專利名稱：：酸性磷脂酶的克隆、表達及應用的制作方法酸性磷脂酶的克隆、表達及應用本發(fā)明涉及編碼具有磷脂酶活性但基本上不具有脂肪酶活性的多肽的新DNA序列。本發(fā)明進一步涉及到新的具有磷脂酶活性但基本上不具有脂肪酶活性的多肽。這些多肽是具有低分子量、高熱穩(wěn)定性和耐高溫性的酸性磷脂酶。另外，這些多肽在寬的PH值范圍內有活性。而且，本發(fā)明還涉及這些磷脂酶用于還原含磷化合物的用途，例如在生產食用油中，以及這些磷脂酶用作面包改良劑、動物飼料添加劑以及紡織品原材料加工過程的添加劑等的用途。初榨的植物油(crudevegetableoil)含有的相關物質(例如游離脂肪酸、磷脂、重金屬和著色劑等)由于在儲存過程中脂質的水解和氧化修飾而會影響油的質量和保質期，并且使油的進一步加工復雜化。所以，必須在提取初榨的植物油后對其進行精煉以除去雜質。在生產高質量食用油的過程中，精煉過程包括脫膠、漂白和除臭步驟。精煉油過程的第一步是脫膠。在脫膠過程中，除去對油的口味起副作用并干擾油精制過程后續(xù)步驟的膠粘物質(主要是磷脂)。由于磷含量是脫膠程度的一個指征，所得到的脫膠油的質量可以通過確定殘留的磷含量來評估。對于精制過程的后續(xù)步驟，脫膠油中殘留的磷含量需要低于lOppm。磷脂是復雜的含磷脂質。磷脂(例如磷脂酰膽堿或卵磷脂)是由在sn-Ι和sn-2位點被脂肪酸酯化以及在sn-3位點被酯結合的磷酸基團酯化的丙三醇結構構成。例如，磷酸基團本身可以被伯醇基團等酯化。在sn-Ι和sn-2位點，天然的磷脂含有不同的脂肪酸鏈，對植物而言脂肪酸鏈主要是多不飽和酰基鏈。有兩種類型的磷脂能水合的和不能水合的。為除去磷脂，需要應用不同的方法。最簡單的方法是水脫膠。在這個過程中，能水合的磷脂可以在水的幫助下被洗掉并因此被從油中移除。依據(jù)初榨油的類型和質量，在這一過程后脫膠油仍然含有80至200ppm的磷。在酸脫膠方法中，用酸處理油。酸將不能水合的磷脂轉變成能水合的磷脂。能水合的磷脂成為油不溶性的。通過離心或過濾的方式將所形成的油不溶性的漿體從油中移除。這一過程后，油中殘余的磷含量是大約25至lOOppm。酶促脫膠提供了一種用于從食用油中緩和地去除磷脂的高效的、具有成本效益的且環(huán)保的方法。磷脂酶是切割磷脂的酶，并且依據(jù)其在磷脂上的酶切位點分為?；饷?磷脂酶Al、A2和B)和磷酸二酯酶(磷脂酶C和D)。磷脂酶Al(EC3.I.I.32)水解磷脂分子sn-Ι位點處的脂肪酸，磷脂酶A2(EC3.I.I.4)特異性地切割磷脂中的sn_2酯鍵。作為反應產物，形成溶血磷脂和游離脂肪酸。磷脂酶B(EC3.I.I.5)非特異性地在sn-Ι和sn_2位點處切割脂肪酸。磷脂酶C(EC3.1.4.10)水解丙三醇和磷酸基團之間的磷酸酯鍵形成磷酸單酯和二?；视?。磷脂酶D(EC3.I.4.4)催化末端磷酸二酯鍵的水解形成切割產物磷脂酸和膽堿。從牛和豬的胰腺以及從蜜蜂或幾種蛇類的毒素中提取磷脂酶A2是已知的。還可以從微生物(例如細菌和真菌)中提取磷脂酶，并且可以利用重組技術產生足夠的產量。在專利EPO513709中，第一次提出了有效的酶促脫膠方法。這一新的方法第一次使用磷脂酶A2切割磷脂sn-2位點處的脂肪酸。用大豆油和油菜籽油測試該方法時，磷含量為72至llOppm。反應體系中含有相對于油重量的最高達5重量％(w/w)的水，并且在40°C或60°C下，在pH值為5.O至5.5的條件下孵育最長達5小時。所產生的溶血磷脂可以通過離心的方式從油中移除。這一過程之后，脫膠油中殘留的磷含量少于5ppm。在脫膠過程中，將油與確定量的水混合。然后，使含有酶的水相與油相混合使酶產生作用。此方式中水的含量應盡可能少。使用大量的水會導致能耗和處理成本的增加。所以，在這一方面，用低含水量(2%)的酶促脫膠方法是有利的。在US2007/134777中提到，用磷脂酶Al進行的植物油的酶促脫膠是在pH值4.O和5.O之間進行。實施這一方法的最佳pH值在4.5和5.O之間。在這個pH值范圍內，所釋放的鈣和/或鎂離子可能會跟反應緩沖液中的其它化學物質(陰離子)結合以形成難溶性的鹽，所述鹽沉積在反應器的表面，并因而污染所用裝置。移除這些污潰并清理所用裝置是費力的。為減少對裝置內部的污染，反應優(yōu)選在約4的pH值下進行。但是，如果反應的pH值進一步降低的話，酶活性會降低或功能性失活。EPO904357中描述了已發(fā)現(xiàn)黑曲霉(Aspergillusniger)中的磷脂酶A能夠用于食用油的脫膠。W02008/040466描述了煙曲霉(Aspergillusfumigatus)中的一種分子量為65kDa的磷脂酶可用于在最高達65°C的溫度下含水量為5%的食用油的脫膠。EPI788080描述了蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)中的磷脂酶C用于60°C下含水量為15%(基于油計)的且持續(xù)時間為6小時的油脫膠。在這一過程后，殘留的磷含量小于5ppm。W02008/094847描述了在磷脂酶Al或A2與磷脂酶C的共同作用下油脫膠過程的反應時間可以減少至30分鐘。磷脂酶還可以在食品工業(yè)和動物飼養(yǎng)工業(yè)中有多種用途,例如用于制備生面團、用于制備烘焙產品和用于提高奶酪產量等。因此，仍然需要在技術上通用的磷脂酶。在生物技術中，磷脂酶用作磷脂提取中的生物催化劑。磷脂是極性脂質，并且由于它們的親脂性和親水性結構特征而用作乳化劑。磷脂酶應用的實例是用于生產經修飾的卵磷脂，在醬汁、蛋黃醬和色拉醬生產中用作食品乳化劑，用于生產即食粉末(例如奶粉、可可粉和咖啡粉)，在生產巧克力時用作助流劑和用作食品添加劑。在制藥和化妝品工業(yè)中，磷脂和溶血磷脂用于生產乳霜、乳液、凝膠和脂質體制劑。卵磷脂在生產清漆、顏料、磁帶、特殊用紙、皮革和紡織品時也是需要的。磷脂酶還可以在紡織工業(yè)中用于“生物精煉”以便在實施后續(xù)加工步驟(例如染色)之前清除植物纖維。磷脂酶與其它酶的混合物也可以用于此處。所述其它酶可以選自纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、蛋白酶和氧化還原酶。因此，現(xiàn)有技術中仍然需要對具有盡可能寬的且優(yōu)化的應用領域的磷脂酶。所以，本發(fā)明的目的是提供具有改善的磷脂酶活性的蛋白和多肽。具體地，所述新的磷脂酶在技術過程中不具有相關的脂肪酶活性。具體地，所述具有磷脂酶活性的蛋白能夠在一個大的pH范圍內有活性并且是高度的溫度耐受的。另外，具有磷脂酶活性蛋白的生產應是簡單的、有成本效益的和可商業(yè)化的。此夕卜，本發(fā)明還提供了適合生產具有磷脂酶活性的蛋白的表達構建體。上述目標可以通過編碼具有磷脂酶活性但基本上無脂肪酶活性的多肽的DNA序列實現(xiàn)，其特征在于，所述DNA序列選自a)含有SEQIDNO:I所示核苷酸序列的DNA序列；b)含有SEQIDNO:I所示編碼序列的DNA序列；c)編碼SEQIDNO:2所示蛋白序列的DNA序列；d)編碼具有圖7所示限制性內切酶圖譜的質粒pPL3949-Topo2.5的DNA序列，所述質粒保藏號為DSM22741；e)能夠在嚴格條件下與a)、b)、c)或d)的DNA序列之一雜交的DNA序列；f)基于遺傳密碼簡并性而與a)、b)、c)、d)或e)中DNA序列相關的DNA序列；g)a)至f)中序列的互補鏈。本發(fā)明進一步涉及一種具有磷脂酶活性但基本上無脂肪酶活性的多肽，選自a)一種由上述DNA序列的編碼部分編碼的多肽；b)—種具有SEQIDNO:2所示序列或由該序列獲得的序列的多肽，可以通過對一個或多個氨基酸的置換、插入、缺失得到；c)具有與SEQIDNO:2中第I至299個氨基酸有至少83%同一性的序列的多肽；d)由能夠在嚴格條件下與下述序列雜交的核酸序列編碼的多肽(i)SEQIDNO:I的核苷酸55至1106；(ii)SEQIDNO:I的核苷酸55至1106中含有的cDNA序列；(iii)由至少100個核苷酸組成的⑴或()的部分序列；或(iv)⑴、(ii)或(iii)的互補鏈；e)具有SEQIDNO:2的多肽的變體，其含有對一個或多個氨基酸的置換、缺失和/或插入；f)a)至e)中氨基酸序列的等位基因變體。另外，本發(fā)明涉及能夠表達本發(fā)明的具有磷脂酶活性的多肽的表達構建體或宿主。而且，本發(fā)明還涉及相應的表達質粒和載體。另外，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的多肽進行植物油脫膠的方法，以及本發(fā)明的多肽在食品
