專(zhuān)利名稱(chēng)：用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的方法和/或引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的存在的引物、探針以及使用所述引物和/或探針的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
結(jié)核病(TB)是一種通常由感染結(jié)核分枝桿菌或者由復(fù)合結(jié)核菌組的一種或多種生物體而引起的慢性傳染病。TB至今仍為全世界主要的健康問(wèn)題，每年約有800萬(wàn)新增病例，有300萬(wàn)人死于該病。在新加坡，TB的發(fā)病率為一年每100，000個(gè)人有35-40個(gè)。這相當(dāng)于每天有4-5個(gè)新增病例。盡管TB的傳播攀升，但是診斷難以建立。特別是，結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)在宿主體內(nèi)維持和繁殖所憑借的免疫系統(tǒng)的機(jī)制尚不清楚。
結(jié)核分枝桿菌基因組的序列測(cè)定推動(dòng)了大量的研究工作以識(shí)別潛在的理論上可由生物體表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)。然而，僅僅序列數(shù)據(jù)不足以得出任何特定蛋白質(zhì)是由生物體在體內(nèi)表達(dá)的結(jié)論，更不用說(shuō)是在感染人或動(dòng)物期間。感染結(jié)核分枝桿菌或者潛伏性感染的再活化誘導(dǎo)宿主反應(yīng)，包括募集單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞到感染部位。隨著更多的免疫細(xì)胞積聚，形成了肉芽腫的小結(jié)，其包括已被巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒產(chǎn)物破壞的免疫細(xì)胞和宿主組織。隨著疾病的發(fā)展，巨噬細(xì)胞酶引起蛋白質(zhì)、月旨類(lèi)和核酸的水解，導(dǎo)致外周組織液化，形成肉芽腫。最終，病灶破裂，并且桿菌被釋放到周?chē)姆闻K、血液或淋巴系統(tǒng)。雖然這種感染可以在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)是無(wú)癥狀的，但是，這種疾病最普通地表現(xiàn)為肺急性炎，導(dǎo)致發(fā)燒和排痰性咳。如果置之不理，結(jié)核分枝桿菌感染的發(fā)展可以超出肺內(nèi)的原發(fā)感染部位到達(dá)身體內(nèi)的任何器官，并且通常導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥和死亡。因此，在感染早期診斷TB是必要的。常規(guī)技術(shù)，如用于耐酸細(xì)菌的顯微鏡檢術(shù)快速并且相對(duì)便宜，但是缺少靈敏性，范圍為40%到60%，并且結(jié)果為弱陰性預(yù)測(cè)值。在具有顯著性水平的非結(jié)核性分枝桿菌(NTM)的群體(如AIDS患者)中，如果陽(yáng)性涂片是TB或NTM的結(jié)果，由于其還不能被確認(rèn)，所以陽(yáng)性涂片的價(jià)值降低。NTM是不會(huì)引起結(jié)核病或漢森氏病(也稱(chēng)麻風(fēng)病)的分枝桿菌。NTM的實(shí)例包括,但不限于,麻風(fēng)分枝桿菌(M. leprae)、鳥(niǎo)分枝桿菌(M. avium)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)等等。目前，在非免疫的人中通過(guò)TB皮膚試驗(yàn)診斷潛伏性感染，非免疫的人對(duì)由結(jié)核分枝桿菌制造的提取物產(chǎn)生遲發(fā)性超敏型反應(yīng)。TB免疫的人或者過(guò)去感染現(xiàn)已清除的人將反應(yīng)出與當(dāng)前處于感染狀態(tài)的人相類(lèi)似的遲發(fā)性超敏感性，所以必須留心采用試驗(yàn)，特別是對(duì)于來(lái)自TB免疫接種普遍的國(guó)家的人。結(jié)核菌素試驗(yàn)也具有產(chǎn)生假陰性的缺點(diǎn)，尤其是當(dāng)患者同時(shí)患有結(jié)節(jié)病、霍杰金淋巴瘤、營(yíng)養(yǎng)不良或最顯著活動(dòng)性TB疾病時(shí)。干擾素Y釋放測(cè)定比結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)更加具有特異性，但是在具有高水平的潛伏性TB的群體中，有癥狀的患者中‘活性’結(jié)果的值較低，陰性結(jié)果的預(yù)測(cè)值不足以排除TB。培養(yǎng)仍然是最靈敏的方法，但是盡管基于肉湯的方法具有很大的改進(jìn)，但是報(bào)告陽(yáng)性的時(shí)間太漫長(zhǎng)而無(wú)助于即時(shí)處理決定。這是因?yàn)?，在?shí)驗(yàn)室中結(jié)核分枝桿菌是一種緩慢生長(zhǎng)的生物體(對(duì)于血培養(yǎng)或痰培養(yǎng)其可需要4至12周)。使用培養(yǎng)物作為‘參考標(biāo)準(zhǔn)’是慣用手段。然而，2-3%的MTBC培養(yǎng)陽(yáng)性樣本是假陽(yáng)性的。針對(duì)TB的完整的醫(yī)學(xué)評(píng)價(jià)必須包括病史、體格檢查、胸部X線(xiàn)、微生物學(xué)涂片和培養(yǎng)。其也可包括結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)。結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)的判讀取決于感染和發(fā)展成TB疾病的個(gè)人的危險(xiǎn)度因子，如接觸其他的TB或免疫抑制的事件。即使所有這些試驗(yàn)之后，TB的診斷結(jié)果仍然會(huì)是有時(shí)可能是不確定的一種可能的結(jié)果。