專利名稱：抗體模擬物支架的制作方法
技術領域：
本文中提供了可用于生成并篩選具有新結合特征的產(chǎn)物的蛋白質支架及其文庫。
背景技術：
雜交瘤和重組DNA技術已經(jīng)導致幾種高度成功的治療性單克隆抗體藥物的開發(fā)。單克隆抗體(單抗)占1000億美元生物制劑市場的主要部分，并且預期是接下去十年里生物制劑成長的關鍵驅動者。然而，盡管有進展和成功，作為生物制劑種類的單抗是昂貴的，并且由于其大小(150kDa)和復雜性(多聚的、糖基化的重和輕鏈)而難以制造。在功能上，單抗展現(xiàn)出較差的組織滲入，并且Fe區(qū)的存在可以導致不期望的Fe受體相互作用和補體激活。為了避開這些問題，已經(jīng)開發(fā)出更小的基于抗體和非抗體的備選形式，稱作抗體模擬物(antibody mimetics),其很容易工程化改造并生成。已經(jīng)顯示了與具有可以根據(jù)祀標適應性(indication)而化學或遺傳納入的其它效應器功能的傳統(tǒng)抗體相比,抗體模擬物展現(xiàn)出相等或卓越的結合親和力和特異性。已經(jīng)將幾種抗體模擬物支架工程化改造成以與傳統(tǒng)抗體匹配的效力和選擇性結合治療性靶物。已經(jīng)利用免疫球蛋白樣折疊，例如纖連蛋白III型、NCAM和CTLA-4來開發(fā)抗體模擬物。已經(jīng)成功驗證不含與免疫球蛋白折疊的相似性的其它模擬物支架，并且處于臨床前或臨床開發(fā)。“三指”折疊在來自毒蛇類(Elapid)(海蛇和眼鏡蛇(cobra))的蛇毒神經(jīng)毒素中第一次鑒定，并且已經(jīng)在此大的多基因超家族中鑒定出超過275種序列，它們都共享共同的結構特征。盡管其相似的結構特性，三指毒素以極度的選擇性和高效力結合多種多樣的分子靶物。例如，短和長鏈神經(jīng)毒素結合a I煙堿乙酰膽堿受體(AChR)，即一種離子通道，蕈毒堿毒素結合毒蕈堿AChR(即一種G偶聯(lián)蛋白受體(GPCR)), dendroaspin和心臟毒素A5分別革巴向整聯(lián)蛋白a IIb ￠3和a vP 3,并且I丐抑蛋白(calciseptine)和FS2毒素結合L型鈣通道。在哺乳動物中，TFPD主要作為細胞表面蛋白存在，其展現(xiàn)出多種多樣的結合特性，包括充當配體諸如尿激酶(尿激酶受體)、TGF-0、激活蛋白、和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(TGF-3受體家族)、和補體蛋白C8和C9 (⑶59)的配體。發(fā)明概述本文中提供了特異性結合祀分子的包含三指蛋白質域(three finger proteindomain)的蛋白質支架，例如抗體模擬物支架、編碼此類蛋白質的多核苷酸、及使用此類蛋白質例如以治療和/或診斷人疾病的方法。還提供了此類支架的文庫。
因而，提供了一種包含三指蛋白質域(TFPD)的多肽，其中所述TFH)具有相對于天然存在的TFPD的氨基酸序列已經(jīng)進行過修飾，使得經(jīng)修飾的TFPD結合特定的靶分子的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述經(jīng)修飾的TFPD結合的靶分子不被天然存在的TFPD結合。在一些實施方案中，修飾在所述TFPD的指I (Fl)、所述TFPD的指2 (F2)、所述TFPD的指3(F3)或兩個或更多個選自下組的指的組合中的某個位置處F1、F2、和F3。此類修飾可以是取代或插入，并且可以進一步明確工程化改造或隨機生成以覆蓋一大批可能的靶分子。在一些實施方案中，TFPD是哺乳動物TFPD。在一些實施方案中，TFPD是人TFPD。在一些實施方案中，人TFPD選自下組Ly-6/uPAR(LU)蛋白質域家族內的基因，其由⑶59、尿激酶受體(uPAR)域I、uPAR域2、uPAR域3、TFPD的TGF- ^受體家族，包括TGFR域I、TGFR 域 2、ACVRl、ACV1B、ACV1C、ACVLl、AMHR2、AVR2A、AVR2B、BMRlB, BMP1A、BMPR2,人 uPAR基因簇的成員，包括 LYPD3-1、LYPD3-2、LYPD4-1、LYPD4-2、LYPD5-1、LYPD5-2、TXlO 1-1、TX101-2、CD177-1、CD177-2、CD177-3、CD177-4 和 LU 家族中含有 TFPD 的其它人基因，包括LYPDl、LYPD2、LYPD6、LPD6B、LY6E、LY6D、LY6DL、LY66C、LY6K、LYG6E、LY65C、LY65B、LY66D、LY6H、LYNXI、PATE、PATEB、PATEDJ、PATEM、PSCA、SLURl、SLUR2、ASPX、HDBPI、SACA4、C9orf57、 和BAMBI組成。另外，在一些實施方案中，TFPD是無活性突變體。另外，提供了包含多個三指蛋白質域(TFPD)的多肽文庫，其中所述TFH)具有相對于相應的天然存在的TFPD的氨基酸序列已經(jīng)進行過修飾，使得經(jīng)修飾的TFPD結合特定的靶分子的氨基酸序列。還提供了使用三指狀蛋白質域(TFPD)作為支架以生成抗體模擬物的方法，包括將氨基酸序列插入所述TFPD的一個或多個指中。在一些實施方案中，TFPD是⑶59或uPAR域3。在一些實施方案中，插入的氨基酸序列是隨機序列。還提供了編碼本文中所公開的多肽的多核苷酸、和含有此類多核苷酸的載體和宿主細胞。附圖簡述圖I顯示了人TFPD序列的比對。自UniProt數(shù)據(jù)庫獲得53種含有人TFPD的序列，并進行比對。⑶59和uPAR域3以箭標示。圖2顯示了物種間TFH)拓撲學保守。自全世界蛋白質數(shù)據(jù)庫獲得蛇毒a、人⑶59、和人uPAR域3的結構(分別為pdb登錄號liq9、2uwr、和2fd6)。顯示了主鏈多肽鏈，并且對每種結構顯示了三個“指”或環(huán)(FI、F2、和F3)。圖3顯示了人TFPD序列多樣性圖。比對編碼細胞表面受體的可溶性蛋白質或胞外域的17種人TFPD序列，并獲得共有序列。顯示了所述序列相對于TFPD三個指的位置。如通過Wu-Kabat蛋白質變異性圖所顯示的，表示每個位置處的序列多樣性。圖4顯示了兩種TFPD，即⑶59和uPAR域3在物種間的序列比對。圖4⑷顯示了⑶59的序列比對,而圖4⑶顯示了幾種物種間uPAR D3的序列比對。SwissProt/UniProtID 表不以下生物體HUMAN,人；A0TTR,桌猴(owl monkey) ；CALSQ,滅(marmoset) ；CERAE,非洲綠猴；MACFA,食蟹稱猴(crabeating macaque) ；PAP SP,狒狒(baboon) ;P0NAB,猩猩(orangutan) ;SAISC,松鼠猴(squirrel monkey) ;PANTR,黑猩猩(chimpanzee) ;RABIT,兔；PIG，豬；RAT，大鼠;M0USE，小鼠。圖5顯示了 h⑶59RGD插入變體的設計。將來自Eristostatin的含有RGD的序列RGDU RGD2、和RGD3(分別由7、9、或11個殘基組成)工程化改造入h⑶59的每個指尖中，如顯示的。每個指內的插入點以環(huán)形殘基標示，由此用插入殘基取代環(huán)形殘基。圖6顯示了 h⑶59及其RGD環(huán)插入變體的表達和功能性分析。在用IPTG誘導3_4小時(0D600達到2左右)后，收獲攜帶加有Flag標簽的wt⑶59或其RGD環(huán)插入變體的HB2151細胞的Iml等分試樣。從這點看，從每Iml HB2151細胞提取100 周質級分。圖6A中顯示了在4-12%Bis-Tris凝膠上分離的來自大腸桿菌表達的wtCD59或CD59F2RGD1、RGD2、和RGD3變體的周質級分，其中通過HPR抗Flag單克隆抗體檢測蛋白質表達。給每道上樣3. 25 ill周質級分，其中三葉草因子UTrefoil Factor 1，TFF1)作為對照。圖6B中顯示了對⑶59 F2環(huán)插入變體的功能性分析的圖，如通過C9或GPIIb/IIIa結合測定法測量的。圖6C和6D顯示了對Fl和F3環(huán)中的h⑶59 RGD插入變體的表達(C)和功能性分析⑶。圖7顯示了 uPAR域3 (uPARD3)及其F2RGD環(huán)插入變體的表達及測試其對GPIIb/IIIa的結合能力。圖7A顯示了 HB2151周質級分中的加有Flag標簽的wt uPARD3和UPARD3F2變體的表達，如通過抗Flag抗體檢測的。圖7B顯示了用于uPARD3 F2 RGD插入 變體的GPIIb/IIIa結合測定法。使用TFFl作為陰性對照。圖8顯示了 h⑶59 F2 RGD變體對GPIIb/IIIa的競爭性結合能力。將連續(xù)稀釋的(1:5逐步稀釋)競爭物RGD肽Integri I in (整聯(lián)蛋白)和血纖蛋白原與2. 5 iUCD59/F2/RGD3周質級分一起預溫育，然后添加至經(jīng)GPIIb/IIIa包被的96孔板，接著進行與GPIIb/IIIa結合測定法相同的規(guī)程。作為陰性對照，使用2. 5 u Iwt⑶59。圖9顯示了 Western印跡分析以證明⑶59-pIII融合蛋白在曬菌體顆粒表面上的展示。將2xl09個攜帶wt⑶59或其RGD變體的噬菌體顆粒或M13K07對照噬菌體在4-12%Bis-Tris凝膠上分離。通過抗pill單克隆抗體和抗Flag抗體探查曬菌體表面上展示的CD59。