技術領域：
(特別是制備生面團、烘焙食品或乳制品)或者在動物營養(yǎng)中和在紡織品原材料加工(又稱為精煉或生物精煉)中的用途。依據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及一種具有磷脂酶活性但基本上不具有脂肪酶活性的多肽，其特征在于，其分子量范圍為28至30kDa并且優(yōu)選地約為28.6kDa，具有廣泛的最佳PH和耐高溫性，并且其可以從曲霉屬生物體中分離。本文中的耐高溫性是指在具有2%的低含水率的油脫膠方法的條件下，于60°C下6小時后，所述酶的活性仍保留在工業(yè)上可利用的程度。如果其產生的油中殘留的磷含量在技術上是可以忽略的，就說明所述酶的活性保留在工業(yè)上可利用的程度。優(yōu)選地，在酶促脫膠的油中殘留的磷含量低于IOppm,更優(yōu)選低于5ppm。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，編碼具有磷脂酶活性但基本上沒有脂肪酶活性并且具有低分子量和耐高溫性的多肽的DNA序列可以從煙曲霉屬的株系中分離。所述磷脂酶是一種來自于絲狀真菌的酸性磷脂酶，計算的分子量約為28.6kDa，其能夠水解來自卵磷脂的兩種脂肪酸中的至少一種。與現(xiàn)有技術中已知的具有磷脂酶活性的多肽相比，本發(fā)明的磷脂酶具有耐高溫性(在60°C下)，因此還可以有利地用于具有2%的低含水量(相對于油)且pH值為4.O的酶促脫膠過程中。這具有特殊的經濟效益，因為這樣可以不必在脫膠過程中先將油的溫度降低以使得能夠在進行酶促脫膠的同時酶不會失活，隨后再升高油的溫度以降低進行分離油相與水相的離心步驟時油的粘度。本發(fā)明的具有磷脂酶活性的多肽的溫度耐受性對食品技術和動物營養(yǎng)領域中和紡織過程中的其它應用也分別是有利的?，F(xiàn)有技術中已知的磷脂酶不包含在本發(fā)明的范圍內。所以，特別有利的是本發(fā)明中來自煙曲霉的磷脂酶能夠在一個3至5的大pH值范圍內具有活性或者優(yōu)選在這個范圍內顯示出廣譜活性。所以，本發(fā)明的磷脂酶不只有基本不具有脂肪酶活性這一優(yōu)勢。它們還在一個大PH范圍內具有酶活性，并因此可以在一個大pH范圍內應用。迄今為止，來自煙曲霉的具有磷脂酶活性的酶(磷脂酶A、B、C或D)已經在多篇出版物中被提及(Birchetal.,ComparisonofextracellularphospholipaseactivitiesinclinicalandenvironmentalAspergillusfumigatusisolates,2004,MedMycol42(I):81-86;Rementeriaetal.,GenesandmoleculesinvolvedinAspergillusfumigatusvirulence,2005,RevIberoamMicol22(I):1-23),但并未對其進行精確表征。按照“概念性的翻譯”(conceptualtranslation),從煙曲霉的基因組序列(Niermanetal.,GenomicsequenceofthepathogenicandallergenicfilamentousfungusAspergillusfumigatus,2005,Nature,438(7071):1151-6)中推導出幾種假定的憐脂酶(A、B、C、D)和溶血磷脂酶。因此，描述了例如一種具有241個氨基酸的假定的磷脂酶A和三個具有高分子量的溶血磷脂酶Plbl、Plb2和Plb3。另外，數(shù)據(jù)庫示出了一種小的假定的細胞外脂肪酶，其含有299個氨基酸，計算的分子量約為28.5kDa(GenBankEAL86100);以及含有409至587個氨基酸的多種脂肪酶。Shen等人(CharacterisationandexpressionofphospholipaseBfromtheopportunisticfungusAspergillusfumigatus,2004,FEMSMicrobolLett239(1):87-93)成功從煙曲霉中克隆和表征了3個磷脂酶B基因。分泌性蛋白AfPLl和AfPL3的分子量約為68kDa，其中AfPLl有633個氨基酸，AfPL3有630個氨基酸。蛋白AfPL2是一種細胞溶質蛋白，含有588個氨基酸，分子量約為63kDa。另外，還從煙曲霉RH3949中分離出一種具有633個氨基酸的磷脂酶(W02008/040466)和一種具有611個氨基酸的溶血磷脂酶(W02008/040465)。此外，從煙曲霉RH3949基因組中發(fā)現(xiàn)一個具有28至30kDa的小分子量的酸性磷脂酶(pl4.I)ο在這個“小”磷脂酶的蛋白測序過程中，N-末端前16個氨基酸與來自煙曲霉Af293含有299個氨基酸的假定細胞外脂肪酶(GenBankEAL86100)的N-末端有93%的同一性。但是，來自RH3949的“小磷脂酶”成熟序列(AA30-299)與所述假定的細胞外脂肪酶序列僅有約82%的同一性。這是特別意外的，因為已發(fā)現(xiàn)在另一個煙曲霉株系(A1163)基因組中的對應位點處的序列與來自Af293的假定脂肪酶(GenBankEDP1054)有顯著更高的同一性(Fedorovaetal.,GenomicIslandsinthePathogenicFilamentousFungusAspergillusfumigatus,2008,PloSGenet.4.el000046)。與之相比，來自煙曲霉Af293(具有241個氨基酸的磷脂酶A，GenBankEAL85761)和煙曲霉RH3949(具有pl4.I的磷脂酶)的兩個N-末端磷脂酶序列之間沒有相似性。所以，本發(fā)明的磷脂酶與已知的來自煙曲霉的磷脂酶以及與來自注釋為密切相關的煙曲霉株系(如Af293)的磷脂酶的序列不同。本發(fā)明使用的幾條寡核苷酸引物是根據(jù)假定的細胞外脂肪酶(GenBankEAL86100)的DNA序列數(shù)據(jù)(GenBankAAHFO1000011)中派生并合成的。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中的DNA序列可以用來自Af293株系的基因組序列的引物從曲霉株系RH3949中分離(參見，實施例4)。這是意想不到的，因為用于擴增的RH3949株系(環(huán)境分離株)與Af293(臨床分離株)有表型差異，并且因此極可能還有基因型(序列)差異。因此，用其它具有鄰近Af293株系基因組DNA中N2-3948和Apal_3949的結合位點的引物對從RH3949中擴增磷脂酶基因是不可能的。基因擴增是通過對煙曲霉RH3949基因組DNA的聚合酶鏈式反應(PCR)實施的。本發(fā)明磷脂酶的耐溫性和寬的最優(yōu)pH值范圍是出乎意料的，并且是基于現(xiàn)有技術中記載的磷脂酶無法想到的。