專利名稱：用于增加異戊二烯氣體產(chǎn)量的膜生物反應器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及產(chǎn)生異戊二烯的改良方法。
背景技術(shù)：
異戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是在大量應用中使用的重要有機化合物。例如，在合成多種化學組合物和聚合物時，異戊二烯被用作中間材料或原料。異戊二烯還是通過許多植物和動物(包括人類)天然合成的重要生物材料。 在工業(yè)應用中使用的異戊二烯通常作為石油或石腦油熱裂解的副產(chǎn)物而產(chǎn)生，或者從石油化學產(chǎn)品流中提取。這是相對昂貴的能源密集型過程。世界范圍內(nèi)對基于石油化工的產(chǎn)品的需求持續(xù)增加，與此同時預計長期內(nèi)對異戊二烯的消耗將上升到高得多的水平，無論如何它的可用性有限。人們擔心，未來從基于石油化工來源提供異戊二烯將不足以滿足計劃的需求，并且其價格將上升到前所未有的水平。因此，存在從環(huán)境友好的低成本、可再生資源中制備異戊二烯來源的需求。最近在由可再生來源產(chǎn)生異戊二烯方面取得了一些進展(參見例如國際專利申請公開No. WO 2009/076676A2)。這些產(chǎn)生異戊二烯的方法在速率、滴度和純度上可能足以滿足穩(wěn)固工業(yè)化生產(chǎn)過程的需求，然而需要改善方法以降低與源于生物來源的異戊二烯的生產(chǎn)相關(guān)的操作成本并增大異戊二烯的產(chǎn)量。所有專利、專利申請、出版物、文獻、核苷酸和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫登錄號、它們參考的序列以及本文中引用的文章均全文以引用方式并入本文中。

發(fā)明內(nèi)容
本文公開了用于由生物材料產(chǎn)生異戊二烯的改良方法，該方法包括與培養(yǎng)產(chǎn)異戊二烯細胞的生物反應器結(jié)合來操作膜生物反應器。在一個方面，本文提供產(chǎn)生異戊二烯的改良方法，所述方法包括(a)在適于產(chǎn)生異戊二烯的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)包含異源核酸的細胞，所述異源核酸編碼異戊二烯合酶多肽，其中所述細胞(i)產(chǎn)生滴度大于40g/L的異戊二烯；或者(ii)具有大于約500mg/Lssw/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率；(b)移出培養(yǎng)物的一部分；(c)過濾培養(yǎng)物的所述移出部分以得到滲透物和滲余物；(d)將所述滲余物返回至培養(yǎng)物；以及(e)產(chǎn)生異戊二烯；其中經(jīng)歷步驟(b)、(c)和⑷的培養(yǎng)細胞與沒有經(jīng)歷步驟(b)、(c)和⑷培養(yǎng)的相同細胞相比(i)產(chǎn)生更高滴度的異戊二烯；或者(ii)具有更高的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在另一方面，本文提供產(chǎn)生異戊二烯的改良方法，所述方法包括(a)在適于產(chǎn)生異戊二烯的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)包含異源核酸的細胞，所述異源核酸編碼異戊二烯合酶多肽，其中所述細胞(i)產(chǎn)生滴度大于40g/L的異戊二烯；或者(ii)具有大于約500mg/Lssw/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率；(b)移出培養(yǎng)物的一部分；(C)過濾培養(yǎng)物的所述移出部分以得到滲透物和滲余物；(d)將所述滲余物返回至培養(yǎng)物；(e)產(chǎn)生異戊二烯；以及(f)回收異戊二烯；其中經(jīng)歷步驟(b)、(C)和(d)的培養(yǎng)細胞與沒有經(jīng)歷步驟(b)、(C)和(d)培養(yǎng)的相同細胞(i)產(chǎn)生更高滴度的異戊二烯；或者(ii)具有更高的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，所述過濾是通過切向流過濾。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約40g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約50g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約60g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約70g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約80g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約90g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約100g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約110g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約120g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約130g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約140g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約150g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約160g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細 胞產(chǎn)生滴度大于約170g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約180g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約190g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約200g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約40g/L至約100g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約60g/L至約100g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約60g/L至約120g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約40g/L至約150g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約40g/L至約200g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約80g/L至約150g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約100g/L至約150g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約100g/L至約180g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約100g/L至約200g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約120g/L至約200g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞具有大于約SOOmg/Lgj^/h的異戍二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，所述細胞具有大于約I，OOOmgZLsta/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，所述細胞具有大于約l，500mg/Lssw/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，所述細胞具有大于約2，000mg/LM/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，所述細胞具有介于約500mg/LM/h至約2，000mg/LM/h之間的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，該方法還包括將所述滲透物回收進相同細胞培養(yǎng)物中或回收進另一細胞培養(yǎng)物中的步驟，其中在存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的細胞具有比不存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的相同細胞更高的異戊二烯平均單位產(chǎn)率。在一些方面，所述細胞具有的異戊二烯平均單位產(chǎn)率是在不存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的相同細胞的約兩倍。在一些方面，所述細胞具有的異戊二烯平均單位產(chǎn)率是在不存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的相同細胞的約三倍。在一些方面，連續(xù)移出培養(yǎng)物的部分。在一些方面，不連續(xù)地移出移培養(yǎng)物的部分。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是植物異戊二烯合酶多肽。在一些方面，所述細胞還包含編碼IDI多肽的異源核酸。在一些方面，所述細胞還包含編碼IDI多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述細胞還包含編碼DXP途徑多肽的異源核酸。在一些方面，所述細胞還包含編碼DXS多肽的異源核酸。在一些方面，所述細胞還包含編碼DXS多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述細胞還包含一條或多條編碼IDI多肽和DXS多肽或DXP途徑多肽核酸。在一些方面，一種核酸編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽以及DXS多肽或DXP途徑多肽。在一些方面，一種質(zhì)粒編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在一些方面，所述細胞還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸。在一些方面，所述MVA途徑多肽為甲羥戊酸激酶(MVK)多肽。在一些方面，所述MVK多肽是來自甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)的多肽。在一些方面，所述甲燒八疊球菌是馬氏甲燒八疊球菌(Methanosarcina mazei)。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬(Pueraria)的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戍二烯合酶多肽是來自山葛(Pueraria montana)的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自楊屬(Populus)的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自銀白楊(Populus alba)的天然存在的多肽。在一些方面，所述細胞還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸。在一些方面，所述MVA途徑多肽是甲羥 戊酸激酶(MVK)。在一些方面，所述MVK來自甲烷八疊球菌屬。在一些方面，所述MVK來自馬氏甲烷八疊球菌。在一些方面，所述細胞是細菌細胞。在一些方面，所述細胞是革蘭氏陽性細菌細胞。在一些方面，所述細胞是芽孢桿菌屬(Bacillus)細胞。在一些方面，所述細胞是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)細胞。在一些方面，所述細胞是革蘭氏陰性細菌細胞。在一些方面，所述細胞是埃希氏菌屬(Escherichia)或泛菌屬(Pantoea)細胞。在一些方面，所述細胞是大腸桿菌(Escherichia coli)或朽1檬泛菌(Pantoea citrea)細胞。在一些方面，所述細胞是真菌細胞。在一些方面，所述細胞是木霉屬(Trichoderma)細胞。在一些方面，所述細胞是里氏木霉(Trichoderma reesei)細胞。在一些方面，所述細胞是酵母細胞。在一些方面，所述細胞是耶氏酵母菌屬(Yarrowia)細胞。在一些方面，所述細胞是解脂耶氏酵母菌(Yarrowia Iipolytica)細胞。在一些方面,所述細胞包含(i)編碼來自釀酒酵母(S. cerevisiae)的MVA下游途徑的整合核酸，其包含葡萄糖異構(gòu)酶啟動子和編碼甲羥戊酸激酶(MVK)的核酸；編碼磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)的核酸；編碼二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)的核酸；以及編碼異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(IDI)的核酸；(ii)編碼銀白楊異戊二烯合酶的核酸；(iii)編碼馬氏甲燒球菌甲輕戍酸激酶的核酸；以及Qv)編碼來自糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的MVA上游途徑的核酸，其包含編碼乙酰乙?；o酶A合酶(硫解酶)多肽的核酸；編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽的核酸；以及編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽的核酸。在另一方面，本文提供產(chǎn)生異戊二烯的改良方法，所述方法包括(a)在適于產(chǎn)生異戊二烯的培養(yǎng)條件下在裝有生長培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)包含異源核酸的細胞，所述異源核酸編碼異戊二烯合酶多肽，其中所述細胞(i)產(chǎn)生滴度大于40g/L的異戊二烯，或者(ii)具有大于約500mg/L發(fā)酵液/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率；(b)將細胞培養(yǎng)物的一部分從發(fā)酵罐中移出；(c)將細胞培養(yǎng)物的移出部分轉(zhuǎn)移至過濾器；(d)過濾細胞培養(yǎng)物的移出部分以形成(i)包含廢生長培養(yǎng)基的滲透物；以及(ii)包含細胞和其他培養(yǎng)物固形物的滲余物；(e)將所述滲余物返回發(fā)酵罐；(f)收集滲透物；以及(g)產(chǎn)生異戊二烯；其中經(jīng)歷步驟(b)、(C)、(d)和(e)的培養(yǎng)細胞與沒有經(jīng)歷步驟(b)、(C)、(d)和(e)培養(yǎng)的相同細胞相比(i)產(chǎn)生更高滴度的異戊二烯，或者(ii)具有更高的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在另一方面，本文提供產(chǎn)生異戊二烯的改良方法，所述方法包括(a)在適于產(chǎn)生異戊二烯的培養(yǎng)條件下在裝有生長培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)包含異源核酸的細胞，所述異源核酸編碼異戊二烯合酶多肽，其中所述細胞(i)產(chǎn)生滴度大于40g/L的異戊二烯，或者(ii)具有大于約SOOmgZLsta/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率；(b)將細胞培養(yǎng)物的一部分從發(fā)酵罐中移出；(c)將細胞培養(yǎng)物的移出部分轉(zhuǎn)移至過濾器；(d)過濾細胞培養(yǎng)物的移出部分以形成(i)包含廢生長培養(yǎng)基的滲透物；以及(ii)包含細胞和其他培養(yǎng)物固形物的滲余物；(e)將所述滲余物返回發(fā)酵罐；(f)收集滲透物；(g)產(chǎn)生異戊二烯；以及(h)回收異戊二烯；其中經(jīng)歷步驟(b)、(c)、(d)和(e)的培養(yǎng)細胞與沒有經(jīng)歷步驟 (b)、(c)、(d)和
(e)培養(yǎng)的相同細胞相比(i)產(chǎn)生更高滴度的異戊二烯，或者(ii)具有更高的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，發(fā)酵罐和過濾器通過循環(huán)管路和循環(huán)泵連接。在一些方面，通過滲透物收集出口和滲透泵從過濾器收集滲透物，并將其儲存在滲透物收集罐中。在一些方面，滲透物收集罐還包括排氣孔以緩解罐內(nèi)的壓力。在一些方面，所述循環(huán)泵和所述滲透泵是蠕動泵。在一些方面，所述過濾器是微過濾器。在一些方面，所述過濾器是超濾器。在一些方面，所述微過濾器是切向流過濾器。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約O. 005 μ m至約IOOym之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約0.05 μ m至約IOym之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述超濾器是切向流過濾器。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于約100,000的標稱截留分子量(NMWC)。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于約250，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器是具有500，000的標稱截留分子量(NMWC)并包括中空纖維膜的GE Healthcare XampIer 超濾濾芯。在一些方面，本方法還包括以下步驟(i)用入口壓力計監(jiān)測過濾器的入口壓力(Ρλρ) ；( )用出口壓力計監(jiān)測過濾器的出口壓力(P出口);( )用滲透物壓力計監(jiān)測滲透物收集出口中的壓力(Pit透物)；以及(iv)確定在整個過濾器上的跨膜壓力(TMP)。在一些方面，本方法還包括在整個過濾器上維持正TMP的步驟。在一些方面，所述發(fā)酵罐還包括連接至異戊二烯儲罐的異戊二烯收集出口。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約40g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約50g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約60g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約70g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約80g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約90g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約100g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約110g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約120g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約130g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約140g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約150g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約160g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約170g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約180g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約190g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約200g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約40g/L至約100g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約60g/L至約100g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約60g/L至約120g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約40g/L至約150g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約40g/L至約200g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約80g/L至約150g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約100g/L至約150g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約100g/L至約180g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約100g/L至約200g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約120g/L至約200g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞具有大于約SOOmg/Lgj^/h的異戍二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，所述細胞具有大于約I，OOOmgZLsta/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，所述細胞具有大于約l，500mg/Lssw/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，所述細胞具有大于約2，000mg/LM/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，所述細胞具有介于約500mg/LM/h至約2，000mg/LM/h之間的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。
在一些方面，本方法還包括對收集的滲透物進行滅菌以及將其回收進相同的發(fā)酵罐內(nèi)或另一發(fā)酵罐內(nèi)的步驟，其中在存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的細胞具有比不存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的相同細胞更高的異戊二烯平均單位產(chǎn)率。在一些方面，所述細胞具有的異戊二烯平均單位產(chǎn)率是在不存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的相同細胞的約兩倍。在一些方面，所述細胞具有的異戊二烯平均單位產(chǎn)率是在不存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的相同細胞的約三倍。在一些方面，連續(xù)移出培養(yǎng)物的部分。在一些方面，不連續(xù)地移出移培養(yǎng)物的部分。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是植物異戊二烯合酶多肽。在一些方面，所述細胞還包含編碼IDI多肽的異源核酸。在一些方面，所述細胞還包含編碼IDI多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述細胞還包含編碼DXS多肽的異源核酸。在一些方面，所述細胞還包含編碼DXS多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述細胞還包含一條或多條編碼IDI多肽和DXS多肽的核酸。在一些方面，一種核酸編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在一些方面，一種質(zhì)粒編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在一些方面，所述細胞還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸。在一些方面，所述MVA途徑多肽為甲羥戊酸激酶(MVK)多肽。在一些方面，所述MVK多肽來自甲烷八疊球菌屬。在一些方面，所述MVK來自馬氏甲烷八疊球菌。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬(Pueraria)的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自山葛(Pueraria montana)的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戍二烯合酶多肽是來自楊屬(Populus)的天然存在的多肽。在一些方面,所述異戍二烯合酶多肽是來自銀白楊(Populusalba)的天然存在的多肽。在一些方面，所述細胞還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸。在一些方面，所述MVA途徑多肽為甲羥戊酸激酶(MVK)多肽。在一些方面，所述MVK多肽來自甲烷八疊球菌屬。在一些方面，所述MVK多肽來自馬氏甲烷八疊球菌。在一些方面，所述細胞是細菌細胞。在一些方面，所述細胞是革蘭氏陽性細菌細胞。在一些方面，所述細胞是芽孢桿菌屬(Bacillus)細胞。在一些方面，所述細胞是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)細胞。在一些方面，所述細胞是革蘭氏陰性細菌細胞。在一些方面，所述細胞是埃希氏菌屬(Escherichia)或泛菌屬(Pantoea)細胞。在一些方面，所述細胞是大腸桿菌(Escherichiacoli)或朽1檬泛菌(Pantoea citrea)細胞。在一些方面，所述細胞是真菌細胞。在一些方面，所述細胞是木霉屬(Trichoderma)細胞。在一些方面，所述細胞是里氏木霉(Trichoderma reesei)細胞。在一些方面，所述細胞是酵母細胞。在一些方面，所述細胞是耶氏酵母菌屬(Yarrowia)細胞。在一些方面，所述細胞是解脂耶氏酵母菌(Yarrowialipolytica)細胞。在一些方面，所述細胞包 含(i)編碼來自釀酒酵母(S. cerevisiae)的MVA下游途徑的整合核酸，其包含葡萄糖異構(gòu)酶啟動子和編碼甲羥戊酸激酶(MVK)的核酸；編碼磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)的核酸；編碼二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)的核酸；以及編碼異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(IDI)的核酸；(ii)編碼銀白楊異戊二烯合酶的核酸；(iii)編碼馬氏甲烷球菌甲羥戊酸激酶的核酸；以及(iv)編碼來自糞腸球菌的MVA上游途徑的核酸，其包含編碼乙酰乙?；o酶A合酶(硫解酶)多肽的核酸；編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽的核酸；以及編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽的核酸。


圖IA示出了異戍二烯的MVA和DXP代謝途徑(基于F. Bouvier等人，Progressin Lipid Res.(《脂類研究進展》)，44 :357-429, 2005)。下面說明包括途徑中每種多肽的別名以及公開測量所指示多肽的活性的測定法的參考文獻(藉此將這些參考文獻中的每一篇各自全文以引用方式并入本文中)。甲羥戊酸途徑=AACT ;乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶，MvaE, EC2.3.1.9。測定法 J. Bacteriol.(《細菌學雜志》)，184 :2116_2122，2002 ;HMGS ;羥甲基戊二酰輔酶A合酶，MvaS, EC 2. 3. 3. 10。測定法J. Bacteriol.(《細菌學雜志》)，184 :4065-4070,2002 ；HMGR ;3_ 羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A 還原酶，MvaE，EC I. I. I. 34。測定法J. Bacteriol.(《細菌學雜志》)，184 :2116_2122，2002 ;MVK;甲羥戊酸激酶，ERG12，EC 2. 7. I. 36。測定法Curr Genet (《當代遺傳學》)，19 :9_14，1991 ；PMK ;磷酸甲羥戊酸激酶，ERG8，EC 2. 7. 4. 2，測定法Mol. Cell. Biol.(《分子細胞生物學》)，11 :620_631，1991 ;DPMDC ;二磷酸甲羥戊酸脫羧酶，MVD1，EC 4. I. I. 33。測定法-Biochemistry (《生物化學》)，33 =13355-13362,1994 ；IDI ;異戊烯二磷酸 δ 異構(gòu)酶，IDI1, EC5. 3. 3. 2。測定法J. Biol.