圖10顯示的圖顯示了對攜帶Wt⑶59或其RGD變體的噬菌體顆粒的功能性分析。通過C9或GPIIb/IIIa結合測定法來測量噬菌體wt⑶59或其RGD變體對C9或Ilb/IIIa的結合能力。圖11顯示了噬菌體⑶59F2RGD變體對GPIIb/IIIa的競爭性結合能力。將連續(xù)稀釋的(I: 10逐步稀釋)競爭物R⑶肽Integrilin、和血纖蛋白原及陰性對照KG與噬菌體⑶59/F2/RGD1預混合，然后添加至經(jīng)GPIIb/IIIa包被的96孔板，接著進行與GPIIb/IIIa結合測定法相同的規(guī)程。使用噬菌體wtCD59作為陰性對照。圖12描繪了在A)C9和B)GPIIb/IIIa結合測定法后的CD59/F2/RGD1噬菌粒DNA的分析。將等量的噬菌體wt⑶59和噬菌體⑶59/RGD1預混合，并與經(jīng)C9包被的或經(jīng)IIb/IIIa包被的板一起溫育。在洗去未結合的噬菌體后，用IOmM甘氨酸pH2. 8洗脫結合的噬菌體，并用IM Tris緩沖液pH8.0中和。然后，用洗脫的噬菌體感染指數(shù)生長的TGl細胞，在具有氨芐青霉素的2xYT瓊脂板上鋪板，并于30° C溫育過夜。自源自經(jīng)C9包被的或經(jīng)GPIIb/IIIa包被的噬菌體洗脫液的每孔板隨機挑出20個克隆。將噬菌粒DNA分離，并通過PstI或DraIII消化來分析。具有奇數(shù)的孔是PstI消化，而具有偶數(shù)的孔是DraIII消化。圖13描繪了顯示對⑶59/F2/7聚體文庫的序列分析的表。對來自⑶59/F2/7聚體文庫的超過90個克隆測序。此表顯示了 69個符合讀碼框的序列的7個位置之每處的每種氨基酸(20種氨基酸中)的頻率。圖14顯示了對自F27聚體隨機文庫表達的⑶59蛋白的Western分析。挑出在HB2151細胞中表達⑶59/F2/7聚體的二十二(22)個個別克隆，并用IPTG誘導。將周質級分分離，并在4-12%Bis-Tris凝膠上分離。用經(jīng)HRP綴合的抗Flag抗體檢測可溶性蛋白質。使用HB2151細胞中的wtCD59周質級分作為陽性對照(“pos”)。圖15顯示了對GPIIB/IIIa陽性⑶59F27聚體結合劑的特異性和序列分析。圖15(A)顯示了通過ELISA進一步表征來自初始淘選的6種GPIIb/IIIa陽性結合劑的特異性。用GPIIb/IIIa(特異性靶物)或間皮蛋 白(Mesothelin)(非特異性靶物)或BSA(非特異性靶物)包被Immulon 96孔板。將周質級分分離，并與經(jīng)靶物或非靶物包被的96孔板一起溫育。通過使用經(jīng)HRP綴合的抗Flag抗體檢測結合。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為ELISA信號，如以OD 405nm測量的。圖15(B)顯示了陽性結合劑的插入氨基酸序列。頂部序列是具有7聚體插入的親本序列。X代表20種氨基酸之任一種。以灰色覆蓋的區(qū)域是在7聚體的任一末端側翼的部分⑶59序列。C3-C16 :克隆名稱。圖15(C)顯示了通過針對整聯(lián)蛋白GPIIb/IIIa篩選CD59F27聚體文庫獲得的三種獨特結合劑C3(SEQ ID NO: 111)、CIO (SEQ ID NO: 112)和C16(SEQ ID NO: 113)的全長序列。圖16顯示了對GPIIB/IIIa陽性⑶59F19聚體結合劑的序列分析。顯示了陽性結合劑的氨基酸序列。頂部序列是具有9聚體插入的親本序列。X代表20種氨基酸之任一種。以灰色覆蓋的區(qū)域是在9聚體的任一末端側翼的部分CD59序列。圖17顯示了對GPIIB/IIIa陽性UPARD3 F29聚體結合劑的序列分析。顯示了陽性結合劑的氨基酸序列。頂部序列是具有9聚體插入的親本序列。X代表20種氨基酸之任一種。以灰色覆蓋的區(qū)域是在9聚體的任一末端側翼的部分UPARD3序列。發(fā)明詳述應當理解，本發(fā)明不限于所描述的具體方法、方案、細胞系、動物種或屬、構建體、和試劑，并且因而可以有所變化。還應當理解，本文中所使用的術語僅為了描述特定的實施方案，而并不意圖限制本發(fā)明的范圍，其僅會由所附權利要求書限定。為了描述并公開例如可以結合目前描述的發(fā)明使用的在出版物中描述的構建體和方法，在此通過提及而將本文中所提及的所有出版物和專利收入本文。上文及遍及整個文本討論的出版物僅以其在本申請的提交日前的公開內容提供。憑借在先發(fā)明，本文中的任何文字都不應解釋為承認發(fā)明人沒有資格早于所述公開。定義除非另有定義，本文中所使用的所有技術和科學術語與本發(fā)明所屬領域普通技術人員的通常理解具有相同的意義。雖然可以在本發(fā)明的實踐或測試中使用與本文中所描述的那些方法、裝置、和材料相似或等同的任何方法、裝置、和材料，但是現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置和材料。如本文中及所附權利要求書中所使用的，單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該/所述”包括復數(shù)提及物，除非上下文另有明確規(guī)定。如此，例如，提及“抗體”指提及一種或多種抗體，并且包括本領域技術人員已知的其等同物，等等。如本文中所使用的，術語“三指狀蛋白質域”或“三指狀域”或“TFPD”可互換使用，并且指以3個獨特的含有P -片層的環(huán)或指(在本文中稱為指I (Fl)、指2 (F2)和指3 (F3))為特征的特定蛋白質域。通常，TFPD的長度為約60-90個氨基酸，并且以三個形成大的5至6條鏈的反平行beta-片層的環(huán)或“指”為主導。一般地，四個保守的二硫鍵存在于三個環(huán)自此延伸的域基部。第五個二硫化物可以存在于一些TFPD蛋白質中，例如在一些人TFPD的第一個指的尖端。在長鏈蛇神經(jīng)毒素中，第五個二硫化物存在于第二環(huán)的尖端中。4-5個二硫鍵的網(wǎng)絡對TFPD支架賦予結構穩(wěn)定性。術語“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指任何長度的氨基酸聚合物。聚合物可以是線性的或分支的，它可以包含經(jīng)修飾的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中斷。該術語還涵蓋已經(jīng)修飾過(例如二硫鍵形成、糖基化、脂質化(Iipidation)、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，諸如與標記構件綴合)的氨基酸聚合物。如本文中所使用的，術語“氨基酸”指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括但不限于甘氨酸和D或L光學異構體兩者，及氨基酸類似物和肽模擬物。使用標準的單或三字母 代碼來指明氨基酸。特定氨基酸的單字母縮寫、其相應的氨基酸、和三字母縮寫如下A，丙氨酸(Ala) ;C，半胱氨酸(Cys) ;D，天冬氨酸(Asp) ;E，谷氨酸(Glu) ;F，苯丙氨酸(Phe) ;G，甘氨酸(Gly) ;H，組氨酸(His) ;1，異亮氨酸(lie) ;K，賴氨酸(Lys) ;L，亮氨酸(Leu) ；M,甲硫氨酸(Met) ;N，天冬酰胺(Asn) ;P，脯氨酸(Pro) ;Q，谷氨酰胺(Gln) ;R，精氨酸(Arg) ;S，絲氨酸(Ser) ;T，蘇氨酸(Thr) ;V，纈氨酸(Val) ;W，色氨酸(Trp) ;Y，酪氨酸(Tyr);和正亮氨酸(Nle)。術語“域/結構域”指一種穩(wěn)定的三維結構，而不管大小。典型結構域的三級結構在溶液中是穩(wěn)定的，并且無論此類成員是分離的還是與其它結構域共價融合的，保持相同。如本文定義的，結構域具有通過二級結構元件，諸如beta-片層、alpha螺旋、和未結構化環(huán)的空間關系形成的特定三級結構。在微生物蛋白質(microprotein)家族的結構域中，二硫橋一般是決定三級結構的主要元件。在一些情況中，結構域是可以賦予特定功能活性，諸如親合性(針對相同靶物的多個結合位點)、多特異性(不同靶物的結合位點)、半衰期(使用結構域、環(huán)肽或線性肽)的模塊，其結合血清蛋白質樣人血清清蛋白(HSA)或IgG (hlgGl、2、3或4)或紅細胞。多肽的“折疊”主要以二硫鍵的連接樣式(即1-4、2-6、3_5)限定。此樣式是一種拓撲學常數(shù)，并且在沒有諸如通過還原和氧化(氧化還原劑)解連接和再連接二硫化物的情況中一般不適合轉化成另一種樣式。一般地，具有相關序列的天然蛋白質采用相同的二硫鍵合樣式。主要的決定因素是半胱氨酸距離樣式(rap)和一些固定的非-cys殘基及金屬結合位點(若存在的話)。在少數(shù)情況中，蛋白質的折疊還受到周圍序列(即，肽原)及在一些情況中受到容許蛋白質結合二價金屬離子(即Ca++)的殘基的化學衍生化(即，ga_a-羧化)(這幫助其折疊)影響。對于大多數(shù)多肽，不需要此類折疊幫助。然而，根據(jù)大得足以給予蛋白質以相當不同的結構的環(huán)的長度和組成的差異，具有相同鍵合樣式的蛋白質仍可以包含多個折疊。蛋白質折疊的決定因素是相對于不同折疊極大改變結構的任何屬性，諸如半胱氨酸的數(shù)目和鍵合樣式、半胱氨酸的間隔、半胱氨酸間環(huán)的序列基序(尤其是固定的環(huán)殘基，其有可能是折疊需要的)，或者鈣(或其它金屬或輔因子)結合位點的位置或組成的差異。術語“支架”指用于以改編的功能和特征工程化改造新產(chǎn)物，例如蛋白質或抗體模擬物的多肽平臺。此類支架可用于構建蛋白質文庫。支架通常以序列相關蛋白家族的比對中觀察到的保守殘基限定。固定的殘基可以是折疊或結構需要的，尤其若比對蛋白質的功能不同的話。如此，在設計來自支架的蛋白質時，保留對于框架有利的特性重要的氨基酸殘基，而可以將其它殘基隨機化或突變。蛋白質支架的完整描述可以包括半胱氨酸的數(shù)目、位置或間隔和鍵合樣式，及環(huán)中的任何固定殘基的位置和身份?！半S機化”或“突變”意圖包括相對于模板序列的一個或多個氨基酸修飾?！半S機化”或“突變”意指將此類氨基酸修飾引入序列中的過程。可以經(jīng)由一般對核酸編碼序列的有意的、盲目的、或自發(fā)的序列變異來實現(xiàn)隨機化或突變，并且可以通過任何技術，例如PCR、易錯PCR、或化學DNA合成來發(fā)生。“相應的非突變蛋白質”意指除了引入的氨基酸突變外在序列上相同的蛋白質?？梢酝ㄟ^取代，即用一種氨基酸替換不同氨基酸來修飾氨基酸。也可以通過插入或刪除氨基酸殘基來修飾氨基酸。如本文中所使用的，術語“抗體模擬物”或“模擬物”意指展現(xiàn)出與抗體相似的結