因為，現(xiàn)有技術中還沒有記載或僅僅是暗示過來自絲狀真菌的天然磷脂酶具有這些性質。將本發(fā)明中SEQIDN0:2所示的磷脂酶序列與現(xiàn)有技術的磷脂酶序列進行比較。發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列與來自其他曲霉株系的已知氨基酸序列有部分的相似性，例如與來自塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)的脂肪酶(W098/45453)或來自臭曲霉(Aspergillusfoetidus)的溶血磷脂酶(EP0808903)有60%的相似性；與來自黑曲霉的磷脂酶(W003/097825、W098/31790)有59%的相似性。序列SEQIDNO:2與來自煙曲霉Af293的假定的細胞外脂肪酶序列(GenBankEAL86100)(Niermanetal.，GenomicsequenceofthepathogenicandallergenicfilamentousfungusAspergillusfumigatus,2005，Nature,438(7071):1151-6)有最高82%的同一性。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，在對食用油進行酶促脫膠的條件下，本發(fā)明的從煙曲霉RH3949中分離的磷脂酶沒有顯示出任何與此過程相關的脂肪酶活性。另外，與迄今為止已知的來自其它曲霉株系的磷脂酶相比，該酶具有明顯較寬的最優(yōu)PH值范圍和耐高溫性。因此，本發(fā)明中的酶可以非常有利地用于食用油的酶促脫膠過程，因為它不水解油中的任何三酸甘油酯鍵或其不顯著的部分。另外，本發(fā)明還涉及具有與SEQIDNO:2的序列有至少83%同一性的序列且具有磷脂酶活性但基本上不具有脂肪酶活性的多肽。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及具有與SEQIDNO:2的氨基酸I至299有至少83%同一性的序列且具有磷脂酶活性的多肽。優(yōu)選地，在相應的序列具有磷脂酶活性但基本上不具有脂肪酶活性的情況下，與SEQIDNO:2的氨基酸I至299的同一性程度為至少90%，更優(yōu)選至少95%，甚至更優(yōu)選至少97%以及尤其優(yōu)選至少98%。本發(fā)明的具有磷脂酶活性的多肽不具有任何明顯的脂肪酶活性或基本上不具有脂肪酶活性。本發(fā)明中的多肽基本不具有任何對油脫膠的工業(yè)過程不利的脂肪酶活性，即，本發(fā)明的多肽基本上不對待脫膠油中的可脂解性切割的化合物顯示出任何活性。這意味著在食用油的酶促脫膠的條件下，本發(fā)明的磷脂酶不具有任何與此過程相關的脂肪酶活性。從技術上來講，這意味著本發(fā)明中具有磷脂酶活性的多肽對作為脂肪酶底物的棕櫚酸對硝基苯酯的水解程度不明顯和/或不能檢測。對于本發(fā)明中具有磷脂酶活性的多肽，磷脂酶活性與脂肪酶活性的比例優(yōu)選>1000:1，更優(yōu)選為5000:1至10000:1，甚至更優(yōu)選為7000:1，最優(yōu)選為7500:1。序列同一性的程度優(yōu)選地是通過以下方式確定的確定較短序列中的殘基數(shù)，所述較短序列被包括比較中并在其它序列中具有“相應的”的對應部分。對于本發(fā)明來說，同一性優(yōu)選地是通過使用普通算法的常規(guī)方式確定。依據(jù)本發(fā)明，只有相應的成熟蛋白的cDNA或氨基酸用于比較。類似地，依據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地通過已知的計算程序將相同的序列對應部分確定為同源序列。這種程序的一個實例是CloneManagerSuite程序,它包括AlignPlus程序部分并且由Scientific&EducationalSoftware,Durham,NC,U.S.A發(fā)行。因此，上述的兩個DNA序列或氨基酸序列的比較是在保留默認值的情況下依據(jù)FastScan-MaxScore方法或Needleman-Wunsch方法選擇局部比對來實施的。具體地，本發(fā)明使用具有“CompareTwoSequences/LocalFastScan-MaxScore/CompareDNAsequences，，或用于氛基酸的“CompareTwoSequences/Global/ComparesequencesasAminoAcids”功能的程序版本“CloneManager7AlignPlus5”來計算同一性。應用可從下述來源獲得的算法Hirschberg,D.S.1975,Alinearspacealgorithmforcomputingmaximalcommonsubsequences.CommunAssocComputMach18:341-343；Myers,E.ff.andff.Miller,1988,Optimalalignmentsinlinearspace,CABIOS4:1,11-17；Chao,K-M,ff.R.Pearsonandff.Miller,1992,Aligningtwosequenceswithinaspecifieddiagonalband,CABIOS8:5,481-487。本發(fā)明還涉及上述具有磷脂酶活性的多肽的插入分子和/或缺失分子。因此，本發(fā)明中具有磷脂酶活性的經修飾的多肽可以通過在N-末端和/或C-末端加入另外的序列而延長，并且由此得到的氨基酸序列仍然必須具有磷脂酶活性且基本上不具有脂肪酶活性。由此產生具有更多有利性質的雜交分子。例如，懸浮蛋白或它們的天然前體形式可以被加入到大量分泌的蛋白中，這進一步增加了分泌效率。另外，可以加入其它酶的活性序列片段以產生具有多種特異性的酶。此外，可以加入極性或非極性的序列從而特異性地影響由此獲得的酶的溶解性或膜流動性。根據(jù)本發(fā)明，具有磷脂酶活性的多肽的序列片段還可以被缺失，但保留磷脂酶活性且基本上不具有脂肪酶活性。突變、延伸和縮短均可以通過本身已知的方式實施，并借助于現(xiàn)有技術中公知的方法?？s短的多肽與全長多肽相比通常具有增加的分泌峰值(secretionheight)。與全長多肽相比,它們也可能顯示出較高的熱穩(wěn)定性，因為它們只包含“壓縮的核心”(compressedcore)。這種變體的產生方法通常是現(xiàn)有技術中已知的。例如，所述多肽的氨基酸序列變體可以通過DNA中的突變產生。用于誘變和改變核苷酸序列的方法是現(xiàn)有技術中公知的(參見，例如Tomicetal.NAR,18:1656(1990),GiebelandSprtizNAR,18:4947(1990))。對目的蛋白的生物學活性沒有不利影響的適宜氨基酸置換的細節(jié)記載于Dayhoffetal.，AtlasofProteinSequenceandStructure,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.(1978)中。優(yōu)選保守性置換，例如將一個氨基酸用另一個具有類似性質的氨基酸置換。這些置換可以分為兩個大組，總共四個分組，并且每個分組中的置換均稱為保守性置換，這優(yōu)選地不影響所述蛋白的活性或折疊。脂肪族非極性GAP___ILV_極性且不帶電荷CSTMNQ極性且?guī)щ姾蒁E____KR_芳香族___HFWY_表述“蛋白”、“肽”和“多肽”基本上可以互換使用。有磷脂酶活性的多肽或酶或者磷脂酶是指能夠催化從磷脂(例如卵磷脂)中釋放脂肪酸的酶。磷脂酶活性可以通過使用任何本身已知的測量方法來確定，所述方法中使用這些底物中的一種。對于本發(fā)明中的多肽，表述“磷脂酶”或磷脂酶A是指具有磷脂酶Al以及磷脂酶A2活性的酶。