因此，當(dāng)前的微生物學(xué)診斷方法是不靈敏的，非特異的和緩慢的。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概述在所附的獨(dú)立權(quán)利要求中限定本發(fā)明。在所附的從屬權(quán)利要求中限定本發(fā)明的一些可選特征。特別是，本發(fā)明提出了上述問(wèn)題，并且提供了高度靈敏和特異的用于更加有效地檢測(cè)患者樣品中的結(jié)核分枝桿菌的方法的寡核苷酸、其片段和/或衍生物。引物和/或探針在檢測(cè)TB中可以是靈敏和特異的并且提供了快速且經(jīng)濟(jì)有效的用于確定結(jié)核分枝桿菌感染和/或與其相關(guān)的疾病狀態(tài)的診斷和預(yù)后試劑。這些引物為廉價(jià)、快速和更加準(zhǔn)確的TB試驗(yàn)提供了工具。根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供了至少一種分離的寡核苷酸，其包含SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :2、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列中的至少一種核苷酸序列，基本由SEQ IDNO :1或SEQ ID NO :2、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列中的至少一種核苷酸序列組成，或者由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列中的至少一種核苷酸序列組成。所述寡核苷酸可以能夠與復(fù)合結(jié)核菌組結(jié)合，和/或從復(fù)合結(jié)核菌組中被擴(kuò)增。這些引物可用于核酸擴(kuò)增(NAA)試驗(yàn)，它們可以比可用來(lái)診斷TB的常規(guī)方法更加靈敏。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了至少一對(duì)寡核苷酸，其包含至少一種正向引物和至少一種反向引物，其中，所述正向引物包含SEQ ID NO :1、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列，基本由SEQ ID NO :1、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列組成，或者由SEQ ID N0:1、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列組成；所述反向引物包含SEQ ID NO :2、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列，基本由SEQ ID NO :2、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列組成，或者由SEQ ID NO
2、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列組成。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了至少一組寡核苷酸，其包括根據(jù)本發(fā)明任一方面所述的一對(duì)寡核苷酸和至少一種探針。根據(jù)又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了至少一種使用至少一種正向引物和至少一種反向引物從復(fù)合結(jié)核菌組中擴(kuò)增的擴(kuò)增子，其中，所述正向引物包含SEQ ID NO :1、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列，基本由SEQ ID NO :1、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列組成，或者由SEQ ID NO :1、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列組成；所述反向引物包含SEQ ID NO :2、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列，基本由SEQ ID NO :2、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列組成，或者由SEQ ID NO :2、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列組成。根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供了至少一種檢測(cè)生物樣本中結(jié)核分枝桿菌的存在的方法，所述方法包括步驟
(a)提供至少一種生物樣本；(b)使根據(jù)本發(fā)明的任一方面的至少一種寡核苷酸、一對(duì)寡核苷酸或一組寡核苷酸，與生物樣本中的至少一種核酸接觸，和/或與從生物樣本中提取、純化和/或擴(kuò)增的至少一種核酸接觸；以及(C)檢測(cè)從步驟(b)中的接觸產(chǎn)生的任何結(jié)合，由此當(dāng)檢測(cè)到結(jié)合時(shí)結(jié)核分枝桿菌存在。根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供了至少一種擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌核酸的方法，所述方法包括使用SEQ ID NO :1、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列和SEQ ID NO :2、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了至少一種用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的試劑盒，所述試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明的任一方面的至少一種寡核苷酸、一對(duì)寡核苷酸或一組寡核苷酸。