合，但是是更小的備選抗體或非抗體蛋白質的蛋白質。如本文中所使用的，“非抗體蛋白質”意指不是由哺乳動物的B細胞天然或在免疫哺乳動物后生成的蛋白質。如適用于蛋白質的，“非天然存在的”意指蛋白質含有至少一個與相應的野生型或天然蛋白質不同的氨基酸?？梢允褂美缱畹妥钚『透怕?sum probability)通過實施BLAST搜索來確定非天然序列，其中比較窗是感興趣(詢問)序列的長度，并且此時使用BLAST 2. 0與Genbank的非冗余(“nr”)數(shù)據(jù)庫比較。BLAST 2. 0算法,其記載于Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410。用于實施BLAST分析的軟件經(jīng)由國立生物技術信息中心是公共可獲得的。如本文中所使用的，術語“分離的”意指與多核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段在自然界中通常關聯(lián)的組分(細胞的和其它方面的)分開。術語“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互換使用。它們指任何長度的核苷酸(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三維結構，并且可以實施任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性例子基因或基因片段的編碼或非編碼區(qū)、通過連鎖分析限定的基因座、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針、和引物。多核苷酸可以包含經(jīng)修飾的核苷酸，諸如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。若存在的話，可以在裝配聚合物之前或之后賦予對核苷酸結構的修飾。核苷酸序列可以被非核苷酸構件中斷?？梢栽诰酆虾笾T如通過與標記構件綴合來進一步修飾多核苷酸。如適用于多核苷酸的，“重組體”意指多核苷酸是生成與存在于自然界中的多核苷酸截然不同的構建體的克隆、限制和/或連接步驟及其它規(guī)程的各種組合的產(chǎn)物?！拜d體”或“質粒”指將插入的核酸分子轉移入宿主細胞中和/或在宿主細胞間轉移的核酸分子，優(yōu)選地自我復制型。該術語包括主要發(fā)揮將DNA或RNA插入細胞中的功能的載體、主要發(fā)揮復制DNA或RNA功能的復制載體、和發(fā)揮DNA或RNA轉錄和/或翻譯功能的表達載體。還包括提供超過一種上述功能的載體。“表達載體”指在導入合適的宿主細胞中時可以被轉錄并翻譯成多肽的多核苷酸。“表達系統(tǒng)”通常意味著由可以發(fā)揮功能以生成期望的表達產(chǎn)物的表達載體構成的合適的宿主細胞?！八拗骷毎卑梢允腔蛘咭呀?jīng)是主題載體的接受體的個別細胞或細胞培養(yǎng)物。宿主細胞包括單一宿主細胞的后代。后代由于天然的、偶然的、或有意的突變而可以不必與初始親本細胞完全相同的(在形態(tài)學或總DNA互補物的基因組中)。宿主細胞包括在體內用本文中所描述的載體轉染的細胞。本文中所描述的宿主細胞的例子是CHO Kl細胞。“藥物組合物”意圖包括活性劑與藥學可接受載體(惰性或活性)的組合，使組合物適合于體外、體內或離體的診斷或治療用途。如本文中所使用的，術語“藥學可接受載體”涵蓋任何標準的藥用載體，諸如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、和乳劑，諸如油/水或水/油乳劑，及各種類型的濕潤劑。組合物還可以包含穩(wěn)定劑和防腐劑。關于載體、穩(wěn)定劑和賦形劑的例子，見Martin, REMINGTON’ SPHARM. SCI.，第 15 版(Mack PubI. Co.，Easton(1975))。
三指狀蛋白質域抗體模擬物代表一類新穎的源自非傳統(tǒng)的基于抗體的蛋白質域或支架的生物制齊U。穩(wěn)健的模擬物的結構特征包括固有的總體構象穩(wěn)定性和耐受在支架內的可變環(huán)區(qū)的廣泛修飾的能力。此類特征容許生成具有新的結合特征的產(chǎn)物的大文庫。經(jīng)由用與新穎的且穩(wěn)健的模擬物的期望概況(profile) —致的特定結構和功能標準對公共蛋白質數(shù)據(jù)庫進行系統(tǒng)搜索將三指狀蛋白質域(TFPD)鑒定為新型抗體模擬物。TFPD是小的，具有約60至90個氨基酸殘基，富含二硫化物，包含約4或5個二硫鍵，并且含有三個獨特的含有￠-片層的環(huán)或“指”，如圖2中所描繪的。三指蛋白質域遍及脊椎動物存在，并且展現(xiàn)出較寬的功能多樣性，從有力的且致命的蛇毒(例如a-銀環(huán)蛇毒素)到生理學重要的細胞表面受體(例如尿激酶受體)。使用與表現(xiàn)良好的模擬物的概況匹配的搜索標準將人TFPD鑒定為潛在的模擬物支架。該標準選擇如下的蛋白質域，其是小的(長度為50-100個氨基酸)，穩(wěn)定的(可溶的，胞外的)，且人起源的。另外，尋找會適合于生成并展示文庫以篩選新型靶物，特別地整合膜蛋白，諸如GPCR和離子通道的結構。如此，具有可以在組成上有所變化并且在長度上延伸的環(huán)的蛋白質域在某些靶蛋白中找到的結合袋或深裂縫中可以有很大的價值。還已經(jīng)顯示了，源自駱駝(camelid)和鯊魚的抗體中找到的延伸的⑶R3環(huán)也展現(xiàn)出此特征。已經(jīng)顯不了存在于對來自原質團的頂膜抗原(AMAl)特異性的S魚IgNAR的可變重鏈中的延伸的CDR3環(huán)滲入蛋白質的深疏水性裂縫。TFPD含有三個環(huán)區(qū)或“指”，并且誘變研究已經(jīng)顯示了牽涉結合靶蛋白諸如乙酰膽堿受體的幾種蛇毒素的接觸殘基駐留于環(huán)內。文庫設計策略通過構建支架環(huán)區(qū)內的多樣性利用TFPD的天然結合特性。這樣做時，認為可以針對過去已經(jīng)證明難以靶向的蛋白質，諸如整合膜蛋白(例如，G蛋白偶聯(lián)受體和離子通道)開發(fā)出TFPD結合劑。鑒定為潛在的模擬物支架的TFPD包括但不限于那些在圖I中所列的。此類TFPD包括 Ly-6/uPAR(LU)蛋白質域家族內的基因，例如 CD59 (SwissProt/UniProt ID#P13987)、尿激酶受體(uPAR)域 I (Q03405)、uPAR 域 2 (Q03405)、和 uPAR 域 3 (Q03405)。TFPD 還包括轉化生長因子受體(TGFR)家族內的基因諸如TGFR域I (P36897) ,TGFR域2(P37173)、ACVRl (Q04771)、ACVlB (P36896)、ACVlC (Q8NER5)、ACVLl (P37023)、AMHR2 (Q16671)、AVR2A (P27037)、AVR2B (Q13705) ,BMRlB (P36894) ,BMRlA (000238)、和 BMPR2 (Q13873)。其它TFPD 包括人 uPAR 基因簇的成員諸如 LYPD3-1 (095274)，LYPD3-2 (095274)，LYPD4-1 (Q6UWN0)，LYPD4-2(Q6UWN0)，LYPD5-1(Q6UWN5)，LYPD5-2(Q6UWN5), TX101-1(Q9BY14)，TXl01-2(Q9BY14)，CD177-1 (Q8N6Q3)，CD177-2 (Q8N6Q3)，CD177-3 (Q8N6Q3)和 CD 177-4 (Q8N6Q3)。另外，TFPD 包括 LU 家族的人基因，諸如 LYPD I (Q8N2G4)，LYPD2 (Q6UXB3)，LYPD6 (Q86Y78)，LPD6B (Q3NI32)，LY6E(Q16553)，LY6D(Q14210)，LY6DL(Q99445)，LY66C(095867)，LY6K(Q 17RY6)，LYG6E (Q9UMP8)，LY65C(Q6SRR4)，LY65B(Q8NDX9)，LY66D(095868)，LY6H(094772)，LYNXl(Q9BZG9)，PATE (Q8WXA2)，PATEB (P0C8F I)，PATEDJ(B3GLJ2)，PATEM(Q6UY27)，PSCA(043653)，SLURl(P55000)，SLUR2(Q86SR0)，ASPX(P26436)，HDBPl(Q8IV16)，SACA4(Q8TDM5)，C9orf57(Q5W0N0)和 BAMBI(Ql3145)。另外，人TFPD的無活性突變體也可以充當潛在的模擬物支架。此類無活性的突變體作為潛在的支架是有用的，因為它們容許在仍保留總體構象穩(wěn)定性的情況中引入具有中 性功能的新結合特征。