(《分子細胞生物學》)，Chem. 264 :19169-19175，1989 ；DXP途徑=DXS ;1_脫氧木酮糖_5_磷酸合酶，dxs，EC2. 2. I. 7。測定法:PNAS (《美國國家科學院院刊》)，94 :12857-62，1997 ；DXR ；I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶,dxr, EC 2. 2. I. 7。測定法Eur. J. Biochem.(《歐洲生物化學雜志》)，269 :4446-4457，2002 ；MCT ;4_ 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇合酶，IspD, EC 2. 7. 7. 60。測定法=PNAS (《美國國家科學院院刊》)，97 :6451-6456,2000 ；CMK ；4- 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇激酶，IspE, EC 2. 7. I. 148。測定法PNAS(《美國國家科學院院刊》)，97 =1062-1067,2000 ；MCS ；2C-甲基-D-赤蘚醇2，4-環(huán)二磷酸合酶，IspF,EC 4. 6. I. 12。測定法=PNAS (《美國國家科學院院刊》)，96 :11758-11763,1999 ；HDS ;1-羥基-2-甲基-2-(E)_ 丁烯基-4- 二磷酸合酶，IspG, EC I. 17. 4. 3。測定法J. Org. Chem.
(《有機化學雜志》)，70 =9168-9174,2005 ；HDR ;1_羥基-2-甲基_2_ (E) - 丁烯基-4-二磷酸還原酶，IspH，EC 1.17.1.2。測定法JACS(《美國化學會志》)，126 :12847-12855，2004 ;圖IB示出了經(jīng)典和改進的MVA途徑。1，乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(AACT) ;2，HMG輔酶A合酶(HMGS) ;3，HMG輔酶A還原酶(HMGR) ;4，甲羥戊酸激酶(MVK) ;5，磷酸甲羥戊酸激酶(PMK) ;6，二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD或DPMDC) ;7，異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(IDI) ;8，磷酸甲羥戊酸脫羧酶(PMDC) ;9，異戊烯基磷酸激酶(IPK)。經(jīng)典的MVA途徑經(jīng)由反應5和6來從反應I進行到反應7，而改進的MVA途徑經(jīng)歷反應8和9。在結(jié)構(gòu)式中的P和PP分別是憐酸根和焦憐酸根。該圖取自 Koga 和 Morii,Microbiology and Mol. Biology Reviews《微生物學與分子生物學評論》)，71 :97-120, 2007，將所述文獻全文以引用的方式并入本文，尤其是關(guān)于該改進MVA途徑的核酸和多肽。改進的MVA途徑存在于例如一些古細菌有機體(例如馬氏甲烷八疊球菌)中。圖2是質(zhì)粒pET24銀白楊HGS的圖譜。圖3A-B是質(zhì)粒pET24銀白楊HGS的核苷酸序列(SEQ ID NO :1)。圖4是示出了用于核酸內(nèi)切酶消化以構(gòu)建質(zhì)粒EWL230以及BspHI與NcoI位點之間的相容粘性末端的限制位點的示意圖。
圖5是質(zhì)粒EWL230的圖譜。圖6A-B是質(zhì)粒EWL230的核苷酸序列(SEQ ID NO :2)。圖7是示出了用于核酸內(nèi)切酶消化以構(gòu)建質(zhì)粒EWL244以及NsiI與PstI位點之間的相容粘性末端的限制性位點的示意圖。圖8是質(zhì)粒EWL244的圖譜。圖9A-B是質(zhì)粒EWL244的核苷酸序列(SEQ ID NO :3)。圖IOA是馬氏產(chǎn)甲烷球菌古細菌的下游途徑操縱子的圖譜。圖IOB-C是馬氏產(chǎn)甲烷球菌古細菌的下游途徑操縱子的核苷酸序列(SEQ ID NO 4)。圖IlA是pET200D中的來自馬氏產(chǎn)甲烷球菌古細菌下游的MCM376-MVK的圖譜。圖IlB-C是pET200D中的來自馬氏產(chǎn)甲烷球菌古細菌下游的MCM376-MVK的核苷酸序列(SEQ ID NO 5) ο圖12 是質(zhì)粒 pBBRCMPGIl. 5-pgl 的圖譜。圖13A-B 是質(zhì)粒 pBBRCMPGIl. 5-pgl 的核苷酸序列(SEQ ID NO 6)。圖14A-F是由大腸桿菌菌株(RHM111608-2)產(chǎn)生異戊二烯的曲線圖，該大腸桿菌菌株表達馬氏產(chǎn)甲烷球菌甲羥戊酸激酶、銀白楊異戊二烯合酶以及pgl，并且在15L規(guī)模的分批補料培養(yǎng)物中生長。圖14A示出了在用葡萄糖加料的15L生物反應器內(nèi)的光密度的時間進程。圖14B示出了在用葡萄糖加料的15L生物反應器內(nèi)的異戊二烯滴度的時間進程。滴度定義為每升發(fā)酵液所產(chǎn)生的異戊二烯的量。計算異戊二烯的方法在59小時內(nèi)累積產(chǎn)生的異戊二烯(g)/在59小時時刻發(fā)酵罐體積(L) [ = ]g/L發(fā)酵液。圖14C也示出了在使用葡萄糖加料的15L生物反應器內(nèi)的異戊二烯滴度的時間進程。計算異戊二烯的方法(異戍二烯的瞬時產(chǎn)率(g/L/h))dt(從t = O至59小時)[=]g/L發(fā)酵液。圖14D示出了由用葡萄糖加料的15L生物反應器產(chǎn)生的總異戊二烯的時間進程。圖14E示出了在用葡萄糖加料的15L生物反應器內(nèi)的體積產(chǎn)率。圖14F示出了在用葡萄糖加料的15L生物反應器內(nèi)的二氧化碳釋放率(CER)或代謝活性譜。圖15A-B是示出了對15L生物反應器中的發(fā)酵廢氣進行的分析的曲線圖。樣品A是在64. 8小時取樣的菌株RMl 11608-2。樣品B是在34. 5小時取樣的菌株EWL256，該菌株為大腸桿菌 BL21 (DE3), pCL upper, cmR-gil. 2-yKKDyI, pTrcAlba-mMVK。兩個樣品檢測到高于基線(0·95Χ10_8托)的氫。圖16Α示出了示例性的異戊二烯回收裝置。圖16Β示出了示例性的異戊二烯解吸/冷凝設(shè)置。圖17示出了異戊二烯產(chǎn)物的GC/FID色譜圖。測得材料的純度為99. 7%。
圖18A-C示出了在用氧化鋁或二氧化硅處理之前(A)以及在用氧化鋁處理后(B)或二氧化硅處理后(C)異戊二烯樣品的GC/FID色譜圖。異戊二烯峰未顯示在這些色譜圖中。圖19Α示出了質(zhì)粒pDW34的圖譜，該質(zhì)粒pDW34在PTrc啟動子和馬氏產(chǎn)甲烷球菌MVK的控制下編碼銀白楊異戊二烯合酶(MEA變體)的截短形式。圖19B-D示出了質(zhì)粒PDW34的完整核苷酸序列(SEQ IDNO 7)。圖20示出了大腸桿菌Κ12菌株MG1655在pgl基因座周圍的染色體結(jié)構(gòu)。在括號中示出了與大腸桿菌K12MG655相比在大腸桿菌BL21 (DE3)中缺失并在菌株CMP215和CMP258中恢復的區(qū)域。用圓圈標記ybgS基因的預測開放閱讀框。正向箭頭(一)指示galMF引物(SEQ ID NO 8)的退火位點。反向箭頭(一)指示galMR引物(SEQ ID NO 9)的退火位點。圖21示出了在15L規(guī)模發(fā)酵中使用的MBR系統(tǒng)的示意圖，該系統(tǒng)用于制備異戊二烯氣體以及收集含滲透物的廢培養(yǎng)基。發(fā)酵液循環(huán)管路將發(fā)酵罐發(fā)酵液遞送至切向流膜過濾器?；趯Ω呒毎芏鹊拇竽c桿菌發(fā)酵液的適用性來選擇膜，GE Healthcare Xamp I er 超濾濾芯，NMWC為500，000、纖維內(nèi)徑為1mm、長60cm、面積為850平方厘米的中空纖維膜。發(fā)酵液循環(huán)管路(包括膜在內(nèi))的滯留體積為約250ml。在使用之前對包括管路組件但排除循環(huán)泵的設(shè)備部分進行高壓滅菌。循環(huán)和滲透泵是蠕動管式泵。使用壓力計測量Ρλρ(膜的入口壓力)，以確保不超過膜的壓力容限(大約2巴)。在示意圖中定義的TMP是驅(qū)動滲透的力的粗略量度。需要正的TMP以收集滲透物。圖22示出了在15L規(guī)模實驗中MBR的操作參數(shù)。主要通過改變循環(huán)泵速率來控制P入口和TMP，例如，通過降低大約20%的循環(huán)泵速率來達到在50小時時刻降低約20%的ΡΛΡ的目的。在滲透期間TMP穩(wěn)定在約O. 2巴。由于在膜濾芯內(nèi)的流體動力學，即使當滲透速率為零時，TMP也從未為零。通過調(diào)節(jié)滲透泵速率來控制滲透速率。在該實例中收集了約8kg的滲透物。圖23示出了在15L規(guī)模發(fā)酵的反應器發(fā)酵液中MBR發(fā)酵和非MBR對照的光密度(OD)圖線。在MBR操作期間OD從195升高至305，而在相同時期非MBR對照的OD從195下降至175。通過發(fā)酵液樣品的550nm吸光度來測定0D。較高的OD表明細胞、細胞碎片和其他懸浮固體的濃度較高。發(fā)酵方法在實例4中進行了描述。圖24示出了在15L規(guī)模實驗中MBR發(fā)酵和非MBR對照的異戊二烯單位產(chǎn)率的圖線。與非MBR對照相比，MBR未改變細胞的單位產(chǎn)率。單位產(chǎn)率是以細胞質(zhì)量計的異戊二烯產(chǎn)率。MBR和非MBR對照實驗之間的相似性表明MBR操作未顯著改變細胞生理。發(fā)酵方法在實例4中進行了描述。使用實例4中的公式來計算單位產(chǎn)率。圖25示出了在15L規(guī)模實驗中MBR發(fā)酵和非MBR對照的異戊二烯氣體滴度的圖線。與非MBR對照相比，MBR增加約16%的滴度。更高的滴度意味著每反應器體積產(chǎn)生了更多的異戊二烯，這使得生產(chǎn)成本降低。發(fā)酵方法在實例4中進行了描述。圖26示出了在15L規(guī)模實驗中MBR發(fā)酵和非MBR對照的異戊二烯氣體總產(chǎn)量的圖線。與在相同發(fā)酵時間內(nèi)的非MBR對照相比，MBR使異戊二烯氣體總產(chǎn)量增加約17%。發(fā)酵方法在實例4中進行了描述。用于計算異戊二烯總產(chǎn)量的公式在實例4中有所描述。圖27示出了在15L規(guī)模實驗中MBR發(fā)酵和非MBR對照的異戊二烯體積產(chǎn)率的圖線。MBR操作期間的體積產(chǎn)率高于在相同時期中非MBR對照的體積產(chǎn)率。較高的體積產(chǎn)率意味著以體積計的異戊二烯產(chǎn)率較高，這使得生產(chǎn)成本降低。發(fā)酵方法在實例4中進行了描述。使用實例4中的公式來計算體積產(chǎn)率。圖28示出了在15L規(guī)模發(fā)酵罐實驗中生物反應器發(fā)酵液重量的圖線。要維持反應器重量，則在MBR實驗中提取膜滲透物，而在非MBR對照實驗中移出全部發(fā)酵液(排出物)。在該實例中，在MBR實驗中收集了約8kg的滲透物，在非MBR對照實驗中收集了約7kg的排出物。發(fā)酵方法在實例4中進行了描述。 圖29示出了通過補充廢培養(yǎng)基分批補料培養(yǎng)物中異戊二烯氣體的單位產(chǎn)率增加的圖線。通過用30重量％的廢培養(yǎng)基(澄清的發(fā)酵液上清液)來補充培養(yǎng)基使異戊二烯的單位產(chǎn)率增加三倍多，盡管有大約25%的較少增長。較高的單位產(chǎn)率意味著每單位時間內(nèi)每細胞質(zhì)量產(chǎn)生更多的異戊二烯。結(jié)果表明包含廢培養(yǎng)基的MBR滲透物能用于增加細胞的單位產(chǎn)率，從而降低生產(chǎn)成本。實驗方法在實例5中進行了描述。
具體實施例方式通過將發(fā)酵與回收本會丟棄的選擇發(fā)酵液組分相結(jié)合，膜生物反應器(MBR)能增加異戊二烯氣體的發(fā)酵產(chǎn)量。MBR包括結(jié)合膜過濾器(諸如交叉流過濾器或切向流過濾器)一起操作的、培養(yǎng)產(chǎn)異戊二烯細胞的液體發(fā)酵生物反應器。MBR過濾發(fā)酵液并將非滲透性組分(過濾器“滲余物”)返回至反應器，從而有效地增加細胞、細胞碎片和其他發(fā)酵液固形物的反應器濃度，同時維持細胞的單位產(chǎn)率。這顯著改善了異戊二烯的滴度、總產(chǎn)量和體積產(chǎn)率，從而使得投資和運行成本更低。濾液(“滲透物”)不返回反應器，從而使反應器體積有利地減小，這類似于收集發(fā)酵液排出物。然而，與發(fā)酵液排出物不同的是，收集的滲透物是澄清的液體，將該澄清液體儲存在普通容器中后可通過過濾輕松對其進行滅菌。因此，該滲透物可以很容易地被重復利用作為營養(yǎng)物質(zhì)和/或水再循環(huán)來源，從而進一步降低運行成本。可將包含可溶性“廢培養(yǎng)基”的滲透物添加至相同的或另一發(fā)酵過程中以增加異戊二烯產(chǎn)量。 MBR是在別處(參見例如國際專利公布No. WO 2009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公布 No. 2009/0203102)、W02010/003007、美國專利公布No. 2010/0048964,WO 2009/132220以及美國專利公布No. 2010/0003716)描述的由可再生資源產(chǎn)生異戊二烯的方法的潛在可擴展和有利的方式。除了提供比其他可行的方式顯著更高的異戊二烯滴度并增加體積產(chǎn)率外，MBR還產(chǎn)生澄清的滲透物，該滲透物可用作營養(yǎng)物質(zhì)和水源，從而降低原料的消耗并改善工藝的可持續(xù)性。相應地，在一個方面，本文提供產(chǎn)生異戊二烯的改良方法，該方法包括(a)在適于產(chǎn)生異戊二烯的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)包含異源核酸的細胞，所述異源核酸編碼異戊二烯合酶多肽，其中所述細胞(i)產(chǎn)生滴度大于40g/L的異戊二烯；或者(ii)具有大于約500mg/LM/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率；(b)移出培養(yǎng)物的一部分；(C)過濾培養(yǎng)物的所述移出部分以得到滲透物和滲余物；(d)將所述滲余物返回至培養(yǎng)物；(e)產(chǎn)生異戊二烯；以及任選(f)回收所述異戊二烯；其中經(jīng)歷步驟(b)、(C)和(d)的培養(yǎng)細胞與沒有經(jīng)歷步驟(b)、(C)和(d)培養(yǎng)的相同細胞相比(i)產(chǎn)生更高滴度的異戊二烯；或者(ii)具有更高的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在另一方面，本文提供的是產(chǎn)生異戊二烯的改良方法，該方法包括(a)在適于產(chǎn)生異戊二烯的培養(yǎng)條件下在裝有生長培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)包含異源核酸的細胞，所述異源核酸編碼異戊二烯合酶多肽，其中所述細胞(i)產(chǎn)生滴度大于40g/L的異戊二烯，或者
(ii)具有大于約SOOmgZLsta/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率；(b)將細胞培養(yǎng)物的一部分從發(fā)酵罐中移出；(c)將細胞培養(yǎng)物的移出部分轉(zhuǎn)移至過濾器；(d)過濾細胞培養(yǎng)物的移出部分以形成(i)包含廢生長培養(yǎng)基的滲透物；以及(ii)包含細胞和其他培養(yǎng)物固形物的滲余物；(e)將所述滲余物返回發(fā)酵罐；(f)收集滲透物；(g)產(chǎn)生異戊二烯；以及(h)回收異戊二烯；其中經(jīng)歷步驟(b)、(c)、(d)和(e)的培養(yǎng)細胞與沒有經(jīng)歷步驟(b)、(c)、(d)和
(e)培養(yǎng)的相同細胞相比(i)產(chǎn)生更高滴度的異戊二烯，或者(ii)具有更高的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。誦用摶術(shù)除非另外指明，否則對本發(fā)明的實施將采用分子生物學(包括重組技術(shù))、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)均為本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)。這些技術(shù)在以下文獻中有完整解釋“Molecular Cloning A Laboratory Manual”，secondedition (《分子克隆實驗手冊》第二版)(Sambrook等人，1989) ,OligonucleotideSynthesis (《寡核苷酸合成》)”(M. J. Gait 編輯，1984) ;“Animal Cell Culture (《動物細胞培養(yǎng)》)” (R· I. Freshney 編輯，1987) ;“Methods in Enzymology (《酶學方法》)” (AcademicPress, Inc.(美國學術(shù)出版社))；uCurrent Protocols in Molecular Biology(《分子生物學實驗室指南》)” (F. M-Ausubel等人編輯，1987，以及定期更新版本)；“PCR :The Polymerase Chain Reaction(《PCR :聚合酶鏈反應》)”，(Mullis 等人編輯，1994)。Singleton 等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.(《微生物學和分子生物學詞典》第二版)，J. ffiley&Sons(New York, N. Y. 1994)(約翰·威利父子公司，紐約州紐約市，1994 年)和 March, Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 4th ed.(《高等有機化學反應、機理和結(jié)構(gòu)》第4版)，Johnffiley&Sons (New York, N. Y. 1992)(約翰·威利父子公司，紐約州紐約市，1992年)向本領(lǐng)域技術(shù)人員提供對本申請中使用的許多術(shù)語的一般性指導。例如，如國際專利公布No. WO 2009/076676、美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公布 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公布 No. 2010/0048964、WO2009/132220以及美國專利公布No. 2010/0003716中所述，生物反應器中的遺傳工程細胞
培養(yǎng)物更有效地產(chǎn)生異戊二烯，所述異戊二烯的量更大、純度更高和/或具有獨特的雜質(zhì)
-i'TfeP曰。定義術(shù)語“異戍二烯”是指2_甲基-1，3_ 丁二烯(CAS號78_79_5)。異戍二烯可以是由3，3_ 二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)消除焦磷酸所得的直接和最終揮發(fā)性C5烴產(chǎn)物。在一些情況下，它可以不涉及IPP分子與DMAPP分子的連接或聚合。除非本文中另外指明，否則術(shù)語“異戊二烯”通常不旨在受其產(chǎn)生方法的限制。如本文所用，“生物產(chǎn)生的異戊二烯”或“生物異戊二烯”是通過任何生物手段產(chǎn)生的異戊二烯，例如通過遺傳工程細胞培養(yǎng)物、天然微生物、植物或動物產(chǎn)生的異戊二烯。生物異戊二烯組合物包含的烴類雜質(zhì)通常比由石油化學來源產(chǎn)生的異戊二烯少，并且通常需要最少的處理以成為聚合級。生物異戊二烯組合物還具有與由石油化學來源產(chǎn)生的異戊二烯組合物不同的雜質(zhì)譜。如本文所用，術(shù)語“滲透物”是指例如通過交叉流過濾來過濾含有生長培養(yǎng)基和細胞(即，含培養(yǎng)細胞)的發(fā)酵罐或生物反應器的內(nèi)容物而得到的濾液(即，廢生長培養(yǎng)基)。細胞可以為本文所述的任意一種示例性的產(chǎn)異戊二烯細胞或細胞類型，包括(例如)包含一條或多條有效連接至啟動子的異源核酸的那些，所述異源核酸編碼異戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽和/或MVA途徑多肽。
如本文所用，術(shù)語“滲余物”是指例如通過交叉流過濾來過濾含有生長培養(yǎng)基和細胞(即，含培養(yǎng)細胞)的發(fā)酵罐或生物反應器中的內(nèi)容物之后保留在過濾器上的固形物(即，細胞、碎片和其他固體培養(yǎng)物)。細胞可以為本文所述的任意一種示例性的產(chǎn)異戊二烯細胞或細胞類型，包括(例如)包含一條或多條有效連接至啟動子的異源核酸的那些，所述異源核酸編碼異戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽和/或MVA途徑多肽。如本文所用，術(shù)語“多肽”包括多肽、蛋白質(zhì)、肽、多肽的片段和融合多肽。如本文所用，“分離的多肽”不是多肽文庫(諸如2種、5種、10種、20種、50種或更多種不同多肽的文庫)的一部分，并且與和其一起存在于自然界中的至少一種組分分離。分離的多肽可例如通過編碼該多肽的重組核酸的表達來獲得。分離的多肽可以是非天然存在的多肽。所謂“異源多肽”，是指其氨基酸序列與在相同宿主細胞中天然表達的另一種多肽不同的多肽。具體地講，異源多肽不同于存在于自然界中的相同宿主細胞內(nèi)存在的野生型多肽。如本文所使用，“核酸”是指以單股或雙股形式共價連接在一起的兩個或更多個脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。所謂“重組核酸”，是指這樣的所關(guān)注核酸，其缺少在該所關(guān)注核酸旁側(cè)的、所關(guān)注核酸所源自的有機體的天然存在的基因組中的一種或多種核酸(例如基因)。因此，該術(shù)語包括(例如)摻入載體中、摻入自主復制型質(zhì)?；虿《局谢驌饺朐松锘蛘婧松锏幕蚪MDNA中，或者獨立于其他序列作為單獨的分子(例如，cDNA、基因組DNA片段或通過PCR或限制性核酸內(nèi)切酶消化制備的cDNA片段)存在的重組DNA。在一些情況下，重組核酸是編碼非天然存在的多肽的核酸。所謂“異源核酸”，是指其核酸序列與天然存在于相同宿主細胞中的另一種核酸不同的核酸。具體地講，異源核酸不同于存在于自然界中的相同宿主細胞內(nèi)存在的野生型核酸。如本文所用，“載體”意指能夠在宿主細胞內(nèi)遞送并合意地表達一種或多種所關(guān)注核酸的構(gòu)建體。載體的例子包括但不限于質(zhì)粒、病毒載體、DNA或RNA表達載體、粘粒和噬菌體載體。