根據(jù)一個(gè)特別的方面，本發(fā)明提供了高度靈敏和特異的引物、其片段和/或衍生物，其可用于能夠檢測(cè)患者樣品中的結(jié)核分枝桿菌DNA的PCR方法中。該試驗(yàn)可用于檢查來(lái)自患有活動(dòng)性肺結(jié)核的患者的樣品。所述引物可以是靈敏的和特異的。此外，可以在每個(gè)反應(yīng)中包含至少一種IC分子以監(jiān)測(cè)PCR的進(jìn)行。根據(jù)以下描述清楚的是，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式提供了用于在所需地方的敏感性和特異性檢測(cè)TB的引物/或探針的最佳使用。從以下描述中，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人而言，這和其他相關(guān)優(yōu)點(diǎn)將是明顯的。


圖I為說(shuō)明與如培養(yǎng)和涂片的常規(guī)方法相比本發(fā)明的樣本選擇中的第一種步驟和PCR結(jié)果(內(nèi)部)的圖。圖2為樣本選擇中的第二個(gè)步驟的流程圖，其中，從圖I中分離所選樣本而獲得的結(jié)果進(jìn)一步被分成與肺部樣本和與非肺部樣本。圖3為顯示涉及選擇用來(lái)試驗(yàn)本發(fā)明的引物和探針的預(yù)定樣本的第三個(gè)步驟的 流程圖。圖4是在存在和不存在PCR添加物的情況下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果。在溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠中觀察PCR產(chǎn)物。A)無(wú)添加物，B)DMS0,5%, C)甲酰胺，5%和D)甜菜堿，IM0濃度為添加物在管中的終濃度。泳道M :IOObp DNA梯型；NTC :無(wú)模板對(duì)照；54_56 陽(yáng)性臨床樣本；69-71 :陰性臨床樣本。預(yù)期PCR產(chǎn)物為145個(gè)堿基對(duì)(bp)。在所用樣本中摻入(spike)預(yù)期大小為95bp的1C。圖5在甲酰胺濃度為1-10%的情況下的PCR產(chǎn)物的凝膠照片。PCR產(chǎn)物由每個(gè)反應(yīng)5個(gè)拷貝的TB DNA克隆產(chǎn)生并且在溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠中觀察。泳道M:100bpDNA梯型；C :沒(méi)有添加甲酰胺的對(duì)照；1-10:甲酰胺的百分比。預(yù)期PCR產(chǎn)物為145bp。在所用樣本中摻入預(yù)期大小為95bp的1C。圖6為甲酰胺在濃度為A) 0 %、B) 3 %和C) 5 %的情況下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并且在溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠中觀察到的凝膠照片。M :100bp DNA梯型；1 NTC ；2~4 :每個(gè)反應(yīng)分別為T(mén)B DNA I個(gè)拷貝、3個(gè)拷貝、5個(gè)拷貝;20、23、25 :陽(yáng)性臨床樣本;24、27、51 :陰性臨床樣本。預(yù)期PCR產(chǎn)物為145bp。在所用樣本中摻入預(yù)期大小為95bp的1C。樣本20和23包含樣本中的基因組DNA。
具體實(shí)施例方式為方便起見(jiàn)，本說(shuō)明書(shū)中涉及的參考文獻(xiàn)以文獻(xiàn)列表的形式列出并加入到實(shí)施例后面。這些參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容在此處通過(guò)引用的方式并入。定義本文所用術(shù)語(yǔ)“生物樣本”定義為來(lái)自至少一種動(dòng)物和/或植物的任何組織和/或流體的樣本。生物樣本可以是動(dòng)物(包括人)、流體、固體(例如，糞便)或者組織，以及液體和固體食物和飼料產(chǎn)品和原料，如乳制品、蔬菜、肉和肉類(lèi)加工副產(chǎn)品以及廢料。生物樣本可以從所有各種各樣的家畜以及野化家畜或者野生動(dòng)物中獲得，包括，但不限于，這些動(dòng)物，如有蹄類(lèi)動(dòng)物、熊、魚(yú)、兔形動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物等等。環(huán)境樣本包括環(huán)境材料，如表面物質(zhì)、
土壤、水、空氣和工業(yè)樣本，以及從食物、乳品加工器械、設(shè)備、裝備、器具、一次性和非一次性產(chǎn)品中得到的樣本。這些實(shí)例并不解釋為限制可適用于本文中所公開(kāi)方法的樣本類(lèi)型。特別是，生物樣本可以是至少來(lái)自人類(lèi)的任何組織和/或流體。本文所用術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”是指與堿基配對(duì)規(guī)則有關(guān)的多核苷酸(即，如寡核苷酸或靶核酸的核苷酸序列)。例如，“5' -A-G-T-3' ”序列與“3' -T-C-A-5' ”序列互補(bǔ)。核酸鏈之間的互補(bǔ)性程度對(duì)核酸鏈之間的雜交的效率和強(qiáng)度具有顯著作用。這在擴(kuò)增反應(yīng)以及依賴(lài)于核酸之間結(jié)合的檢測(cè)方法中尤為重要。特別地，“互補(bǔ)序列”是指一種處于“反向平行聯(lián)會(huì)”的寡核苷酸，當(dāng)其在與核酸序列排列時(shí)以使一種序列的5'末端與另一序列的3'末端配對(duì)。一些在天然核酸中不常發(fā)現(xiàn)的堿基可以被包含在本文所公開(kāi)的核酸中，并且包括，例如，次黃嘌呤核苷和7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤(7-deazaguanine)?；パa(bǔ)性無(wú)需是完全的；穩(wěn)定的雙鏈體可以包含錯(cuò)配堿基對(duì)或不匹配的堿基。