對于⑶59，已知第24位或第40位的突變生成無活性突變體。在Huang Y等，J.Biol. Chem. (2005)280:34073-79中描述，憑借對人CD59蛋白的丙氨酸掃描顯示了與表達CD59野生型的CHO細胞相比，Asp24Ala和Trp40Ala CD59突變體兩者在CHO細胞中表達時在其抑制對CHO細胞的補體裂解的能力方面幾乎是100%無活性的。另外，在Bodian DL等，J. Exp. Med. (1997) 185:507-16中，實施對人CD59的突變分析，并且對突變體表征功能活性和被活性構象特異性CD59抗體識別的能力。此分析表明CD59突變體Trp40Glu是無活性的，但是仍然正確折疊，如通過構象特異性抗體所測定的。還顯示了 hCD59突變體Asp24Arg的活性被破壞,但根據(jù)構象靈敏性CD59抗體,仍正確折疊。如此，可以使用無活性CD59突變體作為供展示、文庫生成、和篩選用的模板支架。在一些實施方案中，無活性CD59突變體個別和組合具有在位置Asp24和Trp40處的修飾。在一些實施方案中，無活性⑶59突變體可以包含修飾Asp24Ala、Asp24Arg> Trp40Ala> Trp40Glu、或其組合。此外，對于uPAR域3，已經(jīng)顯示了與uPAR 240-248對應的特異性9聚體肽阻斷整聯(lián)蛋白結合，此外在位置245處的單一氨基酸突變體uPAR Ser245Ala完全消除整聯(lián)蛋白結合和信號傳導。如此，在一些實施方案中，可以使用uPAR域3的無活性突變體作為供展示、文庫生成、和篩選用的模板支架。在一些實施方案中，uPAR域3的無活性突變體包含在位置Ser245處的修飾，且在一些實施方案中，修飾包含Ser245Ala。還涵蓋的是，可以使用來自其它物種的TFH)作為供展示、文庫生成、和篩選用的模板支架。圖4A顯示了來自HUMAN，人；A0TTR，梟猴；CALSQ，狨；CERAE，非洲綠猴；MACFA，食蟹獼猴；PAPSP，狒狒；P0NAB，猩猩；SAISC，松鼠猴；PANTR，猩猩；RABIT，兔；PIG，豬；RAT，大鼠；和MOUSE，小鼠的⑶59的比對。這些物種展現(xiàn)出保守的二硫化物，并且因此應當保留相似的三級結構。相似地，圖4B顯示了來自幾種物種的uPAR域1-3的比對，其也展現(xiàn)出保守的二硫化物。因而，本申請的一方面是包含三指蛋白質域(TFPD)的多肽，其中所述TFH)具有相對于天然存在的TFPD的氨基酸序列已經(jīng)進行過修飾，使得經(jīng)修飾的TFPD結合特定的靶分子的氨基酸序列。在一些實施方案中，修飾在所述TFPD的指I (Fl)、所述TFPD的指2 (F2)、所述TFPD的指3(F3)、或兩個或更多個指的組合中的某個位置處。在一些實施方案中，由經(jīng)修飾的TFPD結合的特定的靶分子不被天然存在的TFPD結合。在一些實施方案中，特定的靶分子包括但不限于感興趣的蛋白質、核苷酸、抗體、小分子或其它抗原。在一些實施方案中，特定的靶分子是治療性靶物。通過結合治療性靶物，經(jīng)修飾的TFro可以發(fā)揮靶蛋白的激動劑或拮抗劑的功能。如此，出于治療或診斷目的，經(jīng)修飾的TFPD潛在地用作藥用化合物?？梢酝ㄟ^用一個氨基酸殘基取代不同氨基酸殘基，例如通過突變、定向進化、或其它合適的方法來做出修飾?？梢赃x擇單一或多個特定氨基酸進行取代或者備選地可以產(chǎn)生隨機取代。在一些實施方案中，多肽包含特定的預定取代。在其它實施方案中，多肽包含任何氨基酸殘基的隨機取代。也可以通過插入氨基酸殘基的序列來做出修飾。插入可以小到I個殘基?；蛘撸?br> 插入可以是任何長度的。例如，可以將如下文實施例中所描述的7個殘基、9個殘基、和11個殘基的插入物插入F1、F2或F3中。插入也可以在沿著每個指的任何殘基間做出。此外，插入可以牽涉取代一個或多個現(xiàn)有的殘基以及添加一個或多個氨基酸殘基。例如，可以用7個氨基酸殘基取代2個氨基酸殘基，由此給出5個氨基酸殘基的凈插入。在一些實施方案中，修飾也可以通過缺失來做出。此類缺失將必須謹慎完成以阻止三維結構的劇烈變化。在一些實施方案中，可以在兩個或更多個指的組合中做出修飾。例如，可以在Fl和F2、F2和F3、Fl和F3、或FI、F2和F3中做出修飾。另外，修飾可以取代或插入或其組合。例如，可以在Fl中做出取代，并在F3中做出插入。本申請的另一方面提供了包含多個三指蛋白質域(TFPD)的多肽的文庫，其中所述TFPD具有相對于天然存在的TFPD的氨基酸序列已經(jīng)進行過修飾，使得經(jīng)修飾的TFPD結合特定的靶分子的氨基酸序列。此類文庫可以包括在單個指，例如F2中產(chǎn)生的隨機修飾，或者可以包括在多個指中產(chǎn)生的隨機修飾。還提供了編碼本文中所描述的多肽的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、和含有這些載體的宿主細胞。多特異性支架雙特異性抗體代表一種備選的抗體形式，其可以以單一分子同時靶向并接合兩種不同靶分子?？梢詫⒍鄡r抗體模擬物的概念延伸至對支架添加效應器功能。例如，已經(jīng)設計出雙特異性模擬物，其中一個域結合人血清清蛋白，由此延長模擬物的半衰期，而另一個域結合IE分子。在另一個實施方案中，也可以用牽涉腫瘤發(fā)生的配體工程化改造TFPD。例如，可以用靶向T細胞上的CD3的一個結合域和靶向癌癥特異性細胞表面抗原的另一個域來工程化改造TFPD?？笴D3域在T細胞和腫瘤細胞間創(chuàng)建免疫學突觸，最終誘導腫瘤細胞中稱為凋亡或程序性細胞死亡的自身破壞過程。在一些實施方案中，TFro支架可以進一步包含賦予效應器功能的元件。例如，效應器功能會包括特異性結合人血清清蛋白(HSA)的TFPD結合劑，其延長循環(huán)中的TFPD半衰期。在另一個例子中，TFH)可以包含效應器功能，使得它可以與聚乙二醇(PEG)分子或羥乙基淀粉01ES)分子化學偶聯(lián)以延長循環(huán)中的TFPD半衰期。在另一個例子中，將TFPD與免疫球蛋白的Fe區(qū)融合以增強Fe y受體(Fe y R)介導的效應器功能，諸如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和抗體依賴性細胞介導的吞噬(ADCP)。在另一個例子中，將腫瘤特異性TFPD與會實現(xiàn)腫瘤特異性TFPD靶向和細胞毒性的細胞殺傷性毒簇化學綴合。在本申請的另一方面，可以在單個域內生成雙特異性或多價TFPD，使得個別指或環(huán)結合不同靶物。例如，可以生成單個TFPD，使得Fl環(huán)結合特定的靶蛋白，而F2環(huán)結合不同靶蛋白。或者，可以設計TFPD多聚體，并以融合蛋白表達，其中每個TFPD單體結合不同靶物。例如，可以生成TFPD 二聚體，其中每個TFPD單體結合并阻斷腫瘤細胞上過表達的兩種不同受體的功能。在另一個例子中，可以生成具有延長的半衰期的TFH) 二聚體，其中一個TFPD單體以高親和力結合人血清清蛋白，而另一個TFPD單體結合腫瘤細胞上過表達的靶受體。TFPD多聚體的證據(jù)實際上來自哺乳動物中的幾種TFPD，其以細胞表面受體，例如尿激酶受體(uPAR)和TGF-P受體家族成員的胞外域表達。在uPAR的情況中，已經(jīng)顯示了構成uPAR的胞外區(qū)的三個TFPD具有不同結合特性，其中域I和2主要牽涉結合uPAR配體尿激酶，而域3牽涉結合整聯(lián)蛋白a 53 I。 用途本文中所描述的TFPD支架可用于生成具有新結合特征的蛋白質文庫。在一些實施方案中，TFPD支架可用于生成抗體模擬物。此類抗體模擬物可以進化成結合任何感興趣的靶抗原。這些蛋白質具有優(yōu)于天然抗體的特性，并且可以在體外快速進化。因而，可以在使用抗體的所有領域，包括在研究、治療和診斷領域中采用這些抗體模擬物替換抗體。另外，因為這些支架擁有優(yōu)于抗體的溶解度和穩(wěn)定性特性，所以也可以在會破壞或滅活抗體分子的條件下使用本文中所描述的抗體模擬物。最后，因為支架容許結合實質上任何化合物，所以這些分子提供完全新的結合蛋白質，其也在研究、診斷和治療領域中得到應用。在另一個實施方案中，可以在溶液中實施結合靶物。例如，該技術由Viti F等Methods in enzymology (2000)第 326 卷第 480-505 頁;Huang L 等 J. of Mol. Recognit.(2005) 18:327-333所描述。攜帶抗體模擬物支架的噬菌體結合溶液中的生物素化的靶物，然后通過使用經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)的Dynabeads來捕捉復合物。也可以在細胞表面上實施結合祀物。例如，一種方法已經(jīng)被描述為使用磁分選技術(Antibody phagedisplay:methods and protocols by Philippe M. O’Brien, Robert Aitken,第 18 章，第219-226頁)來選擇針對細胞表面抗原的抗體。Eisenhardt SU等(2007，Nature Protocols第2卷3063-3073)也描述了一種如下的方案，其容許選擇能夠區(qū)別細胞表面受體(靶物)的各種構象狀態(tài)的高度特異性scFv抗體。在一個具體的例子中，可以使用TFPD支架作為選擇靶物。例如，若需要結合10個殘基的環(huán)中呈現(xiàn)的特定肽序列的蛋白質，則構建單一 TFro克隆，其中其環(huán)之一已經(jīng)設置為長度10和期望的序列。