如本文所用，“表達控制序列”意指弓I導所關(guān)注核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列。表達控制序列可以為啟動子(例如組成型或誘導型啟動子)或增強子?！罢T導型啟動子”是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下具有活性的啟動子。表達控制序列有效連接至待轉(zhuǎn)錄的核酸片段。術(shù)語“選擇標記”或“可選標記”是指能夠在宿主細胞中表達以使得易于選擇那些含有所引入的核酸或載體的宿主細胞的核酸?？蛇x標記的例子包括但不限于抗生素抗性核酸(例如，卡那霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素、慶大霉素、潮霉素、腐草霉素、博萊霉素、新霉素或氯霉素)和/或賦予宿主細胞代謝優(yōu)勢(諸如營養(yǎng)優(yōu)勢)的核酸。示例性的營養(yǎng)選擇標記包括本領(lǐng)域中稱為amdS、argB和pyr4的那些。除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所一般理解的含義相同的含義。盡管任何與本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料均可用于實踐本發(fā)明，但在本文中對優(yōu)選的方法和材料進行了描述。相應地，接下來定義的術(shù)語通過整體參照本說明書來更完整地描述。在相關(guān)部分引用的全部文檔均全文以引用方式并入本文中。然而，不應當將對任何文檔的引用理解為承認其相對 于本發(fā)明是現(xiàn)有技術(shù)。如本文所用，除非上下文另有明確說明，否則單數(shù)“一個”、“一種”和“該”包括復數(shù)指代。在本說明書通篇中給出的每一個上限值旨在包括每一個下限值，就如同此類下限值在本文中明確地寫出一樣。在本說明書通篇中給出的每一個下限值將包括每一個上限值，就如同此類上限值在本文中明確地寫出一樣。在本說明書通篇中給出的每一個數(shù)值范圍將包括落入此類較寬數(shù)值范圍內(nèi)的每一個較窄數(shù)值范圍，就如同此類較窄數(shù)值范圍在本文中全部明確地寫出一樣。
_4] 增加生物異戊二烯產(chǎn)量的方法本文提供改良的產(chǎn)生異戊二烯的方法。在一些方面，所述改良的方法包括(a)在適于產(chǎn)生異戊二烯的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)包含異源核酸的細胞，所述異源核酸編碼異戊二烯合酶，其中所述細胞(i)產(chǎn)生滴度大于40g/L的異戊二烯，或者(ii)具有大于約500mg/LsM/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率；(b)移出培養(yǎng)物的一部分；(c)過濾培養(yǎng)物的所述移出部分以得到滲透物和滲余物；(d)將所述滲余物返回至培養(yǎng)物；(e)產(chǎn)生異戊二烯；以及任選
(f)回收所述異戊二烯；其中經(jīng)歷步驟(b)、(C)和(d)的培養(yǎng)細胞與沒有經(jīng)歷步驟(b)、(C)和(d)培養(yǎng)的相同細胞相比(i)產(chǎn)生更高滴度的異戊二烯；或者(ii)具有更高的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，細胞在發(fā)酵罐、生物反應器或適于商業(yè)規(guī)模細胞培養(yǎng)的其他容器中培養(yǎng)。在一些方面，發(fā)酵罐、生物反應器或細胞培養(yǎng)容器是不銹鋼、玻璃或銅。在一些方面，發(fā)酵罐、生物反應器或細胞培養(yǎng)容器還包括連接至異戊二烯儲罐的異戊二烯收集出口。在一些方面，異戊二烯收集出口還包括控制異戊二烯通過異戊二烯收集出口的流量的閥門。在一些方面,所述改良的方法包括(a)在適于產(chǎn)生異戍二烯的培養(yǎng)條件下在裝有生長培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)包含異源核酸的細胞，所述異源核酸編碼異戊二烯合酶，其中所述細胞(i)產(chǎn)生滴度大于40g/L的異戊二烯，或者(ii)具有大于約
異戊二烯平均體積產(chǎn)率；(b)將細胞培養(yǎng)物的一部分從發(fā)酵罐中移出；(c)將細胞培養(yǎng)物的移出部分轉(zhuǎn)移至過濾器；(d)過濾細胞培養(yǎng)物的移出部分以形成(i)包含廢生長培養(yǎng)基的滲透物；以及(ii)包含細胞和其他培養(yǎng)物固形物的滲余物；(e)將所述滲余物返回發(fā)酵罐；
(f)收集滲透物；(g)產(chǎn)生異戊二烯；以及任選(h)回收異戊二烯；其中經(jīng)歷步驟(b)、(C)、(d)和(e)的培養(yǎng)細胞與沒有經(jīng)歷步驟(b)、(C)、(d)和(e)培養(yǎng)的相同細胞相比(i)產(chǎn)生更高滴度的異戊二烯，或者(ii)具有更高的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，細胞在發(fā)酵罐、生物反應器或適于商業(yè)規(guī)模細胞培養(yǎng)的其他容器中培養(yǎng)。在一些方面，發(fā)酵罐、生物反應器或細胞培養(yǎng)容器是不銹鋼、玻璃或銅。在一些方面，發(fā)酵罐、生物反應器或細胞培養(yǎng)容器還包括連接至異戊二烯儲罐的異戊二烯收集出口。在一些方面，異戊二烯收集出口還包括控制異戊二烯通過異戊二烯收集出口的流量的閥門。在一些方面，異戊二烯收集出口包括本文所述的任何合適的柔性配管或剛性配管。在一些方面，發(fā)酵罐、生物反應器或細胞培養(yǎng)容器通過循環(huán)管路和循環(huán)泵連接至過濾器。在一些方面，循環(huán)管路還包括一個或多個閥門以控制通過循環(huán)管路的材料(即細胞培養(yǎng)物或滲余物的一部分)的流量。一般來講，可結(jié)合本文所述的方法使用能夠精確調(diào)節(jié)或控制流速和壓力的任何類型的泵。在一些方面，循環(huán)泵包括正位移泵，如蠕動泵、往復泵或旋轉(zhuǎn)泵。在一些方面，循環(huán)泵是蠕動泵。在一些方面，循環(huán)泵是速度泵，如離心泵、徑流 泵、軸流泵、混流泵或重力泵。在一些方面，循環(huán)泵是離心泵。在一些方面，循環(huán)管路包括柔性配管。在一些方面，柔性配管是聚氯乙烯(PVC)、聚氨酯(如Superthanee)、有機硅(如Sikon )、熱塑性橡膠(TPR -MSupmmm)、含氟聚合物、聚乙烯、聚丙烯(如Prolite )、膠乳或金屬配管。在一些方面，PVC配管是編織增強管(如Nylobradees)、鋼絲增強管(如Vardex·)或螺旋增強管(如，Newflex )。在一些方面，聚氨酯配管是編織增強管(如，Urebrade Pneumatic)。在一些方面，有機硅配管是編織增強管(如，Silbrade )、鉬固化性醫(yī)療級配管(如，Sikon Med-Χ)或聚酯和金屬絲增強管(如，Silvae#)。在一些方面，含氟聚合物配管是聚四氟乙烯(PTFE ;如C0NTEF )、氟化乙烯丙烯(FEP ;如Coiltef )、全氟烷氧基(PFA ;如Coiltef )、乙烯-四氟乙烯(ETFE)、乙烯-三氟氯乙烯(ECTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚酰亞胺(PEI)或聚醚醚酮(PEEK)配管。在一些方面，聚乙烯配管是線性低密度聚乙烯配管(LLDPE;如Zelite )。在一些方面，循環(huán)管路包括剛性配管或?qū)Ч?。在一些方面，剛性配管為金屬配管。在一些方面，所述金屬為碳鋼、不銹鋼、鍍鋅鋼、銅、黃銅或任何其他合適的金屬或合金。在一些方面，剛性配管為塑料配管。在一些方面，所述塑料為聚氯乙烯(PVC)、氯化聚氯乙烯(CPVC)、纖維增強塑料(FRP)、增強型聚合物灰漿(RPMP)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、交聯(lián)高密度聚乙烯(PEX)、聚丁烯(PB)、高密度聚氨酯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)或任何其他合適的材料。在一些方面，通過滲透物收集出口和滲透泵從過濾器收集滲透物，并將其儲存在滲透物收集罐中。在一些方面，滲透物收集出口還包括控制滲透物通過滲透物收集出口的流量的閥門。在一些方面，滲透物收集出口包括本文所述的任何合適的柔性配管或剛性配管。在一些方面，滲透物收集出口還包括用于監(jiān)測滲透物收集出口的壓力(Pitsfe)的滲透物壓力計。一般來講，可結(jié)合本文所述的方法使用能夠精確調(diào)節(jié)或控制流速和壓力的任何類型的泵。在一些方面，滲透泵包括正位移泵，例如蠕動泵、往復泵或旋轉(zhuǎn)泵。在一些方面，滲透泵是蠕動泵。在一些方面，滲透泵是速度泵，如離心泵、徑流泵、軸流泵、混流泵或重力泵。在一些方面，滲透泵是離心泵。在一些方面，滲透物收集罐還包括排氣孔以緩解罐內(nèi)的壓力。在一些方面，改良的方法還包括將所述滲透物回收至相同的細胞培養(yǎng)物內(nèi)或至另一細胞培養(yǎng)物內(nèi)的步驟?；厥諠B透物能使異戊二烯的產(chǎn)量在一段時間內(nèi)增加，例如，每升發(fā)酵液在每小時內(nèi)產(chǎn)生更多的異戊二烯。因此，在一個方面，在存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的細胞具有比不存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的相同細胞更高的異戊二烯平均單位產(chǎn)率。在一些方面，所述細胞具有的異戊二烯平均單位產(chǎn)率是在不存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的相同細胞的約兩倍。在一些方面，所述細胞具有的異戊二烯平均單位產(chǎn)率是在不存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的相同細胞的約三倍。在一些方面，在將滲透物回收至相同細胞培養(yǎng)物或至另一細胞培養(yǎng)物之前對其進行滅菌。在一些方面，通過過濾對滲透物進行滅菌。在一些方面，通過高壓滅菌法對滲透物進行滅菌。在一些方面，通過紫外線或Y輻照對滲透物進行滅菌。在一些方面，在將滲透物回收至相同細胞培養(yǎng)物或至另一細胞培養(yǎng)物之前不對其進行滅菌。本文所述系統(tǒng)的一個優(yōu)點在于最少量的所需產(chǎn)物(即異戊二烯)通過回收或丟棄 滲透物而損失。在一方面，在循環(huán)開始前發(fā)酵罐中產(chǎn)生的異戊二烯的至少約50%在循環(huán)完成后是可回收的，因而不會在滲透物的回收或丟棄過程中損失。在另一方面，在發(fā)酵罐中產(chǎn)生的至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %、至少約99 %、至少約99. 5%、至少約99. 6%、至少約99. 7%、至少約99. 8%或至少約99. 9%的異戊二烯是可回收的，并且不會在滲透物中損失。在一些方面，循環(huán)管路還包括用于監(jiān)測過濾器的入口壓力(P入口)的入口壓力計。在一些方面，循環(huán)管路還包括用于監(jiān)測過濾器的出口壓力(Pan)的出口壓力計。在一些方面，循環(huán)管路還包括用于監(jiān)測過濾器的入口壓力(P入口)的入口壓力計和用于監(jiān)測過濾器的出口壓力(Pm)的出口壓力計。在一些方面，所述改良的方法還包括以下步驟α)用入口壓力計監(jiān)測過濾器的入口壓力(P7vn) ；(ii)用出口壓力計監(jiān)測過濾器的出口壓力(P出口)；以及(iii)用滲透物壓力計監(jiān)測滲透物收集出口的壓力(Pitsfe),以確定整個過濾器上的跨膜壓力。在一些方面，通過微濾來進行過濾。在一些方面，通過交叉流過濾來進行微濾。在一些方面，通過超濾來進行過濾。在一些方面，通過交叉流過濾來進行超濾。在交叉流過濾過程中，待過濾的溶液在相對于滲透物側(cè)的正跨膜壓力(TMP)下切向通過過濾膜。小于膜孔徑的一部分材料作為濾液(即滲透物)通過膜，而溶液的剩余部分作為滲余物保留在膜的加料側(cè)上。使用交叉流過濾時，在整個膜上的大多數(shù)流體的切向運動使被捕獲的顆?；蚬腆w留在過濾器表面上以待擦除，因此交叉流過濾器能夠在相對較高的固體載荷下連續(xù)地運行而無污垢。此外，滲余物保持為適于通過循環(huán)管路返回至發(fā)酵罐的流動漿料的形式。在一些方面，通過離心或旋轉(zhuǎn)過濾來進行過濾。在一些方面，通過渦流過濾來進行過濾。在一些方面，通過水力旋流器來進行過濾。在本文所述的任何方面，通過微濾來進行過濾。在本文所述的任何方面，通過超濾來進行過濾。在一些方面，通過微濾來進行過濾。在一些方面，微濾是交叉流過濾。在一些方面，所述交叉流過濾是切向流過濾。在一些方面，所述切向流過濾器包括選自中空纖維膜、螺旋卷式膜、管式膜或板框式膜的膜構(gòu)造。在一些方面，所述切向流過濾器包括中空纖維膜。在一些方面，中空纖維膜、螺旋卷式膜、管式膜或板框式膜包括聚醚砜(PES)膜、聚砜(PS)膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、聚芳砜膜、聚酰胺膜、聚丙烯膜、聚乙烯膜、聚四氟乙烯(PTFE)膜、乙酸纖維素膜、聚丙烯腈膜、乙烯共聚物膜、纖維素膜、再生纖維素膜、聚碳酸酯膜、陶瓷膜、鋼膜或不銹鋼膜。微濾膜(如切向流膜)的孔徑可根據(jù)膜材料和應用而變化。本文所述的任何膜構(gòu)造和膜類型均可具有在各種范圍內(nèi)的過濾器孔徑。在一些方面，切向流過濾器具有適用于本文所述的任何示例性的產(chǎn)異戊二烯細胞或細胞類型的過濾器孔徑，所述細胞或細胞類型包括(例如)包含一條或多條有效連接至啟動子的編碼異戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽和/或MVA途徑多肽的異源核酸的那些。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約O. 005 μ m至約100 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約O. 005 μ m至約50 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約O. 005 μ m至約ΙΟμπι之間的過濾器孔徑。在一些方 面，所述切向流過濾器具有介于約O. 005 μ m至約5 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約O. 005 μ m至約2 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約O. 005 μ m至約I μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約0.05 μ m至約IOOym之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約O. 05 μ m至約50 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約0.05μπι至約ΙΟμπι之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約O. 05 μ m至約5 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面,所述切向流過濾器具有介于約O. 05 μ m至約2 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約O. 05 μ m至約
Iμ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約O. 5 μ m至約100 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約O. 5 μ m至約50 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約O. 5 μ m至約ΙΟμπι之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約0. 5 μ m至約5 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約0. 5μπι至約2μπι之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約0. 5 μ m和I μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約Iym至約ΙΟμπι之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約Iym至約50μπι之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約Iym至約100 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約5 μ m至約10 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約5 μ m至約50 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約5 μ m至約100 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約0. 05 μ m至約0. 5 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約0.5μπι至約Ιμπι之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約Iym至約5 μπι之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約5微米至約10微米之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約10微米至約50微米之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約10微米至約100微米之間的過濾器孔徑。在一些方面，通過超濾來進行過濾。在一些方面，所述超濾是交叉流過濾。在一些方面，所述交叉流過濾是切向流過濾。在一些方面，所述切向流過濾器包括選自中空纖維膜、螺旋卷式膜、管式膜或板框式膜的膜構(gòu)造。在一些方面，所述切向流過濾器包括中空纖維膜。在一些方面，中空纖維膜、螺旋卷式膜、管式膜或板框式膜包括聚醚砜(PES)膜、聚砜(PS)膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、聚芳砜膜、聚酰胺膜、聚丙烯膜、聚乙烯膜、聚四氟乙烯(PTFE)膜、乙酸纖維素膜、聚丙烯腈膜、乙烯共聚物膜、纖維素膜、再生纖維素膜、聚碳酸酯膜、陶瓷膜、鋼膜或不銹鋼膜。超濾膜(如切向流膜)的標稱截留分子量(NMWC)可根據(jù)膜材料和應用而變化。本文所述的任何膜構(gòu)造和膜類型可具有在各 種范圍內(nèi)的NMWC。在一些方面，切向流過濾器具有適用于本文所述的任何示例性的產(chǎn)異戊二烯細胞或細胞類型的標稱截留分子量(NMWC),所述細胞或細胞類型包括(例如)包含一條或多條有效連接至啟動子的編碼異戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽、DXP途徑多肽和/或MVA途徑多肽的異源核酸的那些。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于1000和750，000之間的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于1000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于5000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于10，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于15，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于20，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于25，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于50，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于75，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于100，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于150，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于200，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于250，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于300，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于350，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于400，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于450，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于500，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于600，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于750，000的NMWC。在一些方面,所述切向流過濾器是GE Healthcare Xampler 超濾濾芯(得自位于新澤西州皮斯卡塔韋的通用電氣醫(yī)療生物科學有限公司(GEHealthcare Bio-Sciences,Corp.，Piscataway，NJ))，其具有500，000標稱截留分子量(NMWC)，包含具有Imm內(nèi)徑的中空纖維膜。在一些方面，切向流過濾器是0PTISRP 3000過濾器模塊(來自位于北卡羅來納州埃佩克斯市的NCSRT有限公司(NCSRT, Inc.，Apex, NC)) ,(..)1^1']SI: Ij" 7000過濾器模塊或OPTISEP HOOO過濾器模塊，其使用截留分子量適用于本文所述的任何示例性的產(chǎn)異戍二烯細胞或細胞類型的過濾器，所述細胞或細胞類型包括(例如)包含一條或多條有效連接至啟動子的編碼異戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽和/或MVA途徑多肽的異源核酸的那些。