核酸技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以憑經(jīng)驗(yàn)考慮一些變量來(lái)確定雙鏈體的穩(wěn)定性，所述變量包括，例如，寡核苷酸的長(zhǎng)度、堿基組成和寡核苷酸的序列、離子強(qiáng)度和錯(cuò)配堿基對(duì)的發(fā)生率。在第一寡核苷酸與靶核酸的區(qū)域互補(bǔ)并且第二寡核苷酸與相同區(qū)域(或者該區(qū)域的部分)具有互補(bǔ)性的情況下，沿所述靶核酸的這一位置處就存在一種“重疊區(qū)”。重疊程度可以根據(jù)互補(bǔ)性的范圍而變化。本文所用術(shù)語(yǔ)“包含(包括)”定義為“主要包括，但不是必須唯一的”。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)自發(fā)地將術(shù)語(yǔ)“包含(包括)”解讀為包括“由……組成”。詞語(yǔ)“包含(包括)”的變形，如“包含(包括)(動(dòng)詞原形)”以及“包含(包括)(第三人稱(chēng)單數(shù))”，具有相應(yīng)的各種含義。本文所用術(shù)語(yǔ)“衍生物”定義為本發(fā)明的寡核苷酸的化學(xué)修飾，或者與所述寡核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸序列的化學(xué)修飾。多核苷酸序列的化學(xué)修飾可以包括，例如，由烷基、酰
基或氨基取代氫。本文所用術(shù)語(yǔ)“片段”定義為一種寡核苷酸的全序列的不完整的或分離的部分，所述寡核苷酸包括賦予序列所述寡核苷酸的特征和功能的活性/結(jié)合位點(diǎn)。特別是，其可以更短，為至少一種核苷酸或者氨基酸。更特別的是，所述片段包含能夠使所述寡核苷酸與復(fù)合結(jié)核菌組結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)。特別是，正向引物的片段可以包含SEQ ID NO :1的至少10、
12、15、18或19個(gè)連續(xù)核苷酸，和/或反向引物的片段可以包含SEQ ID NO :2的至少10、12、
15、18、19、20、22或24個(gè)連續(xù)核苷酸。更加特別的是，引物片段的長(zhǎng)度可以為至少15個(gè)核苷酸。本文所用術(shù)語(yǔ)“內(nèi)對(duì)照(IC)分子”定義為體外轉(zhuǎn)錄的寡核苷酸分子，所述寡核苷酸分子是通過(guò)本發(fā)明的方法中使用的針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的相同引物組進(jìn)行共擴(kuò)增的。特別是，所述IC可以在反應(yīng)混合物 中混合以監(jiān)測(cè)PCR的運(yùn)行從而避免假陰性結(jié)果。用于檢測(cè)該IC分子的探針可以特異性針對(duì)該分子的內(nèi)部。該內(nèi)部可以為人工設(shè)計(jì)的并且在自然界不會(huì)發(fā)生。本發(fā)明上下文中使用的術(shù)語(yǔ)“復(fù)合結(jié)核菌組”指的是一種或多種生物體，如結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌(M. bovis)、非洲分枝桿菌(M. africanum)、卡氏分枝桿菌(M. canetti)、田鼠分枝桿菌(M. microti)等等。本文所用術(shù)語(yǔ)“突變”定義為在核酸序列中一定長(zhǎng)度的核苷酸的改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，小的突變，特別是置換、缺失和/或插入的點(diǎn)突變對(duì)核苷酸的延長(zhǎng)影響不大，特別是在所述核酸是用作探針時(shí)。因此，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸包括至少一種核苷酸的替換、缺失和/或插入的突變。而且，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸及其衍生物也可以用作探針，因此，本文所涉及的任何寡核苷酸也包括它們的突變和衍生物。術(shù)語(yǔ)“生物樣本中的核酸”是指任何包含核酸(RNA或DNA)的樣本。特別是，核酸的來(lái)源是包括但不限于血液、唾液、腦脊髓液、胸膜腔積液、乳汁、淋巴液、痰和精液的生物樣本。根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供了至少一種分離的寡核苷酸，其包含SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :2、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列中的至少一種核苷酸序列，或者由SEQ IDNO :1或SEQ ID NO :2、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列中的至少一種核苷酸序列組成。所述寡核苷酸可以能夠與復(fù)合結(jié)核菌組結(jié)合和/或從復(fù)合結(jié)核菌組中被擴(kuò)增。所述復(fù)合結(jié)核菌組可以選自結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、卡氏分枝桿菌和田鼠分枝桿菌中。這些引物可以與結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、卡氏分枝桿菌或田鼠分枝桿菌中的一種或多種結(jié)合。這些引物可以對(duì)復(fù)合結(jié)核菌組而非NTM是靈敏的和特異的。根據(jù)本發(fā)明任一方面的引物可用于辨別結(jié)核分枝桿菌與非洲分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌和卡氏分枝桿菌的基因型。結(jié)核分枝桿菌基因型可以包括結(jié)核分枝桿菌的耐藥菌株。所述結(jié)核分枝桿菌的耐藥菌株可以抵抗選自利福平、乙胺丁醇、異煙肼、二芳基喹諾酮、氟喹諾酮、鏈霉素和吡嗪胺中的一種或多種藥物。