性。在存在有機(jī)溶劑例如甲醇(質(zhì)子極性溶劑)和二甲基亞砜(非質(zhì)子極性溶劑)的條件下進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明的核苷磷酸化酶酶耐受有機(jī)溶劑，在包含5和10體積％的所述有機(jī)溶劑的緩沖液中表現(xiàn)出活性。
表I. PNPase酶對(duì)一些有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性
權(quán)利要求
1.一種重組表達(dá)載體，包含a)編碼嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase，E. C. 2. 4. 2. I)的序列，b)編碼尿苷磷酸化酶(UPase，E. C. 2. 4. 2.3)的序列，c)或者前述兩者；所述序列中的每一個(gè)可操作地連接于指導(dǎo)在合適的表達(dá)宿主中產(chǎn)生所述磷酸化酶的一個(gè)或多個(gè)控制序列；所述序列源自于古菌熱變形菌綱，其特征在于PNPase來自硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus) (SEQ ID NO. 7), UPase 來自敏捷氣熱菌(Aeropyrum pernix) (SEQ IDNO. 8)。
2.—種宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求I的重組表達(dá)載體。
3.權(quán)利要求2的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
4.權(quán)利要求2-3任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是裂解物的形式。
5.一種在存在磷酸離子時(shí)在供糖核苷和受體堿基之間的轉(zhuǎn)糖基方法，其特征在于所述方法包括使用敏捷氣熱菌的尿苷磷酸化酶(UPase)(NC_000854. 2)、硫磺礦硫化葉菌的嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase) (NC_002754. I)或它們的結(jié)合物。
6.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)糖基方法,其中所述敏捷氣熱菌的UPase和所述硫磺礦硫化葉菌的PNPase由權(quán)利要求2_4任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞提供。
7.權(quán)利要求5-6任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)糖基方法，其中所得到的產(chǎn)物是活性藥物成分(API)或其中間體。
8.權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)糖基方法，其中所述供糖核苷選自包含D-核糖或2’-脫氧核糖的天然的核苷或修飾的核苷；包含2’、3’和/或5’位修飾的核糖基團(tuán)的核苷；以及其中糖是β -D-阿拉伯糖、a -L-木糖、3’ -脫氧核糖、3’ , 5’ -雙脫氧核糖、2’ , 3’ -雙脫氧核糖、5’ -脫氧核糖、2’，5’ -雙脫氧核糖、2’ -氨基-2’ -脫氧核糖、3’ -氨基-3’ -脫氧核糖，或者2’ -氟-2’ -脫氧核糖的核苷。
9.權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)糖基方法，其中所述受體堿基選自天然的或取代的嘧啶和嘌呤堿基；在1、2和6位中有一個(gè)或多個(gè)被取代的嘌呤堿基；在3和5位中有一個(gè)或多個(gè)被取代的嘧啶堿基；以及嘌呤、2-氮雜嘌呤、8-氮雜嘌呤、I-脫氮嘌呤(咪唑并吡啶)、3_脫氮嘌呤、7-脫氮嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、反式玉米素、2-氯-6-甲氨基嘌呤、6- 二甲氨基嘌呤、6-巰基嘌呤。
10.權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)糖基方法，其中所述方法在60°C和100°C之間進(jìn)行。
11.權(quán)利要求5-10任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)糖基方法，其中所述方法在水性介質(zhì)或者在非質(zhì)子極性共溶劑體系中進(jìn)行。
12.權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)糖基方法，其中所述非質(zhì)子極性共溶劑體系選自二甲基亞砜、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃和二甲基甲酰胺。
13.權(quán)利要求5-12任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)糖基方法，其中所述供糖核苷選自尿苷和2’-脫氧尿苷，所述受體堿基選自2，6- 二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、反式玉米素、2-氯-6-甲氨基嘌呤、6- 二甲氨基嘌呤和6-巰基嘌呤。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組表達(dá)載體，包含a)編碼嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase,E.C.2.4.2.1)的序列，b)編碼尿苷磷酸化酶(UPase,E.C.2.4.2.3)的序列，c)或者前述兩者；所述序列中的每一個(gè)可操作地連接于指導(dǎo)在合適的表達(dá)宿主中產(chǎn)生所述磷酸化酶的一個(gè)或多個(gè)控制序列；所述序列源自于古菌熱變形菌綱，其特征在于PNPase來自硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)(SEQ ID NO.7)，UPase來自敏捷氣熱菌(Aeropyrum pernix)(SEQ ID NO.8)。另外，本發(fā)明涉及一種在存在磷酸離子下在供糖核苷和受體堿基之間的轉(zhuǎn)糖基方法，特征在于所述方法包括使用敏捷氣熱菌的尿苷磷酸化酶(UPase)(NC_000854.2)、硫磺礦硫化葉菌的嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)(NC_002754.1)或它們的結(jié)合物。
文檔編號(hào)C12N9/10GK102770532SQ201080064567
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者C·埃斯特韋斯康帕尼, C·洛佩茲戈麥茲, J·卡斯泰爾斯波利亞特, M·帕斯卡爾吉拉波特, R·蒙蒂利亞阿雷瓦洛, V·M·德隆賽勒托馬斯 申請(qǐng)人:普拉斯米亞生物技術(shù)有限公司