在一些方面，過濾器是切向流過濾器，該切向流過濾器具有適用于本文所述的任何示例性的產(chǎn)異戍二烯細胞或細胞類型的標稱截留分子量(NMWC),所述細胞或細胞類型包括(例如)含有一條或多條有效連接至啟動子的編碼異戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽、DXP途徑多肽和/或MVA途徑多肽的異源核酸的那些。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于1000和750，000之間的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于10，000和750，000之間的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于100，000和750，000之間的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于250，000和750，000之間的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于1000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于5000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于10,000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于15，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于20，000的》(。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于25，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于50，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于75，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于100,000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于150，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于200，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于250，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于300，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于350，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于400，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于450，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于500，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于600，000的NMWC。在一些方面，所述切向流過濾器具有大于750，000的NMWC。
在一些方面，發(fā)酵罐、生物反應器或細胞培養(yǎng)容器沒有循環(huán)管路和循環(huán)泵，過濾是通過浸沒式膜生物反應器來進行的。在一些方面，浸沒式膜生物反應器包括浸入發(fā)酵罐、生物反應器或細胞培養(yǎng)容器內(nèi)的細胞培養(yǎng)物中的過濾模塊。在一些方面，過濾模塊包括過濾器和與僅通過該過濾器的細胞培養(yǎng)物流體接觸的滲透物側(cè)。在一些方面，過濾器包括聚醚砜(PES)膜、聚砜(PS)膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、聚芳砜膜、聚酰胺膜、聚丙烯膜、聚乙烯膜、聚四氟乙烯(PTFE)膜、乙酸纖維素膜、聚丙烯腈膜、乙烯共聚物膜、纖維素膜、再生纖維素膜、聚碳酸酯膜、陶瓷膜、鋼膜或不銹鋼膜。在一些方面，在浸沒式膜生物反應器中的過濾器為超濾器，該超濾器具有適用于本文所述的任何示例性的產(chǎn)異戍二烯細胞或細胞類型的標稱截留分子量(NMWC),所述細胞或細胞類型包括(例如)包含一條或多條有效連接至啟動子的編碼異戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽和/或MVA途徑多肽的異源核酸的那些。在一些方面，所述過濾器具有介于1000和750，000之間的NMWC。在一些方面，所述過濾器具有大于1000的NMWC。在一些方面，所述過濾器具有大于5000的NMWC。在一些方面，所述過濾器具有大于10，000的NMWC。在一些方面，所述過濾器具有大于15,000的NMWC。在一些方面，所述過濾器具有大于20，000的NMWC。在一些方面，所述過濾器具有大于25，000的NMWC。在一些方面，所述過濾器具有大于50，000的NMWC。在一些方面，所述過濾器具有大于75，000的NMWC。在一些方面，所述過濾器具有大于100，000的NMWC。在一些方面，所述過濾器具有大于150，000的NMWC。在一些方面，所述過濾器具有大于200,000的NMWC。在一些方面，所述過濾器具有大于250，000的NMWC。在一些方面，所述過濾器具有大于300，000的NMWC。在一些方面，所述過濾器具有大于350，000的NMWC。在一些方面，所述過濾器具有大于400，000的NMWC0在一些方面，所述過濾器具有大于450，000的NMWC。在一些方面，所述過濾器具有大于500，000的NMWC。在一些方面，所述過濾器具有大于600，000的NMWC。在一些方面，所述過濾器具有大于750，000的NMWC。在一些方面，在浸沒式膜生物反應器中的過濾器為微過濾器，該微過濾器具有適用于本文所述的任何示例性的產(chǎn)異戊二烯細胞或細胞類型的過濾器孔徑，所述細胞或細胞類型包括(例如)包含一條或多條有效連接至啟動子的編碼異戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽、DXP途徑多肽和/或MVA途徑多肽的異源核酸的那些。在一些方面，所述過濾器具有介于約O. 005 μ m至約100 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約O. 005 μ m至約50 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面,所述過濾器具有介于約O. 005 μ m至約10 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約O. 005 μ m至約5 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約O. 005 μ m至約2 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約O. 005μπι至約Ιμπι之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約O. 05 μ m至約100 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約O. 05 μ m至約50 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約0.05 μ m至約ΙΟμπι之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約
O.05 μ m至約5 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約O. 05 μ m至約
2μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約O. 05 μ m至約I μ m之間的 過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約O. 5 μ m至約100 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約O. 5 μ m至約50 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約O. 5 μ m至約IOym之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約O. 5 μ m至約5 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述切向流過濾器具有介于約O. 5 μ m至約2 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約O. 5 μ m至約Iym之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約Iym至約IOym之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約Iym至約50μπι之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約Ium至約IOOym之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約5μπι至約ΙΟμπι之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約5 μ m至約50 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面,所述過濾器具有介于約5 μ m至約100 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約0. 05 μ m至約0. 5 μ m之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約0.5μπι至約Ιμπι之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約Ium至約5μπι之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約5微米至約10微米之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約10微米至約50微米之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾器具有介于約10微米至約100微米之間的過濾器孔徑。在一些方面，所述過濾模塊還包括滲透物收集出口和滲透泵。在一些方面，所述過濾模塊還包括滲透物收集罐。在一些方面，滲透泵包括正位移泵，例如蠕動泵、往復泵或旋轉(zhuǎn)泵。在一些方面，滲透泵是蠕動泵。在一些方面，滲透泵是速度泵，如離心泵、徑流泵、軸流泵、混流泵或重力泵。在一些方面，滲透泵是離心泵。在一些方面，滲透物收集罐還包括排氣孔以緩解罐內(nèi)的壓力。在一些方面，所述改良的方法還包括維持正跨膜壓力的步驟，所述跨膜壓力的計算方式如下ΤΜΡ = ([PλP+Pttip]/2)-Pο在一些方面,所述改良的方法還包括通過反轉(zhuǎn)TMP ( S卩，使TMP為負)來清潔過濾器的步驟。反轉(zhuǎn)TMP會導致滲透物流回待過濾的溶液中，從而使積垢于過濾器的任何固形物上升離開膜的表面，從而改善通過過濾器和循環(huán)管路的流動。反轉(zhuǎn)TMP通常需要對膜的滲透物側(cè)加壓。在更為通常的情況下，將反轉(zhuǎn)TMP的操作應用于陶瓷和鋼膜過濾器，因為它們具備內(nèi)在強度而較不易受到損壞。通過將滲透物管路連接至壓縮空氣或水以及其他方法可實現(xiàn)對滲透物的加壓。參見(例如)丹尼斯克公司(Danisco)的專利申請W02009/035700的關(guān)于在螺旋卷式高分子膜中反轉(zhuǎn)TMP的具體方式的示例性教導內(nèi)容。在一些方面，在過濾單元內(nèi)的停留時間為25秒，發(fā)酵液內(nèi)的葡萄糖濃度介于3至25g/L之間。在一些方面，在過濾單元內(nèi)的停留時間為10秒，發(fā)酵液內(nèi)的葡萄糖濃度介于I至3g/L之間。在一些方面，在過濾單元內(nèi)的停留時間介于5至60秒之間，發(fā)酵液內(nèi)的葡萄糖濃度介于O. 2至25g/L之間。在一些方面，當培養(yǎng)物達到目標體積時，首先開始移出培養(yǎng)物的一部分。在一些方面，憑借經(jīng)驗來確定目標體積。在一些方面，目標體積為發(fā)酵罐、生物反應器或細胞培養(yǎng)容器總體積的1/2 (二分之一)、1/3 (三分之一)、1/4(四分之一)、1/5 (五分之一)、1/6(六分之一)、1/7 (七分之一)、1/8 (八分之一)、1/9 (九分之一)、1/10(十分之一)或更少。在 一些方面，目標體積是用于培養(yǎng)細胞的發(fā)酵罐、生物反應器或細胞培養(yǎng)容器的工作容量。在一些方面，在開始細胞培養(yǎng)之后(S卩，開始發(fā)酵之后)5小時、10小時、15小時、20小時、25小時、30小時、35小時或更長的時間首先開始移出培養(yǎng)物的一部分。循環(huán)管路的連續(xù)運行耗費能量(對抗壓力泵送)并增大對細胞的應力。因此，延緩或暫停過濾(即，在發(fā)酵過程中以特定的次數(shù)或者每隔一段時間而非連續(xù)地收集廢培養(yǎng)基)的選項可提供經(jīng)濟益處并可能改善發(fā)酵成果。在一些方面，將所述部分的培養(yǎng)物連續(xù)地從發(fā)酵罐、生物反應器或細胞培養(yǎng)容器中移出。在一些方面，將所述部分的培養(yǎng)物以I毫升/分鐘、5毫升/分鐘、10毫升/分鐘、15毫升/分鐘、20毫升/分鐘、25毫升/分鐘、30毫升/分鐘、35毫升/分鐘、40毫升/分鐘、45毫升/分鐘、50毫升/分鐘、100毫升/分鐘、250毫升/分鐘、500毫升/分鐘、1000毫升/分鐘或更高的速率連續(xù)地移出。在一些方面，將所述部分的培養(yǎng)物以I毫升/15分鐘、5毫升/15分鐘、10毫升/15分鐘、15毫升/15分鐘、20毫升/15分鐘、25毫升/15分鐘、30毫升/15分鐘、35毫升/15分鐘、40毫升/15分鐘、45毫升/15分鐘、50毫升/15分鐘、100毫升/15分鐘、250毫升/15分鐘、500毫升/15分鐘、1000毫升/15分鐘或更高的速率連續(xù)地移出。在一些方面，將所述部分的培養(yǎng)物以I暈升/30分鐘、5暈升/30分鐘、10暈升/30分鐘、15暈升/30分鐘、20暈升/30分鐘、25暈升/30分鐘、30毫升/30分鐘、35毫升/30分鐘、40毫升/30分鐘、45毫升/30分鐘、50毫升/30分鐘、100毫升/30分鐘、250毫升/30分鐘、500毫升/30分鐘、1000毫升/30分鐘或更高的速率連續(xù)地移出。在一些方面，將所述部分的培養(yǎng)物以I毫升/60分鐘、5毫升/60分鐘、10毫升/60分鐘、15毫升/60分鐘、20毫升/60分鐘、25毫升/60分鐘、30毫升/60分鐘、35毫升/60分鐘、40毫升/60分鐘、45毫升/60分鐘、50毫升/60分鐘、100毫升/60分鐘、250毫升/60分鐘、500毫升/60分鐘、1000毫升/60分鐘或更高的速率連續(xù)地移出。在一些方面，將所述部分的培養(yǎng)物以I克/分鐘、2克/分鐘、3克/分鐘、4克/分鐘、5克/分鐘、6克/分鐘、7克/分鐘、8克/分鐘、9克/分鐘、10克/分鐘、20克/分鐘、30克/分鐘、40克/分鐘、50克/分鐘、60克/分鐘、70克/分鐘、80克/分鐘、90克/分鐘、100克/分鐘或更高的速率連續(xù)地移出。在一些方面，將所述部分的培養(yǎng)物以I克/15分鐘、2克/15分鐘、3克/15分鐘、4克/15分鐘、5克/15分鐘、6克/15分鐘、7克/15分鐘、8克/15分鐘、9克/15分鐘、10克/15分鐘、20克/15分鐘、30克/15分鐘、40克/15分鐘、50克/15分鐘、60克/15分鐘、70克/15分鐘、80克/15分鐘、90克/15分鐘、100克/15分鐘或更高的速率連續(xù)地移出。在一些方面，將所述部分的培養(yǎng)物以I克/30分鐘、2克/30分鐘、3克/30分鐘、4克/30分鐘、5克/30分鐘、6克/30分鐘、7克/30分鐘、8克/30分鐘、9克/30分鐘、10克/30分鐘、20克/30分鐘、30克/30分鐘、40克/30分鐘、50克/30分鐘、60克/30分鐘、70克/30分鐘、80克/30分鐘、90克/30分鐘、100克/30分鐘或更高的速率連續(xù)地移出。在一些方面，將所述部分的培養(yǎng)物以I克/60分鐘、2克/60分鐘、3克/60分鐘、4克/60分鐘、5克/60分鐘、6克/60分鐘、7克/60分鐘、8克/60分鐘、9克/60分鐘、10克/60分鐘、20克/60分鐘、30克/60分鐘、40克/60分鐘、50克/60分鐘、60克/60分鐘、70克/60分鐘、80克/60分鐘、90克/60分鐘、100克/60分鐘或更高的速率連續(xù)地移出。在一些方面，將所述部分的培養(yǎng)物以O(shè). 2千克/分鐘、O. 4千克/分鐘、O. 6千克/分鐘、O. 8千克/分鐘、I. O千克/分鐘、I. 2千克/分鐘、I. 4千克/分鐘、I. 6千克/分鐘、
1.8千克/分鐘、2. O千克/分鐘、3. O千克/分鐘、4. O千克/分鐘、5. O千克/分鐘或更高的速率連續(xù)地移出。在一些方面，將所述部分的培養(yǎng)物以O(shè). 2千克/15分鐘、O. 4千克/15分鐘、O. 6千克/15分鐘、O. 8千克/15分鐘、I. O千克/15分鐘、I. 2千克/15分鐘、I. 4千克 /15分鐘、I. 6千克/15分鐘、I. 8千克/15分鐘、2. O千克/15分鐘、3. O千克/15分鐘、4. O千克/15分鐘、5. O千克/15分鐘或更高的速率連續(xù)地移出。在一些方面，將所述部分的培養(yǎng)物以O(shè). 2千克/30分鐘、O. 4千克/30分鐘、O. 6千克/30分鐘、O. 8千克/30分鐘、I. O千克/30分鐘、I. 2千克/30分鐘、I. 4千克/30分鐘、I. 6千克/30分鐘、I. 8千克/30分鐘、
2.O千克/30分鐘、3. O千克/30分鐘、4. O千克/30分鐘、5. O千克/30分鐘或更高的速率連續(xù)地移出。在一些方面，將所述部分的培養(yǎng)物以O(shè). 2千克/60分鐘、O. 4千克/60分鐘、O. 6千克/60分鐘、O. 8千克/60分鐘、I. O千克/60分鐘、I. 2千克/60分鐘、I. 4千克/60分鐘、I. 6千克/60分鐘、I. 8千克/60分鐘、2. O千克/60分鐘、3. O千克/60分鐘、4. O千克/60分鐘、5. O千克/60分鐘或更高的速率連續(xù)地移出。在一些方面，以所需的時間間隔，從發(fā)酵罐、生物反應器或細胞培養(yǎng)容器中不連續(xù)地移出培養(yǎng)物的部分。在一些方面，每5分鐘、每10分鐘、每15分鐘、每20分鐘、每25分鐘、每30分鐘、每35分鐘、每40分鐘、每45分鐘、每50分鐘、每55分鐘、每60分鐘或更久將培養(yǎng)物的一部分從發(fā)酵罐、生物反應器或細胞培養(yǎng)容器中移出。在一些方面，每隔一段時間將 lml、5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、35ml、40ml、45ml、50ml、75ml、100ml、125ml、150ml、175ml、200ml、225ml、250ml或更多的物質(zhì)從培養(yǎng)物中移出。在一些方面，每隔一段時間將 O. 2kg、0. 4kg、0. 6kg、0. 8kg、l. 0kg、l. 2kg、l. 4kg、l. 6kg、l. 8kg、2. Okg 或更多的物質(zhì)從培養(yǎng)物中移出。在一些方面，在任何本文所述改良方法中培養(yǎng)的細胞是任何本文所述的產(chǎn)異戊二烯細胞，所述細胞包含一條或多條有效連接至啟動子的編碼異戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽、DXP途徑多肽和/或MVA途徑多肽的異源核酸。在一些方面，包含編碼異戊二烯合酶的異源核酸的細胞(i)產(chǎn)生滴度大于40g/L的異戊二烯；或者(ii)具有大于約500mg/L發(fā)酵液/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，DXP途徑多肽選自DXS(1_脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶)、DXR(1_脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶)、MCT(4- 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇合酶)、CMK(4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶)、MCS (2C-甲基-D-赤蘚醇_2，4-環(huán)二磷酸合酶)、HDSd-羥基-2-甲基-2-(E)- 丁烯基-4- 二磷酸合酶)、HDR(1-羥基_2_甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸還原酶)以及IDI多肽。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑上游多肽。在一些方面，MVA途徑上游多肽選自(i)乙酰乙?；o酶A合酶(硫解酶)多肽；(ii)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽；以及(iii) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽。在一些方面，MVA途徑上游多肽來自腸球菌屬(Enterococcus)。在一些方面，MVA途徑上游多肽來自糞腸球菌。在一些方面，MVA途徑上游多肽包括來自糞腸球菌的乙酰乙?；o酶A合酶(硫解酶)多肽、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽。在一些方面，MVA途徑多肽是MVA途徑下游多肽。在一些方面，MVA途徑下游多肽選自(i)甲羥戊酸激酶(MVK) ；(ii)磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD);以及(iv)異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(IDI)。