結(jié)核分枝桿菌的耐藥菌株可以是多重耐藥菌株，其可以抵抗選自利福平、乙胺丁醇、異煙肼、二芳基喹諾酮、氟喹諾酮、鏈霉素和吡嗪酰胺中的多個(gè)藥物。所述寡核苷酸序列的長(zhǎng)度可以在13至35個(gè)連接的核苷酸之間并且可以包含與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的至少70%序列同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是給出的引物無(wú)需以100%的互補(bǔ)性雜交從而有效地啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)中互補(bǔ)核酸鏈的合成。引物可以在一種或多種片段上雜交，以使插入片段或相鄰片段沒(méi)有參與雜交事件(例如，環(huán)結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。特別是，所述寡核苷酸的序列可以具有與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的80%、85%、90%，、95%或 98%的序列同一性。序列同一性的70%到100%的變化范圍，或者這其中的任何范圍可以與公開(kāi)的特異性引物序列相關(guān)。下述實(shí)例中描述了序列同一丨I"生的確定一種長(zhǎng)度為20個(gè)核苷酸的引物與另一種具有兩個(gè)非全同殘基的長(zhǎng)度為20個(gè)核苷酸的引物一致,20個(gè)中具有18個(gè)相同殘基(18/20 = 0.9或90%序列同一性)。另一個(gè)實(shí)例中，一種長(zhǎng)度為15個(gè)核苷酸的引物的所有殘基與一種長(zhǎng)度為20個(gè)核苷堿基的引物中的15個(gè)核苷酸的片段一致,就會(huì)與20個(gè)核苷酸的引物具有15/20 = 0. 75或75%的序列同一性。同源性、序列同一性或者互補(bǔ)性的百分比可以通過(guò)，例如使用默認(rèn)設(shè)置的Gap程序(Wisconsin序列分析包，UNIX版本8,遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組,大學(xué)研究園，Madison WI),來(lái)確定，其采用Smith和Waterman的運(yùn)算法則。技術(shù)人員能夠計(jì)算出序列同一丨丨生百分比或者序列同源性百分比，并能夠無(wú)需過(guò)多實(shí)驗(yàn)就能確定引物序列同一性的變化對(duì)引物行使其啟動(dòng)用于制備擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸互補(bǔ)鏈的合成的功能的影響。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了至少一對(duì)寡核苷酸，其包括至少一種正向引物和至少一種反向引物，其中，所述正向引物包含SEQ ID NO :1、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列，基本由SEQ ID NO :1、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列組成，或者由SEQ ID N0:1、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列組成；以及所述反向引物包含SEQ ID NO :2、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列，基本由SEQ ID NO :2、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列組成，或者由SEQ ID NO :2、其片段、衍生物、突變或互補(bǔ)序列組成。根據(jù)又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了至少一組寡核苷酸，其包括根據(jù)本發(fā)明任一方面的一對(duì)寡聚核苷酸和至少一種探針。所述探針可以用熒光染料在其5'和3'末端標(biāo)記。5'-標(biāo)記熒光染料的實(shí)例可以包括，但不限于，6-羧基熒光素(FAM)、六氯-6-羧基熒光素(HEX)、四氯-6-羧基熒光素和花青_5(Cy5)。3'-標(biāo)記熒光染料的實(shí)例可以包括，但不限于，5-羧基四甲基若丹明(TAMRA)和黑洞猝滅劑-1,2,3 (BHQ-1，2，3)。根據(jù)本發(fā)明的任一方面的寡核苷酸可以用于檢測(cè)臨床樣本或培養(yǎng)樣本中的結(jié)核分枝桿菌的方法，其中，所述臨床樣本可以選自痰、支氣管肺泡灌洗液、胸膜腔積液、腹水/腹膜液、腦脊髓液(CSF)、膿、排泄物、尿、羊水、月經(jīng)血、外周血或其他體液、淋巴結(jié)、膿、或其他抽吸物和活檢組織。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了至少一種使用至少一種正向引物和至少一種反向引物從復(fù)合結(jié)核菌組中擴(kuò)增的擴(kuò)增子，所述正向引物包含SEQ ID NO :1的核苷酸序列，所述反向引物包含SEQ ID NO 2的核苷酸序列。 根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供了至少一種檢測(cè)生物樣本中結(jié)核分枝桿菌的存在的方法，所述方法包括步驟(a)提供至少一種生物樣本；(b)使根據(jù)本發(fā)明的任一方面的至少一種寡核苷酸、一對(duì)寡核苷酸或一組寡核苷酸，與生物樣本中的至少一種核酸接觸，和/或與從生物樣本中提取、純化和/或擴(kuò)增的至少一種核酸接觸；以及(c)檢測(cè)從步驟(b)中的接觸產(chǎn)生的任何結(jié)合，由此當(dāng)檢測(cè)到結(jié)合時(shí)結(jié)核分枝桿菌存在。