將新克隆在細菌中表達并純化，然后在固體支持物上固定化。然后，容許基于合適支架的噬菌體展示文庫與支持物相互作用，然后將其清洗，并將期望的分子洗脫，并再選擇，如上文所描述的。類似地，可以使用本文中所描述的支架，例如TFPD支架來尋找與由支架(例如在TFro指中)展示的肽序列相互作用的天然蛋白質。如上文所描述的，將支架蛋白質諸如TFro蛋白固定化，并對噬菌體展示文庫針對展示環(huán)的結合劑。經(jīng)由多輪選擇富集結合劑，并通過DNA測序來鑒定?；谥Ъ艿慕Y合蛋白的定向進化可以在用于進化新的或改善的結合蛋白的任何技術中使用本文中所描述的抗體模擬物。在一個具體的例子中，將結合靶物在固體支 持物，諸如柱樹脂或微量滴定板孔上固定化，并將靶物與候選的基于支架的結合蛋白的文庫接觸。此類文庫可以由抗體模擬物克隆，諸如經(jīng)由TFPD指的序列和/或長度的隨機化自野生型TFPD支架構建的TFPD克隆組成。若想要的話，此文庫可以由在絲狀噬菌體上展示的融合蛋白文庫組成，如記載于GPSmith, Science(1985), J McCafferty 等，Nature (1990)或 HB Lowman 等，Biochemistry(1991)的。也可以在酵母[見ET Boder等，Nat. Biotech. (1997)]或哺乳動物細胞(見RR Beerli 等 Proc. Nat. Acad. Sci. USA (2008)]表面上，或使用核糖體展不[見 C Zahnd等，Nat. Methods (2007)]在體外展示文庫。在另一個例子中，文庫可以是例如通過記載于 Szostak 等，美國流水號 09/007,005 和 09/247，190; Szostak 等，W098/31700;及Roberts 和 Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997)第 94 卷，第 12297-12302 頁的技術生成的RNA-蛋白質融合物文庫?；蛘?，它可以是DNA-蛋白質文庫(例如，如記載于Lohse, DNA-Protein Fusions and Uses Thereof,美國流水號 60/110，549，美國流水號09/459，190及WO 00/32823)。將融合物文庫與固定化的靶物一起溫育，清洗支持物以除去非特異性結合劑，并在非常嚴格的條件下洗脫最緊密的結合劑，并將其進行PCR以回收序列信息或者創(chuàng)建新的結合劑文庫，其可以用于在進行或不進行序列的進一步誘變的情況中重復選擇過程?？梢詫嵤┰S多選擇輪次，直至獲得對抗原具有足夠親和力的結合劑。靶蛋白捕捉和檢測可以使用選定的TFPD支架結合劑群體來檢測和/或定量例如樣品諸如生物樣品中的分析物靶物。為了實施此類診斷測定法，將選定的針對感興趣靶物的支架結合劑在合適的支持物上固定化以形成多特征的蛋白質芯片。接著，將樣品應用于芯片，并基于固定化的結合劑的靶物特異性鑒定與結合劑聯(lián)合的樣品組分。使用此技術，可以在樣品中同時鑒定或定量一種或多種組分(例如，作為實施樣品序型分析的手段)。用于靶物檢測的方法容許測量結合的蛋白質靶物的水平，并且包括但不限于放射照相術、熒光掃描、質譜術(MS)、和表面等離振子共振(SPR)。使用磷光成像儀系統(tǒng)(Molecular Dynamics, Sunnyvale, Calif.)的自體放射照相術可以用于檢測并量化革巴蛋白，其已經(jīng)例如使用35S甲硫氨酸放射性標記。使用激光掃描儀(見下文)的熒光掃描可以用于檢測并量化經(jīng)熒光標記的靶物?；蛘撸梢允褂脽晒鈷呙鑱頇z測經(jīng)熒光標記的配體，其自身結合靶蛋白(例如，結合靶物-生物素的經(jīng)熒光標記的靶物特異性抗體或經(jīng)熒光標記的鏈霉抗生物素蛋白，如下文所描述的)?；谄浞肿恿浚梢允褂觅|譜術來檢測并鑒定結合的靶物?？梢灾苯幼孕酒砻嫱ㄟ^激光輔助實現(xiàn)對結合的靶蛋白的解吸，如下文所描述的。質量檢測也容許基于分子量測定靶修飾，包括翻譯后修飾，如磷酸化或糖基化?？梢允褂帽砻娴入x振子共振來量化結合的蛋白質祀物，其中將支架-結合劑在合適的金表面(例如，如獲自Biacore, Sweden)上固定化。
實施例
對于本領域技術人員會顯而易見的是，本文中所描述的實施例和實施方案是作為例示而不是限制性的，并且可以在偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下使用其它實施例，如權利要求書中所列的。實施例I :通過數(shù)據(jù)庫挖掘鑒定人TFPD支架在搜索公共蛋白質數(shù)據(jù)庫中采用幾種標準來鑒定可以充當用于抗體模擬物的良好支架的新型蛋白質折疊。理想地，支架是小的，長度在50和100個氨基酸之間，人起源的以使免疫原性最小化，可溶性的且胞外的以確保容易處理，并且具有已知的三維結構。另夕卜，應當具有如下的數(shù)據(jù)，其表明蛋白質域的重組形式可以在異源宿主生物體，諸如大腸桿菌或畢赤酵母中以高水平表達。另外，高度期望的是，具有顯示支架適合于修飾的誘變或蛋白質工程數(shù)據(jù)，所述修飾會包括引入新的結合特性。潛在的支架還選擇為具有結合靶物的能力，所述靶物過去用傳統(tǒng)的基于抗體的方法已經(jīng)證明是困難的，特別地整合膜蛋白，諸如GPCR和離子通道。支架的此結構和功能適 應性在表明可以將支架再工程化改造成結合多種多樣的靶物種類中是重要的。使用上文所概述的標準，自SMART(簡單模塊結構研究工具(Simple ModularArchitecture Research Tool), 5. I發(fā)布)數(shù)據(jù)庫中的752個域鑒定出88個蛋白質域。在將這些域定位至蛋白質結構分類(Structural Classification of Proteins, SCOP)數(shù)據(jù)庫并針對物種間最高度保守的序列進行Blast后，選出17種蛋白質域，并選擇三指狀蛋白質域[SM001526，Ly-6/uPA受體樣域(LU)]以進行作為模擬物支架的實驗確認。在SCOP數(shù)據(jù)庫(蛋白質結構分類)內，“蛇毒素樣”折疊[編號#57301]由在三個超家族(蛇毒毒素、dendroaspin、和細胞表面受體的胞外域)內的36種蛋白質結構組成?！吧叨舅貥印闭郫B定義為長度為60-75個氨基酸，其中兩個beta片層涵蓋三個大環(huán)或“指”。4-5個二硫化物的網(wǎng)絡對TFPD支架賦予結構穩(wěn)定性。人TFPD支架與鼠Ly-6抗原有關，并且涵蓋主要存在于細胞表面受體(例如TGF-beta受體家族、尿激酶受體uPAR)的胞外域內的至少53種已知的人蛋白質及GPI連接的蛋白質(例如⑶59、PSCA)。圖I列出了 53種已知的人TFPD序列及其來自UniProt (http://www. uniprot. org/)的登錄號?；诖罅筷P于這些蛋白質域已知的結構和功能數(shù)據(jù)，包括描述無活性突變體的誘變數(shù)據(jù)，及關于與其相應配體的復合物的結構數(shù)據(jù)，兩個人TFPD域，即CD59和人尿激酶受體中的第三個域(UPARD3)選擇為展示候選物。TFPD在物種間共享非常相似的拓撲學(圖2)。折疊以4個二硫化物的結構核心區(qū)別，自所述結構核心發(fā)出三個環(huán)或“指”。第五個二硫化物存在于人TFPD的指I中，其可以對此環(huán)的遠距離部分提供額外結構穩(wěn)定性。即使TFH)在人TFPD內共享顯著相似的拓撲學，存在著大的序列多樣性，特別地在三個指區(qū)內。圖3顯示了來自SCOP數(shù)據(jù)庫的17種人TFPD的序列多樣性圖。高度序列變異反映域的功能多樣性及TFPD支架容納高度修飾同時保留總體構象的能力。大的缺口區(qū)趨于存在于環(huán)內，指示在組成上的多樣性外，指可以耐受可變的長度。TFPD作為模擬物支架的確認牽涉三個階段。第一，通過插入來自含有RGD的蛋白質eristostatin的7、9、或11個殘基對每個指或環(huán)測試其容納尖端區(qū)內的額外序列的能力。使用人CD59，表明了每種插入變體的特定整聯(lián)蛋白結合活性，同時保留對C9補體蛋白的天然結合。另外，還對人uPAR域3的F2環(huán)顯示了特異性整聯(lián)蛋白結合。第二，表明了h⑶59野生型和插入變體可以在噬菌體上以gill融合蛋白展示，而且它們維持結合功能性。第三，在hCD59的環(huán)2的尖端內構建高度多種多樣的隨機文庫，并且用于篩選可溶性靶蛋白 GPIIb/IIIa。實施例2 :材料和方法質粒構建將所有轉基因克隆入pM197噬菌粒載體中。此載體源自pCANTAB5E (Genebank#U14321)，其中用pelB前導序列替換gill信號序列，并將FLAG-標簽在E-標簽前面插入。為了純化并檢測，使用FLAG或E-標簽。人⑶59基因編碼77個氨基酸的成熟肽。將人成熟⑶59序列(Gene bank#NM-203330)進行密碼子優(yōu)化以進行細菌表達。生成三個CD59/F2/RGD變體。將來自eristostatin中包含7至11個殘基 的RGD環(huán)的三個肽插入⑶59的指2 (F2)中，并替換殘基Gly32_Leu33 (插入位點)，見圖 5。RGD 序列是 VARGDWN(RGDI，SEQ ID NO: 89), RVARGDffND (RGD2, SEQ ID NO: 90)、和RVARGDffNDDY(RGD3, SEQ ID NO:91)。經(jīng)由 BlueHeron(Invitrogen)合成經(jīng)密碼子優(yōu)化的野生型CD59和三個CD59/F2/RGD變體。