因此，磷脂酶Al或A2被分別按照標準的酶EC分類命名為EC3.I.I.32或3.I.I.4。磷脂酶B或溶血磷脂酶是依據(jù)標準酶EC分類法命名為EC3.I.I.5的多肽。本發(fā)明還涉及編碼具有磷脂酶活性的多肽的DNA序列，包括對SEQIDNO:I所示序列的突變、修飾或變異。另外，本發(fā)明還涉及與上述序列在不嚴格或嚴格條件下雜交的序列。下述條件被認為是嚴格的在硫酸葡聚糖溶液中于65°C下雜交18小時(GenescreenPlus,DuPont),隨后于65°C下分別用下述溶液洗濾膜30分鐘，首先用6xSSC洗、然后2xSSC洗兩次、2xSSC洗兩次、0.1%SDS洗、最后用0.2xSSC洗(轉膜和檢測方法，Amersham)。另外，本發(fā)明還涉及由遺傳密碼的簡并性形成的與上述序列相關的DNA序列，以及其等位基因變體。因此，遺傳密碼的簡并性可能是由于天然的簡并性或特別選擇的密碼子選擇。天然產生的等位基因變體可以通過公知的分子生物學技術(例如聚合酶鏈式反應(PCR)和雜交技術)進行鑒定。本發(fā)明還涉及利用重組技術生產具有磷脂酶活性的多肽的方法，包括在能夠促進所述酶的表達和隨后對所述酶的提取的條件下，培養(yǎng)含有本發(fā)明DNA序列的重組原核和/或真核宿主細胞。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明中的多核苷酸序列用于制備探針的用途，所述探針用于檢測其它生物體中編碼相應酶的相似序列或用于轉化宿主細胞。本發(fā)明中編碼多肽的DNA序列可以用于轉化任何宿主細胞，例如真菌細胞、酵母細胞、細菌細胞、植物細胞或動物細胞。用這種方式轉化的細胞的特征在于分泌本發(fā)明的磷脂酶。如此產生的磷脂酶使得能夠有效地水解磷脂中的脂肪酸。本發(fā)明還涉及表達盒，其可用于向宿主細胞引入編碼本發(fā)明中磷脂酶的DNA序列或開放讀碼框。它們優(yōu)選地包含一個與所述開放讀碼框相連的轉錄起始區(qū)域。這種表達盒可以包含多個限制性酶切位點用于插入所述開放讀碼框和/或其它的DNA，例如轉錄調節(jié)子區(qū)域和/或可選擇的標記基因。所述轉錄盒在5’一3’轉錄方向上含有在微生物細胞中有功能的轉錄起始區(qū)域和翻譯起始區(qū)域、目的DNA序列以及轉錄終止區(qū)域和翻譯終止區(qū)域。所述終止區(qū)域可以是與所述轉錄起始區(qū)域天然對應的、可以是與所述目的DNA序列天然對應的或者可以是來自其它來源。所述表述“開放讀碼框”(0RF)是指編碼序列中翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子之間序列所編碼的氨基酸序列。所述表述“起始密碼子”和“終止密碼子”是指編碼序列中確定蛋白合成(mRNA翻譯)鏈起始和鏈終止的一個由三個相鄰核苷酸組成的單位(密碼子)。與核酸相關的“可操作連接”是指化合物作為同一核酸分子的部分，并且相對于啟動子的轉錄起始點處于合適的位置和方向。與啟動子功能性連接的DNA處于啟動子的轉錄起始調控之下。編碼序列可以與調節(jié)子序列以同義方向或反義方向可操作地連接。對于多肽，可操作連接是指所述連接作為同一多肽的一部分，也就是通過肽鍵。本發(fā)明中可以應用任何啟動子。啟動子通常是指編碼序列上游(5，)的核苷酸序列，并通過提供正確轉錄必需的對RNA聚合酶和其它因子的識別而控制編碼序列的表達。本發(fā)明中所用的啟動子可以包括最小啟動子，也就是從TATA盒起始的一段短的DNA序列和其它確定轉錄起始位點的序列，所述轉錄起始位點連接調節(jié)子元件進行表達控制。本發(fā)明中所用的啟動子還可以包括一種包含一個最小啟動子和調節(jié)子元件并可以控制編碼序列或功能性RNA表達的核苷酸序列。這種類型的啟動子序列由位于上游的近側和遠側元件構成，其中最后命名的元件通常是增強子。所以，增強子是可以刺激啟動子活性的DNA序列，并且可以是啟動子固有的元件或者是為提高啟動子的表達強度或組織特異性而插入的異源元件。增強子在兩個方向都可以起作用，并且甚至位于啟動子的上游或下游時都可以起作用。增強子和其他位于上游的啟動子元件均會序列特異性地與介導他們作用的DNA結合蛋白結合。啟動子可以全部來自天然基因或者可以由來自不同自然存在的啟動子的元件組成，或者甚至可以由合成的DNA片段組成。啟動子還可以含有參與蛋白因子結合的DNA序列，所述蛋白因子能夠控制轉錄起始效率，作為對生理或發(fā)育相關的狀況的反應。在沒有上游的激活時，啟動子元件(特別是失活的或者啟動子活性會顯著降低的TATA元件)稱為最小啟動子或核心啟動子。在一個或多個合適的轉錄因子存在時，最小啟動子的功能是使轉錄得以進行。因此，最小啟動子或核心啟動子僅僅包含轉錄起始所必須的所有基礎元件，例如TATA盒和/或起始因子。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明中DNA序列的載體構建體。這些載體構建體可以包含雙鏈或單鏈、線狀或環(huán)狀形式的任何質粒、粘粒、噬菌體或其它載體，它們任選地本身是可傳播或可移動的并且可以通過以下方式轉化原核或真核宿主整合到細胞基因組中或以額外染色體的形式存在(例如具有復制起始點的自主復制質粒)。待用于轉化細胞的載體、質粒、粘粒、人工酵母染色體(YAC)、人工細菌染色體(BAC)和DNA片段通常包含本發(fā)明中編碼磷脂酶的DNA以及其它將被引入至細胞中的DNA，例如cDNA、一個或多個基因。如果需要，這些DNA構建體還可以包括其它的結構，例如啟動子、增強子、聚合接頭(polylinker)或調節(jié)子基因。選擇用于轉化細胞的DNA片段或基因可方便地編碼在所獲得的轉化(重組)細胞中表達的蛋白，這使得所述轉化細胞具有可篩選或可選擇的特性和/或使所述轉化細胞具有改良的表型。通過上述公開內容和普通的專業(yè)知識，本發(fā)明中可使用的載體的構建是本領域技術人員已知的(參見，例如Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual(2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,N.Y.(1989)))。本發(fā)明中的表達盒可以包含一個或幾個限制性酶切位點，以將編碼磷脂酶的多核苷酸置于調節(jié)子序列的控制之下。所述表達盒還可以包含一個與所述多核苷酸可操作連接的終止信號以及所述多核苷酸正確翻譯所需要的調節(jié)子序列。含有本發(fā)明的多核苷酸的表達盒可以是嵌合的，也就是說其至少一個組分相對于其至少另一個組分是異源的。所述表達盒中多核苷酸的表達可以受組成型啟動子、誘導型啟動子、受調節(jié)的啟動子、病毒啟動子或合成啟動子的控制。所述載體還可以包括調節(jié)子元件例如啟動子，或者可操控本發(fā)明中的DNA序列以使得它們包含這種元件。可以使用的合適啟動子元件是現(xiàn)有技術中已知的，例如用于里氏木霉(Trichodermareesei)的cbhl啟動子或cbh2啟動子,用于米曲霉(Aspergillusoryzae)的amy啟動子,用于黑曲霉的xyl啟動子、glaA啟動子、alcA啟動子、aphA啟動子、tpiA啟動子、gpdA啟動子、sucl啟動子和pkiA啟動子?？捎糜诮湍钢斜磉_的合適的啟動子是現(xiàn)有技術中已知的，例如pho5啟動子或gap啟動子可用于在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和畢赤酵母(Pichiapastoris)中表達,如aoxl啟動子、fmd啟動子或mox啟動子用于甲醇酵母(H.polymorpha)o除本發(fā)明中的DNA以外，適合于導入細胞的DNA還可以包括從任何來源衍生或分離的DNA。