所述方法可以用來(lái)確定樣本中結(jié)核分枝桿菌的身份和數(shù)量，包括使樣本與根據(jù)本發(fā)明的任一方面的一對(duì)引物和已知數(shù)量的包含校準(zhǔn)序列的校準(zhǔn)多核苷酸接觸；同時(shí)用該對(duì)引物從樣本中的結(jié)核分枝桿菌中擴(kuò)增核酸和用該對(duì)引物從樣本中的校準(zhǔn)多核苷酸中擴(kuò)增核酸，以獲得包含識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的擴(kuò)增子的第一擴(kuò)增產(chǎn)物和包含校準(zhǔn)擴(kuò)增子的第二擴(kuò)增產(chǎn)物；獲得包含識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的擴(kuò)增子的分子質(zhì)量和豐度數(shù)據(jù)(abundance data)和校準(zhǔn)擴(kuò)增子的分子質(zhì)量和豐度數(shù)據(jù)，其中，識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的擴(kuò)增子和校準(zhǔn)擴(kuò)增子的5'和3'末端是該對(duì)引物或其互補(bǔ)物的序列；以及基于其各自的分子質(zhì)量，辨別識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的擴(kuò)增子與校準(zhǔn)擴(kuò)增子，其中，所述識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的擴(kuò)增子的分子質(zhì)量表明結(jié)核分枝桿菌的身份，以及識(shí)別結(jié)核分枝桿菌的擴(kuò)增子豐度數(shù)據(jù)和校準(zhǔn)擴(kuò)增子豐度數(shù)據(jù)的比較表明樣本中結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量。根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供了至少一種擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌核酸的方法，其中，所述方法包括使用SEQ ID NO :I和SEQ ID NO 2進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
根據(jù)本發(fā)明的任一方面的方法可以進(jìn)一步包括將內(nèi)分子(IC)和特異性針對(duì)所述IC的探針與生物樣本混合。所述IC可以包含SEQ ID NO :3的核苷酸序列。使用IC可以提高TB診斷的效率，增加結(jié)果的準(zhǔn)確性。除了肺結(jié)核之外，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的方法還可以用于特異性診斷結(jié)核性腦膜炎、腹部結(jié)核、腸結(jié)核、泌尿生殖結(jié)核的PCR擴(kuò)增。此外，PCR擴(kuò)增可以用于只是檢測(cè)活動(dòng)性疾病而不是以往的接觸，因此診斷更加特異和準(zhǔn)確。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了至少一種用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的試劑盒，所述試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明的任一方面的至少一種寡核苷酸、一對(duì)寡核苷酸或一組寡核苷酸?？梢哉J(rèn)為，通過(guò)參照經(jīng)由舉例所提供的下列實(shí)施例，將更加容易地理解上述內(nèi)容，但是并不意欲限制本發(fā)明。實(shí)施例本領(lǐng)域已知的和未被具體說(shuō)明的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)通常在Sambrook和Russel的分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Springs Harbor Laboratory),紐約(2001)中描述。實(shí)施例I包含內(nèi)對(duì)照(IC)的根據(jù)本發(fā)明的方法的診斷準(zhǔn)確性的評(píng)價(jià)。研究群體對(duì)兩組樣本進(jìn)行評(píng)價(jià)。第一組來(lái)自陳篤生醫(yī)院(Tan Tock Seng Hospital, TTSH,新加坡)TB PCR處理診斷請(qǐng)求的一年的414個(gè)原始DNA提取物；它們代表‘回顧性’組。全部DNA提取物在_80°C冷凍。然后，如圖I和2所示，選擇來(lái)自回顧性組內(nèi)的三個(gè)子群的樣本。已報(bào)告復(fù)合結(jié)核菌組(MTBC)培養(yǎng)陽(yáng)性的所有樣本，報(bào)告MTBC培養(yǎng)陰性但NTM培養(yǎng)陽(yáng)性的所有樣本，以及從MTBC和NTM均為培養(yǎng)陰性的樣本中隨機(jī)選擇的樣本。第二組樣本由不參與這項(xiàng)評(píng)價(jià)的工作人員預(yù)期采集，要求工作人員從對(duì)分枝桿菌涂片和培養(yǎng)進(jìn)行處理過(guò)的涂片陽(yáng)性和陰性臨床樣本混合物中收集等分試樣。在收集的時(shí)候，不知道培養(yǎng)結(jié)果。一個(gè)熟練的工作人員在不知道樣本詳情或患者的背景的情況下進(jìn)行PCR0在收集后，數(shù)據(jù)是隱名的。樣本處理將呼吸性樣本用等體積的I % N-乙酰半胱氨酸液化，劇烈渦旋并放置15分鐘。然后，將它們?cè)?000rpm下離心并丟棄上清。將I. 5mL的沉積物的等分試樣在_80°C儲(chǔ)藏，未離心的腦脊髓(CSF)和胸膜腔積液的等分試樣以及已用0. 5ml無(wú)菌鹽水絞碎的組織/活檢材料的等分試樣也在_80°C儲(chǔ)藏。使用具有板外裂解(offboard lysis)的NucliSens easyMAG系統(tǒng)(BIOMERIEUX，荷蘭)進(jìn)行DNA提取。在儀器分配了裂解緩沖液之后，將500 Ul的各樣本加入到Class IIBiosafety箱的各自的容器中并且通過(guò)來(lái)回抽吸取充分混合。