這些基因側翼有SfiI和Notl，并將它們克隆入pM197中以創(chuàng)建 PGT2042、pGT2043 和 pGT2044。將相同的原則應用于⑶59的指I和指3。將A11D12或N57E58缺失，并用三個RGD序列替換。還生成三個⑶59/F1/R⑶和三個⑶59/F3/RGD變體。為了生成⑶59/F1/RGD變體，合成三對寡聚物GER283 (5，-CGGCCATGGCTCTTCAATGCTACAACTGTCCTAACCCGACTGTGGCACGTGGTGATTGGAATTGTAAAAC CGC-3’，SEQ ID NO:92)和 GER284(5’-GGTTTTACAATTCCAATCACCACGTGCCACAGTCGGGTTAG GACAGTTGTAGCATTGAAGAGCCATGGCCGGCT-3’，SEQ ID NO :93)(對于RGDI) ;GER285(5’-CGGCCATGGCTCTTCAATGCTACAACTGTCCTAACCCGACTCGCGT GGCACGTGGTGATTGGAATGACTGTAAAACCGC-3’，SEQ ID NO: 94)和GER286(5’-GGTTTTACAGTCATTCCAATCACCA CGTGCCACGCGAGTCGGGTTAGGACAGTTGTAGCATTGAAGAGCCATG GCCGGCT-3，，SEQ ID NO: 95)(對于RGD2) ；GER287 (5，-CGGCCCTTCAATGCTACAACTGTCCTAACCCGACTCGCGTGGCACGTG GTGATTGGAATGACGACTACTGTAAAACCGC-3’，SEQ ID NO:96)and GER 288(5，-GGTTTTACAGTAGTCGTCATTCCAATCACCACGTGCCACGCGAGTCGGGTTAGGACAGTTGTAGCATTGAAGGGCCGGCT-3’，SEQ ID NO :97)(對于RGD3)。將相應的寡聚物對退火，使得雙鏈片段側翼有SfiI和SacII，然后將其克隆入pM197中以創(chuàng)建pGT2046、pGT2047和pGT2048。為了生成CD59/F3/RGD變體，還合成三對寡聚物GER289(5’-CGCGTCTCCGTGAAGTGGCACGTGGT GATTGGAATCTTAC-3’，SEQ ID NO:98)和GER290(5’-GTAAGATTCCAATCACCACGTGCCACTTCACGGAGA-3’，SEQ ID N0:99)(對于 RGD1) ;GER291(5’_CGCGTCTCCGTGAACGCGTGGCACGTGGTGATTGGAATGACCTTAC -3’，SEQ ID NO:100)和 GER292(5’_GTAAGGTCATTCCAATCACCACGTGCCACGCGTTCACGGAGA-3’，SEQ ID NO: 101)(對于RGD2) ；GER293(5’-CGCGTCTCCGTGAACGCGTGGCACGTGGTGATTGGAATGACGACTA CCTTAC-3’，SEQ ID NO:102)和GER294(5’-GTAAGGTAGTCGTCATTCCAATCACCACGTGCCACGCGTTCACGGA GA-3’，SEQ ID NO:103)(對于RGD3)。將相應的寡聚物對退火，使得雙鏈片段側翼有MluI和SnaBI，然后克隆入PM197 中以創(chuàng)建 pGT2049、pGT2050 和 pGT2051。將人uPAR域3 (gene bank#X51675，含有成熟蛋白質的氨基酸192至283)進行密碼子優(yōu)化以進行細菌表達，并經(jīng)由BlueHeron(Invitrogen)合成?；騻纫碛蠸fiI和NotI,并克隆入PM197中以創(chuàng)建pGT2036。為了生成 uPAR D3/F2/RGD 變體，合成三對寡聚物GER297: (5，-CCGGTACTCACGAAGTGGCACGTGGTGATTGGAATAATCA ATCTTATATGGTCCGC-3，，SEQ ID NO:104)和 GER298:(5，-GGACCATATAAGATTGATTATTCCAATCACCACGTGCCACTT CGTGAGTA-3’ , SEQ IDNO:105)(對于 RGD1) ；GER299:(5， -CCGGTACTCACGAACGCGTGGCACGTGGTGATTGGAATGACAATCAATCTTATATGGTCCGC-3’，SEQ ID NO:106)和 GER300:(5’ -GGACCATATAAGATTGATTGTCATTCCAATCACCACGTGCC ACGCGTTCGTGAGTA-3’ , SEQ ID NO:107)(對于 RGD2) ；GER301:(5’ -CCGGTACTCACGAACGCGTGGCACGTGGTGATTGGAATGA CGACTACAATCAATCTTATATGGTCCGC -3’，SEQ ID NO:108)和 GER302: (5，-GGACCATATAAGATTGATTGTAGTCGTCATTCCAATCACCACGTGCCACGCGTTCGTGAGTA-3’，SEQ ID NO: 109)(對于 RGD3)。將相應的寡聚物對退火，使得雙鏈片段側翼有AgeI和SacII，然后克隆入pM197中以創(chuàng)建 pGT2053、pGT2054、和 pGT2055。細囷表達和周質提取將單細菌克隆(來自HB2151細胞)在2ml具有100iig/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于37° C溫育過夜。將預培養(yǎng)物在具有100 u g/ml氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中以1:100稀釋，并于30° C搖動以給出OD6tltl=O. 5。然后，通過添加IPTG (終濃度ImM)來誘導細胞，并于30° C再培養(yǎng)3至4小時，之后收獲以進行周質級分提取。使用PeriPr印s周質體提取(periplasting)試劑盒(Epicentre Biotechnologies, Wisconsin)依照制造商的指令來實施周質提取規(guī)程。Western印跡將細菌裂解物或重組噬菌體上樣，并在4-12%Bis-Tris凝膠(Invitrogen, Carlsbad, CA)上分離。經(jīng)由 iBlot (Invitrogen, Carlsbad, CA)將凝膠印跡到硝酸纖維素膜上，并立即在0.5%乳PBS中封閉。然后，使用iSNAP裝置(Bio-Rad, Hercules, CA)來將膜與經(jīng) HPR 綴合的抗 Flag 抗體(Sigma, St.Louis, MO,在 0.05%PBST 中 1:3000) — 起溫育 10 分鐘。使用 ECL Plus (AmershamBiosciences, Pittsburgh, PA)來檢測條帶。C9結合測定法用碳酸氫鹽緩沖液中的每孔50ng/50iil C9蛋白(來自Quidel，CA)于4° C將Immulon 4HBX板包被過夜。用PBS中的200 U I/孔3%BSA在搖動的情況中將板封閉I小時。將周質樣品或噬菌體在期望百分比的PBS內制備為50iU/孔，并于RT溫育2小時。然后，使用平板清洗儀(Bio-Tek)用0. 05%PBST(PBS緩沖液中的0. 05%Tween 20)清洗緩沖液將平板清洗4次。在用PBST (0. 05%Tween20)清洗四次后，將50 U I/孔經(jīng)HRP偶聯(lián)的抗E-標簽抗體(GE，1:5000稀釋)或抗Ml3抗體(NEB，1:2500稀釋)于RT溫育I小時。在添加IOOu I/孔ABTS (Sigma)后測量405nm的吸光度。GPIIb/IIIa結合和競爭測定法將Immulon IB 板用包被緩沖液(20mM Tris, pH 7. 5,150mM NaCl，各 ImM CaCl2,MgCl2、MnCl2)中的每孔 200ng/100 u I GPIIb/IIIa 蛋白(Innovative research Inc,)于4° C包被過夜。將板用包含結合緩沖液(50mM Tris pH 7. 5, IOOmM NaCl，各ImM CaCl2,MgCl2^MnCl2)中的3%BSA的200 yl/孔封閉緩沖液在搖動的情況中封閉I小時。對于直接的結合測定法，在期望百分比的結合緩沖液內制備周質樣品或噬菌體(50iU/孔)，并于RT溫育2小時。在競爭測定法的情況中，將連續(xù)稀釋的(I: 10逐步稀釋)競爭物RGD肽BHRF1、BHRFl-KG(與KG(因子VIII)連接的BHRF1)和血纖蛋白原、陰性對照KG與周質級分或噬菌體混合，然后添加至經(jīng)GPIIb/IIIa包被的96孔板上，接著室溫溫育2小時。然后，使用洗板儀(Bio-Tek)用BB將板清洗4次。在用結合緩沖液清洗四次后，將50 U I/孔經(jīng)HRP-綴合的抗E-標簽抗體(GE，1:5000稀釋)或抗M 13抗體(NEB，1:2500稀釋)于RT溫育I小時。在添加IOOu I/孔ABTS (Sigma)后測量405nm的吸光度。文庫構建和克隆通過修飾⑶59的F2域來生成隨機文庫。將殘基Gly32和Leu33缺失，并用7個氨基酸殘基插入物替換，其中使用基于三亞磷酰胺(triphosphoroamidite)的合成用所有20種可能的氨基酸隨機化每個位置，如此消除移碼、終止密碼子和自文庫過度呈現(xiàn)一些氨基酸。