在一些方面，MVA途徑下游多肽來自甲烷八疊球菌屬。在一些方面，MVA途徑下游多肽來自馬氏甲烷八疊球菌。在一些方面，MVA途徑下游多肽包括來自馬氏甲烷八疊球菌的MVK多肽。在一些方面，MVA途徑下游多肽包括來自釀酒酵母的MVK多肽、PMK多肽、MVD多肽以及IDI多肽。在一些方面，MVA下游多 肽包括來自馬氏甲烷八疊球菌的MVK多肽以及來自釀酒酵母的MVK多肽、PMK多肽、MVD多肽和IDI多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬(Pueraria)的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戍二烯合酶多肽是來自山葛(Pueraria montana)的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自楊屬(Populus)的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戍二烯合酶多肽是來自銀白楊(Populus alba)的天然存在的多肽。在一些方面，MVA途徑上游多肽包括來自糞腸球菌的乙酰乙酰基輔酶A合酶(硫解酶)多肽、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶多肽；MVA下游多肽包括來自馬氏甲烷八疊球菌的MVK多肽以及來自釀酒酵母的MVK多肽、PMK多肽、MVD多肽和IDI多肽；并且所述異戊二烯合酶多肽來自銀白楊。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約40g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約50g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約60g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約70g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約80g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約90g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約100g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約110g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約120g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約130g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約140g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約150g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約160g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約170g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約180g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約190g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度大于約200g/L的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約40g/L至約100g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約60g/L至約100g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約60g/L至約120g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約40g/L至約150g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約40g/L至約200g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約80g/L至約150g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約100g/L至約150g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約100g/L至約180g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約100g/L至約200g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞產(chǎn)生滴度介于約120g/L至約200g/L之間的異戊二烯。在一些方面，所述細胞具有大于約SOOmg/Lgj^/h的異戍二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，所述細胞具有大于約I，OOOmgZLsta/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，所述細胞具有大于約l，500mg/Lssw/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，所述細胞具有大于約2，000mg/LM/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，所述細胞具有介于約500mg/LM/h至約2，000mg/LM/h之間的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是植物異戊二烯合酶多肽。在一些方面，所述細胞還包含編碼IDI多肽的異源核酸。在一些方面，所述細胞還包含編碼IDI多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述細胞還包含編碼DXS多肽的異源核酸。在一些方面，所述細胞還包含編碼DXP途徑多肽的異源核酸。在一些方面，所述細胞還包含編碼DXS多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述細胞還包含一條或多條編碼IDI多肽和 DXS多肽或DXP途徑多肽核酸。在一些方面，一種核酸編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽以及DXS多肽或DXP途徑多肽。在一些方面，一種質(zhì)粒編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽以及DXS多肽或DXP途徑多肽。在一些方面，所述細胞還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸。在一些方面，所述細胞還包含編碼MVA途徑多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。在一些方面，所述MVA途徑多肽是甲羥戊酸激酶(MVK)。在一些方面，所述MVK是來自甲烷八疊球菌屬的多肽。在一些方面，所述MVK是來自馬氏甲烷八疊球菌的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬(Pueraria)的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戍二烯合酶多肽是來自山葛(Pueraria montana)的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自楊屬(Populus)的天然存在的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自銀白楊(Populus alba)的天然存在的多肽。在一些方面，所述細胞還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸。在一些方面，所述MVA途徑多肽是甲羥戊酸激酶(MVK)。在一些方面，所述MVK是來自甲烷八疊球菌屬的多肽。在一些方面，所述MVK是來自馬氏甲烷八疊球菌的多肽。在一些方面，所述細胞是細菌細胞。在一些方面，所述細胞是革蘭氏陽性細菌細胞。在一些方面，所述細胞是芽孢桿菌屬(Bacillus)細胞。在一些方面，所述細胞是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)細胞。在一些方面,所述細胞是革蘭氏陰性細菌細胞。在一些方面，所述細胞是埃希氏菌屬(Escherichia)或泛菌屬(Pantoea)細胞。在一些方面，所述細胞是大腸桿菌(Escherichia coli)或朽1檬泛菌(Pantoea citrea)細胞。在一些方面，所述細胞是真菌細胞。在一些方面，所述細胞是木霉屬(Trichoderma)細胞。在一些方面，所述細胞是里氏木霉(Trichoderma reesei)細胞。在一些方面，所述細胞是酵母細胞。在一些方面，所述細胞是耶氏酵母菌屬(Yairowia)細胞。在一些方面，所述細胞是解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)細胞。分離核酸的示例性方法使用標準方法可分離異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑多肽、MVA途徑多肽、PGL、氫化酶、氫化酶成熟和/或轉(zhuǎn)錄因子核酸。從所關(guān)注的來源生物體(例如細菌基因組)獲得所需核酸的方法是分子生物學領(lǐng)域常見和眾所周知的(參見例如WO 2004/033646和其中所引用的參考文獻)。分離核酸的標準方法，包括已知序列的PCR擴增、核酸的合成、基因組文庫的篩選、粘粒文庫的篩選，在國際專利公布No. W02009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公布 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公布No. 2010/0048964、TO2009/132220 以及美國專利公布 2010/0003716)中進行了描述。示例性的啟動子和載體本文所述的任何異戊二烯合酶、DXS、DXP途徑多肽、IDI、MVA途徑多肽、PGL、氫化酶、氫化酶成熟和/或轉(zhuǎn)錄因子核酸可包含在一個或多個載體內(nèi)。因此，本文還描述的是具有一條或多條編碼本文所述的異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑多肽、MVA途徑多肽、PGL、氫化酶、氫化酶成熟和/或轉(zhuǎn)錄因子多肽任一者的核酸的載體。在一些方面，載體含有受表達控制序列控制的核酸。在一些方面，表達控制序列是天然表達控制序列。在一些方面，表達控制序列是非天然表達控制序列。在一些方面，載體含有選擇標記或可選標記。在一些方面，異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)核·酸整合進不具有可選標記的細胞的染色體內(nèi)。合適的載體是與所采用的宿主細胞相容的那些。合適的載體可源自例如細菌、病毒(例如源自噬菌體的噬菌體T7或M-13)、粘粒、酵母或植物。合適的載體可在宿主細胞中維持低、中或高拷貝數(shù)。獲得和使用這些載體的方案是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的(參見例如 Sambrook 等人,Molecular Cloning A Laboratory Manual (《分子克隆實驗指南》)，第 2版,Cold Spring Harbor(冷泉港實驗室出版社)，1989)。與本文所述的細胞和方法相容的合適載體在國際專利公布No. WO 2009/076676、美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公布 No. 2009/0203102)、W02010/003007、美國專利公布 No. 2010/0048964、WO 2009/132220以及美國專利公布No. 2010/0003716)中進行了描述。啟動子是本領(lǐng)域所熟知的。在宿主細胞中起作用的任何啟動子可用于在宿主細胞中表達異戊二烯合酶、DXS、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟和/或轉(zhuǎn)錄因子核酸。有多種可用于驅(qū)動異戊二烯合酶、DXS、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟和/或轉(zhuǎn)錄因子核酸在各種宿主細胞中表達的起始控制區(qū)或啟動子，并且這些為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知(參見例如WO 2004/033646和其中所引用的參考文獻)。實際上，可使用能夠驅(qū)動這些核酸的任何啟動子，包括葡萄糖異構(gòu)酶啟動子(參見例如美國專利No. 7，132，527和其中所引用的參考文獻)。與本文所述的細胞和方法相容的合適的啟動子在國際公開No. W02009/076676、美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公布No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公布 No. 2010/0048964、W02009/132220 以及美國專利公布No. 2010/0003716)中進行了描述。在一些方面，表達載體還包括終止序列。終止控制區(qū)域還可源自宿主細胞中天然存在的多種基因。在一些方面，終止序列和啟動子序列源自相同來源。與本文所述的細胞和方法相容的合適的終止序列在國際專利公布No. WO 2009/076676A2和美國專利申請No. 12/335,071中進行了描述，將這兩者均以引用方式并入本文中?？捎脴藴始夹g(shù)將異戊二烯合酶、DXS、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟和/或轉(zhuǎn)錄因子核酸摻入載體(如表達載體)內(nèi)(Sambrook等人，MolecularCloning A Laboratory Manual (《分子克隆實驗指南》)，Cold Spring Harbor (冷泉港實驗室出版社)，1982。與本文所述的細胞和方法相容的合適的技術(shù)在國際專利公布 No. TO2009/076676、美國專利申請 12/335，071 (美國專利公布 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公布 No. 2010/0048964、W02009/132220 以及美國專利公布No. 2010/0003716)中進行了描述。在一些方面，可能期望以遠高于目前在天然存在的細胞中所發(fā)現(xiàn)的水平過表達異戊二烯合酶、DXP途徑多肽、IDI,MVA途徑多肽、PGL、氫化酶、氫化酶成熟和/或轉(zhuǎn)錄因子核酸。在一些方面，可能期望以遠低于目前在天然存在的細胞中所發(fā)現(xiàn)的水平以受限方式表達(如突變、失活或缺失)異戊二烯合酶、DXP途徑多肽、IDI、MVA途徑多肽、PGL、氫化酶、氫化酶成熟或編碼核酸的轉(zhuǎn)錄因子多 肽。與本文所述的細胞和方法相容的適于過表達或受限表達異戊二烯合酶、DXP途徑多肽、IDI,MVA途徑多肽、PGL、氫化酶、氫化酶成熟和/或轉(zhuǎn)錄因子核酸的方法在國際專利公布No. WO 2009/076676、美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公布 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公布 No. 2010/0048964、WO2009/132220以及美國專利公布No. 2010/0003716)中進行了描述。示例件來源的牛物體異戊二烯合酶、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟和/或轉(zhuǎn)錄因子核酸(以及它們所編碼的多肽)可從天然含有異戊二烯合酶、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟和/或轉(zhuǎn)錄因子核酸的任何生物體獲得。如上所述，異戊二烯由多種生物體(例如細菌、酵母、植物和動物)天然地形成。生物體含有MVA途徑、DXP途徑或MVA和DXP途徑二者來產(chǎn)生異戊二烯(圖IA和1B)。因此，DXP途徑核酸可例如從任何含有DXP途徑或含有MVA和DXP途徑二者的生物體獲得。IDI和異戊二烯合酶核酸可例如從任何含有MVA途徑、DXP途徑或MVA和DXP途徑二者的生物體獲得。MVA途徑核酸可例如從任何含有MVA途徑或含有MVA和DXP途徑二者的生物體獲得。氫化酶核酸可例如從任何使氫氧化或使氫離子還原的生物體獲得。發(fā)酵副產(chǎn)物基因可例如從任何經(jīng)歷有限氧呼吸或厭氧呼吸(如糖酵解)的生物體獲得或鑒別。異戊二烯合酶、DXP途徑、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟和/或轉(zhuǎn)錄因子核酸的核酸序列可從細菌、真菌、植物、藻類或藍細菌分離。示例性的來源生物體包括(例如)酵母，如酵母屬(Saccharomyces)的物種(如釀酒酵母)或耶氏酵母屬(Yarrowia)的物種(如解脂耶氏酵母)；其他真菌，如木霉屬(Trichoderma)的物種(如里氏木霉(T. reesei));細菌，如芽孢桿菌屬的物種(如枯草芽孢桿菌)、埃希氏菌屬的物種(如大腸桿菌)、甲烷八疊球菌屬的物種(如馬氏甲烷八疊球菌)或泛菌屬的物種(如檸檬泛菌)；植物，如野葛或楊樹(如銀白楊X歐洲山楊CAC35696)或白楊(如美洲山楊(Populustremuloides))。示例性的宿主生物體在美國臨時專利申請No. 61/187, 959、國際專利公布 No. TO2009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公布 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公布 No. 2010/0048964、W02009/132220 以及美國專利公布No. 2010/0003716 中進行了描述。示例件的宿主細胞在本文所述的方法，多種宿主細胞可用于表達異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑多肽、MVA途徑多肽、氫化酶、氫化酶成熟和/或轉(zhuǎn)錄因子多肽以及用于共同產(chǎn)生異戊二烯和氫氣。示例性的宿主細胞包括來自標題為“示例性來源的生物體”的前面部分中所列出的任何生物體的細胞。宿主細胞可以是天然產(chǎn)異戊二烯的細胞或不會天然產(chǎn)異戊二烯的細胞。在一些方面，宿主細胞采用DXP途徑來天然產(chǎn)生異戊二烯，并增添異戊二烯合酶、DXS和/或IDI核酸以增強采用該途徑產(chǎn)生異戊二烯。在一些方面，宿主細胞采用MVA途徑來天然產(chǎn)生異戊二烯，并增添異戊二烯合酶和/或一種或多種MVA途徑核酸以增強采用該途徑產(chǎn)生異戊二烯。在一些方面，宿主細胞采用DXP途徑來天然產(chǎn)生異戊二烯，并增添一種或多種MVA途徑核酸以利用MVA途徑以及DXP途徑的部分或全部來產(chǎn)生異戊二烯。在一些方面，宿主細胞采用DXP和MVA途徑二者來天然產(chǎn)生異戊二烯，并增添一種或多種異戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途徑核酸以增強通過這些途徑中的一者或二者產(chǎn)生異戊二烯。
適用于本文所述方法的多種類型的宿主細胞，包括利用DXP和MVA途徑二者天然產(chǎn)生異戊二烯的細胞，在國際專利公布No. W02009/076676、美國專利中請No. 12/335，071 (美國專利公布 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公布No. 2010/0048964,W02009/132220 以及美國專利公布 No. 2010/0003716 中進行了論述。非限制性的宿主細胞包括大腸桿菌、檸檬泛菌、枯草芽孢桿菌、解脂耶氏酵母和里氏木霉。示例性的轉(zhuǎn)化方法可使用用于將DNA構(gòu)建體或載體引入宿主細胞內(nèi)的標準技術(shù)，如轉(zhuǎn)化、電穿孔、細胞核顯微注射、轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)染(如，脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染或DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染或者使用重組噬菌體病毒的轉(zhuǎn)染)、使用磷酸鈣-DNA沉淀進行溫育、用DNA包被的微粒進行高速轟擊以及原生質(zhì)體融合，來將異戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途徑、PGL、氫化酶、氫化酶成熟和/或轉(zhuǎn)錄因子核酸或含有它們的載體插入宿主細胞(如，本文所述的植物細胞、真菌細胞、酵母細胞或細菌細胞)內(nèi)。常規(guī)的轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(參見例如Current Protocolsin Molecular Biology (《分子生物學實驗室指南》),F. M. Ausubel等人(編輯)，第9章,1987 ;Sambrook 等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual (《分子克隆實驗手冊》)，第2版，Cold Spring Harbor (冷泉港實驗室出版社)，1989 ;以及Campbell等人，Curr. Genet.(《當代遺傳學》)，16 =53-56,1989)。引入的核酸可整合進染色體DNA內(nèi)或維持為染色體外復制型序列。轉(zhuǎn)化株可通過本領(lǐng)域中已知的任何方法選擇。適于選擇轉(zhuǎn)化株的方法在美國臨時專利申請No. 61/187，959、國際專利公布No. WO 2009/076676、美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公布No. 2009/0203102)、W02010/003007、美國專利公布No. 2010/0048964、WO 2009/132220 以及美國專利公布 No. 2010/0003716 中進行了描述。示例性的細胞培養(yǎng)基所謂“培養(yǎng)物中的細胞”，是指允許細胞夠經(jīng)歷一次或多次細胞分裂的溶液(如，細胞生長培養(yǎng)基)中的兩個或更多個細胞?！芭囵B(yǎng)物中的細胞”不包括為含有已分化為植物組織的細胞的活的多細胞植物的部分的植物細胞。在多個方面，細胞培養(yǎng)物包含至少或約10、20、50、100、200、500、1，000,5, 000,10, 000 個或更多個細胞。任何碳源均可用于培養(yǎng)宿主細胞。術(shù)語“碳源”是指一種或多種能夠被宿主細胞或生物體代謝的含碳化合物。例如，用于培養(yǎng)宿主細胞的細胞培養(yǎng)基可包含任何適于維持生活力或使宿主細胞生長的碳源。適于培養(yǎng)根據(jù)本文所述方法的產(chǎn)異戊二烯細胞的多種碳源在國際專利申請公開WO 2009/076676A2和美國專利申請No. 12/335,071中進行了描述，這兩者均全文以引用方式并入本文中。