然后，將40 的QIAGEN蛋白酶K加入到各容器中并且通過(guò)來(lái)回抽吸充分混合。將混合物在室溫孵育30分鐘，之后返回到EasyMag儀器中以用25 yl洗脫方案自動(dòng)提取。將洗脫物在_80°C儲(chǔ)藏。引物用于擴(kuò)增的一組引物源自編碼IS6110(結(jié)核分枝桿菌的IS樣元件)的基因序列(NCBI登錄號(hào)X17348 ;SEQ ID NO :4)。正向引物(U)和反向引物(L)的序列為 TBMSUdS' -3 ' ) CGATCGCTGATCCGGCCACA (SEQ ID NO :1)和 TB145L : (5 ' -3 ')GCGTCGGTGACAAAGGCCACGTAGG(SEQ ID NO :2)。將內(nèi)對(duì)照(IC)混合在反應(yīng)混合物中以監(jiān)測(cè)PCR的進(jìn)行從而檢測(cè)假陰性結(jié)果。該 IC分子通過(guò)相同的上述針對(duì)TB的引物組被共擴(kuò)增。該IC分子的內(nèi)部為人工設(shè)計(jì)的并且在自然界不會(huì)發(fā)生。IC分子的序列為T(mén)B145IC (5 ' -3 ' )CTGATCCGGCCACATATCGCGTTTATGCGAGGTCGGGTGGGCGGGTCGTTAGTTTCGTTTTGGGCCTACGTGGCCTTTGTCAC(SEQ ID NO :3)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在熱循環(huán)儀中，在含有5 ill的DNA樣本、100個(gè)拷貝的IC分子、I. 25 U I的終濃度為5%的甲酰胺和終濃度為0. 3iiM的各引物的25 ill反應(yīng)體積中使用Finnzyme Phire HotStart DNA 聚合酶(目錄號(hào) F-120)進(jìn)行 PCR。使用 Eppendorf MastercycIer-ep-gradient-S (Hamburg,德國(guó))，采用下列步驟和條件在98°C初始激活65秒,接著40個(gè)循環(huán)(98°C變性17秒，69°C退火20秒和72°C延伸15秒)，以及在72°C最終延伸I分鐘。擴(kuò)增后，通過(guò)常規(guī)的凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。在新加坡分子和細(xì)胞生物學(xué)研究院(Institute of Molecularand Cellular Biology, Singapore)設(shè)計(jì)和最優(yōu)化 PCR 測(cè)定。用于靈敏性分析的參考標(biāo)準(zhǔn)定義為外部TB實(shí)驗(yàn)室使用基于固體和液體的培養(yǎng)基(其是最靈敏的可用的方法)報(bào)告的‘MTBC培養(yǎng)陽(yáng)性’。為了分析特異性，MTBC培養(yǎng)不能作為單一的參考標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)閺闹委熤械谋憩F(xiàn)為樣本培養(yǎng)陰性的患者提交的樣本會(huì)誤導(dǎo)分析和過(guò)高估計(jì)假陽(yáng)性率。例如，有過(guò)另一次最近的樣本報(bào)告為MTBC培養(yǎng)陽(yáng)性的患者也可以具有報(bào)告為MTBC培養(yǎng)陰性的樣本。出于分析目的將它們作為真陰性處理而是明確無(wú)益的，因?yàn)樗鼈儚姆治鲋信懦?，但是又在結(jié)果中被清楚地辨別和呈現(xiàn)。將發(fā)現(xiàn)為PCR陽(yáng)性但是在2個(gè)月內(nèi)沒(méi)有任何MTBC培養(yǎng)陽(yáng)性樣本的樣本進(jìn)行再提取并提交以重復(fù)PCR。對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序以確定特異性。序列測(cè)定由外部實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行并提交到NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST分析。如果重復(fù)PCR為陽(yáng)性并且序列匹配‘MTBC’，那么就不認(rèn)為這些樣本的結(jié)果為假陽(yáng)性，因此從特異性分析中排除。同樣地，它們不被包括在靈敏性分析中。在基于網(wǎng)上程序上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(www. quantitativeskills. com/sisa/statistics/diagnos. htm)。僅對(duì)組I ‘臨床要求PCR樣本’計(jì)算置信區(qū)間。在100%靈敏性的情況下，它們不能計(jì)算。
參考標(biāo)準(zhǔn)方法是按照常規(guī)診斷工作流程在樣本采集的24-72小時(shí)內(nèi)在外部實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的常規(guī)分枝桿菌培養(yǎng)。第一組(來(lái)自臨床PCR請(qǐng)求的樣本)的詳情和結(jié)果示于圖I中，進(jìn)一步由樣品類(lèi)型表現(xiàn)的MTBC培養(yǎng)陽(yáng)性組示于圖2中。第二組(預(yù)期收集的樣本)示于圖3中。靈敏性分析示于表I中以及特異性分析示于表2中。具有教導(dǎo)真陽(yáng)性的明顯的假陽(yáng)性PCR結(jié)果的6個(gè)樣本的詳情不于表3中。四個(gè)來(lái)自具有從一周(2例)或6周(2例)內(nèi)收集的其他樣本中分離的MTBC的患者。兩個(gè)來(lái)自沒(méi)有任何其他樣本MTBC培養(yǎng)陽(yáng)性的患者的PCR陽(yáng)性樣本。這些是重復(fù)的PCR陽(yáng)性，并且根據(jù)在基因庫(kù)(NCBI數(shù)據(jù)庫(kù))上對(duì)很多結(jié)核分枝桿菌例子的BLAST分析，每個(gè)病例中的PCR產(chǎn)物的序列是100%匹配的。在任一存在TB DNA的病例中，這些患者可能患過(guò)TB或者樣本可能被污染。由于所有的在一年期間診斷TB PCR的報(bào)告為陽(yáng)性的樣本也為‘培養(yǎng)陽(yáng)性’，因此PCR系統(tǒng)可為‘干凈的’。