一個衍生DNA的實例是從給定生物體中被鑒定為有用的片段，然后通過化學方法合成為基本上純凈的形式的DNA序列。這種DNA的一個實例是一個合適的DNA序列，所述DNA序列是例如使用限制性核酸內切酶得到的，從而使得其能根據(jù)本發(fā)明被進一步操作，例如擴增。例如使用來自構巢曲霉(Aspergillusnidulans)的用作標記基因的amdS基因及其調節(jié)序列，以及聚合接頭。這種DNA通常是指重組DNA。因此，合適的DNA包括完全合成的DNA、半合成的DNA、從生物來源分離的DNA以及來自導入RNA的DNA。一般來說，導入的DNA不是受體DNA基因型的起始部分，但是本發(fā)明中的基因還可以從給定基因型中分離，并且可任選地被改變，和隨后將所述基因的多個拷貝導入相同的基因型，例如增加給定基因產物的產量。所導入的DNA包括但不限于，來自例如細菌、酵母、真菌或病毒基因的DNA。所導入DNA可以包括修飾的或合成的基因、部分基因或嵌合基因，包括相同或不同基因型的基因。這還可以包括例如質粒pUC18、pUC19的DNA。本發(fā)明中使用的用于轉化的DNA可以是環(huán)狀的或線狀的、雙鏈的或單鏈的。一般來說，DNA是嵌合體DNA，例如質粒DNA，所述質粒還包括編碼區(qū)，所述編碼區(qū)的側翼連接有調節(jié)子序列并且可支持重組DNA在所述轉化的細胞中表達。例如，DNA自身可以包含一個在細胞中有活性的、來自于與該細胞不同的來源的啟動子或者由其組成，或者也可以使用一個已經存在于該細胞(即轉化的靶細胞)中的啟動子。一般而言，所導入的DNA相對較小，小于大約30kb，從而使其對物理的、化學的或酶降解的敏感性盡可能小，所述敏感性隨著DNA的增大而增加。合適的表達載體的選擇依據(jù)宿主細胞而定。酵母表達載體或真菌表達載體可以包含一個復制起點、一個合適的啟動子和增強子以及任何必須的核糖體結合位點、多腺苷酸化位點、剪接供體位點和剪接受體位點、轉錄終止序列和非轉錄的5’-側翼序列。適合的宿主細胞的實施例是曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)、木霉屬(Trichoderma)、鏈抱霉屬(Neurospora)、毛霉屬(Mucor)、青霉屬(Penicillium)等的真菌細胞，例如克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、毛抱子菌屬(Trichosporon)、許旺酵母屬(Schwanniomyces)、漢森(氏)酵母屬(Hansenula)、畢赤酵母屬(Pichia)等的酵母。適合的宿主系統(tǒng)是例如真菌，如曲霉屬，例如黑曲霉(ATCC9142)或無花果曲霉(Aspergillusficuum,NRLL3135)，或木霉屬(例如里氏木霉QM6a);以及酵母，例如酵母屬，例如釀酒酵母或畢赤酵母屬，例如畢赤酵母，或漢森(氏)酵母屬，例如甲醇酵母(DSMZ70277)。這些微生物可以從已建立的保藏中心獲得，例如美國模式培養(yǎng)物集存庫(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)、皇家荷蘭生物科技研究所培養(yǎng)物保藏中心(CentraalbureauvoorSchimmelcultures,CBS)或德國微生物菌種保藏中心(DeutscheSammlungfiirMikroorganismenundZellkulturenGmbH,DSMZ)或任何其它的保藏中心。所述表達盒按照5’-3’轉錄方向可以包括本發(fā)明的多核苷酸的轉錄起始區(qū)域和翻譯起始區(qū)域以及在體內或體外有功能的轉錄區(qū)域和終止區(qū)域。所述終止區(qū)域相對于所述轉錄起始區(qū)域可以是天然的，或者相對于所述多核苷酸是天然的或其它來源的。調節(jié)子序列可以位于編碼序列的上游(5，非編碼序列)、內部(內含子)或下游(3’非編碼序列)，并且可能會影響相關編碼序列的轉錄、RNA加工或穩(wěn)定性和/或翻譯。調節(jié)子序列可以包含但不限于增強子、啟動子、抑制子結合位點、翻譯前導序列、內含子或多腺苷酸化信號序列。它們還可以包括天然的或合成序列，以及由合成的和天然的序列相結合的序列。本發(fā)明中使用的載體還可以包括用于增強表達的適合序列。本發(fā)明中可以使用的啟動子的實例是已知在真核細胞中控制表達的啟動子?？梢允褂萌魏文軌蛟诮z狀真菌中表達的啟動子。實例是能夠被淀粉或纖維素強誘導的啟動子，例如來自曲霉屬的葡萄糖淀粉酶啟動子或a-淀粉酶啟動子，或者來自木霉屬的纖維素酶(纖維二糖水解酶)啟動子，糖酵解代謝途徑中的酶(例如磷酸甘油酸酯激酶(PGK)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GPD)等)的啟動子。優(yōu)選纖維二糖水解酶-I啟動子、纖維二糖水解酶-II啟動子、淀粉酶啟動子、葡萄糖淀粉酶啟動子、木聚糖酶啟動子或烯醇化酶啟動子。除使用特定啟動子之外，其它類型的元件也可能影響轉基因的表達。具體地，證明了內含子有可能增強轉基因的表達。表達盒還可以包括其它元件，例如可以被內源或外源元件(例如鋅指蛋白，包括天然存在的鋅指蛋白和嵌合鋅指蛋白)調節(jié)的元件。本發(fā)明中使用的表達盒還可以包括增強子元件或上游啟動子元件。本發(fā)明中使用的載體還可以構建為使得它們包含增強子元件。因此，本發(fā)明的構建體包含目的基因和一個3’DNA序列，該序列用作終止轉錄并允許將所獲得的mRNA多腺苷酸化的信號?？梢詰萌魏问沟脧倪x定的宿主生物體的分泌成為可能的信號序列。優(yōu)選的信號序列是來自煙曲霉的磷脂酶信號序列或來源于其的用于從絲狀真菌的分泌的信號序列。還可以使用特定的如導序列，因為轉錄起始點和編碼序列起始點之間的DNA序列，即非翻譯的前導序列可能會影響基因表達。優(yōu)選的前導序列包含控制相連基因的最佳表達的序列，也就是說，它們包含能夠增加或保持mRNA穩(wěn)定性并阻止不合適的翻譯起始的優(yōu)選一致前導序列(consensusleadersequence)。這種序列的選擇是本領域技術人員所熟知的。為提高鑒定轉化體的可能性，所述表達盒中可以包括可選擇或可篩選的標記基因。這種標記基因是本領域技術人員所熟知的。將所述表達盒或含有所述表達盒的載體構建體引入宿主細胞。將構建體引入宿主細胞的多種技術是可用的并且是本領域技術人員所熟知的。對微生物細胞的轉化可以通過以下方式來實施聚乙二醇、氯化鈣、病毒感染、DEAE-葡聚糖、噬菌體感染、電穿孔和其它現(xiàn)有技術中已知的方法。真菌的轉化可以按照Penttilaetal.，Gene61:155-164，1987實施。將重組載體引入至酵母中可以通過本身已知的方法實現(xiàn)，包括電擊穿、用原生質球、醋酸鋰等。一旦獲得本發(fā)明的表達盒或DNA序列，就可以按照用本身已知的方法導入，從而在適合的宿主系統(tǒng)中過表達所編碼的多肽。然而，DNA序列本身也可以用于轉化本發(fā)明的適合的宿主系統(tǒng)以實現(xiàn)所編碼的多肽的過表達。一旦本發(fā)明的DNA序列在適合的宿主細胞和適合的培養(yǎng)基中表達，所編碼的磷脂酶可以按照本身已知的方法從培養(yǎng)基(在磷脂酶分泌到培養(yǎng)基中的情況下)或者從宿主生物體(在磷脂酶存在于細胞內，例如細胞周質間隙中的情況下)中濃縮和/或分離。已知用于分離培養(yǎng)基中不可溶部分和生物質的方法以及隨后用于濃縮磷脂酶的方法可以用于生產濃縮的磷脂酶溶液或用于制備磷脂酶的干燥品。例如，過濾方法或離心方法可以用于移除不溶的組分，繼而通過超濾法進行濃縮或使用錯流過濾法。