在一些方面，所述細胞在含有生理鹽和營養(yǎng)物質(zhì)的標準培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)(參見例如 Pourquie, J.等人，Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation(
素降解的生物化學與遺傳學》)，Aubert等人編輯，Academic Press (美國學術(shù)出版社),第71-86頁，1988以及Ilmen等人,Appl. Environ. Microbiol.(《應用與環(huán)境微生物學》)，63 1298-1306,1997。示例性的生長培養(yǎng)基是常規(guī)的市售成品培養(yǎng)基，如Luria Bertani (LB)肉湯、沙氏葡萄糖(SD)肉湯或酵母培養(yǎng)基(YM)肉湯。也可使用其他成分確定的或合成的生長培養(yǎng)基，并且適于特定宿主細胞生長的培養(yǎng)基是微生物學或發(fā)酵科學領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。除了適當?shù)奶荚赐?，細胞培養(yǎng)基有利地含有合適的礦物質(zhì)、鹽、輔因子、緩沖液以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適于培養(yǎng)物生長或增強異戊二烯產(chǎn)量的其他組分(參見例如WO2004/033646和其中所引用的參考文獻以及WO 96/35796和其中所引用的參考文獻)。在一些方面，在異戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途徑核酸受誘導型啟動子控制的情況下，有利地是將誘導劑(如，糖、金屬鹽或抗微生物劑)以可有效地誘導異戊二烯合酶、DXS、IDI、 DXP途徑多肽和/或MVA途徑多肽的表達的濃度加至培養(yǎng)基中。在一些方面，細胞培養(yǎng)基具有抗生素(如卡那霉素)，該抗生素對應于具有一條或多條異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑核酸或MVA途徑核酸的載體上的抗生素抗性核酸(如卡那霉素抗性核酸)。示例性的細胞培養(yǎng)條件適于細菌培養(yǎng)物的維持和生長的材料和方法是本領(lǐng)域眾所周知的。示例性的技術(shù)可在 Manual of Methods for General Bacteriology (《普通細菌學方法手冊》)，Gerhardt等人編輯，American Society for Microbiology, Washington, D. C.(美國微生物學會出版，華盛頓哥倫比亞特區(qū))(1994)或 Brock 的 Biotechnology :A Textbook of IndustrialMicrobiology (生物技術(shù)工業(yè)微生物學教材)，第二版(1989) Sinauer Associates, Inc.,Sunderland，MA(馬薩諸塞州桑德蘭)中找到。在一些方面，細胞在容許通過插入宿主細胞的核酸編碼的一種或多種異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑多肽或MVA途徑多肽表達的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。標準的細胞培養(yǎng)條件適于培養(yǎng)細胞(參見例如WO 2004/033646和其中所引用的參考文獻)。在適當?shù)臏囟?、氣體混合物和pH下(如在約20°C至約37°C、在約6%至約84%的CO2以及在介于約5至約9的pH下)培養(yǎng)和維持細胞。在一些方面，細胞在適當?shù)募毎囵B(yǎng)基中于35°C下生長。在一些方面，例如，將培養(yǎng)物在振蕩培養(yǎng)物或發(fā)酵罐中在大約28°C的適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至得到所需量的異戊二烯和氫氣的總產(chǎn)量。在一些方面，發(fā)酵的pH范圍介于約pH 5. O至約pH 9. O之間(例如，約pH 6. O至約pH 8. O或約pH 6. 5至約7. 0)。根據(jù)宿主細胞的需求，反應在有氧、缺氧或無氧條件下進行。標準培養(yǎng)條件和發(fā)酵方式(如分批發(fā)酵、分批補料發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵)在國際專利公布No. WO 2009/076676、美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公布No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公布 No. 2010/0048964、WO 2009/132220以及美國專利公布No. 2010/0003716中進行描述。分批發(fā)酵和分批補料發(fā)酵是通用的并為本領(lǐng)域所熟知，其實例可在如下文獻中找到Brock的Biotechnology :A Textbook ofIndustrial Microbiology (《生物技術(shù)工業(yè)微生物學教材》)，第二版(1989) SinauerAssociates， Inc.。
在一些方面,使用組成型或滲漏啟動子(leaky promoter)(如Trc啟動子)，并且未加入化合物(如IPTG)來誘導有效連接至啟動子的異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑核酸或MVA途徑核酸的表達。在一些方面，加入化合物(如IPTG)來誘導有效連接至啟動子的異戊二烯合酶、DXS、IDI、DXP途徑核酸或MVA途徑核酸的表達。示例性的導戊二烯合酶多肽和核酸在一些方面，大腸桿菌細胞包含編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸。在一些方面，異戍二烯合酶多肽或核酸來自豆科(Fabaceae),例如蝶形花亞科(Faboideae)。在一些方面，異戊二烯合酶多肽或核酸是來自以下植物的多肽或核酸山葛(野葛)(Sharkey等人，Plant Physiology (《植物生理學》)137 :700-712, 2005)、葛根(Pueraria Iobata)、楊樹(如銀白楊、黑楊(Populus nigra)、毛果楊(Populus trichocarpa)或銀白楊x歐洲山楊(CAC35696), Miller 等人，Planta (《植物學》)213 :483_487，2001)、白楊(如美洲山楊，Silver 等人，JBC 270(22) : 13010-1316，1995)或者英國橡樹(歐洲櫟(Quercusrobur)) (Zimmer等人，WO 98/02550)。在一些方面,異戍二烯合酶多肽或核酸是天然存在的異戊二烯合酶多肽或核酸。在一些方面，異戊二烯合酶多肽或核酸是非天然存在的異戊 二烯合酶多肽或核酸。示例性的異戊二烯合酶多肽和核酸以及測量異戊二烯合酶活性的方法在國際專利公布No. WO 2009/076676、美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公布No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公布 No. 2010/0048964、WO 2009/132220 以及美國專利公布No. 2010/0003716中有更詳細地描述。示例性的DXP途徑多肽和核酸示例性的DXP途徑多肽包括但不限于下列多肽中的任一者DXS多肽、DXR多肽、MCT多肽、CMK多肽、MCS多肽、HDS多肽、HDR多肽、IDI多肽以及具有DXP途徑多肽中的一種、兩種或更多種的活性的多肽(如，融合多肽)。具體地講，DXP途徑多肽包括具有DXP途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的DXP途徑核酸包括編碼具有DXP途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性的DXP途徑多肽和核酸包括來自本文所述的任何來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及本文所述的任何來源生物體的突變型多肽和核酸。示例性的DXS多肽包括具有DXS多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可使用標準方法(如本文所述的那些)通過測定多肽在體外、在細胞提取物內(nèi)或體內(nèi)將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力來確定多肽是否具有DXS多肽活性。示例性的DXS多肽和核酸以及測量DXS活性的方法在國際專利公布 No. TO2009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公布 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公布 No. 2010/0048964、W02009/132220 以及美國專利公布No. 2010/0003716中有更詳細地描述。具體地講，DXS多肽將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為1_脫氧-d_木酮糖-5-磷酸(DXP)。可使用標準方法通過測定多肽在體外、在細胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸的能力來確定多肽是否具有DXS多肽活性。DXR多肽將I-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸(DXP)轉(zhuǎn)化為2_C_甲基-D-赤蘚醇_4_磷酸(MEP)。可使用標準方法通過測定多肽在體外、在細胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化DXP的能力來確定多肽是否具有DXR多肽活性。
MCT多肽將2-C-甲基-D-赤蘚醇_4_磷酸(MEP)轉(zhuǎn)化為4_(胞苷_5 ' - 二磷酸)-2-甲基-D-赤蘚醇(CDP-ME)?？墒褂脴藴史椒ㄍㄟ^測定多肽在體外、在細胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化MEP的能力來確定多肽是否具有MCT多肽活性。CMK多肽將4-(胞苷-5丨-二磷酸)_2_C_甲基-D-赤蘚醇(OTP-ME)轉(zhuǎn)化為2_磷酸4-(胞苷-5' - 二磷酸)-2-C-甲基-D-赤蘚醇(⑶P-MEP)。可使用標準方法通過測定多肽在體外、在細胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化CDP-ME的能力來確定多肽是否具有CMK多肽活性。MCS多肽將2-磷酸-4-(胞苷-5' - 二磷酸)-2_C_甲基-D-赤蘚醇(CDP-MEP)轉(zhuǎn)化為2-C-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸(ME-CPP或cMEPP)?？墒褂脴藴史椒ㄍㄟ^測定多肽在體外、在細胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化CDP-MEP的能力來確定多肽是否具有MCS多肽活性。HDS多肽將2-C-甲基-D-赤蘚醇_2，4_環(huán)二磷酸(ME-CPP或cMEPP)轉(zhuǎn)化為(E) -4-羥基-3-甲基丁 -2-烯-I-基二磷酸(HMBPP或HDMAPP)?？墒褂脴藴史椒ㄍㄟ^測定 多肽在體外、在細胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化ME-CPP或cMEPP的能力來確定多肽是否具有HDS多肽活性。HDR多肽將(E) -4-羥基-3-甲基丁 _2_烯-I-基二磷酸(HMBPP或HDMAPP)轉(zhuǎn)化為異戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)?？墒褂脴藴史椒ㄍㄟ^測定多肽在體外、在細胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化HMBPP或HDMAPP的能力來確定多肽是否具有HDR多肽活性。IDI多肽將異戊烯基二磷酸轉(zhuǎn)化為二甲基烯丙基二磷酸?？墒褂脴藴史椒ㄍㄟ^測定多肽在體外、在細胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化異戊烯基二磷酸的能力來確定多肽是否具有IDI多肽活性。示例件的IDI多肽和核酸異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶多肽(異戊烯基二磷酸-δ -異構(gòu)酶或IDI)催化異戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的互變(如，將IPP轉(zhuǎn)化為DMAPP和/或?qū)MAPP轉(zhuǎn)化為IPP)。示例性的IDI多肽包括具有IDI多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽?？墒褂脴藴史椒?例如本文所述的那些)通過測定多肽在體外、在細胞提取物內(nèi)或體內(nèi)使IPP和DMAPP互變的能力來確定多肽是否具有IDI多肽活性。示例性的IDI多肽和核酸以及測量IDI活性的方法在國際專利公布No. W02009/076676、美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公布No. 2009/0203102)、W0 2010/003007、美國專利公布No. 2010/0048964,W02009/132220以及美國專利公布No. 2010/0003716中有更詳細地描述。示例件的MVA涂徑多肽和核酸示例性的MVA途徑多肽包括乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、3_羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)多肽、甲羥戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羥戊酸脫羧酶(PMDC)多肽、異戊烯基磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽，以及具有兩種或更多種MVA途徑多肽的活性的多肽(例如，融合多肽)。具體地講，MVA途徑多肽包括具有MVA途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的MVA途徑多肽和核酸以及測量IDI活性的方法在國際專利公布 No. WO 2009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公布 No. 2009/0203102)、W02010/003007、美國專利公布 No. 2010/0048964、WO 2009/132220 以及美國專利公布No. 2010/0003716中有更詳細地描述。在一些方面，細胞包含MVA上游途徑，所述MVA上游途徑包含AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶以及HMG-CoA還原酶核酸。在一些方面，細胞包含MVA下游途徑，所述MVA下游途徑包含MVK、PMK、MVD和IDI核酸。在一些方面，細胞包含整個MVA途徑，所述整個MVA途徑包含AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA還原酶、MVK, PMK、MVD和IDI核酸。在一些方面，細胞包含整個MVA途徑，所述整個MVA途徑包含AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA 還原酶、MVK、PMDC, IPK 和 IDI 核酸。本文所述的改良方法還可用于產(chǎn)生異戊二烯和副產(chǎn)物(如氫氣)。示例性的氫 化酶多肽和核酸、與產(chǎn)生發(fā)酵副產(chǎn)物有關(guān)的基因的多肽和核酸以及與氫氣再攝取相關(guān)的基因的多肽和核酸也可用于本文所述的組合物和方法。這些多肽和核酸在美國臨時專利申請No. 61/141，652、美國臨時專利申請No. 61/187，934、美國專利公布No. 2010/0196988、WO 2010/078457、國際專利公布 No. WO 2009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公布 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公布 No. 2010/0048964、WO2009/132220以及美國專利公布No. 2010/0003716中進行了描述。由可再生資源產(chǎn)生的異戊二烯組合物由可再生資源(如生物異戊二烯)產(chǎn)生的異戊二烯組合物有別于石油-異戊二烯組合物，這是因為生物異戊二烯是與其他生物副產(chǎn)物(源自生物來源和/或與伴隨生物異戊二烯一起獲得的生物過程相關(guān)的化合物)一起產(chǎn)生的，所述生物副產(chǎn)物如醇、醛、酮等在石油-異戊二烯組合物中不存在或以低得多的含量存在。所述生物副產(chǎn)物可包括但不限于乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、甲基丙烯醛、甲基乙烯酮、2-甲基-2-乙烯基環(huán)氧乙烷、順式和反式3-甲基-1，3-戊二烯、C5異戊烯醇(例如3-甲基-3- 丁烯-I-醇或3-甲基-2- 丁烯-I-醇)、2_庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、甲硫醇、乙酸甲酯、I-丙醇、二乙酰、2- 丁酮、2-甲基-3- 丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-I-丙醇、3-甲基-I- 丁醛、3-甲基-2- 丁酮、I- 丁醇、2-戊酮、3-甲基-I- 丁醇、異丁酸乙酯、3-甲基-2- 丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸異戊酯、3-甲基-3- 丁烯-I-基乙酸酯、3-甲基-2- 丁烯-I-基乙酸酯、3-己烯-I-醇、3-己烯-I-基乙酸酯、檸檬烯、香葉醇(反式_3，7-二甲基-2，6-辛二烯-I-醇)、香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-I-醇)、(E)_3，7_ 二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z) -3，7- 二甲基-1，3，6-辛三烯、2，3-環(huán)庚烯醇吡啶或線性異戊二烯聚合物(例如源自多個異戊二烯單元的聚合反應的線性異戊二烯二聚體或線性異戊二烯三聚體)。由生物異戊二烯衍生的產(chǎn)物包含生物副產(chǎn)物或由任意副產(chǎn)物衍生的化合物中的一種或多種。此外，由生物異戊二烯衍生的產(chǎn)物可包含在隨后的化學轉(zhuǎn)化中由這些副產(chǎn)物所形成的化合物。此類化合物的例子包括衍生自親二烯體Diels-Alder環(huán)加成至異戊二烯或異戊二烯的氧化的那些化合物。由可再生資源產(chǎn)生的、包含特定副產(chǎn)物或雜質(zhì)的異戊二烯組合物在美國臨時專利申請No. 61/187，959、美國專利申請No. 12/818，090、PCT/US10/039088、國際專利公布No. WO 2009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公布 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公布 No. 2010/0048964、WO 2009/132220 以及美國專利公布No. 2010/0003716中有更詳細地描述。示例性的純化方法在一些方面，本文所述的任意方法還包括回收異戊二烯的步驟。產(chǎn)生和回收異戊二烯的有效方法的另外的實例在美國臨時專利申請No. 61/187，959和No. 61/187，934、國際專利公布No. WO 2009/076676、美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公布No. 2009/0203102)、W02010/003007、美國專利公布 No. 2010/0048964、WO 2009/132220 以及美國專利公布No. 2010/0003716中進行了描述。產(chǎn)生和回收異戊二烯與副產(chǎn)物(如氫氣)的有效方法的另外的實例在美國臨時專利申請No. 61/141，652、No. 61/187，934和 No. 61/187，959、國際專利公布 No. TO2009/076676、美國專利申請 No. 12/335，071 (美國專利公布 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公布 No. 2010/0048964、W02009/132220以及美國專利公布No. 2010/0003716中進行了描述。此外，回收可通過如美國專利申請No. 12/969, 440中所述的吸收與解吸法來實現(xiàn)。其他技術(shù) 通過本文所述方法在細胞中產(chǎn)生的異戊二烯產(chǎn)量可通過將異戊二烯產(chǎn)生與細胞生長分離來增加，如在美國臨時專利申請No. 