權(quán)利要求
1.一種分離的寡核苷酸，其包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2、其片段、衍生物或互補(bǔ)序列中的至少一種核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸序列的長(zhǎng)度在13至35個(gè)連接的核苷酸之間并且包含與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的任意一種的至少70%序列同一性。
3.一種分離的寡核苷酸，其由SEQ ID NO=USEQ ID NO :2、其片段、衍生物或互補(bǔ)序列組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的分離的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸能夠與復(fù)合結(jié)核菌組結(jié)合，和/或從復(fù)合結(jié)核菌組中被擴(kuò)增。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離的寡核苷酸，其中，所述復(fù)合結(jié)核菌組選自結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、卡氏分枝桿菌和田鼠分枝桿菌中。
6.一對(duì)寡核苷酸，其包括至少一種正向引物和至少一種反向引物，其中，所述正向引物包含SEQ ID NO :1、其片段、衍生物和互補(bǔ)序列，以及所述反向引物包含SEQ ID NO :2、其片段、衍生物和互補(bǔ)序列。
7.一對(duì)寡核苷酸，其包括至少一種正向引物和至少一種反向引物，其中，所述正向引物由SEQ ID NO :1、其片段、衍生物或互補(bǔ)序列組成，以及所述反向引物由或SEQ ID NO :2、其片段、衍生物或互補(bǔ)序列組成。
8.一組寡核苷酸，其包括根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一對(duì)寡核苷酸和至少一種探針。
9.一種使用至少一種正向引物和至少一種反向引物從結(jié)核分枝桿菌中擴(kuò)增的擴(kuò)增子，所述正向引物包含SEQ ID NO : I的核苷酸序列，所述反向引物包含SEQ ID NO :2的核苷酸序列。
10.一種檢測(cè)和/或定量生物樣本中復(fù)合結(jié)核菌組的方法，所述方法包括步驟 (a)提供至少一種生物樣本； (b)使至少一種根據(jù)權(quán)利要求I 5中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，與生物樣本中的至少一種核酸接觸，和/或與從生物樣本中提取、純化和/或擴(kuò)增的至少一種核酸接觸；以及 (c)檢測(cè)和/或定量從步驟(b)中的接觸產(chǎn)生的任何結(jié)合，由此當(dāng)檢測(cè)到結(jié)合時(shí)復(fù)合結(jié)核菌組存在。
11.一種檢測(cè)和/或定量生物樣本中復(fù)合結(jié)核菌組的方法，所述方法包括步驟 (a)提供至少一種生物樣本； (b)使根據(jù)權(quán)利要求8所述的一組寡核苷酸，與生物樣本中的至少一種核酸接觸，和/或與從生物樣本中提取、純化和/或擴(kuò)增的至少一種核酸接觸；以及 (c)檢測(cè)和/或定量從步驟(b)中的接觸產(chǎn)生的任何結(jié)合，由此當(dāng)檢測(cè)到結(jié)合時(shí)復(fù)合結(jié)核菌組存在。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其進(jìn)一步包括在步驟(a)之后將內(nèi)分子(IC)和特異性針對(duì)IC的探針與生物樣本混合的步驟。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述IC包含SEQID NO :3、其片段、衍生物或互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
14.一種擴(kuò)增復(fù)合結(jié)核菌組核酸的方法，其中，所述方法包括使用SEQ ID NO :1和SEQID NO : 2進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述方法進(jìn)一步包括至少一種探針。
16.一種用于檢測(cè)復(fù)合結(jié)核菌組的試劑盒，所述試劑盒包括至少一種根據(jù)權(quán)利要求I 5中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸。
17.一種用于檢測(cè)復(fù)合結(jié)核菌組的試劑盒，所述試劑盒包括至少一對(duì)根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的寡核苷酸。
18.一種用于檢測(cè)復(fù)合結(jié)核菌組的試劑 盒，所述試劑盒包括至少一組根據(jù)權(quán)利要求8所述的寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于結(jié)核分枝桿菌的存在的簡(jiǎn)單、特異和/或靈敏的試驗(yàn)的寡核苷酸。特別是，本發(fā)明提供了用于結(jié)核分枝桿菌試驗(yàn)的寡核苷酸。此外，還提供了試劑盒，其包括所述試驗(yàn)使用的用作探針和/或引物的寡核苷酸。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102656277SQ201080030235
公開(kāi)日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2010年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日
發(fā)明者T·巴克漢姆, 井上雅文 申請(qǐng)人:新加坡科技研究局, 陳篤生醫(yī)院