干燥可以通過冷凍干燥或噴霧干燥、?；?、擠出法或其它方法實施?？墒褂靡阎牡鞍准兓椒ǚ蛛x本發(fā)明的磷脂酶。例如，多種色譜或凝膠色譜方法可以單獨使用或組合使用。依據(jù)重組生產方法中所用的宿主細胞，本發(fā)明的酶可以或不可以通過糖基化方式共價修飾。在真核細胞中，對分泌蛋白的糖基化為調控蛋白折疊、構象穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和蛋白水解抗性提供了基礎。對于磷脂酶的特定用途，該酶的糖基化變體可能比非糖基化的變體更為優(yōu)選。本發(fā)明還涉及分離的或基本上純化的核酸組合物和蛋白組合物。分離和純化的多核苷酸/多肽或其片段是指從其天然環(huán)境中分離并以純化的形式存在用于下一步使用的多核苷酸或多肽或其片段。分離的多核酸片段或多肽可以以純化的形式存在或者可以在非天然環(huán)境中存在，例如在轉基因的宿主細胞中。例如，分離的或純化的多核苷酸片段或蛋白或其生物活性部分如果是通過重組技術產生則基本上不含其它細胞材料或培養(yǎng)基，或者基本上不含化學前體或其它化合物。分離的多核苷酸優(yōu)選地不含作為該核酸來源的生物體的基因組DNA中天然位于該核酸側翼(即位于該核酸的5’末端和3’末端的序列)的核酸序列(優(yōu)選蛋白編碼序列)。例如，依照不同的實施方案，所述分離的核酸分子可以包含小于約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0.5kb或0.Ikb的核苷酸序列，所述核苷酸序列在作為該核酸分子來源的細胞基因組DNA中天然位于該核酸分子側翼?；旧喜缓毎牧系牡鞍装ň哂猩儆诩s70%、50%、30%、20%、10%、5%(基于干重計)污染蛋白的蛋白和多肽的組合物。如果本發(fā)明的蛋白或其生物活性片段是以重組方法產生的，則所述培養(yǎng)基優(yōu)選地包含少于大約70%、50%、30%、20%、10%或5%(基于干重計)的化學前體或非蛋白類化學物質。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的多肽的磷脂酶組合物。磷脂酶組合物通常是液體或干燥的。液體組合物優(yōu)選地包含純化或富集形式的磷脂酶。但是，可以添加助劑，例如穩(wěn)定劑和/或甘油、山梨醇或單丙烯乙二醇(monopropyleneglycol);添加劑,例如鹽、糖、防腐劑、調節(jié)PH值的試劑和蛋白質。典型的液體組合物是水性或油性懸浮液。干燥組合物可以是冷凍干燥、噴霧干燥、?；驍D出的組合物，其可以只含有酶。干燥組合物可以是顆粒形式，其可以很容易地與例如食品或飼料組分混合或者其優(yōu)選地形成預混合物的組分。優(yōu)選地，所述酶顆粒的顆粒大小與所述混合物中其它組分的顆粒大小是相容的。這使得安全且目的明確的試劑將酶合并到經加工的食品、預混合物或動物飼料中。干燥組合物還可以包含其它添加劑(例如鹽，尤其是磷酸鹽及其無水形式)以及穩(wěn)定劑(例如聚乙烯吡咯烷酮等)以在應用中調節(jié)某些條件，例如PH值。本發(fā)明中該實施方案的食品添加劑可以與其它食物組分以類似的方式組合，由此生產經加工的食品產品。這種其它食品組分包含一種或多種酶補充劑、維生素、礦物質或微量元素。然后，由此獲得的組合的膳食補充劑可以與其它食物組分(例如谷物和植物蛋白)以合適的量混合以獲得經加工的食品。將這些組分加工成經加工食品的過程可以通過本身已知的加工裝置實施。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的磷脂酶組合物額外地包含有效含量的一種或多種酶用于食品或動物飼料，或者用于食品或動物飼料生產的前期或者用于紡織工業(yè)，優(yōu)選地選自a-半乳糖苷酶、￠-半乳糖苷酶、漆酶、其它磷脂酶、磷酸酶、內切葡聚糖酶(特別是內切-P-I,4-葡聚糖酶、內切-￠-1,3(4)-葡聚糖酶、內切-1，2-P-葡聚糖酶和內切-1，3-a-葡聚糖酶)、纖維素酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶(尤其是阿拉伯半乳聚糖-內切-1，4-0-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖-內切-1，3-0-半乳糖苷酶)、果膠-降解酶(特別是果膠酶、果膠酯酶、果膠裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸乙酰酯酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸-a-鼠李糖苷酶、果膠酸裂解酶和a-半乳糖醒酸酶(a-galacturonidase))、甘露聚糖酶、^-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、蛋白酶、木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶、脂肪分解酶(例如脂肪酶、二半乳糖苷-雙甘油酯酶和角質酶)以及其它的酶，例如漆酶和轉谷氨酰胺酶。本發(fā)明的磷脂酶還可以用于多種用途。實例是在烘焙中和在動物飼養(yǎng)中以及在用可持續(xù)能量來源(例如油菜籽)中生產燃料中或者在紡織品原材料加工中的應用。一個優(yōu)選的用途是本發(fā)明中具有磷脂酶活性的多肽在植物油脫膠方法中的應用。例如，用本發(fā)明的多肽處理待脫膠的食用油，借此將大部分磷脂酶水解并且隨后將含有經水解的磷脂的水相從所述油中分離。這一方法尤其適用于純化含有磷脂的食用油，例如植物油，如大豆油、油菜籽油和葵花籽油。在磷脂酶處理之前，優(yōu)選地將油預處理以除去粘性物質，例如通過水蒸氣精餾法(humidrefining)。典型地,在用本發(fā)明中的磷脂酶處理之初,油中含有50_850ppm以磷脂形式存在的磷。處理之后，磷含量通常介于2-10ppm之間。磷脂酶處理通常是通過以下方式實施的將磷脂酶分散在水溶液中，優(yōu)選地是平均直徑<10ym的小滴。優(yōu)選地，基于油計，水的含量是0.5至5%重量(w/w)。任選地可以加入乳化劑?？梢詫ζ溥M行機械攪拌以保持乳液狀態(tài)。磷脂酶的處理可以在約3.5至約5.0的pH值范圍內進行。此方法的pH值范圍可以是約3.5至約5，優(yōu)選3.8至4.5，最優(yōu)選4.0至4.2，以使所述酶的性能最大化。pH值可以例如通過加入檸檬酸、檸檬酸緩沖液、磷酸或鹽酸進行調節(jié)。適合的溫度通常為30°-70°C，優(yōu)選45°-65°C，最優(yōu)選55°-62°C。反應時間通常為I至12小時，優(yōu)選2至6小時。適合的酶用量通常為120至3000單位/千克油，優(yōu)選250至2000，最優(yōu)選750至1500單位/千克油。磷脂酶處理可以分批進行(例如在一個帶攪拌的釜中)或者可以是連續(xù)的，例如在一系列帶有攪拌的釜式反應器中。磷脂酶處理之后是分離水相和油相。所述分離可以通過常規(guī)方式進行，例如離心。所述溶液含有磷脂酶，并且所述酶可以再次使用以提高該方法的經濟效率。所述處理可以通過本身已知的方法進行。有利地，本發(fā)明的磷脂酶還可以用于制備生面團和烘焙食品，其中有效量的本發(fā)明多肽在生面團中起作用。與沒有加入本發(fā)明的具有磷脂酶活性的多肽的生面團或烘焙產物相比，通過加入本發(fā)明的具有磷脂酶活性的多肽，生面團或由該生面團制備的烘焙產品的一種或幾種性質得到改善。在使用本發(fā)明的磷脂酶制備生面團的過程中，可將磷脂酶加入到生面團本身中，加入到任何制備生面團的成分中和/或加入到制備生面團的生面團成分的混合物中。