61/187，959、美國專利中請No. 12/496，573、國際專利公布No. WO 2009/076676、美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公布No.2009/0203102) ,WO2010/003007、美國專利公布 No. 2010/0048964、WO 2009/132220 以及美國專利公布No. 2010/0003716中所述。通過本文所述方法在細胞中產(chǎn)生異戊二烯的方法的安全性可通過在安全操作范圍內(nèi)產(chǎn)生異戊二烯而得到改善，如在美國臨時專利申請No. 61/187，959、美國專利申請No. 12/496，573、國際專利公布No. WO 2009/076676、美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公布No. 2009/0203102)、W0 2010/003007、美國專利公布No. 2010/0048964、WO 2009/132220 以及美國專利公布 No. 2010/0003716 中所述。可改善在高異戊二烯滴定度(如通過本文所述的產(chǎn)生異戊二烯的改良方法所獲得的那些)下的細胞生活力，如在美國臨時專利申請No. 61/187，959、國際專利公布No. WO 2009/076676、美國專利申請No. 12/335，071 (美國專利公布No. 2009/0203102)、W0 2010/003007、美國專利公布 No. 2010/0048964、WO 2009/132220 以及美國專利公布 No. 2010/0003716 中所述。產(chǎn)生和回收異戊二烯的有效方法的另外的實例在美國臨時專利申請No. 61/187，959、國際專利公布 No. WO 2009/076676、美國專利申請 No. 12/335,071 (美國專利公布 No. 2009/0203102)、WO 2010/003007、美國專利公布 No. 2010/0048964、WO 2009/132220、美國專利公布No. 2010/0003716以及美國專利申請No. 12/969，440中進行了描述。產(chǎn)生和回收異戊二烯與副產(chǎn)物(諸如氫氣)的有效方法的另外的實例在美國臨時專利申請No. 61/141，652、美國臨時專利申請No. 61/187，934、美國專利公布No. 2010/0196977 以及 WO 2010/078457 中進行了描述。通過參照以下實例能進一步理解本發(fā)明，這些實例以舉例說明的方式提供而非旨在進行限制。SM實例I :表汰釀酒酵母gil. 2KKDyI操縱子、銀白楊異戊二烯合酶、馬氏產(chǎn)甲烷球菌甲輕戍酸激酶、pCL _t'M MVA (糞腸球菌myaE矛口 mvaS)以及ybhE (prI)的大腸桿菌菌株的構(gòu)建(i)菌株 EWL201 (BL21, Cm-GIl. 2-KKDvI)的構(gòu)律大腸桿菌BL21 (Novagen牌，來自EMD生命科學有限公司(EMDBiosciences,Inc.))是受體菌株,用MCM331P1溶胞產(chǎn)物(根據(jù)Ausubel等人在Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.(《分子生物學實驗室指南》，約翰·威利父子出版公司)中所述的方法制備的溶胞產(chǎn)物)轉(zhuǎn)導。MCM331細胞含有編碼釀酒酵母甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶以及IPP異構(gòu)酶的染色體構(gòu)建體gil. 2KKDyI (即，來自釀酒酵母的gil. 2-KKDyI操縱子)。將細胞鋪展到L瓊脂和20 μ g/μ I氯霉素上，對轉(zhuǎn)導子進行選擇。將平板在30°C下溫育過夜。對轉(zhuǎn)導子的分析顯示在對照平板(用于回復的水+細胞對照平板，以及用于溶胞產(chǎn)物污染的水+Pl溶菌產(chǎn)物對照平板)上沒有菌落。挑選四種轉(zhuǎn)導子并用于接種5ml L-肉湯和20 μ g/μ I氯霉素。在30°C和200rpm 的振蕩下使培養(yǎng)物生長過夜。對I. 5mL的過夜細胞培養(yǎng)物進行離心，以獲得用于PCR分析的每個轉(zhuǎn)導子的基因組DNA制備物。將細胞沉淀顆粒用400 μ I重懸緩沖液(20mM TrisUmMEDTA、50mM NaCl,pH7. 5)重新懸浮，并添加4 μ I不含DNA酶(脫氧核糖核酸酶)的RNA酶(核糖核酸酶)(來自羅氏公司(Roche))。將管在37°C下溫育30分鐘，隨后加入4μ I 10%SDS和4μ1 10mg/ml的蛋白酶K儲備液(來自西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich))。將管在37°C下溫育I小時。將細胞裂解液轉(zhuǎn)移至2ml Phase Lock Light Gel管(來自艾本德公司(Eppendorf))中，隨后分別加入200 μ I的飽和酌· (pH 7. 9)(來自Ambion有限公司)和氯仿。將管充分混勻并微量離心5分鐘。用400 μ I氯仿進行第二次萃取，將水層轉(zhuǎn)移至新的Eppendorf管中。通過加入Iml的100%乙醇并離心5分鐘來使基因組DNA沉淀。用Iml 70%乙醇洗滌基因組DNA沉淀顆粒。移除乙醇，讓基因組DNA沉淀顆粒簡單風干。用200 μ I TE將基因組DNA沉淀顆粒重新懸浮。用Pfu Ultra II DNA聚合酶(來自Stratagene公司)和200ng/ μ I的基因組DNA作為模板，根據(jù)制造商的方案制備兩組不同的PCR反應管。對于第I組，將引物MCM130和GB Cm-Rev (表I)用于確保轉(zhuǎn)導子被成功整合進attTn7基因座。第I組的PCR參數(shù)為95°C下2分鐘(僅第一次循環(huán))、95°C下25秒、55°C下25秒、72°C下25秒(重復步驟2到4，循環(huán)28次)、72°C下I分鐘。對于第2組，將引物MVD For和MVD Rev (表I)用于確保gil. 2-KKDyI操縱子被正確地整合。第2組的PCR參數(shù)為95°C下2分鐘(僅第一次循環(huán))、95°C下25秒、55°C下25秒、72°C下10秒(重復步驟2到4，循環(huán)28次)、72°C下I分鐘。對I. 2% E-凝膠(來自英杰公司(Invitrogen Corp.))上的PCR擴增子的分析顯示全部4種轉(zhuǎn)導克隆均是正確的。挑選一個菌落并命名為菌株EWL201。(ii)菌株 EWL204(BL21, Ioopout-GI I. 2-KKDyI)的構(gòu)津用質(zhì)粒pCP20將氯霉素標記從菌株EWL201中環(huán)出(looped out),如Datsenko和Wanner (2000 年)(Datsenko 等人，Proc Natl. Acad. Sci USA (《美國國家科學院院刊》)97 6640-6645,2000)所述。用PCR產(chǎn)物對大腸桿菌K-12中的染色體基因進行一步滅活。(Datsenko等人，PNAS97 =6640-6645,2000)。使EWL201細胞在L-肉湯中生長至對數(shù)中期，然后在冰冷的無菌水中洗滌三次。將50 μ I細胞懸浮物的等分試樣與I μ I的pCP20混合，然后將細胞懸浮液混合物置于2_電擊杯(來自英杰公司)中用Gene Pulser電穿孔儀(來自伯樂有限公司(Bio-Rad Inc.))在2. 5伏特和25 μ Fd下進行電穿孔。將Iml的LB立即加至該細胞，然后轉(zhuǎn)移至帶有金屬蓋的14ml聚丙烯管(來自莎斯特公司(Sarstedt))。通過使細胞在30°C下生長I小時使其恢復。在L瓊脂和20 μ g/μ I氯霉素以及50 μ g/μ I羧芐青霉素上選擇轉(zhuǎn)化株，并在30°C下溫育過夜。次日，使單個克隆在IOml L-肉湯和50 μ g/μ I羧芐青霉素中于30°C下生長直至對數(shù)早期。然后使生長的培養(yǎng)物的溫度變?yōu)?2°C并維持2小時。進行連續(xù)稀釋，然后將細胞鋪展到LA平板上(無抗生素選擇)，并在30°C下溫育過夜。次日，挑選20個菌落并影印到L瓊脂(無抗生素)和LA與20 μ g/ μ I氯霉素平板上。然后將平板在30°C下溫育過夜。能夠在LA平板上而非LA加20 μ g/μ I氯霉素平板上生長的細胞被認為其氯霉素標記被環(huán)出(挑出一個并命名為菌株EWL204)。(iii)質(zhì)粒DEWL230 (pTrc銀白楊)的構(gòu)建將編碼銀白楊異戊二烯合酶(銀白楊HGS)的合成基因的產(chǎn)生外包給位于加利福 尼亞州門洛帕克市(Menlo Park, CA)的DNA2. O公司，因為該公司擁有大腸桿菌表達的密碼子優(yōu)化方法。合成的基因被定制克隆進質(zhì)粒pET24a (Novagen牌,來自EMD生命科學有限公司)中并以凍干形式提供(圖2、3A-B ；SEQ ID NO :1)。根據(jù)制造商的方案將pET24銀白楊HGS用作模板、使用引物MCM182和MCM192以及Herculase II融合型DNA聚合酶(Stratagene)來進行PCR反應，以擴增銀白楊異戍二烯合酶(銀白楊HGS)基因。PCR條件如下95°C下2分鐘(僅第一次循環(huán))，95°C下25秒、55°C下20秒、72°C下I分鐘，重復25次，最后在72°C下延伸3分鐘。使用QIAquick PCR純化試劑盒(來自凱杰公司(Qiagen Inc.))對銀白楊異戊二烯合酶PCR產(chǎn)物進行純化。然后將銀白楊異戊二烯合酶PCR產(chǎn)物在含有I μ I BspHI核酸內(nèi)切酶(來自紐英倫生物技術(shù)公司(New England Biolabs))與2 μ I IOXNEB緩沖液4的20 μ I反應物中進行消化。將該反應物在37°C下溫育2小時。然后使用QIAquick PCR純化試劑盒來純化已消化的PCR片段。在含有1μ I PstI核酸內(nèi)切酶(羅氏公司)與2μ I IOX緩沖液H的20 μ I反應物中進行第二次限制酶切消化。將該反應物在37°C下溫育2小時。然后使用QIAquickPCR純化試劑盒來純化已消化的PCR片段。質(zhì)粒pTrcHis2B (英杰公司)在含有Iy I NcoI核酸內(nèi)切酶(羅氏公司)、1 μ I PstI核酸內(nèi)切酶和2μ I IOX緩沖液H的20 μ I反應物中進行消化。將該反應物在37°C下溫育2小時。將消化的pTrcHis2B載體用I. 2% E-凝膠(英杰公司)進行凝膠純化，并用QIAquick凝膠提取試劑盒(凱杰公司)進行提取(圖4)。利用BspHI和NcoI位點的相容粘性末端，制備含有5 μ I銀白楊異戊二烯合酶插入物、2 μ IPTrc載體、I μ I T4DNA連接酶(紐英倫生物技術(shù)公司)、2 μ I IOX連接酶緩沖液和10 μ IddH20的20 μ I連接反應物。將連接混合物在室溫下溫育40分鐘。通過在ddH20的有蓋培養(yǎng)皿中懸浮O. 025 μ m硝化纖維膜過濾器(密理博公司(Millipore))并在室溫下將連接混合物輕輕地施加到硝化纖維膜過濾器之上30分鐘來對連接混合物進行脫鹽。使MCM446細胞(參見第II部分)在LB中生長至對數(shù)中期，然后在冰冷的無菌水中洗滌三次。將50 μ I細胞懸浮液的等分試樣與5 μ I的脫鹽pTrc銀白楊HGS連接混合物混合。將細胞懸浮液混合物置于2mm電擊杯中用Gene Pulser電穿孔儀在2. 5伏特和25 μ Fd下進行電穿孔。將Iml的LB立即加至該細胞，然后轉(zhuǎn)移至帶有金屬蓋的14ml聚丙烯管(莎斯特公司)。通過使細胞在30°C下生長2小時而使其恢復。在L瓊脂和50 μ g/ μ I羧芐青霉素以及IOmM甲羥戊酸上挑選轉(zhuǎn)化株，并在30°C下溫育。次日，挑選6個轉(zhuǎn)化株，并使其在5ml L-肉湯和50 μ g/ μ I羧節(jié)青霉素的管中于3(TC下生長過夜。使用QIAquick Spin Miniprep試劑盒(凱杰公司)對過夜的培養(yǎng)物進行質(zhì)粒制備。由于使用了 BL21細胞來使質(zhì)粒增殖，所以將用PB緩沖液5X和PE緩沖液3X洗滌離心柱的修改形式并入標準制造商的方案以便得到高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。在20 μ I反應物中用PstI消化質(zhì)粒以確保線性片段的大小正確。全部6種質(zhì)粒均為正確大小，將其運送至位于加里福利亞州伯克利市的昆塔納生物科學公司(Quintara BiosCiences (Berkeley, CA)),以用引物 MCM65、MCM66、EL1000 (表 I)進行測序。DNA測序結(jié)果顯示全部6種質(zhì)粒均是正確的。挑出一種質(zhì)粒并命名為質(zhì)粒EWL230 (圖5，圖6A-B ；SEQ ID NO :2)。iv)質(zhì)粒 dEWL244 (pTrc 銀白楊-mMVK)的構(gòu)建根據(jù)制造商的方案用MCM376作為模板(參見以下第(V)部分)、使用引物MCM165和MCM177(參見表I)以及Pfu Ultra II融合型DNA聚合酶(Stratagene公司)來進行PCR反應，以擴增馬氏甲烷八疊球菌MVK基因。PCR條件如下95°C下2分鐘(僅第一次循環(huán))，95°C下25秒、55°C下25秒、72°C下18秒，重復28個循環(huán)，最后在72°C下延伸I分鐘。用QIAquick PCR純化試劑盒(凱杰公司)純化馬氏產(chǎn)甲烷球菌MVKPCR產(chǎn)物。 然后將該馬氏產(chǎn)甲烷球菌MVK PCR產(chǎn)物在含有8 μ I PCR產(chǎn)物、2 μ IPmeI核酸內(nèi)切酶(紐英倫生物技術(shù)公司)、4 μ I 10 XNEB緩沖液4、4 μ 110 XNEB BSA以及22 μ I ddH20的40 μ I反應物中消化。將該反應物在37°C下溫育3小時。然后用QIAquick PCR純化試劑盒純化該消化的PCR片段。在含有2 μ I NsiI核酸內(nèi)切酶(羅氏公司)、4. 7 μ I IOX緩沖液H以及40 μ I PmeI消化的馬氏產(chǎn)甲烷球菌MVK片段的47 μ I反應物中進行第二次限制酶切消化。將該反應物在37°C下溫育3小時。然后將該消化的PCR片段用1.2%E-凝膠來進行凝膠純化，用QIAquick凝膠提取試劑盒進行提取。將質(zhì)粒EWL230在含有10 μ I質(zhì)粒、2μ I Pmel 核酸內(nèi)切酶、4μ I 10ΧΝΕΒ 緩沖液 4、4 μ I 10ΧΝΕΒ BSA 和 20μ1 ddH20 的 40μ1反應物中消化。將該反應物在37°C下溫育3小時。然后用QIAquick PCR純化試劑盒純化該消化的PCR片段。在含有2μ1 PstI核酸內(nèi)切酶、4. 7μ I 10 X緩沖液H以及40 μ IPmeI消化的EWL230線性片段的47 μ I反應物中進行第二次限制酶切消化。將該反應物在37°C下溫育3小時。然后將消化的PCR片段用I. 2% E-凝膠進行凝膠純化，用QIAquick凝膠提取試劑盒進行提取(圖7)。利用NsiI和PstI位點的相容粘性末端，制備含有8μ1馬氏產(chǎn)甲烷球菌MVK插入物、3 μ I EWL230質(zhì)粒、Ιμ T4DNA連接酶、2μ1 IOX連接酶緩沖液和6 μ IddH2O的20 μ I連接反應物。將連接混合物在16°C下溫育過夜。次日，通過在ddH20的有蓋培養(yǎng)皿中懸浮O. 025 μ m硝化纖維膜過濾器并在室溫下將連接混合物輕輕地施加到硝化纖維膜過濾器之上30分鐘來對連接混合物進行脫鹽。使MCM446細胞在LB中生長至對數(shù)中期，然后在冰冷的無菌水中洗滌三次。將50 μ I細胞懸浮液的等分試樣與5μ I的脫鹽pTrc P. alba-mMVK連接混合物混合。將細胞懸浮液混合物置于2_電擊杯中用GenePulser電穿孔儀在2. 5伏特和25 μ Fd下進行電穿孔。將Iml的LB立即加至該細胞，然后將細胞轉(zhuǎn)移至帶有金屬蓋的14ml聚丙烯管。通過使細胞在30°C下生長2小時而使其恢復。在LA和50 μ g/ μ I羧芐青霉素以及5mM甲羥戊酸平板上選擇轉(zhuǎn)化株，并在30°C下溫育。次日，挑選6個轉(zhuǎn)化株，并使其在5ml LB和50 μ g/ μ I羧芐青霉素的管中于30°C下生長過夜。使用QIAquick Spin Miniprep試劑盒對過夜的培養(yǎng)物進行質(zhì)粒制備。由于使用了 BL21細胞來使質(zhì)粒增殖，所以將用PB緩沖液5X和PE緩沖液3X洗滌離心柱的修改形式并入標準制造商的方案以便得到高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。在20 μ I反應物中用PstI消化質(zhì)粒以確保線性片段的大小正確。6種質(zhì)粒中的3種為正確大小，將其運送至昆塔納生物科學公司以便使用引物MCM65、MCM66、EL1000、EL1003和EL1006(表I)進行測序。DNA測序結(jié)果顯示全部3種質(zhì)粒均是正確的。挑選一種并命名為質(zhì)粒EWL244(圖8和9A-B ；SEQ ID NO 3)。v)pET200D中的來自馬氐產(chǎn)甲烷球菌古細菌下游的質(zhì)粒MCM376-MVK的構(gòu)律。使用英杰公司的Platinum HiFi PCR混合物，利用引物MCM161和MCM162 (表I)對來自馬氏產(chǎn)甲烷球菌古細菌下游途徑操縱子(圖10A-C ;SEQ ID NO 4)的MVK ORF進行PCR擴增。將45 μ L的PCR混合物與I μ L模板、I μ L引物(每種引物的濃度分別為10 μ Μ)以及2μ L水合并。對反應進行如下循環(huán)在94°C下2:00分鐘；在941下0:30分鐘、在55°C下0:30分鐘，并且在68°C下1:15分鐘，循環(huán)30次；然后在72°C下7:00分鐘，并且在4°C 下直至冷卻。根據(jù)制造商的方案將3 μ L的該PCR反應物連接至英杰公司的PET200D質(zhì)粒。將3 μ L的該連接物引入英杰公司的Τ0Ρ10細胞，并且在LA/kan50上選擇轉(zhuǎn)化株。分離來自轉(zhuǎn)化株的質(zhì)粒，并對插入物進行測序，從而得到MCM376 (圖11A-C)。vi)菌株 EWL251 (BL21 (DE3), Cm-GII. 2-KKDvI, DTrc 銀白楊-mMVK)的構(gòu)律使MCM331細胞(其含有編碼釀酒酵母甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶和IPP異構(gòu)酶的染色體構(gòu)建體gil. 2KKDyI)在LB中生長至對數(shù)中期，然后在冰冷的無菌水中洗滌三次。將50 μ I的細胞懸浮液與I μ I的質(zhì)粒EWL244混合。將細胞懸浮液混合物置于2mm電擊杯中用Gene Pulser電穿孔儀在2. 5伏特和25 μ Fd下進行電穿孔。將Iml的LB立即加至該細胞，然后將細胞轉(zhuǎn)移至帶有金屬蓋的14ml聚丙烯管。通過使細胞在30°C下生長2小時而使其恢復。在LA和50 μ g/μ I羧芐青霉素以及5mM甲羥戊酸平板上選擇轉(zhuǎn)化株，并在37°C下溫育。選擇一個菌落并命名為菌株EWL251。vii)菌株 EWL256 (BL21 (DE3), Cm-GIl. 2-KKDyI,pTrc 銀白楊-mMVK,dCL 上游 MVA)的構(gòu)建。使EWL251細胞在LB中生長至對數(shù)中期，然后在冰冷的無菌水中洗滌三次。使50 μ I的細胞懸浮液與I μ I的質(zhì)粒MCM82 (包含pCL Ptrc上游途徑(也稱為“pCL上游MVA”)，編碼糞腸球菌mvaE和mvaS)混合。如國際專利公布No. WO 2009/076676A2的實例8和美國專利申請No. 12/335, 071中所述構(gòu)建質(zhì)粒pCL Ptrc Upper Pathway (pCL Ptrc上游途徑)，所述專利均全文以引用方式并入本文中。將細胞懸浮液混合物置于2_比色皿中用Gene Pulser電穿孔儀在2. 5伏特和25 μ Fd下進行電穿孔。將Iml的LB立即加至該細胞。然后將細胞轉(zhuǎn)移至帶有金屬蓋的14ml聚丙烯管。通過使細胞在30°C下生長2小時而使其恢復。在LA和50 μ g/ μ I羧芐青霉素以及50 μ g/ μ I大觀霉素平板上選擇轉(zhuǎn)化株,并在37°C下溫育。挑選一個菌落并命名為菌株EWL256。表I :引物序列
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生異戊二烯的改良方法，所述方法包括 (a)在適于產(chǎn)生異戊二烯的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)包含異源核酸的細胞，所述異源核酸編碼異戊二烯合酶多肽，其中所述細胞(i)產(chǎn)生滴度大于40g/L的異戊二烯；或者(ii)具有大于約SOOmg/Ljgg^/h的異戍二烯平均體積產(chǎn)率； (b)移出所述培養(yǎng)物的一部分； (c)過濾所述培養(yǎng)物的所述移出部分以產(chǎn)生滲透物和滲余物； (d)將所述滲余物返回至所述培養(yǎng)物；以及 (e)產(chǎn)生異戊二烯； 其中經(jīng)歷步驟(b)、(C)和(d)的所述培養(yǎng)細胞與沒有經(jīng)歷步驟 (b)、(C)和(d)培養(yǎng)的相同細胞相比(i)產(chǎn)生更高滴度的異戊二烯； 或者(ii)具有更高的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的改良方法，其中所述過濾是通過切向流過濾。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的改良方法，其中所述細胞產(chǎn)生滴度大于約40g/L的異戊二烯。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的改良方法，其中所述細胞產(chǎn)生滴度大于約50g/L的異戊二烯。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的改良方法，其中所述細胞產(chǎn)生滴度大于約60g/L的異戊二烯。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的改良方法，其中所述細胞產(chǎn)生滴度大于約70g/L的異戊二烯。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的改良方法，其中所述細胞產(chǎn)生滴度大于約80g/L的異戊二烯。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的改良方法，其中所述細胞產(chǎn)生滴度大于約90g/L的異戊二烯。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的改良方法，其中所述細胞產(chǎn)生滴度大于約100g/L的異戊二烯。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的改良方法，其中所述細胞產(chǎn)生滴度介于約40g/L至約IOOg/L之間的異戊二烯。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的改良方法，其中所述細胞具有大于約500mg/L_a/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的改良方法，其中所述細胞具有大于約1，000mg/LM/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。