自Gene-Link Inc. (Hawthorne, NY)合成含有直接鏈引物的文庫5’ -TCGATGCATGCTTAATTACTAAAGCCXXXXXXXCAGGTGTACAATAA ATGT-3’ , SEQ ID NO: 110 ;及互補鏈5’ -GTTCCAGCGGATCCGGATAC-3’ , SEQ ID NO:111。將文庫片段合成，并用pM197作為模板通過PCR(PCR superMix HiFi, Invitrogen)擴增。然后，將此PCR產(chǎn)物用Sphl/Notl雙重消化，并克隆入經(jīng)Sphl/Notl消化的pM197噬菌粒載體中。依照Engberg等及制造提示將所得的連接反應電穿孔入電感受態(tài)大腸桿菌TGl細胞(Lucigen, Wisconsin)中，產(chǎn)生文庫大小為6. 2xl08。將文庫作為甘油儲液忙存，拯救，并用于依照標準的方案進行噬菌體生成。文庫表征將總共96個克隆隨機挑出，并測序以確認插入物大小、移碼和7個氨基酸的區(qū)域的每個位置的多樣性。通過Western印跡來評估⑶59-pIII融合蛋白在噬菌體表面上的展示。使用抗PlII小鼠單抗(NEB，I 1000稀釋)和經(jīng)HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG (JacksonLab, 1:6000)作為檢測試劑。微量滴定板上的文庫淘選實施針對GPIIb/IIIa的淘選。用100 iil/孔GPIIb/IIIa蛋白(在包被緩沖液中的5 iig/ml，見GPIIb/IIIa結合測定方法)于4° C將Immulon IB板包被過夜，接著用BB緩沖液進行兩次短暫洗滌，并用封閉緩沖液(具有3%BSA的BB緩沖液)于室溫(RT)封閉2小時。在用BB緩沖液洗滌后，每孔添加封閉緩沖液中的IO11個噬菌體顆粒，并于RT溫育2小時。通過用BBT (0. l%Tween 20) 5次并用BB5次來洗去未結合的噬菌體。用每孔IOOyl0. IM甘氨酸洗脫緩沖液洗脫結合的噬菌體，然后用IOiU IM Tris中和。然后，使用洗脫的噬菌體來感染指數(shù)生長的TGl細胞。對于Hyperphage衍生的文庫，實施三輪微量滴定板淘選和一輪溶液淘選。實施針對GPIIb/IIIa的噬菌體ELISA以篩選陽性克隆。溶液中的文庫淘選使用EZ-Iink NHS-生物素(Pierce, Rockford IL)依照制造商的用法說明書來將GPIIb/IIIa生物素化。將生物素化的GPIIb/IIIa (第I輪淘選50nM ;第2輪20nM及第3輪5nM)與預封閉的7xlOncfu (第I輪淘選，IxlO11Cfu噬菌體(對于第2和第3))噬菌體⑶59/F2/7聚體文庫在旋轉儀上于室溫溫育I小時。通過于室溫再溫育10分鐘將噬菌體-靶物混合物在預封閉的經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)的磁珠上捕獲。用磁性濃縮器實施珠與溶液的分離。然后，用BBT 0. 1%將珠清洗4次，接著用BB進行5次(對于第一輪淘選)。對于第2和第3輪淘選，提高清洗嚴格性。通過與0. IM甘氨酸緩沖液pH2. 5 一起溫育15分鐘來洗脫結合的噬菌體，然后用IM Tris中和。然后，使用洗脫的噬菌體來感染指數(shù)生長的TGl細胞。對于M13K07衍生的文庫，實施三輪溶液淘選。ELISA 篩選在3至4輪淘選后，使用洗脫的噬菌體來感染指數(shù)生長的HB2151細胞或DH10BF。將個別克隆在96孔板中的200ul具有100 u g/ml氨芐青霉素和0. 1%葡萄糖的2xYT中溫育。將板于37° C在搖動器培養(yǎng)箱中溫育3小時。然后，用ImMIPTG于30° C將細胞誘導 3-4小時。將周質級分提取，并在GPIIb/IIIa ELISA中測試。實施例3 :CD59wt和F2RGD奪體的表汰和測試為了測試人TFH)充當用于摻入新結合活性的支架的能力，將一系列源自解聯(lián)蛋白的肽eristostain (其含有整聯(lián)蛋白識別序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD))工程化改造入h⑶59的每個指中(圖5)。含有RGD的肽是可變長度(7、9、或11個氨基酸)的，并且將其摻入指尖中，如自hCD59結構測定的。將含有hCD59RGD的環(huán)插入變體在大腸桿菌中以可溶性的加有FLAG標簽的蛋白質表達，并測試CD59活性(結合補體因子C9)和在GPIIb/IIIa ELISA中測試整聯(lián)蛋白結合(圖6)。圖6A是來自表達h⑶59野生型(wt)和三種插入指2 (F2)內的hCD59R⑶變體(RGD 1、2、和3)的大腸桿菌的周質級分的提取物的SDS-PAGE凝膠免疫印跡。將野生型和變體以約13kDa的單一種類分泌入周質中。圖6B顯示了在C9和GPIIb/IIIa結合ELISA中測試hCD59wt和F2RGD變體。CD59wt和含有RGD的變體兩者以劑量依賴性方式結合C9，指示所有這些CD59種類已經(jīng)保留正確的折疊，并展現(xiàn)出天然的⑶59活性。在GPIIb/IIIa ELISA中，RGD變體以劑量依賴性方式結合整聯(lián)蛋白，而⑶59wt展現(xiàn)出可忽略的結合，如預期的。這支持如下的想法，即可以將⑶59支架工程化改造成在F2環(huán)內展現(xiàn)出新的結合活性，而保留天然的C9結合活性。已經(jīng)通過將相同的RGD環(huán)插入序列工程化改造入h⑶59的Fl和F3環(huán)區(qū)中獲得相似的結果(圖6C和6D)。另外，已經(jīng)將相同的RGD環(huán)序列克隆入uPAR域3(uPARD3)的F2環(huán)中。對大腸桿菌表達的蛋白質測試GPIIb/IIIa結合，并展現(xiàn)出相似的結合(圖7)。為了顯示⑶59RGD變體對整聯(lián)蛋白結合的特異性，實施競爭ELISA，其中將固定量的h⑶59wt或⑶59F2RGD3變體結合GPIIb/IIIa，并且與天然配體血纖蛋白原或拮抗劑Integrilin 競爭(圖8)。在每種情況中，Ilb/IIIa結合存在著劑量依賴性競爭，指示插入變體以對RGD結合位點的高特異性結合整聯(lián)蛋白。RGD環(huán)插入研究表明，⑶59支架能夠容納F1、F2、和F3環(huán)內的修飾，并且支持使用人TFPD作為模擬物支架的想法。數(shù)據(jù)表明CD59或uPAR域3支架的柔性和將新結合功能性工程化改造入F2環(huán)中的能力。實施例4 人⑶59wt和RGD變體可以在噬菌體上展示證實TFH)作為模擬物支架中的下一步驟是證明通過用于篩選文庫的展示方法，例如核糖體、細菌、酵母、或哺乳動物展示來呈現(xiàn)支架的能力。在這些方法中，使用噬菌體的細菌展示是用于構建并篩選文庫的最流行的且直接的技術。
將加有FLAG標簽的h⑶59wt和F2RGD變體克隆入噬菌粒載體中，并在經(jīng)噬菌體感染的大腸桿菌中作為與噬菌體gill蛋白的融合蛋白(CD59-gIII)表達。在過夜培養(yǎng)后自經(jīng)感染的大腸桿菌分離表達⑶59-gIII的噬菌體，并通過SDS-PAGE分析(圖9)。用抗gill抗體檢測CD59-gIII融合蛋白，其以比gill蛋白略高的分子量移動(圖9A)。預期相對于gill條帶，融合蛋白條帶的強度較低，因為⑶59-gIII蛋白以比輔助噬菌體表達的gill蛋白低的水平表達?？笷LAG抗體檢出CD59wt和三種含有RGD變體的融合蛋白的強烈條帶(圖 9B)。顯示了表達⑶59-gI 11的噬菌體在結合ELISA中結合C9及GPIIB/II Ia兩者，指示蛋白質正確折疊，并且能夠展現(xiàn)出野生型RGD結合活性兩者(圖10)。與用可溶性CD59wt和F2RGD變體蛋白的結果類似，表達CD59-gIII的噬菌體的結合是劑量依賴性的，并且在表達⑶59-gIII RGD變體的噬菌體的情況中，對GPIIb/IIIa的結合對RGD結合位點是特異性的，如通過用已知GPIIb/IIA配體自整聯(lián)蛋白的競爭替換證明的(圖11)。為了評估選擇表達特異性結合劑的噬菌體的能力，將等量的表達⑶59 wt和⑶59F2 RGDl的噬菌體混合，然后使用ELISA測定法形式，結合C9或GPIIb/IIIa。將板清洗，將結合的噬菌體洗脫，并用于感染TGl大腸桿菌。對來自每塊板的12個克隆的噬菌粒DNA分析顯示結合C9板的表達⑶59wt和⑶59 F2 RGDl的噬菌體的比率大致相等(5個wt和7個RGD克隆)(圖12A)。然而，結合GPIIb/IIIa板的噬菌體幾乎僅含有表達RGD的噬菌體(I個wt和11個RGD克隆，圖12B)。結果表明⑶59wt和RGD變體蛋白在噬菌體上以gill融合蛋白展示時保留其結合特性。實施例5 :⑶59F2文庫的構津和確認設計TFPD文庫，并通過用隨機組成的7個氨基酸的插入替換Gly32_Ala33來在h⑶59的F2環(huán)尖端內構建。設計與⑶59 F2 RGDl變體類似，其中將7個氨基酸的肽插入F2環(huán)內，只是在此情況中，用存在于每個位置處的所有可能的20種氨基酸隨機化7聚體的組成。使用三亞磷酰胺化學來合成隨機寡核苷酸以使移碼最小化，消除終止密碼子的出現(xiàn)，并且提供所有20種氨基酸(包括半胱氨酸)的相等呈現(xiàn)。F27聚體文庫的理論多樣性是