因此，本發(fā)明中具有磷脂酶活性的多肽本身可以加入到生面團制備的任何步驟中，或者加入到一個、兩個或更多個步驟。所述的有效量是指足以對生面團和/或烘焙產物中至少一種目的性質產生可測量作用的磷脂酶的量。本文所定義的表述“改良的特性”是指相對于沒有加入本發(fā)明磷脂酶的生面團或產物，由于所述磷脂酶的作用而得以改良的生面團和/或從生面團得到的產物(尤其是烘焙食品)的任何性質。改良的性質可以包括，例如生面團強度提高、生面團的彈性提高、生面團的穩(wěn)定性提高、生面團的粘性減小、生面團的延展性提高、生面團的可機械加工性改善、烘焙產品的體積增加、烘焙產品的屑狀結構改善、烘焙產品的柔軟性改善、烘焙產品的香味改善和/或烘焙產品變味延遲。確定這些性質的方法是現(xiàn)有技術中已知的。本文中所定義的生面團是指面粉和其它成分的混合物，其堅硬到足以進行揉或卷。生面團可以是新鮮的、冷藏的、預熟的或預烘焙的。所述的“烘焙產品”是指用生面團制備的任何產品，并且是軟或脆的。可應用本發(fā)明中磷脂酶制備的烘焙產品的實例是，例如面包(尤其是白面包、全麥面包或黑麥面包)，通常是大面包(loaves)或法棍面包式的法國面包、面團、口袋面包、玉米粉圓餅、玉米面卷(tacos)、蛋糕、薄烤餅、餅干和糕點(pastry)、烤面包、雙面烤面包(doublebakedbread)坐寸o在制備這些烘焙產品過程中，可以加入本發(fā)明中具有磷脂酶活性的多肽和/或任何適合相應用途的制劑形式的一種或多種其它的酶，例如干燥形式，以及液體或預混合物。另外，可向生面團中加入一種或多種其他的酶。這些其他的酶可以是任何來源，以及例如可以來自于哺乳動物和植物。優(yōu)選地，它們來自于微生物，更特別優(yōu)選地來自于細菌或真菌。依據(jù)優(yōu)選的實施方案，其它的酶可以是淀粉酶，例如a-淀粉酶(適合于生產可以通過酵母發(fā)酵的和延遲變質的糖)或3-淀粉酶、環(huán)糊精葡聚糖轉移酶、肽酶，尤其是外肽酶(適于增加香味)、轉谷氨酰胺酶、脂肪酶(適合于修飾存在于生面團或生面團的一部分中的脂質以使生面團更柔軟)、磷脂酶(可用于修飾存在于生面團或生面團的一部分中的脂質以使生面團更柔軟并增加生面團中的氣體保留量)、纖維素酶、半纖維素酶，特別是戊聚糖酶，例如木聚糖酶(可用于部分水解戊聚糖以增加生面團的延展性)、蛋白酶(用于面筋軟化，特別是使用硬質小麥面粉時)、蛋白質二硫化物異構酶(例如，W095/00636中公開的蛋白二硫化物異構酶)、糖基轉移膜、過氧化物酶(用于增加生面團的稠度)、漆酶或氧化酶，例如醛醣氧化酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂肪氧合酶或L-氨基酸氧化酶(用于增加生面團的稠度)。這個/這些任選地另外加入的酶可任選地單獨加入或與本發(fā)明中具有磷脂酶活性的多肽一起加入作為發(fā)酵劑或生面團添加劑的組分。本發(fā)明還涉及這種生面團的制備以及用這些生面團制成的相應烘焙產品的制備。本發(fā)明還涉及預混合物(例如以面粉組合物的形式)用于生面團和/或由生面團制成的烘焙產品的制備，其中該預混合物包含本發(fā)明中具有磷脂酶活性的多肽。本發(fā)明中具有磷脂酶活性的多肽還可以用作動物飼料的添加劑。向飼料中加入磷脂酶能夠提高動物對飼料的轉化效率。因此，用這種飼料喂養(yǎng)的動物的生長得到改善。因此，本發(fā)明中的磷脂酶可以本身的方式或飼料濃縮物的方式加入。另外，磷脂酶還可以通過轉基因植物被加入到動物飼料中，其中所述磷脂酶是通過異源基因表達合成的。EP0449376中公開了生產這種轉基因植物的方法。本發(fā)明中具有磷脂酶活性的多肽還可以用于紡織品原材料(例如棉花纖維)加工中的洗滌過程，以促進對纖維的進一步處理。通過洗滌得到的改善能夠影響染色過程中的性能以及后續(xù)對纖維或其制成的紡織品的機械加工和酶促加工。從微生物煙曲霉中分離的磷脂酶基因儲存在質粒pPL3949-Topo2.5中，其依據(jù)布達佩斯協(xié)議的規(guī)定于2009年7月2日保藏于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ),Inhoffenstra^e7B,D_38124Braunschweig，的登錄號為DSM22741。本發(fā)明進一步基于所公開的附圖進行描述。示出如下圖I:從煙曲霉中純化的磷脂酶的等電點聚焦(IEF)凝膠泳道I:來自等電點聚焦校準試劑盒的標記蛋白，pH2.5-6.5泳道2-3:箭頭標記的為pi大約4.I的磷脂酶條帶圖2:里氏木霉RH32664中表達的重組磷脂酶的溫度優(yōu)化曲線圖3:里氏木霉RH32664中表達的重組磷脂酶的pH優(yōu)化曲線圖4:煙曲霉RH3949的染色體磷脂酶基因的核苷酸序列及由其得到的氨基酸序列。內含子用斜體表示，氨基酸序列用粗體表示(SEQIDNO:I)。圖5:煙曲霉RH3949的染色體磷脂酶基因的核苷酸序列(SEQIDNO:I)。圖6:煙曲霉RH3949的磷脂酶基因的氨基酸序列(SEQIDN0:2)。圖7:載體pPL3949-Topo2.5的限制性內切酶圖譜。圖8:表達載體pAB500-PL3949的限制性內切酶圖譜。參考實施例I磷脂酶活性的測定I個磷脂酶單位(PLU)相當于標準條件下每分鐘從磷脂酰膽堿中釋放IUmol脂肪酸所需的酶量。試劑底物乳液將IgEpikuron200(從LucasMeyer公司的大豆中純化的磷脂酰膽堿,現(xiàn)可從Cargill獲取)、IOOml去離子水和5ml0.32MCaCl2溶液用UltraTurrax在24，OOOrpm下勻漿2分鐘。底物乳液在4°_8°C下可穩(wěn)定3-4天。其它溶液0.32MMgCl2溶液、新鮮的3.3mM檸檬酸-單水合物溶液、IOmMKOH溶液、溶解于去礦物質水的l%TritonXlOO(Fluka公司)溶液。酶溶液酶制劑溶于去離子水中。反應體系中酶的濃度應不超過2.5Ug'步驟主值IOml底物乳液IOmll%TritonXlOO溶液5ml3.3mM檸檬酸-單水合物溶液移液至一個25ml的廣口錐形瓶中，置于40°C下10分鐘。調整pH值至大約3.3_3.5o加入0.Iml酶溶液后，將分析體系在40°C下孵育10分鐘。孵育時間結束后，將所述溶液中用IOmMKOH滴定至pH值為10.0，其中開始的5mlKOH快速加入(持續(xù)時間約I分鐘)。記錄KOH的消耗量。空白值將酶的母液加熱至95°C持續(xù)15分鐘從而將其滅活。冷卻至室溫后，進一步的處理與用于主值的相同?？瞻字挡恍枰跤Ｔu估^ttt,AYkoh*ckoh*1000PLUfg=-At*Cs*VVkoh(ml)空白值和主值之間KOH消耗量差異cKOH(moIr1)KOH溶液濃度At(min)孵育時間Cs(gmr1)樣本濃度V(ml)使用的體積參考實施例2pH3.5時用于磷脂酶檢測的快速測試試劑底物乳液將IgEpikuron-200與IOOgMilliQ水和5ml0.32M氯化鈣溶液混合，然后用Ultra-Turrax進行勻衆(zhòng)化(在約24000rpm下進行約1-2分鐘)。對于分析體系，將IOml該底物乳液與10mll%TritonX-100溶液和5ml3.3mM檸檬酸-單水合物溶液混合。游離脂肪酸,半微量測試(Boehringer)(半微量測試包含反應混合物A、反應混合物B和N-乙基順丁烯二酰亞胺的試劑)。步驟在微量滴定板中加入5UI稀釋的酶溶液并與0.Iml底物乳液混合。將所述底物/酶體系在水浴中于40°C下孵育lOmin。隨后，將5UI所述體系移液至另一個微量滴定板，加入到100uI反應混合物A中，于40°C下在水浴中孵育5分鐘。孵育結束后，加入5ill1:1比例的反應混合物B與N-乙基順丁烯二酰亞胺的混合物，并在40°C下再次孵育5分鐘。