13.根據(jù)權(quán)利要求I所述的改良方法，其中所述細胞具有大于約1，500mg/LM/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。
14.根據(jù)權(quán)利要求I所述的改良方法，其中所述細胞具有大于約2，000mg/LM/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。
15.根據(jù)權(quán)利要求I所述的改良方法，其中所述細胞具有介于約500mg/L_a/h至約2，000mg/LM/h之間的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。
16.根據(jù)權(quán)利要求I所述的改良方法，所述方法還包括將所述滲透物回收進相同細胞培養(yǎng)物中或回收進另一細胞培養(yǎng)物中的步驟，其中在存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的細胞具有比不存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的相同細胞更高的異戊二烯平均單位產(chǎn)率。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的改良方法，其中所述細胞具有的異戊二烯平均單位產(chǎn)率是在不存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的相同細胞的約兩倍。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的改良方法，其中所述細胞具有的異戊二烯平均單位產(chǎn)率是在不存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的相同細胞的約三倍。
19.根據(jù)權(quán)利要求I所述的改良方法，其中連續(xù)移出所述培養(yǎng)物的所述部分。
20.根據(jù)權(quán)利要求I所述的改良方法，其中不連續(xù)地移出所述培養(yǎng)物的所述部分。
21.根據(jù)權(quán)利要求I所述的改良方法，其中所述異戊二烯合酶多肽為植物異戊二烯合酶多肽。
22.根據(jù)權(quán)利要求I或21所述的改良方法，其中所述細胞還包含編碼異戊基二磷酸異構(gòu)酶(IDI)多肽的異源核酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的改良方法，其中所述細胞還包含編碼IDI多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的改良方法，其中所述細胞還包含編碼DXS多肽的異源核酸。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的改良方法，其中所述細胞還包含編碼DXS多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。
26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的改良方法，其中所述細胞還包含一條或多條編碼IDI多肽和DXS多肽的核酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的改良方法，其中一種核酸編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的改良方法，其中一種質(zhì)粒編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。
29.根據(jù)權(quán)利要求22所述的改良方法，其中所述細胞還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的改良方法，其中所述MVA途徑多肽為甲羥戊酸激酶(MVK)多肽。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的改良方法，其中所述MVK多肽為來自甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)的多妝。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的改良方法，其中所述甲烷八疊球菌是馬氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina mazei)。
33.根據(jù)權(quán)利要求21所述的改良方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是天然存在的來自葛屬(Pueraria)的多肽。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的改良方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是天然存在的來自山葛(Pueraria montana)的多妝。
35.根據(jù)權(quán)利要求21所述的改良方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是天然存在的來自楊屬(Populus)的多肽。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的改良方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是天然存在的來自銀白楊(Populus alba)的多肽。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的改良方法，其中所述細胞還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的改良方法，其中所述MVA途徑多肽為甲羥戊酸激酶(MVK)。
39.根據(jù)權(quán)利要求37-38中任一項所述的改良方法，其中所述MVK來自甲烷八疊球菌屬。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的改良方法，其中所述MVK來自馬氏甲烷八疊球菌。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的改良方法，其中所述細胞為細菌細胞。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的改良方法，其中所述細胞為革蘭氏陽性細菌細胞。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的改良方法，其中所述細胞為芽孢桿菌屬(Bacillus)細胞。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的改良方法，其中所述細胞為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)細胞。
45.根據(jù)權(quán)利要求41所述的改良方法，其中所述細胞為革蘭氏陰性細菌細胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的改良方法,其中所述細胞為埃希氏菌屬(Escherichia)或泛菌屬(Pantoea)細胞。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的改良方法,其中所述細胞為大腸桿菌(Escherichiacoli)或朽1檬泛菌(Pantoea citrea)細胞。
48.根據(jù)權(quán)利要求40所述的改良方法，其中所述細胞為真菌細胞。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的改良方法,其中所述細胞為木霉屬(Trichoderma)細胞。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的改良方法，其中所述細胞為里氏木霉(Trichodermareesei)細胞。
51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的改良方法，其中所述細胞為酵母細胞。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的改良方法，其中所述細胞為耶氏酵母菌屬(Yairowia)細胞。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的改良方法，其中所述細胞為解脂耶氏酵母菌(YairowiaIipolytica)細胞。
54.—種產(chǎn)生異戊二烯的改良方法，所述方法包括 (a)在適于產(chǎn)生異戊二烯的培養(yǎng)條件下在裝有生長培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)包含異源核酸的細胞，所述異源核酸編碼異戊二烯合酶多肽，其中所述細胞(i)產(chǎn)生滴度大于40g/L的異戊二烯，或者(ii)具有大于約SOOmgZLsfaZh的異戊二烯平均體積產(chǎn)率； (b)將所述細胞培養(yǎng)物的一部分從所述發(fā)酵罐中移出； (c)將所述細胞培養(yǎng)物的所述移出部分轉(zhuǎn)移至過濾器； (d)過濾所述細胞培養(yǎng)物的所述移出部分以形成(i)包含廢生長培養(yǎng)基的滲透物；和( )包含細胞和其他培養(yǎng)物固形物的滲余物； (e)將所述滲余物返回所述發(fā)酵罐； (f)收集所述滲透物；以及 (g)產(chǎn)生異戊二烯； 其中經(jīng)歷步驟(b)、(c)、⑷和(e)的培養(yǎng)細胞與沒有經(jīng)歷步驟 (b)、(c)、(d)和(e)培養(yǎng)的相同細胞相比(i)產(chǎn)生更高滴度的異戊二烯，或者(ii)具有更高的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的改良方法，其中所述發(fā)酵罐和所述過濾器通過循環(huán)管路和循環(huán)泵連接。
56.根據(jù)權(quán)利要求54所述的改良方法，其中通過滲透物收集出口和滲透泵從所述過濾器收集所述滲透物，并將其儲存在滲透物收集罐中。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的改良方法，其中所述滲透物收集罐還包括排氣孔以緩解所述罐內(nèi)的壓力。
58.根據(jù)權(quán)利要求55和56中任一項所述的改良方法，其中所述循環(huán)泵和所述滲透泵是螺動栗。
59.根據(jù)權(quán)利要求55所述的改良方法，其中所述過濾器是微過濾器。
60.根據(jù)權(quán)利要求55所述的改良方法，其中所述過濾器是超濾器。
61.根據(jù)權(quán)利要求59所述的改良方法，其中所述微過濾器是切向流過濾器。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的改良方法，其中所述切向流過濾器具有介于約O.005 μ m至約100 μ m之間的過濾器孔徑。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的改良方法，其中所述切向流過濾器具有介于約O.05 μ m至約10 μ m之間的過濾器孔徑。
64.根據(jù)權(quán)利要求60所述的改良方法，其中所述超濾器是切向流過濾器。
65.根據(jù)權(quán)利要求63所述的改良方法，其中所述切向流過濾器具有大于約100，000的標稱截留分子量(NMWC)。
66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的改良方法，其中所述切向流過濾器具有大于約250，000的NMWC0
67.根據(jù)權(quán)利要求64所述的改良方法，其中所述切向流過濾器是具有500，000的標稱截留分子量(NMWC)并包括中空纖維膜的GE Healthcare XampIer 超濾濾芯。
68.根據(jù)權(quán)利要求61和64中任一項所述的改良方法，所述方法還包括以下步驟(i)用入口壓力計監(jiān)測所述過濾器的入口壓力(ΡΛη) ；(ii)用出口壓力計監(jiān)測所述過濾器的出口壓力(Pan)用滲透物壓力計監(jiān)測所述滲透物收集出口中的壓力(Pite);以及(iv)確定在整個所述過濾器上的跨膜壓力(TMP)。
69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的改良方法，所述方法還包括在整個所述過濾器上維持正TMP的步驟。
70.根據(jù)權(quán)利要求68所述的改良方法，其中所述發(fā)酵罐還包括連接至異戊二烯儲罐的異戊二烯收集出口。
71.根據(jù)權(quán)利要求68所述的改良方法，其中所述細胞產(chǎn)生滴度大于約40g/L的異戊二烯。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的改良方法，其中所述細胞產(chǎn)生滴度大于約50g/L的異戊二烯。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的改良方法，其中所述細胞產(chǎn)生滴度大于約60g/L的異戊二烯。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的改良方法，其中所述細胞產(chǎn)生滴度大于約70g/L的異戊二烯。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的改良方法，其中所述細胞產(chǎn)生滴度大于約80g/L的異戊二烯。
76.根據(jù)權(quán)利要求75所述的改良方法，其中所述細胞產(chǎn)生滴度大于約90g/L的異戊二烯。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的改良方法，其中所述細胞產(chǎn)生滴度大于約100g/L的異戊二烯。
78.根據(jù)權(quán)利要求68所述的改良方法，其中所述細胞產(chǎn)生滴度介于約40g/L至約lOOg/L之間的異戊二烯。
79.根據(jù)權(quán)利要求68所述的改良方法，其中所述細胞具有大于約500mg/L_a/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。
80.根據(jù)權(quán)利要求79所述的改良方法，其中所述細胞具有大于約1，000mg/LM/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。
81.根據(jù)權(quán)利要求80所述的改良方法，其中所述細胞具有大于約1，500mg/LM/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。
82.根據(jù)權(quán)利要求81所述的改良方法，其中所述細胞具有大于約2，000mg/LM/h的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。
83.根據(jù)權(quán)利要求68所述的改良方法，其中所述細胞具有介于約SOOmgzlstaAi至約2，000mg/LM/h之間的異戊二烯平均體積產(chǎn)率。
84.根據(jù)權(quán)利要求68所述的改良方法，所述方法還包括對所述收集的滲透物進行滅菌以及將其回收至相同發(fā)酵罐中內(nèi)或另一發(fā)酵罐內(nèi)的步驟，其中在存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的細胞具有比不存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的相同細胞更高的異戊二烯平均單位產(chǎn)率。
85.根據(jù)權(quán)利要求84所述的改良方法，其中所述細胞具有的異戊二烯平均單位產(chǎn)率是在不存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的相同細胞的約兩倍。
86.根據(jù)權(quán)利要求84所述的改良方法，其中所述細胞具有的異戊二烯平均單位產(chǎn)率是在不存在回收的滲透物的情況下培養(yǎng)的相同細胞的約三倍。
87.根據(jù)權(quán)利要求84所述的改良方法，其中所述細胞具有約10%的產(chǎn)率增長。
88.根據(jù)權(quán)利要求84所述的改良方法，其中所述細胞具有約50%的產(chǎn)率增長。
89.根據(jù)權(quán)利要求54所述的改良方法，其中連續(xù)移出所述培養(yǎng)物的所述部分。
90.根據(jù)權(quán)利要求54所述的改良方法，其中不連續(xù)地移出所述培養(yǎng)物的所述部分。
91.根據(jù)權(quán)利要求54所述的改良方法，其中所述異戊二烯合酶多肽為植物異戊二烯合酶多肽。
92.根據(jù)權(quán)利要求54或91所述的改良方法，其中所述細胞還包含編碼IDI多肽的異源核酸。
93.根據(jù)權(quán)利要求92所述的改良方法，其中所述細胞還包含編碼IDI多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。
94.根據(jù)權(quán)利要求92所述的改良方法，其中所述細胞還包含編碼DXS多肽的異源核酸。
95.根據(jù)權(quán)利要求92所述的改良方法，其中所述細胞還包含編碼DXS多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。
96.根據(jù)權(quán)利要求92所述的改良方法，其中所述細胞還包含一條或多條編碼IDI多肽和DXS多肽的核酸。
97.根據(jù)權(quán)利要求96所述的改良方法，其中一種核酸編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。
98.根據(jù)權(quán)利要求97所述的改良方法，其中一種質(zhì)粒編碼所述異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。
99.根據(jù)權(quán)利要求91所述的改良方法，其中所述細胞還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸。
100.根據(jù)權(quán)利要求99所述的改良方法，其中所述MVA途徑多肽為甲羥戊酸激酶(MVK)多肽。
101.根據(jù)權(quán)利要求100所述的改良方法，其中所述MVK多肽來自甲烷八疊球菌屬。
102.根據(jù)權(quán)利要求101所述的改良方法，其中所述MVK來自馬氏甲烷八疊球菌。
103.根據(jù)權(quán)利要求91所述的改良方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是天然存在的來自葛屬的多肽。
104.根據(jù)權(quán)利要求103所述的改良方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是天然存在的來自山葛的多
105.根據(jù)權(quán)利要求91所述的改良方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是天然存在的來自楊屬的多肽。
106.根據(jù)權(quán)利要求105所述的改良方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是天然存在的來自銀白楊的多肽。
107.根據(jù)權(quán)利要求106所述的改良方法，其中所述細胞還包含編碼MVA途徑多肽的異源核酸。
108.根據(jù)權(quán)利要求107所述的改良方法，其中所述MVA途徑多肽為甲羥戊酸激酶(MVK)多肽。
109.根據(jù)權(quán)利要求108所述的改良方法，其中所述MVK多肽來自甲烷八疊球菌屬。
110.根據(jù)權(quán)利要求109所述的改良方法，其中所述MVK多肽來自馬氏甲烷八疊球菌。
111.根據(jù)權(quán)利要求110所述的改良方法，其中所述細胞為細菌細胞。
112.根據(jù)權(quán)利要求111所述的改良方法，其中所述細胞為革蘭氏陽性細菌細胞。
113.根據(jù)權(quán)利要求112所述的改良方法，其中所述細胞為芽孢桿菌屬細胞。
114.根據(jù)權(quán)利要求113所述的改良方法，其中所述細胞為枯草芽孢桿菌細胞。
115.根據(jù)權(quán)利要求111所述的改良方法，其中所述細胞為革蘭氏陰性細菌細胞。
116.根據(jù)權(quán)利要求115所述的改良方法，其中所述細胞為埃希氏菌屬或泛菌屬細胞。
117.根據(jù)權(quán)利要求116所述的改良方法，其中所述細胞為大腸桿菌或檸檬泛菌細胞。
118.根據(jù)權(quán)利要求110所述的改良方法，其中所述細胞為真菌細胞。
119.根據(jù)權(quán)利要求118所述的改良方法，其中所述細胞為木霉屬細胞。
120.根據(jù)權(quán)利要求119所述的改良方法，其中所述細胞為里氏木霉細胞。
121.根據(jù)權(quán)利要求118所述的改良方法，其中所述細胞為酵母細胞。
122.根據(jù)權(quán)利要求121所述的改良方法，其中所述細胞為耶氏酵母菌屬細胞。
123.根據(jù)權(quán)利要求122所述的改良方法，其中所述細胞為解脂耶氏酵母菌細胞。
124.根據(jù)權(quán)利要求I或54所述的改良方法，所述方法還包括回收所述異戊二烯的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供由生物材料產(chǎn)生異戊二烯的改良方法。
文檔編號C12P5/02GK102906269SQ201080064447
公開日2013年1月30日 申請日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者A·R·卡拉布里亞, G·K·肖塔尼, R·方戈, A·T·尼爾森, K·J·桑福德 申請人:丹尼斯科美國公司, 固特異輪胎和橡膠公司