(20)7或約I. 28xl09。通過PCR來擴增隨機寡核苷酸混合物，并克隆入pM197噬菌粒載體中。自用載體DNA轉化的TGl大腸桿菌分離隨機克隆，并表征。在轉化TGl細胞后通過有限稀釋來將文庫大小測定為6. 2xl08。對69個克隆的序列分析顯示了每個位置處的氨基酸的預測隨機分布(圖13)。在轉化HB2151細胞后通過對周質提取物的Western分析來將來自表達可溶性CD59的文庫的克隆數(shù)目測定為約72%(表達蛋白質的22個克隆中的16個)(圖 14)。針對GPIIb/IIIa篩選⑶59 F2 7聚體文庫，并在三輪淘選后，對選定數(shù)目的結合劑確認特異性(圖15A)。對6個克隆測序，并且揭示了已知的整聯(lián)蛋白結合RGD基序(圖15B)。圖15C中顯示了通過針對Ilb/IIIa篩選⑶59 F2 7聚體文庫獲得的獨特結合劑的全長序列SEQ ID NO: 112-114。此數(shù)據(jù)表明⑶59 F2文庫篩選并鑒定選定靶物的有力結合劑的性能，并且確認人TFPD為抗體模擬物支架。實施例6 CD59F1文庫的構建和確認設計TFPD文庫，并通過用隨機組成的9個氨基酸的插入替換Alal2_Aspl3來在 h⑶59的Fl環(huán)尖端內構建。設計與⑶59 Fl RGD2變體類似，其中將源自eristostatin的9個氨基酸的含有RGD的序列插入Fl環(huán)內，只是在此情況中，用存在于每個位置處的所有可能的20種氨基酸隨機化9聚體的組成。F19聚體文庫的理論多樣性是(20)9或約5. 12xlOn。針對GPIIb/IIIa篩選⑶59 Fl 9聚體文庫，并且在三輪淘選后，對選定數(shù)目的結合劑確認特異性。對陽性克隆測序，并且揭示了 25種含有已知的整聯(lián)蛋白結合R⑶基序的獨特序列(圖16)。此數(shù)據(jù)表明使用hCD59 TFPD內的Fl環(huán)來生成高度多種多樣的文庫的性能和用Fl文庫篩選并鑒定選定靶物的有力結合劑的能力。實施例7 UPARD3 F2 f庫的構律和確認設計TFPD文庫，并通過用隨機組成的9個氨基酸的插入替換人UPAR的第三個域(其中UPARD3的殘基I對應于全長UPAR的殘基192)內的Pro40_Lys41來在人UPARD3的F2環(huán)尖端內構建。設計與UPARD3 F2 RGD2變體類似，其中將9個氨基酸的含有RGD的序列插入F2環(huán)內，只是在此情況中，用存在于每個位置處的所有可能的20種氨基酸隨機化9聚體的組成。F29聚體文庫的理論多樣性是(20)9或約5. 12xlOn。針對GPIIb/IIIa篩選UPARD3 F2 9聚體文庫，并且在三輪淘選后，對選定數(shù)目的結合劑確認特異性。對陽性克隆測序，并且揭不了 2種含有已知的整聯(lián)蛋白結合RGD基序的獨特序列(見克隆序列M B4和 M B7)(圖17)。此數(shù)據(jù)表明hUPARD3 F2文庫篩選并鑒定選定靶物的有力結合劑的性能，并且使用此蛋白質家族的不同成員確認TFPD作為模擬物支架的效用。通過提及而將上述說明書中所提及的所有出版物和專利收入本文。本發(fā)明所描述的方法的各種修飾和變型在不偏離本發(fā)明的范圍和精神的前提下對于本領域技術人員會是顯而易見的。雖然本發(fā)明已經(jīng)結合具體實施方案進行了描述，但是應當理解，如要求保護的發(fā)明不應過度限于此類具體實施方案。實際上，對于本領域技術人員顯而易見的用于實施本發(fā)明的上文所描述的模式的各種修飾意圖在所附權利要求書的范圍內。本領域技術人員應當認可，可以僅使用常規(guī)的實驗便能夠確認本文中所描述的本發(fā)明的具體實施方案的許多等同方案。所附權利要求書意圖涵蓋此類等同方案。
權利要求
1.一種包含三指蛋白質域(TFPD)的多肽，其中所述TFPD具有相對于天然存在的TFPD的氨基酸序列已經(jīng)進行過修飾，使得經(jīng)修飾的TFPD結合特定的靶分子的氨基酸序列。
2.權利要求I的多肽，其中所述修飾在所述TFPD的指I(Fl)中的某個位置處。
3.權利要求I的多肽，其中所述修飾在所述TFPD的指2(F2)中的某個位置處。
4.權利要求I的多肽，其中所述修飾在所述TFPD的指3(F3)中的某個位置處。
5.權利要求I的多肽，其中在兩個或更多個選自下組的指的組合中做出所述修飾F1、F2、和 F3。
6.權利要求1-5中任一項的多肽，其中所述氨基酸序列通過一個或多個取代來修飾。
7.權利要求6的多肽，其中所述取代包括隨機氨基酸殘基。
8.權利要求1-5中任一項的多肽，其中所述氨基酸序列通過插入來修飾。
9.權利要求8的多肽，其中所述插入是隨機氨基酸序列。
10.權利要求8的多肽，其中所述插入是預定的序列。
11.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述TFPD選自下組CD59、尿激酶受體(uPAR)域 I、uPAR 域 2、uPAR 域 3、TGFR 域 I、TGFR 域 2、ACVRI、ACVIB、ACVIC、ACVLI、AMHR2、AVR2A、AVR2B、EMRlB、EMRlA、EMPR2、LYPDl、LYPD2、LYPD3-1、LYPD3-2、LYPD4-1、LYPD4-2、LYPD5-1、LYPD5-2LYPD6、LPD6B、LY6E、LY6D、LY6DL、LY66C、LY6K、LYG6E、LY65C、LY65B、LY66D、LY6H、LYNXl、PATE, PATEB, PATEDJ, PATEM、PSCA, SLURl、SLUR2、ASPX, HDBPl、SACA4、C9orf57、TX101-1、TX101-2、CD177-1、CD177-2、CD177-3、CD177-4、和 BAMBL·
12.權利要求11的多肽，其中所述TFPD是⑶59。
13.權利要求12的多肽，其中所述CD59來自選自下組的物種人、桌猴、狨、非洲綠猴、食蟹獼猴、狒狒、猩猩、松鼠猴、黑猩猩、兔、豬、大鼠和小鼠。
14.權利要求12的多肽，其中所述CD59是無活性突變體。
15.權利要求14的多肽，其中所述CD59無活性突變體包含第24位或第40位的修飾。
16.權利要求11的多肽，其中所述TFPD是uPAR域3。
17.權利要求16的多肽，其中所述uPAR域3來自選自下組的物種人、桌猴、狨、非洲綠猴、食蟹獼猴、狒狒、猩猩、松鼠猴、黑猩猩、兔、豬、大鼠和小鼠。
18.權利要求16的多肽，其中所述uPAR域3是無活性突變體。
19.權利要求18的多肽，其中所述uPAR域3無活性突變體包含第245位修飾。
20.權利要求I的多肽，其中所述天然存在的TFPD不結合所述規(guī)定的靶物。
21.權利要求I的多肽，其中所述規(guī)定的靶物選自下組感興趣的蛋白質、核苷酸、抗體、小分子和抗原。
22.權利要求I的多肽，其進一步包含賦予效應器功能的元件。
23.權利要求22的多肽，其中所述元件延長循環(huán)半衰期。
24.權利要求22的多肽，其中所述元件容許化學綴合。
25.—種分離的多核苷酸,其編碼權利要求1-21中任一項的多肽。
26.一種表達載體，其包含如權利要求25中所限定的核苷酸序列。
27.—種宿主細胞，其包含如權利要求26中所限定的表達載體。
28.一種藥物組合物，其包含如權利要求I中所限定的多肽和至少一種藥學可接受載體或賦形劑。
29.—種包含多個三指蛋白質域(TFPD)的多肽文庫，其中所述TFH)具有相對于相應的天然存在的TFPD的氨基酸序列已經(jīng)進行過修飾，使得經(jīng)修飾的TFPD結合特定的靶分子的氨基酸序列。
30.權利要求29的文庫，其中隨機修飾所述氨基酸序列。
31.權利要求29的文庫，其中所述文庫包含含有不同經(jīng)修飾的TFPD的至少100種不同多肽。
32.—種多核苷酸文庫，其編碼權利要求29的多肽文庫。
33.一種包含三指蛋白質域(TFPD)的多特異性多肽，其中所述TFH)具有相對于天然存在的TFPD的氨基酸序列已經(jīng)進行過修飾，使得經(jīng)修飾的TFPD結合兩種或更多種特定的靶分子的氨基酸序列。
34.權利要求33的多特異性多肽，其中所述靶分子結合所述經(jīng)修飾的TFPD的不同指。
35.一種多特異性化合物，其包含兩個或更多個三指蛋白質域(TFPD)的融合物，其中所述TFPD具有相對于天然存在的TFPD的氨基酸序列已經(jīng)進行過修飾，使得經(jīng)修飾的TFPD結合不同靶分子的氨基酸序列。
36.使用三指狀蛋白質域(TFPD)作為支架以生成抗體模擬物的方法，包括將氨基酸序列插入所述TFPD的一個或多個指中。
37.權利要求36的方法，其中所述TFPD是⑶59。
38.權利要求36的方法，其中所述TFPD是uPAR域3。
39.權利要求36的方法，其中所述氨基酸序列是隨機序列。
40.一種包含三指蛋白質域(TFPD)的多肽，其中所述TFPD具有相對于天然存在的TFPD的氨基酸序列已經(jīng)進行過修飾，使得經(jīng)修飾的TFH)結合GPIIb/IIIa的氨基酸序列。
41.權利要求40的多肽，其中所述TFPD具有如SEQID NO: 112中所顯示的氨基酸序列。
42.權利要求40的多肽，其中所述TFPD具有如SEQID NO: 113中所顯示的氨基酸序列。
43.權利要求40的多肽，其中所述TFPD具有如SEQID NO: 114中所顯示的氨基酸序列。
全文摘要
本文中提供了特異性結合靶分子的包含三指蛋白質域的蛋白質支架，例如抗體模擬物支架、編碼此類蛋白質的多核苷酸、使用此類蛋白質的方法、及此類支架的文庫。
文檔編號C12P21/08GK102711811SQ201080060225
公開日2012年10月3日 申請日期2010年11月1日 優(yōu)先權日2009年10月30日
發(fā)明者M.賽托, R.哈金斯, 金夷, 金方 申請人:拜耳醫(yī)藥保健有限公司