如果所述反應體系呈現(xiàn)紅色，則說明磷脂酶活性存在。參考實施例3游離脂肪酸含量的測定試劑乙醇(96%溶液)、甲苯乙醇和甲苯以I:I的比例(體積比)混合；0.IN乙醇制KOH(ethanolicK0H)溶于乙醇的1%酚酞溶液步驟稱取約3g無水油至錐形瓶中，精確至小數(shù)點后四位，溶于20ml乙醇-甲苯混合物中，混入2至3滴酚酞并用0.INKOH溶液滴定至呈現(xiàn)穩(wěn)定的紅色。評估酸值是游離脂肪酸含量的指示。酸值是指中和Ikg油中所含的游離脂肪酸時所需的氫氧化鉀的量(單位為克)。酸值(AN)依據(jù)下述等式計算權利要求1.一種DNA序列，其編碼具有磷脂酶活性但基本上不具有脂肪酶活性的多肽，其特征在于所述DNA序列選自a)含有SEQIDNO:I所示核苷酸序列的DNA序列，b)含有SEQIDNO:I所示編碼序列的DNA序列，c)編碼SEQIDN0:2所示蛋白序列的DNA序列，d)由具有圖7所示限制性內切酶圖譜的質粒pPL3940-Topo2.5編碼的DNA序列，該質粒保藏號為DSM22741，e)在嚴格條件下可與a)、b)、c)或d)的DNA序列之一雜交的DNA序列，f)由于遺傳密碼的簡并性而與a)、b)、c)、d)或e)中DNA序列相關的DNA序列，并且g)a)至f)的序列的互補鏈，其中所述DNA序列優(yōu)選地來自曲霉(Aspergillus),更優(yōu)選來自煙曲霉(Aspergillusfumigatus)。2.—種核酸序列，其含有權利要求I的序列之一的類似物，其特征在于，所述序列編碼具有磷脂酶活性但基本不具有脂肪酶活性的多肽，并且a)與a)、d)、e)、f)和g)的序列之一有至少82%的同一'性,或b)與b)、c)、e)、f)和g)序列之一有至少88%的同一'性,或c)與這些序列之一在嚴格條件下雜交，或d)是這些序列之一的等位基因變體，或e)是a)至d)中序列的互補鏈，其中所述序列可以通過對SEQIDNO:I所示的DNA序列中一個或多個核酸的置換、缺失、插入、增加或突變而獲得。3.—種表達載體，其含有與一個或多個用于在適合的宿主細胞中指導具有磷脂酶活性的多肽表達的序列可操作連接的權利要求I至2中任一項所述的序列，其中所述用于指導多肽表達的序列優(yōu)選地為一個啟動子，其選自曲霉屬的葡萄糖淀粉酶啟動子或α-淀粉酶啟動子，木霉屬的纖維素酶(纖維二糖水解酶)啟動子，糖酵解代謝途徑中酶的啟動子，所述酶例如磷酸甘油酸酯激酶或甘油醛-3-磷酸脫氫酶，木聚糖酶啟動子或烯醇酶啟動子，并且任選地進一步包括一個分泌性前導序列。4.一種重組的宿主細胞，其特征在于，該細胞是用權利要求3的表達構建體轉化的。5.權利要求4的重組宿主細胞，其特征在于，該細胞是來自曲霉屬、根霉屬(Rhizopus)、木霉屬(Trichoderma)、鏈抱霉屬(Neurospora)、毛霉屬(Mucor)或青霉屬(Penicillium)的真菌細胞或來自克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、毛抱子菌屬(Trichosporon)、許旺酵母屬(Schwanniomyces)、漢森氏酵母屬(Hansenula)或畢赤酵母屬(Pichia)的酵母細胞。6.具有圖7所示限制性內切酶圖譜的質粒pPL3949-Topo2.5，其保藏號為DSM22741。7.一種具有磷脂酶活性但基本不具有脂肪酶活性的多肽，選自a)由權利要求I至2中任一項的DNA序列的編碼部分編碼的多肽，b)具有SEQIDN0:2所示序列或來自該序列的序列的多肽，可以由對一個或多個氨基酸的置換、增加、缺失獲得，c)具有與SEQIDNO:2的氨基酸I至299有至少83%同一性的序列的多肽，d)由可在嚴格條件下與下述序列雜交的核酸序列編碼的多肽(i)SEQIDNO:I中核苷酸55至1106，(ii)SEQIDNO:I中核苷酸55至1106中包含的cDNA序列，(iii)(i)或Qi)中至少100個核苷酸的部分序列,或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補鏈，e)具有SEQIDNO:2的多肽的變體，其含有對一個或多個氨基酸的置換、缺失和/或插入，f)a)至e)的氨基酸序列的等位基因變體。8.一種具有磷脂酶活性的多肽，其特征在于，-其分子量范圍為28至30kDa，-可以水解卵磷脂的兩種脂肪酸中的至少一種，-基本上不具有脂肪酶活性，-具有耐高溫性，-可以從曲霉屬的生物體中分離。9.權利要求8的多肽，其特征在于，其可以從煙曲霉中分離。10.權利要求9的多肽，其特征在于，其可以與抗SEQIDNO:2序列的抗體發(fā)生免疫反應。11.與權利要求8至10中任一項所述的多肽，其特征在于，該多肽包含如SEQIDNO:2所示的序列。12.磷脂酶組合物，其特征在于，其包含與權利要求7至11中任一項的多肽以及添加齊U，并且任選地進一步包括一種或多種用于食品或動物飼料的酶。13.權利要求7至11中任一項的多肽或權利要求12的磷脂酶組合物用于植物油脫膠、用于生面團和/或烘焙產品制備、用于乳制品制備、作為動物飼料添加劑或用于紡織品原材料加工的用途。14.用于制備權利要求7至11中任一項的具有磷脂酶活性多肽的方法，其特征在于，將權利要求4或5中任一項所述的宿主細胞在支持所述多肽表達的條件下培養(yǎng)，隨后提取所述多肽。15.用于植物油脫膠方法，其特征在于，a)所述待處理的植物油任選地經過預處理，b)向所獲得的任選地經預處理的油中加入含有權利要求7至11中任一項的多肽或權利要求12的磷脂酶組合物的水溶液，c)將b)中反應體系加熱I至12小時至30°C至70°C之間的溫度，d)將水相和油相分離。全文摘要本發(fā)明涉及一種DNA序列，其編碼具有磷脂酶活性但基本上不具有脂肪酶活性的多肽，其特征在于所述DNA序列選自a)含有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的DNA序列，b)含有SEQIDNO:1所示編碼序列的DNA序列，c)編碼SEQIDNO:2所示蛋白序列的DNA序列，d)由具有圖7所示限制性內切酶圖譜的質粒pPL3940-Topo2.5編碼的DNA序列，該質粒保藏號為DSM22741，e)能在嚴格條件下與a)、b)、c)或d)的DNA序列之一雜交的DNA序列，f)由于遺傳密碼的簡并性而與a)、b)、c)、d)或e)的DNA序列相關的DNA序列，以及g)a)至f)的序列的互補鏈，其中所述DNA序列優(yōu)選地來自曲霉，更優(yōu)選地來自煙曲霉；本發(fā)明還涉及一種具有磷脂酶活性但基本上不具有脂肪酶活性的多肽，其選自a)由上述DNA序列的編碼部分編碼的多肽，b)具有SEQIDNO:2所示序列或由其衍生的序列的多肽，其可以通過對一個或多個氨基酸的置換、增加或缺失獲得，c)與SEQIDNO:2的氨基酸1至299有至少83%同一性的序列的多肽，d)由可與下述序列在嚴格條件下雜交的核酸序列編碼的多肽(i)SEQIDNO:1的核苷酸55至1106，(ii)SEQIDNO:1的核苷酸55至1106中包含的cDNA序列，(iii)由至少100個核苷酸組成的(i)或(ii)中的部分序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補鏈，e)具有SEQIDNO:2序列的多肽的變體，其包含對一個或多個氨基酸的置換、缺失和/或插入，f)a)至e)的氨基酸序列的等位基因變體。文檔編號C12N9/16GK102803455SQ201080059893公開日2012年11月28日申請日期2010年10月27日優(yōu)先權日2009年10月28日發(fā)明者Q·K·阮,K·蒂策,T·施瓦茲,S·帕拉迪諾,V·馬施納,P·勞倫茨申請人:Ab酶有限公司